Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Detectie van Tilapia Lake Virus met behulp van conventionele rechts-PCR en SYBR groene RT-qPCR

Published: November 10, 2018 doi: 10.3791/58596
Automatic Translation
1, 2, 2
1Institute of Veterinary Bacteriology Vetsuisse Faculty, University of Bern, 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology and Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Kasetsart University Institute for Advanced Studies, Kasetsart University

Summary

Dit protocol diagnose Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia weefsels met behulp van de RT-PCR methodes. De hele methode is beschreven van weefsel dissectie totaal RNA extractie, gevolgd door de cDNA synthese en opsporing van TiLV door conventionele PCR of kwantitatieve PCR dsDNA bindend een bindende fluorescerende kleurstof gebruiken.

Abstract

Het doel van deze methode is om de snelle, gevoelige en specifieke detectie van Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia weefsels. Dit protocol kan worden gebruikt als onderdeel van toezicht-programma's, biosecurity maatregelen en in TiLV fundamenteel onderzoekslaboratoria. De gouden standaard van de diagnostiek van het virus betekent meestal dat de isolatie van het virus gevolgd door aanvullende technieken, zoals reverse-transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR) voor verdere verificatie. Dit kan worden omslachtig en tijdrovend en vereist normaliter weefselsteekproeven zwaar besmet met het virus. Het gebruik van RT-kwantitatieve (q) PCR in de opsporing van virussen is voordelig vanwege haar kwantitatieve aard, hoge gevoeligheid, specificiteit, schaalbaarheid en zijn snelle tijd resulteren. Hier, gebaseerde de gehele methode van PCR benaderingen voor TiLV detectie beschreven, van tilapia orgel vectorafbeeldingsbestanden, totaal RNA acid (RNA) extractie met behulp van een guanidium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroformoplossing, RNA kwantificering is, gevolgd door een tweestaps PCR Protocol inhoudt, complementaire deoxyribonucleic acid (cDNA) synthese en opsporing van TiLV door conventionele PCR of kwantitatieve identificatie via qPCR met behulp van SYBR groene kleurstof ik. Conventionele PCR post-PCR de stappen vereist en zal gewoon informeren over de aanwezigheid van het virus. De laatste benadering zal zorgen voor absolute kwantificering van TiLV tot zo weinig zoals 2 exemplaren en is dus buitengewoon nuttig voor TiLV diagnose in sub klinische gevallen. Een gedetailleerde beschrijving van de twee benaderingen van PCR, representatieve resultaten uit twee laboratoria en een diepgaande bespreking van de kritische parameters van beide zijn opgenomen om ervoor te zorgen dat onderzoekers en diagnosticians hun meest geschikte en toepassing vinden methode voor de detectie van de TiLV.

Introduction

Het hoofd van de wereldwijde bevolking vis aanbod bereikt een nieuw record van 20 kg in 2014, en dit was als gevolg van de krachtige groei van de aquacultuur. Aquacultuur blijft een van de snelst groeiende dierlijk voedsel producerende sectoren wereldwijd en is de enige dierlijke voedselproducerende sector die sneller dan de menselijke populatie1 groeit. Tilapiine cichilds omvatten de tweede belangrijkste zoetwatervis gekweekt wereldwijd met een totale mondiale productie van 6,4 miljoen ton (MT) en een geschatte waarde van 9,8 miljard Amerikaanse dollars in 20152. De producenten van de top tien van tilapia zijn China (1.78 MT), Indonesië (1.12 MT) en Egypte (0.88 MT), gevolgd door Bangladesh, Vietnam, de Filippijnen, Brazilië, Thailand, Colombia en Oeganda2. Verwacht wordt dat globale tilapia productie ongeveer 7,3 zullen MT door 20303. Tilapia zijn dergelijke een belangrijke wereldwijde voedingsbron geworden, niet alleen omdat ze een goedkope bron van eiwit4 maar ook omdat ze gemakkelijk te kweken in capaciteit onder een brede waaier van water en klimaat voorwaarden5,6. Slechts een paar decennia geleden, men geloofde dat er maar weinig commercieel belangrijke ziekten bedreigend tilapia landbouw maar dit niet langer waar is. Een opkomende virale ziekte heet het syndroom tilapia lake virus ziekte (TiLVD) is de eerste ooit kritische ziekte epidemie gevonden in tilapia en de hele sector wordt bedreigd. Deze ziekte heeft ernstige sociaal-economische gevolgen en is een directe bedreiging voor de voedselzekerheid voor miljoenen mensen in Afrika7, Azië en Zuid-Amerika. Aan het begin van 2018, de Wereldorganisatie voor besmettelijke veeziekten (OIE) gemeld dat het etiologische agens van deze ziekte, TiLV, officieel ontdekt was op drie continenten die betrekking hebben op acht landen8 en aangezien deze informatiekaart pathogen bijgewerkte er zijn meer meldingen van TiLV in Tanzania, Oeganda9, Indonesië10, Taiwan11 en Peru12. TiLV is een nieuwe single-stranded RNA virus beschreven om een orthomyxo-achtig virus omdat het bevat een aantal kenmerken denken aan andere orthomyoxoviruses zoals Influenza of Infectious zalmanemie virus (ISAV)13. Het werd voor het eerst geïdentificeerd in de nasleep van massale verliezen van wilde en gekweekte tilapia in het meer van Galilea, Israël-14. Daarna, soortgelijke ziekte-uitbraken aangeduid als zomer sterfte en de sterfte syndroom dat gepaard gaat met TiLV infecties werden gemeld in de Nijl tilapia (Labeo niloticus) in Egypte15 en de Nijl en rode hybride tilapia maand (Labeo spp.) in Thailand16, respectievelijk. Detectie van aquatische dieren virussen is historisch uitgevoerd door groei en isolatie van virus in celkweek. Verschillende cellijnen zijn getest voor de vermeerdering en de isolatie van TiLV met inbegrip van, E-11 cellen afgeleid van snakehead vis (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB en TmB afkomstig uit Labeo fimbriatus18, en OnlB en OnlL van oorsprong van de Nijl tilapia (O. niloticus)19. Terwijl virus cultuur het voordeel dat het levert materiaal voor verdere experimenten, heeft het het nadeel dat het vereist ten minste 4-7 dagen om te observeren van de vorming van cytopathogeen effect (CPE) en cruciaal, verschillende piscine virussen, die meer aanpassen aan repliceren kunnen worden gekweekt en produceren van soortgelijke CPE.

In de afgelopen decennia, is er een beweging weg van traditionele, vaak tijdrovend diagnostische methoden zoals celcultuur, serologie en opsporing van antigeen en vervanging door sneller en meer gevoelige nucleic zuur gebaseerde detectie tests20, 21. Dit is duidelijk door het feit dat vele qPCR tests zijn ontwikkeld als belangrijk diagnosemethoden voor een veelheid van virale ziekten bij waterdieren, zoals voor ISAV22,23, virale hemorragische septikemie virus (VHSV)24 ,25, betanodavirus26,27 zalmachtigen alphavirus28, vis iridovirus29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30en Lymphocystis disease virus (LCDV)31 . Robuuste methoden voor diagnose en ziekteverwekker toezicht zijn dringend vereist zijn ter vermindering van de verspreiding van TiLV. Dergelijke methoden laten voor de vroegtijdige opsporing van infectie voordat klinische symptomen ontwikkelen en opsporing van lage virus ladingen. Tot op heden verschillende PCR protocollen zoals RT-PCR14,32, zijn geneste RT-PCR18, semi-geneste RT-PCR33en RT-qPCR32,34 ontwikkeld voor het opsporen van TiLV in vis weefsels. Een vergelijking van de RT-qPCR en virus isolement in gevoelig cellijnen voor detectie van de TiLV bleek dat RT-qPCR 1000 maal gevoeliger dan de virus isolatie32was. Hoewel elk gepubliceerde PCR protocol is gerapporteerd door verschillende gevoeligheden voor de detectie van TiLV, zijn de meeste testen hooggevoelige met de detectiegrenzen van virale exemplaren op 7,5 kopieën33, 7 kopieën18 of 2 kopieën32 per reactie.

Het doel van dit artikel methoden is om uit te leggen, in detail, het uitvoeren van TiLV detectie testen, beginnend met tilapia weefsel collectie, totale extractie van RNA, cDNA synthese en vervolgens TiLV specifieke PCR gebaseerde testen. In het bijzonder zijn uitgebreide protocollen van zowel conventionele rechts-PCR, en ook SYBR groen gebaseerde RT-qPCR om een beroep op een breed scala aan wetenschappers die zijn gericht op het detecteren van TiLV beschreven. Eerstgenoemde is minder gevoelig maar is meestal een goedkopere optie voor detectie. De laatste uitgebreidere infrastructuur zoals een kwantitatieve PCR-machine en duurder reagentia vereist, maar het heeft de voordelen van het kwantitatieve, snel en uiterst gevoelige, wat betekent dat het kan worden gebruikt voor de detectie van TiLV in sub klinisch besmette vis. De RT-PCR en RT-qPCR protocollen werden uitgevoerd in twee verschillende laboratoria met verschillende geografische isolaten van TiLV en de opgenomen resultaten markeren de gevoeligheid en de reproduceerbaarheid van de hier beschreven tests.

