Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Upptäckt av Tilapia sjön Virus använder konventionella RT-PCR och SYBR Green RT-qPCR

Published: November 10, 2018 doi: 10.3791/58596
Automatic Translation
1, 2, 2
1Institute of Veterinary Bacteriology Vetsuisse Faculty, University of Bern, 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology and Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Kasetsart University Institute for Advanced Studies, Kasetsart University

Summary

Detta protokoll diagnoser Tilapia sjön Virus (TiLV) i tilapia vävnader med hjälp av RT-PCR-metoder. Hela metoden beskrivs från vävnad dissektion till total RNA-extraktion, följt av cDNA syntes och upptäckt av TiLV av antingen konventionell PCR eller kvantitativ PCR med dsDNA bindande ett fluorescerande bindande färgämne.

Abstract

Syftet med denna metod är att underlätta den snabb, känsligt och specifikt påvisande av Tilapia sjön Virus (TiLV) i tilapia vävnader. Detta protokoll kan användas som en del av övervakningsprogram, åtgärder för biosäkerhet och i TiLV grundläggande forskningslaboratorier. Den gyllene standarden för virus diagnostik oftast virusisolering följt av kompletterande tekniker såsom omvänd-Transkription polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) för ytterligare kontroll. Detta kan vara besvärligt och tidskrävande och kräver normalt vävnadsprover kraftigt infekterade med virus. Användning av RT-kvantitativa (q) PCR för detektion av virus är fördelaktigt på grund av dess kvantitativa natur, hög känslighet, specificitet, skalbarhet och dess snabb tid till leda. Här, baserat hela metoden för PCR tillvägagångssätt för TiLV upptäckt är beskrivna, från tilapia orgel snittning, totala ribonukleinsyra (RNA) extraktion med hjälp av en guanidium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform lösning, RNA kvantifiering, följt av en två-stegs PCR protokollet medför, kompletterande deoxiribonukleinsyra (cDNA) syntes och upptäckt av TiLV av antingen konventionell PCR eller kvantitativa identifiering via qPCR med SYBR green jag färga. Konventionella PCR kräver post-PCR steg och helt enkelt informera om förekomsten av viruset. Den senare metoden möjliggör absolut kvantifiering av TiLV ner till så lite som 2 kopior och därmed är exceptionellt bra för TiLV diagnos i sub kliniska fall. En detaljerad beskrivning av de två PCR-metoder, representativa resultat från två laboratorier och en ingående diskussion av de kritiska parametrarna av båda har inkluderats för att forskare och diagnostiker hitta sin mest lämplig och tillämpliga metod för TiLV upptäckt.

Introduction

Den globala capita fiskförsörjningen nått ett nytt rekord på 20 kg i 2014 och detta var på grund av kraftig tillväxt inom vattenbruket. Vattenbruket är fortfarande en av de snabbast växande djur mat producerande sektorerna i hela världen och är den enda animaliska livsmedelsproducerande sektor som växer snabbare än den mänskliga befolkning1. Artikel om abborrartade cichilds utgör den näst viktigaste sötvattenfisk odlad över hela världen med en total global produktion 6,4 miljoner ton (MT) och ett uppskattat värde på 9,8 miljarder US-dollar i 20152. Topp tio producenterna av tilapia är Kina (1,78 MT), Indonesien (1.12 MT) och Egypten (0.88 MT), följt av Bangladesh, Vietnam, Filippinerna, Brasilien, Thailand, Colombia och Uganda2. Det förväntas att globala tilapia produktion kommer att vara cirka 7,3 MT av 20303. Tilapia har blivit sådan en viktig global mat källa inte bara eftersom de är en billig källa till protein4 utan också eftersom de är lätta att odla i kapacitet under ett brett utbud av vatten och klimat förhållanden5,6. Bara några årtionden sedan trodde man att det fanns några kommersiellt betydande sjukdomar hotar tilapia jordbruk men detta är inte längre sant. En framväxande virussjukdom som kallas tilapia sjön virus sjukdom (TiLVD) är den första någonsin kritiska sjukdomsepidemi Funna i tilapia och hela branschen är i riskzonen. Denna sjukdom har allvarliga socioekonomiska konsekvenser och är ett direkt hot om tryggad livsmedelsförsörjning för miljontals människor i Afrika7, Asien och Sydamerika. I början av 2018 rapporterade Världsorganisationen för djurens hälsa (OIE) att det etiologiska medlet av denna sjukdom, TiLV, officiellt hade upptäckts på tre kontinenter som omfattar åtta länder8 och sedan denna patogen informationskort var Uppdaterad det har fler rapporter om TiLV i Tanzania, Uganda9, Indonesien10, Taiwan11 och Peru12. TiLV är en roman enkelsträngat RNA-virus som beskrivs för att vara en orthomyxo-liknande virus eftersom det innehåller en mängd egenskaper som påminner om andra orthomyoxoviruses såsom influensa eller infektiös laxanemi (ISA)-virus13. Det identifierades först i efterdyningarna av massiva förluster av vild och odlad tilapia i sjön Galileen, Israel14. Därefter, avses liknande sjukdomsutbrott som sommaren dödlighet och den en månad dödlighet syndrom som förknippas med TiLV infektion rapporterades i Nilen tilapia (Oreochromis niloticus) i Egypten15 och Nilen och röda hybrid tilapia (Oreochromis spp.) i Thailand16, respektive. Detektion av vattenlevande djur virus är historiskt utförs av tillväxt och isolering av virus i cellodling. Olika cellinjer har testats för förökning och isolering av TiLV inklusive, SW-11 celler härstammar från ormhuvudsfisk fisk (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB och TmB med ursprung från Oreochromis mossambicus18, och OnlB och OnlL med ursprung från Nile tilapia (O. niloticus)19. Även virus kultur har fördelen att det ger material för ytterligare experiment, har den nackdelen att