Protocol

Het protocol voor dierlijk gebruik voor deze studie werd goedgekeurd door de Kasetsart Universiteit dier ethische commissie onder vergunning nummer ACKU 59-dierenarts-016.

Opmerking: Raadpleeg de Tabel van materialen voor uitgebreide informatie over de reagentia en apparatuur voorgesteld voor dit protocol.

1. de weefsels Sample collectie

  1. De vis met een overdosis van kruidnagel olie (het volume is afhankelijk van de grootte van de vis en de concentratie van producten, meestal meer dan 3 mL/L) euthanaseren. Een vierde van de verlostang en mayo schaar onderdompelen in ethanol van 95% (v/v) gevolgd door het verbranden van de apparatuur met behulp van een alcohol brander om de apparatuur te steriliseren.
    Opmerking: Tricaïne methanesulfonate (MS-222) kan worden gebruikt in plaats van kruidnagel olie.
  2. Vinden van de lever en sneed een klein stuk (ongeveer 20-100 mg) of verzamelen van 200 µL van slijm met behulp van dekking glas of chirurgische blade verwijderen slijm uit anterior to posterior van de vis tilapia en plaats de monsters in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
  3. Proces monsters onmiddellijk, opslaan in een RNA oplossing te stabiliseren of verplaatsen tot-80 ° C tot verder gebruik.
    Opmerking: De grootste taak in het werken met RNA is intact molecules van RNA voorbereiden en houden ze onbeschadigd tijdens eventuele latere handlings. De ruggengraat van RNA is aangeboren gevoeliger voor schade dan DNA. Extractie en isolatie van totaal RNA van weefselcellen vergt zorgvuldige laboratorium techniek; Neem alle bepalingen RNase om verontreiniging te voorkomen door het dragen van handschoenen, gebruik van RNase gratis water, reagentia, uitrusting, plastic consumptieaardappelen, glaswerk, werkruimte en met behulp van de filter tips voor pipetteren.

2. Guanidium kaliumthiocyanaat - fenol - Chloroform extractie van RNA

  1. Voeg 1 mL monofasische oplossing met fenol en guanidine isothiocyanaat in een buis met weefsel monster van sectie 1.
    Let op: Deze oplossing is zeer giftig en moet met zorg in een laminaire flow-kap met beschermende uitrusting en door het dragen van de juiste beschermende brillen, kleding en veiligheid handschoenen worden behandeld.
  2. Het malen van het weefsel monster met behulp van een weefsel stamper homogenizer tot homogene.
    Opmerking: Monsters kunnen ook worden gehomogeniseerd met behulp van een homogenizer van de macht in combinatie met keramische kralen. Zorgen dat het weefsel monster is volledig gehomogeniseerd voordat u verdergaat met de volgende stap of stoppen met het protocol hier en bewaren van de volledig gehomogeniseerde monsters bij-80 ° C tot verder gebruik.
  3. Voeg 200 µL van chloroform voor fase-separatie zichtbaar.
    Let op Chloroform is een potentiële verdovende middelen en is uiterst gevaarlijk. Het moet met zorg in een laminaire flow-kap met beschermende uitrusting, alsook door het dragen van de juiste beschermende brillen, kleding en veiligheid handschoenen worden behandeld. Als een minder toxisch alternatief, 1-Bromo-3-chloorpropaan kan ook worden gebruikt.
    Opmerking: Schalen de volumes omhoog of omlaag waar nodig. Bijvoorbeeld, als slechts 500 µL monofasische oplossing met fenol en guanidine isothiocyanaat werd gebruikt, alleen voegt u 100 µL van chloroform bij deze stap.
    1. Monsters meng goed door inversie voor 15 s.
    2. Incubeer monsters gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  4. Centrifugeer gedurende 15 min op 12.000 × g - en 4 ° C.
    Opmerking: Moet er een duidelijke scheiding in een lagere organische fase, een witte interfase en een bovenste waterige fase met RNA. Deze top fase is doorgaans kleurloos maar afhankelijk van het type en de hoeveelheid gehomogeniseerde weefsel, kan er een lichte roze verschijning.
  5. De bovenste laag van waterige (ongeveer 500 µL) overbrengen in een verse microcentrifuge buis zonder verstoring van de interfase.
    Opmerking: Probeer niet om te dragen de hele waterfase, laat een kleine hoeveelheid om te voorkomen dat potentiële verontreiniging van het RNA met waterige fase met de organische of interfase.
  6. Voeg 1 deel van 100% isopropanol te precipiteren van RNA.
    1. Optioneel, als zeer kleine hoeveelheden weefsel werden gebruikt, voeg dan 1 µL (5-10 µg) van glycogeen RNase-vrij aan elk monster ter bevordering van de efficiënte RNA neerslag. Dit zal helpen de identificatie van de RNA-pellet in stap 2.8.
      Opmerking: De glycogeen fungeert als een drager van het RNA en zal kleine hoeveelheden van RNA voorkomen kleven aan de kant van de buis.
    2. Mix-buizen goed door inversie meerdere malen.
    3. Opslaan van de monsters gedurende 2 uur naar girale bij-20 ° C.
  7. Centrifugeer steekproeven voor 15 min van 12.000 x g - en 4 ° C.
  8. Verwijder het supernatant, voorzichtig om niet te verjagen van de RNA-pellet onderin microcentrifuge buis.
  9. Voeg vervolgens 1 mL van 75% ethanol (v/v) en meng RNA monsters door het omkeren van de buis meerdere malen.
  10. Centrifugeer gedurende 15 min op 10.000 x g - en 4 ° C.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gestopt en de monsters met de RNA-pellet in 75% ethanol kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C tot verder gebruik.
  11. Verwijder het supernatant, waakzame niet te verjagen van de RNA-pellet op de onderkant van de buis microcentrifuge wordt.
    1. Optioneel, herhaal stap 2.9-2.11 met 70% ethanol (v/v). Grondig wassen van de RNA-pellet zal minimaliseren elke zout of verontreinigingen "Carry-over" die kan belemmeren zal gevoelige downstream toepassingen.
  12. Trekken uit de resterende ethanol met behulp van een precisiepipet en vervolgens drogen de RNA-pellet bij kamertemperatuur niet langer dan 5 tot 10 min.
    Opmerking: overdreven gedroogde korrels worden moeilijk te resuspendeer.
  13. Voeg 30-60 µL RNase-gratis water, vooraf opgewarmd tot 55-60 ° C tot solubilize de RNA-pellet.
  14. Plaats de RNA op ijs voor onmiddellijk gebruik of winkel bij-80 ° C voor later gebruik.

3. het kwantificeren van RNA concentratie met behulp van een Micro-Volume spectrofotometer

  1. Activeer de instellingen van de spectrofotometer RNA.
  2. 1-2 µL van RNase-gratis water gebruiken als een leeg.
  3. Gebruik 1-2 µL van elk monster RNA te beoordelen van de RNA-hoeveelheid.
  4. Opnemen van de lezingen op 230 nm, 260 nm en 280 nm voor elk monster.
  5. Verdun de RNA tot 200 ng/µL met behulp van RNase-gratis water.

4. synthese van cDNA (cDNA) met behulp van totale RNA

  1. Meng 1 µg totaal RNA van protocol 2, 2 µM oligo (dT), 0,5 mM dNTPs mengsel en breng het eindvolume aan 10 µL met nuclease-gratis water. Bereid hiervoor een RT-master-mix volgens het aantal monsters en besturingselementen worden getest.
    Opmerking: De controles zijn een min-reverse-transcriptase monster (-RT) waarin het enzym RT is vervangen door nuclease-gratis water (zie stap 4.3) en een sjabloon oncontroleerbaar (NTC) waarin nuclease-vrije water wordt toegevoegd aan de master-mix in plaats van RNA sjabloon.
    1. Meng de monsters goed door pipetteren gevolgd door een kort centrifugeren.
  2. Incubeer de monsters bij 65 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door een 2 min incubatie op ijs.
    1. Kort centrifugeren de monsters te verzamelen van alle van de vloeistof in de bodem van de buizen.
  3. 1 x reverse-transcriptase buffer, 100 U reverse-transcriptase toevoegen en breng het uiteindelijke volume van elk monster aan 20 µL met behulp van de nuclease-gratis water.
    1. Meng de monsters goed door pipetteren gevolgd door een kort centrifugeren.
  4. Incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 60 minuten gevolgd door 85 ° C gedurende 5 minuten.
  5. Verdund gesynthetiseerd cDNA tot een gewenste concentratie door het toevoegen van een passende hoeveelheid nuclease-gratis water en plaats van cDNA op ijs voor onmiddellijk gebruik of bij-20 ° C voor later gebruik opslaan.

5. TiLV conventionele PCR

  1. Gebruik de cDNA, monsters en besturingselementen, gegenereerd in protocol sectie 4 als sjablonen voor een PCR-reactie met behulp van een van de gevestigde primerparen gedetailleerd in tabel 1, samen met een polymerase van DNA van keuze.
    Opmerking: Een extra controle van de neen-template (NTC) moet worden opgenomen hier te vervangen door cDNA voor nuclease-gratis water in de PCR-reactie. Een positieve controle, indien beschikbaar, moet ook worden opgenomen bestaande uit eerder geverifieerde TiLV positieve monsters of het juiste TiLV cDNA fragment gekloond in naar een plasmide.
  2. Voorbereiden van een PCR meester-mix volgens de richtlijnen van de polymerase van DNA-systeem in gebruik en het aantal monsters en besturingselementen worden getest. Deze mix moet omvatten de voorwaartse primer, omgekeerde primer, dNTPs, MgCl2 en de geselecteerde polymerase van DNA, samen met de buffer.
  3. Volgens de richtlijnen van de geselecteerde polymerase van DNA, de aangewezen hoeveelheid meester-mix met voorgestelde bedrag cDNA monsters of controlemonsters te combineren.
    Opmerking: Voorbereiding van een 0,5 x reactie overmaat is vaak gunstig omdat sommige van de meester-mix tijdens pipetteren wordt verbroken.
  4. Uitvoeren van PCR voorwaarden volgens de richtlijnen van de benutte polymerase van DNA systeem fietsen en het gebruik van een passende onthardende temperatuur voor de inleidingen in gebruik (tabel 1). Meestal een dergelijk programma houdt een eerste denaturatie bij 95 ° C gedurende 2-5 min, gevolgd door 30-40 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 s, gloeien bij de aanbevolen temperatuur voor 30 s en rek bij 72 ° C gedurende 30 s, gevolgd door een definitieve rek bij 72 ° C gedurende 5-10 min.
  5. Laden van 5-15 µL van elke PCR-reactie en een geschikte DNA-ladder in putjes van een 1-2% agarose gel, afhankelijk van de grootte van de verwachte PCR product. De versterkte DNA scheiden door elektroforese van het gel en de gel door ethidiumbromide (EthBr) ter vergemakkelijking van de visualisatie van DNA bands van de verwachte grootte (tabel 1) vlek in een gel documentatie machine met behulp van UV-licht.
    Let op: EtBr is giftig; het moet voorzichtig behandeld worden door het dragen van de juiste beschermkledij en veiligheidshandschoenen.
TiLV genoom doelsegment Voorwaartse primer
5' - 3'		 Omgekeerde primer
5' - 3'		 PCR product grootte (bp) Tm
° C		 Oorspronkelijke verwijzing
1 CCAAACGTTATCTCTTAATTACGCAC GCAAATATTTCTCTCATTCGCCT 1641 50 Surachetpong et al., 2017
1 CCTCATTCCTCGTTGTGTAAGT AGGAGTTGCTGTTGGGTTATAG 1000 62 Mugimba et al., 2018
2 ACTCTCTATTACCAAATACATTTACT TTACCATATATATAGTGAAGGC 1445 45 Surachetpong et al., 2017
2 GTCCAGGGCGGTATGTATTG CTTACGGCTGACAAGTCTCTAAG 834 62 Mugimba et al., 2018
3 GTTGGGCACAAGGCATCCTA TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT 250 56 Eyngor et al., 2014
3 TATGCAGTACTTTCCCTGCC TTGCTCTGAGCAAGAGTACC 491 57 Eyngor et al., 2014
3 ACCCCTTAATCCTTAATAGACCGTTA CCCATAATCCTCTATTAGAACGTCGT 1352 50 Surachetpong et al., 2017
3 GTCGAGGCATTCCAGAAGTAAG GAGCTAAGGGAACGGCTATTG 834 62 Mugimba et al., 2018
4 AGCAGCAGCAGGAGAAAGAG ACCGTCCTGTTTCTGAATGG 358 60 Nicholson et al., 2017
4 CCAAAGTTTACTCCTATTACCCAGA GCAAATCTTTCTCCAATTACCGTCT 1250 50 Surachetpong et al., 2017
4 GCCCAATGGTTCCCATATCT GCCCAATGGTTCCCATATCT 524 62 Mugimba et al., 2018
5 CCAAATGTTTCTCTTATCTCAGACTC CTTTTTCTCAGTTTACCACTTTATG 1087 57 Surachetpong et al., 2017
5 CAACTCTTAGCCTCCGGAATAC CGTTCTGCACTGGGTTACA 696 62 Mugimba et al., 2018
6 CCAAATTTTACCTCTCGCAT TCAAGCACTTAAAACTGTACC 1027 45 Surachetpong et al., 2017
6 CCCACACGACAGGACATATAG GAGTTGGCTTAGGGTGATAAGA 948 62 Mugimba et al., 2018
7 CTCTCTTTGCATTGCATACCGT GACCAATTATCCCTGCTTTCA 704 57 Surachetpong et al., 2017
7 TCCTTTAGGGATTGGCACTAAC TTCCATCGACTGCTCCTAGA 486 62 Mugimba et al., 2018
8 ACCTCATCTACACTAACATTTCCA TCATCATTACACAAATGGAGTAGCT 637 50 Surachetpong et al., 2017
8 CTTAAGGGCCATCCTGTCATC TGGCTCAAATCCCAACACTAA 476 62 Mugimba et al., 2018
9 TTGGTGATGTCACGATGGATA AGTTCTATCGCCAGCCATGT 351 60 Nicholson et al., 2017
9 ACAAGTCCGATTACTTTTTCCGC TCTTTCTCACGTCCTTAAAGTCA 530 50 Surachetpong et al., 2017
9 GATATCCTCCACATGACCCTTC GTACGTCACTTTGTGCCATTAC 261 62 Mugimba et al., 2018
10 AACCCTACTAACACCAAATATAGCT CTTTCCCTCTGACACCCTGT 450 50 Surachetpong et al., 2017
10 TCCTCTCTGTCCCTTCTGTT CAGGATGAGTGTGGCAGATTAT 276 62 Mugimba et al., 2018

Tabel 1. Gepubliceerde primerparen voor de versterking van cDNA van de TiLV met behulp van eindpunt PCR. De primer instellen in vet getoond werden gebruikt om de representatieve resultaten weergegeven in figuur 3A en 3B te genereren.

6. TiLV kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (qPCR)

  1. Met behulp van een plasmide die met de passende TiLV genomic segment 3 cDNA als een standaard, zoals de pTiLV32, bereiden een gedupliceerde of triplicated 10-fold seriële verdunningsreeks.
  2. Een qPCR master-mix voorbereiden van alle monsters, normen en controles, rekening houdend met die de reacties moeten worden uitgevoerd in tweevoudige of drievoudige met behulp van 0.4 µL van nuclease-gratis water, 0,3 µL voorste primer, 0,3 µL van omgekeerde primer en 5 µL van 2 x SYBR groen DNA-polymerase meester-mix per reactie.
    1. De inleidingen bij een concentratie van 10 µM, en de informatie van de primer en de standaard pTiLV als volgt gebruiken:
      Toekomen primer: TiLV-112F (5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3')
      Omgekeerde primer: TiLV-112R (5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3')
      Standaard pTiLV:10 pg/µL
      Opmerking: Als het totale aantal monsters en besturingselementen 10 is en zal worden uitgevoerd in triplicates, is dit gelijk aan een qPCR master-mix bestaande uit 12 µL nuclease-gratis water, 9 µL voorste primer, 9 µL omgekeerde primer en 150 µL van SYBR Green DNA polymerase meester-mix. Commercieel gekocht 2 x universele SYBR Green DNA bevatten polymerase meester-mixen alle benodigde onderdelen voor de reactie van de qPCR, namelijk de SYBR groene ik kleurstof, hot-start polymerase van DNA Taq, dNTPs, MgCl2 en passieve referentie kleurstoffen. De SYBR groene master mix beschermen tegen licht.
  3. Afzien 6 µL van het qPCR master-mix in qPCR strip buizen of een 96 goed plaat compatibel met de qPCR machine in gebruik.
  4. Voeg 4 µL van cDNA sjabloon, besturingselementen of serieel verdunde TiLV normen in de buizen of putjes van de 96 goed plaat.
  5. Sluit de qPCR buizen of verzegelen van de 96 goed plaat met een compatibel plaat cover voor de qPCR machine in gebruik
    1. Zachtjes flick de buizen van de qPCR te mengen de oplossing en de spin naar beneden de qPCR buizen of 96 goed plaat met behulp van een centrifuge voor het verzamelen van alle van de vloeistof in de bodem van de schepen.
  6. Plaats de buizen of plaat in de real-time thermische cycler.
    1. De qPCR thermocycler voor het uitvoeren van een eerste denaturatie bij 95 ° C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C Program voor 10 s en 60 ° C gedurende 30 s voor primer gloeien en rek, eindigend met een smeltend kromme stap van 65 ° C tot 95 ° C met een toename van 0,5 ° C / 5 s.
    2. Selecteer SYBR als een fluorophore kleurstof, dan onbekende als een soort monster en invoegen van een naam in het naamvak van een steekproef.
    3. Open het deksel van de RT-qPCR-machine en plaats de qPCR strip in de toegewezen putjes en vervolgens zuinig naar de omslag.
  7. De bepaling van de RT-qPCR met de geselecteerde voorwaarden uit te voeren. De machine zal beginnen te lopen nadat het deksel de gewenste temperatuur heeft bereikt. Het verzamelen van de fluorescentie van elk monster na elke stap van de uitbreiding om de voortgang van de reactie.
    Opmerking: De qPCR machine en verwante software automatisch berekenen van alle parameters van de bepaling en de versterking-curven in real-time weergegeven, terwijl de standaard curve en smeltende curve wordt gegenereerd aan het einde van de cyclus van de qPCR.
  8. Uitvoeren van data-analyse en overname door eerste ervoor te zorgen dat het smelten buigt voor elk monster en de standaard hebben één uniforme piek op de verwachte temperatuur voor de amplicon.
    1. Evalueren van de curven van de versterking van de monsters en standaarden en reeks de drempel in een regio waren dat het tarief van de versterking van de cDNAs is hetzelfde in alle monsters. Dit gebeurt normaal gesproken automatisch door de software maar moet zorgvuldig worden gecontroleerd.
    2. Het aantal exemplaren van de TiLV met behulp van de standaard curve te berekenen.

Representative Results

Na het protocol beschreven in sectie 1, werden de stervende rode hybride tilapia weergeven van klinische tekenen van infectie van de TiLV (figuur 1A) euthanized door zwemmen in een hoge concentratie van kruidnagel olie, die als een verdoving fungeert. Gerapporteerde klinische symptomen zijn variabel, maar de voorkomende symptomen verschijnen lethargie, erosie van de huid en verkleuring, exophthalmia, vrijstaand schalen, open wonden/laesie en abnormaal gedrag15,16,33, 35,36, sommige van deze duidelijk kan worden gezien in figuur 1A. De buikwand werd verwijderd om het verzamelen van interne organen zoals de lever, milt of hoofd nier (figuur 1B). Slijm monsters werden ook verzameld in dit stadium door voorzichtig schrapen van de huid van de voorste naar posterior van de vis met een glazen cover of chirurgische blade37.

Figure 1
Figuur 1 . Tilapia dissectie en monster collectie. A. TiLV-geïnfecteerde rode hybride tilapia met leisons van de huid, roodheid rond de mond en operculum, erosie van de huid en hoornvlies dekking. B. Sectioned rode hybride tilapia te maken voor de inzameling van het weefsel van de lever (op het punt van blauwe pijl), milt of hoofd nier organen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Daarna volgde het protocol beschreven in sectie 2 voor Guanidium kaliumthiocyanaat-fenol-Chloroform extractie van totale RNA en RNA kwantificering zoals uiteengezet in sectie 3 werd uitgevoerd voor de beoordeling van de zuiverheid van het monster door berekening van de verhoudingen van de zuiverheid en onderzoek van spectrale profielen (Figuur 2). Figuur 2A geeft een representatief resultaat uit een succesvolle totaal RNA extractie procedure, terwijl figuur 2B aangeeft een slechte voorbereiding van RNA. Nucleic zuren hebben extinctie maxima op 260 terwijl eiwitten hen op 280 hebben nm. De verhouding tussen de metingen op 260 nm en 280 nm geven de zuiverheid van elk monster en ratio van 1,9 tot 2.1 geven zuivere RNA, zoals het geval is voor het monster in figuur 2A. Lagere A260/280 verhoudingsgetallen waargenomen in figuur 2B geven mogelijke eiwit of fenol verontreiniging overgebleven van de RNA extractie procedure. Absorptie bij 230 nm kan het resultaat van verontreiniging van de steekproef en de verhouding van A260/230 nm ook om deze reden wordt berekend. Deze ratio moeten in het bereik voor 2.0-2.2 voor zuivere RNA-preparaten zoals geïllustreerd met een waarde van 2.03 voor het monster in figuur 2A, terwijl figuur 2B een lage A260/230 verhouding van 1,07 heeft en de spectrale profiel een verschuiving in de trog op 230 toont nm naar 240 nm die indicatieve residuele guanidine of fenol in de steekproef is. Voor het monster weergegeven in figuur 2B, kan opnieuw het neerslaan van het RNA als u wilt verwijderen de besmetting verbeteren de zuiverheid van het monster.

Figure 2
Figuur 2 . Spectrofotometrische kwantificering van totale RNA weefsels van de zieke tilapia is onttrokken. A. zuiverheid ratio's en spectrale profielen uit een succesvolle voorbereiding van RNA. B. als A, met uitzondering van de vertegenwoordiger van een arme RNA extractie procedure. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

U wilt opsporen TiLV door RT-PCR, pure monsters zoals weergegeven in figuur 2A waren omgekeerde getranscribeerde (Protocol nr. 4) in cDNA en gebruikt als een sjabloon voor de PCR-test op gedetailleerde in sectie 5 en representatieve resultaten worden weergegeven in figuur 3A. Inleidingen weergegeven in vet in tabel 1 werden gebruikt om een 491 bp fragment van TiLV genomic segment 314te vergroten. De PCR-producten werden gescheiden door gelelektroforese en gekleurd met EtBr voor visualisatie. Figuur 3A toont de resultaten van een tweestaps RT-PCR met 4 cDNA monsters (S1-S4), afgeleid van de lever van zieke tilapia geïsoleerd in Thailand, en in elk monster, een schone enkele band van ongeveer 500 bp kan worden waargenomen en monsters 1-4 zijn dus TiLV positief. Hetzelfde PCR product is verkregen uit het monster van de positieve controle, bestaande uit cDNA van TiLV segment 3 gekloond in een plasmide32 , terwijl de sjabloon oncontroleerbaar (NTC) PCR producten niet opbrengst. De bepaling in figuur 3B werd uitgevoerd met behulp van de dezelfde inleidingen zoals in figuur 3A , maar in een verschillende laboratorium, met behulp van een one-step RT-PCR aanpak en met 5 RNA samples afgeleid van de hoofd nier weefsels van tilapia van oorsprong in de Egyptische aquacultuur 15. het werd bepaald met behulp van deze test van de detectie dat monsters 1, 3 en 5 TiLV positieve monsters 2 en 4 zijn TiLV negatief zijn aangezien geen PCR product werd aangetroffen bij het juiste formaat. De negatieve controles, waaronder twee minus reverse-transcriptase besturingselementen en twee NTC deed niet genereren van PCR producten. Een one-step RT-PCR-test was ook uitgevoerd gericht op tilapia ActinB gen. De grootte van de amplicon van 217 bp is gegenereerd in elk monster (S1-S5) als verwachte38. Deze test diende als een controle van de integriteit van de RNA-monsters evenals waardoor een semi-kwantitatief onderzoek van de positieve monsters van TiLV. Gezien het feit dat de gegenereerde Tilapia ActB product relatief gelijk is, kunnen dan verschillen in hoeveelheid TiLV specifieke PCR product gegenereerd worden geïnterpreteerd als een weerspiegeling van de hoeveelheid TiLV in een bepaald weefsel monster.

Figure 3
Figuur 3 . TiLV RT-PCR. A. cDNA monsters geproduceerd uit lever weefsels van de zieke tilapia, verzameld uit Thailand waren scherm voor TiLV infectie met behulp van specifieke primers voor segment 3 (weergegeven in vet weergegeven in tabel 1) van TiLV met behulp van een 2-step RT-PCR-test. M = markering weergegeven in basenparen; S1-S4 = steekproeven 1-4; C1 = positieve controle met behulp van pTiLV als de sjabloon van een PCR; en C2 = geen sjabloon controle (NTC). B. One-step RT-PCR met behulp van de dezelfde inleidingen in A en monsters van hoofd nier weefsels van de zieke tilapia verzameld van Egypte15. M = markering weergegeven in basenparen; S1-S5 = steekproeven 1-5. Besturingselementen C1-C2 zijn minus reverse-transcriptase besturingselementen en C3-C4 zijn NTC. onderste paneel een one-step RT-PCR gebruikt inleidingen gericht tegen de tilapia ActinB38 (zie tekst voor details) produceren een PCR-product van 217 basenparen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

In tegenstelling tot het eindpunt PCRs vertegenwoordigd in Figuur 3, qPCR-tests die worden beschreven in het Protocol nr. 6, meten de hoeveelheid PCR product na elke PCR cyclus. De versterking van DNA van het doel wordt gedetecteerd met behulp van fluorescerende moleculen die interactie met DNA gegenereerd op basis van elke ronde van reactie. Hier, werd SYBR Green ik kleurstof gebruikt, die intercalates met double-stranded DNA. De fluorescerende signaal wordt gevolgd tijdens de reactie en de intensiteit heeft betrekking op de hoeveelheid product gevormd 39,40,41,42,43. TiLV qPCR tests werden uitgevoerd zoals beschreven in het Protocol nr. 6 in verschillende laboratoria met behulp van verschillende SYBR Green reagentia, qPCR machines en monsters uit verschillende landen. De resulterende amplificatie curven zijn weergegeven in figuur 4A en 4B. Het kan worden waargenomen dat voor elke assay, de cursus van het experiment vier fasen heeft: de lineaire grond fase, vroege exponentiële fase, laat-exponentiële groeifase en de fase van het plateau. De lineaire grond fase treedt op tijdens de vroege cycli waar DNA verdubbeling nog niet worden geïdentificeerd als gevolg van DNA hoeveelheden produceren onvoldoende signaal/achtergrond verhouding. Fluorescentie van de basislijn wordt berekend tijdens deze fase. Daarna begint de target-DNA verdubbelen in concentratie met elke cyclus inducerende het signaal om aantoonbaar boven achtergrond en exponentieel toenemen. De efficiëntie (E) van de versterking van een goed geoptimaliseerde qPCR assay is zeer hoog (in de buurt van 100%) in het begin van de reactie en blijft stabiel tijdens deze vroege exponentiële fase van de versterking en het is op dit punt dat kwantificering wordt uitgevoerd, wanneer reactie efficiëntie is nog steeds stabiel. In latere cycli begint het signaal naar het plateau, en de intensiteit van de fluorescentie is niet meer gecorreleerd aan het nummer van de eerste sjabloon kopiëren, omdat de reactie componenten uitgeput44. Verzadiging kan ook optreden als gevolg van concurrentie uit opnieuw onthardende reacties, de veranderende verhoudingen van de concentratie van de onderdelen, of het aantal eenheden van het enzym DNA substraat moleculen. Eventueel rekening dergelijke parameters voor de verschillen tussen de bochten van de versterking voor de testen die zijn weergegeven in figuur 4A en 4B. De opgenomen besturingselementen deed niet het genereren van deze karakteristieke amplificatie krommen.

Figure 4
Figuur 4 . Versterking percelen te tonen van de accumulatie van product gedurende de looptijd van de real-time PCR-test. A. versterking curven van de TiLV-positieve monsters afkomstig van Thailand, NTC, en positieve plasmide controle met behulp van een SYBR-groen ik 2-step qPCR assay. De grafiek werd gegenereerd door het uitzetten van relatieve fluorescentie (RFU) vs. cyclus nummer. B. versterking curven van TiLV positieve monsters afkomstig uit Egypte, zoals in figuur 3B en een NTC. De versterking curve is de fluorescentie van het signaal van de verslaggever genormaliseerd naar de fluorescentie van de passieve ROX kleurstof opgenomen in de bepaling (Rn) versus cyclus nummer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aan het einde van de thermocycling van de qPCR op de verschillende machines in elk laboratorium, was de gegevens verworven en geanalyseerd. Figuur 5A en 5B Toon representatieve smeltende curven van de tests uitgevoerd in elk laboratorium. Elke qPCR machine werd geprogrammeerd om uit te voeren een smeltende kromme analyse aan het eind. Dit werd bereikt door het stapsgewijs verhogen van de temperatuur en het toezicht op de fluorescentie als een functie van de temperatuur. Wanneer de temperatuur hoog genoeg om te denatureren dsDNA is, is een grote daling van de fluorescentie opgenomen omdat het fluorophore molecuul wordt vrijgegeven. De software van elk instrument afzonderlijk qPCR berekend op basis de onthardende temperatuur (Tm) van de smeltende curve-gegevens door het uitzetten van het negatieve eerste afgeleide vs temperatuur (Figuur 5). Het kan worden gezien in figuur 5A en 5B dat de producten in de verschillende sample sets gevormd hebben uniforme smeltende overgang op de verwachte temperatuur van ongeveer 80 ° C voor de assay. Geen andere pieken bij lagere temperaturen werden waargenomen. Vanwege hun kleine omvang is de T-m voor inleidingsdimeer doorgaans lager dan dat van het doel van de opeenvolging van DNA. Dus maakt dit verschil tussen de Tm'shet gemakkelijk om potentiële inleidingsdimeer- of andere niet-specifieke versterking producten te identificeren. De besturingselementen heeft niet het genereren van smelt bochten zoals TiLV positieve monsters en normen en kunnen worden gezien als een bijna horizontale lijn aan de onderkant van de grafieken in figuur 5A en 5B.

Figure 5
Figuur 5 . Smelt kromme analyse om ervoor te zorgen assay specificiteit en verschillende PCR producten kunnen worden onderscheiden zich door hun smeltende functies. A. smelten kromme analyse van TiLV-positieve monsters afkomstig uit Thailand, negatieve controle en positieve plasmide controle. B. smelten van kromme analyse van TiLV positieve monsters afgeleid van Egypte, pTiLV normen en een NTC. De grafieken in A en B beide de verandering fluorescentie gedeeld door de verandering in de temperatuur vertonen uitgezet tegen de temperatuur tot een duidelijk beeld van de smeltende dynamiek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De meeste qPCR machines voorzien van een software vergemakkelijken verdere evaluatie de qPCR uitvoeren en zal het kwantificeren van de monsters door het genereren van een standaard curve door het automatisch uitzetten van de drempel van de cyclus (Ct) tegen de logaritme van de pTiLV normen sjabloon Kopieer nummer zoals aangegeven in figuur 6A en 6B voor de twee onafhankelijke laboratoria. Kortom, de C-t is de eenheid die wordt gebruikt voor de evaluatie van de resultaten van de qPCR. De C-t -waarde geeft het aantal cycli dat nodig is om een ingestelde drempel fluorescentie signaalniveau te bereiken. Hoe groter het bedrag van het starten van de sjabloon, hoe minder cycli het neemt om een detecteerbare fluorescentie-niveau te bereiken. Monsters met een hoge belasting van de TiLV zal inderdaad lager Ct -waarden dan monsters met een lage belasting van TiLV zoals in vis met een subklinisch infectie. Om te bepalen Ct -waarden, fluorescentie achtergrondniveaus worden eerst in mindering onbewerkte gegevens. Vervolgens selecteert de software gekoppeld aan het qPCR-apparaat automatisch een fluorescentie-drempel door het zoeken van de curven van de gegevens voor elk monster en de integratie van een Ct vertegenwoordigen waar het monster de drempel overschreden. Dit gebeurt apart voor elk assay en elke drempel moet zorgvuldig worden beoordeeld, ervoor te zorgen dat de drempel is vastgesteld in de logaritmische deel van de curven van de versterking en op een plaats waar alle krommen parallel zijn. Dus, de specifieke Ct verworven is een relatieve waarde en is ten opzichte van de eerste sjabloon kopiëren nummer45, maar het is ook specifiek voor de qPCR machine en gebruikte reagentia, de efficiëntie van de PCR versterking en de gevoeligheid van detectie. Deze parameters dragen bij aan de verschillen waargenomen met behulp van de dezelfde bepaling in Figuur 6.

Van de standaard curven in Figuur 6, regressieanalyses, met inbegrip van de berekening van de standaard curve hellingen (m) en onderschept, versterking efficiëntie (100 x (10-1/m -1))46 en de lineariteit van de reactie werden uitgevoerd. Standaard curve analyses werden ook gebruikt om te bevestigen gevoeligheid (limiet van detectie), de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid van de test. Theoretisch, de hoeveelheid DNA wordt verdubbeld met elke PCR cyclus, wat betekent dat de efficiëntie (E) gelijk aan 100 is %. Echter in de praktijk een dergelijke ideale efficiëntie is zelden kan bereiken als gevolg van sub-optimale PCR voorwaarden zoals remming van de polymerase van DNA, contaminanten, teveel cDNA en pipetteren fouten47. Typisch, versterking E variëren van 90-110% voor goed testen, in figuur 6A een rendement van 94,5% werd berekend aan de hand van 8 serieel verdunde pTiLV monsters, terwijl de efficiëntie van de bepaling in de analyse weergegeven in figuur 6B gebruik van 7 serieel verdunde pTiLV monsters was 101,2%. Een rendement van meer dan 100% is meestal te wijten aan de aanwezigheid van PCR-remmers in de bepaling. Lineaire regressie-analyse van de standaard plot voorziet ook in de berekening van het aantal TiLV exemplaren in elk monster41,42,45, zoals kan worden waargenomen voor de drie TiLV monsters weergegeven in rood in de figuur 6B die strookt met de resultaten voor monsters S1, S3 en S5 weergegeven in figuur 3B.

Figure 6
Figuur 6 . RT-qPCR standaard curven. PCR in real time van 10-fold seriële verdunningen van het pTiLV, de standaard in beide laboratoria wordt gebruikt. A. 8 serieel verdunde pTiLV monsters werden getest, alle bekende concentratie en gecorreleerd aan het aantal TiLV kopieën / reactie. De standaard curve werd gegenereerd door het uitzetten van log kopie nummer vs. cyclus drempel (Ct). De helling =-3.462, R2 = 0.9992 en de efficiëntie is 94.47%. B. zoals in A, behalve 7 serieel verdunde pTiLV monsters (groen) werden getest en de grafiek toont de drempel-cyclus op de y-as en het exemplaaraantal van TiLV (Quantity) op de x-as. Het y-snijpunt = 32.327, helling =-3.292, R2 = 0,98 en de efficiëntie is 101,2%. Voor beide normen krommen worden in A en B, de helling, het y-snijpunt en de waarden van de correlatiecoëfficiënt (R2) gebruikt om de prestaties van de test begrijpen. Bovenal moet R2 waarde dicht bij 1 omdat het een maatregel van de lineariteit van de standaard curve. De helling is gebruikt om te meten van de PCR-efficiëntie waarin 100% rendement komt met een helling van-3.32 overeen, zie hoofdtekst voor de vergelijking en de verdere details. De reactie van een goede qPCR heeft over het algemeen een rendement tussen 90-110% correleren aan een helling van tussen-3.58 en-3.10. De standaard curve wordt gebruikt voor absolute kwantificering van onbekende TiLV positieve monsters en bepaalt het exacte aantal TiLV kopieën / reactie, zoals het geval voor de drie TiLV positieve monsters rood in B.

Discussion

TiLV werd voor het eerst gemeld in 2014 in Israël14 , en sindsdien is het aangewezen in meerdere landen, waaronder Egypte, Colombia, India, Maleisië, Oeganda, Tanzania en Thailand15,16,18, 35 , 48. Mondiaal bewustzijn, met name, tilapia producerende landen heeft geplaatst meer aandacht over het virus en diverse beperkingen en controlemaatregelen van overheidsinstanties zijn doorgevoerd probeert te voorkomen dat de verspreiding van TiLV. Hier, is een gedetailleerd protocol voor de detectie van de TiLV in tilapia weefsel, die betrekking hebben op sample collectie, isolatie van RNA, cDNA synthese, PCR en qPCR testen uiteengezet. Er zijn diverse aspecten aan deze methoden die specifieke discussie rechtvaardigen. TiLV is geconstateerd in vis spanning een verschillende maten9,12,14,15,49 en soorten tilapia tot nu toe, met inbegrip van gekweekte hybride tilapia (O. niloticus x O. aureus)11,14, Nijl tilapia (O. niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 en rood tilapia (Labeo sp.)16,33,48,51, zoals alsook in wild Nile tilapia9,12, zwart Tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, O. aureus en T. simonis intermedia14 en zeer onlangs TiLV werd geïdentificeerd in wild carp (Barbonymus schwanenfeldii)52. Weefselmonsters van inwendige organen (gill, milt, lever, hart, hoofd nier) of slijm37 kunnen worden verkregen van zowel de gezonde als de stervende tilapia ongeacht leeftijd, grootte of soorten en verwerkt voor RNA isolatie. Het totale RNA extractie protocol beschreven gebruikt hier een monofasische oplossing van kaliumthiocyanaat van fenol en guanidinium, die een chaotropic denatureren agent is. De weefsels zijn direct gehomogeniseerd in deze oplossing, gevolgd door de toevoeging van chloroform en centrifugeren om fase-separatie zichtbaar waarin een duidelijke RNA met bovenste waterfase, een interfase en een lagere organische fase wordt gegenereerd. RNA is geïsoleerd van de waterige fase door isopropanol en neerslag, gevolgd door het wassen van de herstelde RNA om zich te ontdoen van verontreinigingen. Isolatie van RNA door deze methode werd ontwikkeld door Piotr Chomczynski en Nicoletta Sacchi en was bedoeld als guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie53,54. Dit soort reagens gebruikt voor RNA extractie kan commercieel worden gekocht of worden gemaakt in het laboratorium (Zie de Tabel van materialen voor meer informatie). Dit protocol duurt iets langer dan kolom gebaseerde methoden zoals de zuivering van silica gebaseerde, maar in het algemeen, het is rendabeler en levert meer RNA.

In dit protocol, kwantificeren van RNA met behulp van de A260 waarden werd geschetst waarbij spectrofotometrie waarden RNA kwaliteit aangeven kunnen (A260/A280 = 1.9-2.1). Terwijl deze methode een goede indicatie van de zuiverheid van de steekproef geeft, kan niet het absoluut informeren over de kwaliteit van de uitgepakte RNA. Controleer goed of het RNA intact of gedeeltelijk aangetaste is, kunnen monsters scheiding door agarose gelelektroforese waarin 18S smeren van de EtBr gekleurd en 28 rRNA banden geven de aantasting van het RNA. Verdere verificatie van de kwaliteit van het RNA kan zijn met het gebruik van een lab-on-a-chip-instrument. Daarnaast is het ook belangrijk om te verteren de gezuiverde RNA met DNase ik verwijderen besmetten host genomic DNA, die afhankelijk van de downstream toepassingen tot onjuiste resultaten leiden kan. Als gastheer gDNA is nog steeds verontreiniging van het RNA-monster voor een groot deel, een extra DNaseI behandeling kan ook worden uitgevoerd aan het einde van de RNA extractie procedure (Zie Tabel van materialen).

Complementaire DNA-herstelsynthese kan grote invloed hebben op de algemene resultaten van de qPCR en is een aspect van de methode die variatie kan invoeren. Het protocol van de cDNA bepleit hier bestaat uit een enkelvoudige component set-up met behulp van oligo (dT) en dus alleen transcribeert mRNAs met polyA staarten. Het staat de gebruikerscontrole van precies welke onderdelen te gebruiken in de reactie van de omgekeerde transcriptie en deze modus van cDNA synthese een succes voor TiLV detectie32 gebleken is. Een alternatief voor deze set-up is een commercieel gekocht meester-mix bevat alle onderdelen die nodig zijn voor de reactie van omgekeerde transcriptie en is zeer snel en eenvoudig zonder het gebruikelijke scriptingregel, pipetting en multi temperatuur protocol. Dit is voordelig omdat het behandeling minimaliseert en bevordert de uniformiteit in verschillende alle steekproeven. Deze master-mixen bevatten vaak zowel oligo(dT) als willekeurige inleidingen voor verschillende RNA-sjablonen te maken, en genereren van representatieve cDNA kopieën van sequenties van de gehele lengte van de RNAs in een populatie (virale en tilapia host mRNA) en in theorie, elke gewenste soort RNA kan vervolgens worden gemeten door conventionele PCR of qPCR uit dergelijke een monster. Deze veelzijdigheid is het belangrijkste voordeel van een 2-step RT-PCR benadering; Het biedt een lange zwembad dat kan worden gebruikt voor vele verschillende experimenten. In de resultaten een one-step RT-PCR aanpak is vertegenwoordigd waarin reeks specifieke primers (tabel 1) werden gebruikt en de RT en PCR werden uitgevoerd in één buis (Zie materiële lijst). In het algemeen, reeks specifieke primers voorzien in een hogere efficiëntie van de RT van het specifieke doel RNA dan het gebruik van willekeurige priming, maar de specifieke doelstelling RNA is de enige die kunnen worden gekwantificeerd in dergelijke een cDNA monster die het enige doel van bepaalde laboratoria wellicht (Zie Tabel van materialen voor cDNA synthese product suggesties).

Terwijl conventionele rechts-PCR lijkt te worden veelgebruikte tot nu toe in de TiLV diagnose9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR heeft aangetoond dat een meer krachtige tool voor de detectie en kwantificering van kleine hoeveelheden TiLV in vis weefsels of slijm32,37. In het algemeen, wordt qPCR veel gebruikt in de diagnostische laboratoria klinische virologie vanwege haar hoge gevoeligheid, specificiteit, goede reproduceerbaarheid, breed dynamisch bereik en snelheid21. Terwijl qPCR kan in eerste instantie duurder te implementeren dan conventionele rechts-PCR, biedt het veel belangrijke voordelen ten opzichte van conventionele PCR; het heeft een snellere turn-around tijd uit monster tot resultaten en op doet niet vergen ieder post-PCR de stappen. Dit laatste punt betekent dat er minimaal risico voor besmetting van het laboratorium en het gemakkelijker aangepast aan hoge-doorvoer situaties zoals bij een uitbraak worden kan. Bovendien is het inherent gevoeliger dan conventionele rechts-PCR, die van vitaal belang voor het detecteren van lage virale belastingen in21van de infecties subklinisch. Dit zou vereisen een geneste PCR aanpak vereisen van omgekeerde transcriptie, twee verdere PCR reacties en vervolgens analyse door agarose gel elektroforese. Deze vele stappen nemen veel tijd en verhogen de kans op fouten of besmetting. Niettemin, als gevolg van de hoge gevoeligheid, RT-qPCR vraagt nauwgezette proefopzet en een grondige kennis van kwantificering technieken voor het genereren van precieze resultaten56,57.

De DNA-bindende fluorophore, SYBR Green ik is aangetoond in dit protocol. Het is een dsDNA aspecifieke DNA binden kleurstof en dus de specificiteit van de bepaling ligt geheel in de reeks inleidingen, die valse positieven58kan genereren. Dus, terwijl de dsDNA smelten kromme analyse uitgevoerd aan het einde van elke PCR een bijzonder belangrijk onderdeel van de PCR reactie is omdat het bevestigt dat slechts één PCR amplicon van de juiste Tm wordt geproduceerd (dit moet ook worden bereikt door gel elektroforese wanneer nieuwe testen worden uitgevoerd). De T-m van een fragment van DNA is afhankelijk van een aantal functies zoals lengte, GC samenstelling, reeks strand complementariteit, concentratie zo goed als op buffer onderdelen en de versterkers van de PCR. De smeltende analyses van de curve in het representatieve resultaten getoond van twee laboratoria deed niet onthullen de aanwezigheid van inleidingsdimeer of andere ongewenste PCR producten maar indien dit wordt waargenomen met andere monsters en/of experimentele opstellingen, dan zou de bepaling moeten opnieuw geoptimaliseerd. Meer geavanceerde qPCR-technologieën vereisen geen dergelijke smeltende kromme stap en inderdaad, sinds deze methoden papier werd geschreven, een TaqMan op basis TiLV RT-qPCR ontwikkeld met behulp van twee inleidingen en een sonde, waardoor het zeer specifieke TiLV34.

Ongetwijfeld, de inleidingen ontworpen voor RT-qPCR testen zijn fundamenteel voor het succes van de bepaling en de inleidingen hier waren ontworpen op basis van de openbaar beschikbare TiLV genomic gegevens op de tijd-32. RNA virussen zijn bekende hoge mutatie tarieven vertonen echter en mogelijke stammen zal ontsnappen de huidige diagnostische tests, zoals voor ISAV59werd waargenomen. Het zal altijd moeilijk zijn voor dergelijke typen van het virus voor het genereren van een universele pan-TiLV-RT-qPCR assay en deze gehaltebepalingen zal alleen worden voortdurend verbeterd als meer TiLV genomic gegevens van verregaande locaties en de termijnen beschikbaar komen.

Tot slot is het essentieel te starten dubbele of indien mogelijk, drievoudige reacties in zowel intra en inter qPCR testen. Als de Ct -waarden zeer hoog zijn, dan is het gebruik van replicaat-organismen is vooral belangrijk om te constateren dat de PCR reactie betrouwbare en reproduceerbare. In het algemeen, als gegevens uit repliceren reacties varieert meer dan 0.5 cycli, de reacties moeten worden herhaald en als de C-t -waarden variëren consequent > 0,5 cycli in repliceert, de bepaling moet opnieuw worden geoptimaliseerd. Het gebruik van een geïntegreerde qPCR pipetting robot helpt enorm met dit probleem, maar het is een luxe-tool. Als met een experiment zijn de opneming adequate en passende controles van het grootste belang aan de ontwikkeling van robuuste moleculaire tests, met name in de diagnostische laboratoria waar deze gehaltebepalingen moeten worden geaccrediteerd. Besturingselementen moeten positieve (positief TiLV monster, TiLV plasmide standaard) en negatieve controles (NTC en -RT) monsters evenals de detectie van endogene tilapia huishouding genen bevatten. Dergelijke controles niet onderschat mag worden en moeten worden opgenomen in elke assay goed inzicht hebben in de kwaliteit van elke stap van de test en de resultaten correct te interpreteren.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij zijn dankbaar aan het Instituut voor veterinaire Bacteriologie, de Vetsuisse faculteit, de Universiteit van Bern voor hun steun. Dit werk werd gefinancierd door de Commissie voor de academische promotie van vroege carrière onderzoekers en gender gelijkheid aan de faculteit Vetsuisse, Universiteit van Bern met 120% model financiering toegekend aan PN. WS en PR worden ondersteund door Center for Advanced Studies voor landbouw en voeding, Institute for Advanced Studies, Universiteit van de Kasetsart, Bangkok, Thailand onder de bevordering van het hogeronderwijs onderzoek en nationale onderzoek Universiteit Project van Thailand, Office van het hoger onderwijs Commissie, ministerie van onderwijs, Thailand. We zouden graag bedanken Dr. Kwanrawee Sirikanchana voor haar verhaal en Piyawatchara Sikarin voor het bewerken van de video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue collection Step 1
Tricaine methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 An alternative to clove oil. 
Step 1.1
RNAlater stabilization solution Thermo Fisher Scientific   AM7020 For storing tissues if they cannot be processed immediately
Step 1.3
RNA extraction Step 2
TRIreagent Sigma-Aldrich  Step 2.1
TRIzol Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) 15596026 Step 2.1
GENEzol Geneaid GZR100 Step 2.1
Trisure Bioline BIO-38032 Step 2.1
Homemade solution  -  - 94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate
30.45 g/L  (400 mM) ammonium thiocyanate
8.20 g/L  (100 mM) sodium acetate
380 mL/L  (38 % v/v) phenol
50 mL/L (5 % v/v) glycerol
1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0
Store up to 2 years at 4oC
Step 2.1
MagNA Lyser Green Beads Roche 3358941001 An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below
Step 2.2
Lysing Matrix D, 2 mL Tube MP BIOMEDICALS 116913050
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Step 2.3
Chloroform RCI Labscan AR1027E-G2.5L Step 2.3
1-Bromo-3-chloropropane Sigma-Aldrich B9673 A less toxic alternative to chloroform
Step 2.3
Isopropanol (GC) ≥ 99.8 % Sigma-Aldrich 59300 Step 2.6
Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) Merck KGaA (EMSURE) 1.09634.2500 Step 2.6
Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767) Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific) R0551 Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation
optional
Ethanol (purity (GC) ≥ 99.9 % Sigma-Aldrich (EMD Millipore) 1.00983 Step 2.9
Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) Merck (EMSURE) 1.00983.2500 Step 2.9
Nuclease-free water Promega P1193 Step 2.13
Nuclease-free water Multicell 809-115-CL Step 2.13
Ambion TURBO DNA-free kit  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) AM1907 Can be performed at the end of the RNA extraction protocol
optional
cDNA synthesis Step 4
Viva cDNA Synthesis Kit Vivantis cDSK01 Step 4.1 & 4.3
ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover Toyobo A1172K An alternative option 
see discussion
ReverTra Ace qPCR RT Kit Toyobo FSQ-101 An alternative option 
see discussion
AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase  Agilent Technologies 600107 An alternative option 
PCR Step 5
DNA polymerase systems: Step 5.2
   - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)  14001012a Step 5.2
   - GoTaq Mastermix Promega M7122 Step 5.2
Separate PCR mixture components: Step 5.2
10mM dNTP Mix Vivantis NP2409 Step 5.2
25mM MgCl2 Thermo Fisher Scientific R0971 Step 5.2
10X Taq Buffer with KCl Thermo Fisher Scientific 00348114 Step 5.2
Taq DNA polymerase Vivantis PL1202 Step 5.2
   - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq Thermo Fisher Scientific  AB1454 One step RT-PCR exemplified in Figure 3B
Gel electrophoresis: For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4
Ethidium Bromide solution (10 mg/mL) Thermo Fisher Scientific 17898 Step 5.5
Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer: Step 5.5
   - Tris Vivantis PR0612-1KG Step 5.5
   - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur) Merck KGaA (EMSURE) 1.00063.2500 Step 5.5
   - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BIO-RAD 161-0729 Step 5.5
Agarose Vivantis PC0701-100G Step 5.5
DNA ladders and markers Vivantis NL1405 Step 5.5
DNA gel loading dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611 Step 5.5
qPCR Step 6
PowerUP SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) A25779 Exemplified in Figures 4-6B
Step 6.2
iTaq Universal SYBR Green Supermix BIO-RAD 1725120 Exemplified in the video and in Figures 4-6A
Step 6.2
Equipment 
Dounce tissue grinder pestle Sigma-Aldrich P1110 Protocol 2
MagNA Lyser Instrument Roche 3358976001 An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above
Step 2.2
FastPrep-24 5G Homogenizer MP BIOMEDICALS 116005500
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf Eppendorf 5427R Protocol 2
Step 2.4, 2.7 & 2.10
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf Eppendorf 5418R
Heat box Labnet AccuBlock Digital Dry Bath Protocol 2
Step 2.13
Microvolume spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) Nanodrop 2000 Protocol 3
Step 3.1 - 3.4
PCR machine BIO-RAD T100 Thermal Cycler Protocol 5
Step 5.4
Power supply BIO-RAD PowerPac HC Protocol 5
Step 5.5
Horizontal gel electrophoresis BIO-RAD Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu Protocol 5
Step 5.5
Mini microcentrifuge Corning LSE 6766 Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 & 6
Step 6.5.1
Microcentrifuge LioFuge LM-60 Step 6.5.1
qPCR machine and software Thermo Fisher Scientific 7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0 Protocol 6
Step 6.6-6.8
qPCR machine and software BIO-RAD CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software
General Materials 
Mayo scissors Step 1.1-1.2
Forceps Step 1.1-1.2
Pipette Rainin Pipette-Lite XLS
Aerosol-barrier pipette tips Sigma-Aldrich Z333328, Z333336, Z333344
Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAO. The State of World Fisheries and Aquaculture, 2014. Opportunities and Challenges. , Rome. (2014).
  2. FAO. The State of World Fisheries and Aquaculture, 2016. Contributing to Food Security and Nutrition for all. , Rome. (2016).
  3. WorldBank. FISH TO 2030: Prospects for Fisheries and Aquaculture. Agriculture and Environmental Services Discussion Paper 03. , (2013).
  4. Wing-Keong, N., Nicholas, R. A review of the nutrition and feeding management of farmed tilapia throughout the culture cycle. Reviews in Aquaculture. 5 (4), 220-254 (2013).
  5. Cleasby, N., et al. The socio-economic context for improving food security through land based aquaculture in Solomon Islands: A peri-urban case study. Marine Policy. 45, 89-97 (2014).
  6. Ponzoni Raul, W., et al. Genetic improvement of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) with special reference to the work conducted by the WorldFish Center with the GIFT strain. Reviews in Aquaculture. 3 (1), 27-41 (2011).
  7. Hounmanou, Y. M. G., et al. Tilapia lake virus threatens tilapiines farming and food security: Socio-economic challenges and preventive measures in Sub-Saharan Africa. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 493, 123-129 (2018).
  8. OIE. Tilapia Lake Virus (TiLV) - a novel orthomyxo-like virus. OIE technical disease cards. , http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Internationa_Standard_Setting/docs/pdf/A_TiLV_disease_card.pdf (2018).
  9. Mugimba, K. K., et al. Detection of tilapia lake virus (TiLV) infection by PCR in farmed and wild Nile tilapia (Oreochromis niloticus) from Lake Victoria. Journal of Fish Diseases. , (2018).
  10. Koesharyani, I., Gardenia, L., Widowati, Z., Khumaira,, Rustianti, D. D. Studi kasus infeksi tilapia lake virus (tilv) pada ikan nila (Oreochromis niloticus). Jurnal Riset Akuakultur. 13 (1), 85-92 (2018).
  11. OIE. Tilapia lake virus disease (TiLV), Chinese Taipei. Immediate Notification. , http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?reportid=24033 (2017).
  12. OIE. Tilapia Lake Virus Disease (TiLV), Peru. Immediate Notification. , (2018).
  13. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), e00431-e00416 (2016).
  14. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  15. Nicholson, P., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Egyptian fish farms experiencing high mortalities in 2015. Journal of Fish Diseases. 40 (12), 1925-1928 (2017).
  16. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  17. Tattiyapong, P., Dachavichitlead, W., Surachetpong, W. Experimental infection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and red tilapia (Oreochromis spp.). Veterinary Microbiology. 207, 170-177 (2017).
  18. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  19. Thangaraj, R. S., et al. Derivation of two tilapia (Oreochromis niloticus) cell lines for efficient propagation of Tilapia Lake Virus (TiLV). Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 492, 206-214 (2018).
  20. Hanson, L. A., Rudis, M. R., Vasquez-Lee, M., Montgomery, R. D. A broadly applicable method to characterize large DNA viruses and adenoviruses based on the DNA polymerase gene. Virology Journal. 3, 28-28 (2006).
  21. Josko, D. Molecular virology in the clinical laboratory. Clinical Laboratory Science. 23 (4), 231-236 (2010).
  22. Munir, K., Kibenge, F. S. Detection of infectious salmon anaemia virus by real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 117 (1), 37-47 (2004).
  23. Snow, M., et al. Developement, application and validation of a Taqman real-time RT-PCR assay for the detection of infectious salmon anaemia virus (ISAV) in Atlantic salmon (Salmo salar). Developments in Biologicals. 126, discussion 325-136 133-145 (2006).
  24. Matejusova, I., McKay, P., McBeath, A. J., Collet, B., Snow, M. Development of a sensitive and controlled real-time RT-PCR assay for viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) in marine salmonid aquaculture. Diseases of Aquatic Organisms. 80 (2), 137-144 (2008).
  25. Garver, K. A., et al. Development and validation of a reverse transcription quantitative PCR for universal detection of viral hemorrhagic septicemia virus. Diseases of Aquatic Organisms. 95 (2), 97-112 (2011).
  26. Dalla Valle, L., et al. Development of a sensitive and quantitative diagnostic assay for fish nervous necrosis virus based on two-target real-time PCR. Veterinary Microbiology. 110 (3-4), 167-179 (2005).
  27. Hodneland, K., Garcia, R., Balbuena, J. A., Zarza, C., Fouz, B. Real-time RT-PCR detection of betanodavirus in naturally and experimentally infected fish from Spain. Journal of Fish Diseases. 34 (3), 189-202 (2011).
  28. Hodneland, K., Endresen, C. Sensitive and specific detection of Salmonid alphavirus using real-time PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 131 (2), 184-192 (2006).
  29. Wang, X. W., Ao, J. Q., Li, Q. G., Chen, X. H. Quantitative detection of a marine fish iridovirus isolated from large yellow croaker, Pseudosciaena crocea, using a molecular beacon. Journal of Virological Methods. 133 (1), 76-81 (2006).
  30. van Beurden, S. J., et al. Development and validation of a real-time PCR assay for the detection of anguillid herpesvirus 1. Journal of Fish Diseases. 39 (1), 95-104 (2016).
  31. Ciulli, S., et al. Development and application of a real-time PCR assay for the detection and quantitation of lymphocystis disease virus. Journal of Virological Methods. 213, 164-173 (2015).
  32. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  33. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 476, 111-118 (2017).
  34. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 497, 184-188 (2018).
  35. Behera, B. K., et al. Emergence of Tilapia Lake Virus associated with mortalities of farmed Nile Tilapia Oreochromis niloticus (Linnaeus 1758) in India. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 484, 168-174 (2018).
  36. Ferguson, H. W., et al. Syncytial hepatitis of farmed tilapia, Oreochromis niloticus (L.): a case report. Journal of Fish Diseases. 37 (6), 583-589 (2014).
  37. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 486, 75-80 (2018).
  38. Yang, C. G., et al. Evaluation of reference genes for quantitative real-time RT-PCR analysis of gene expression in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Gene. 527 (1), 183-192 (2013).
  39. Bustin, S. A. Real-time, fluorescence-based quantitative PCR: a snapshot of current procedures and preferences. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (4), 493-498 (2005).
  40. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
  41. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 95-125 (2006).
  42. Mackay, I. M., Arden, K. E., Nitsche, A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research. 30 (6), 1292-1305 (2002).
  43. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  44. Bustin, S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 25 (2), 169-193 (2000).
  45. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Research. 6 (10), 986-994 (1996).
  46. Rutledge, R. G., Côté, C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves. Nucleic Acids Research. 31 (16), e93-e93 (2003).
  47. Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).
  48. Amal, M. N. A., et al. A case of natural co-infection of Tilapia Lake Virus and Aeromonas veronii in a Malaysian red hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. mossambicus) farm experiencing high mortality. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 485, 12-16 (2018).
  49. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 473, 430-432 (2017).
  50. OIE. Tilapia Lake Virus disease (TiLV), Philippines. Immediate Notification. , (2017).
  51. OIE. Tilapia lake virus disease (TiLV), Malaysia. Immediate Notification. , https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?page_refer=MapFullEventReport&reportid=24809 (2017).
  52. Abdullah, A., et al. First detection of tilapia lake virus (TiLV) in wild river carp (Barbonymus schwanenfeldii) at Timah Tasoh Lake, Malaysia. Journal of Fish Diseases. 41 (9), 1459-1462 (2018).
  53. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  54. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  55. Del-Pozo, J., et al. Syncytial Hepatitis of Tilapia ( Oreochromis niloticus L.) is Associated With Orthomyxovirus-Like Virions in Hepatocytes. Veterinary Pathology. 54 (1), 164-170 (2017).
  56. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  57. Purcell, M. K., Getchell, R. G., McClure, C. A., Garver, K. A. Quantitative polymerase chain reaction (PCR) for detection of aquatic animal pathogens in a diagnostic laboratory setting. Journal of Aquatic Animal Health. 23 (3), 148-161 (2011).
  58. Simpson, D. A., Feeney, S., Boyle, C., Stitt, A. W. Retinal VEGF mRNA measured by SYBR green I fluorescence: A versatile approach to quantitative PCR. Molecular Vision. 6, 178-183 (2000).
  59. Kibenge, M. J., et al. Discovery of variant infectious salmon anaemia virus (ISAV) of European genotype in British Columbia, Canada. Virology Journal. 13, 3 (2016).

Tags

Milieuwetenschappen kwestie 141 Tilapia lake virus tilapia diagnose RT-PCR RT-qPCR orthomyxo-achtig virus
Detectie van Tilapia Lake Virus met behulp van conventionele rechts-PCR en SYBR groene RT-qPCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nicholson, P., Rawiwan, P.,… More

Nicholson, P., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR. J. Vis. Exp. (141), e58596, doi:10.3791/58596 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter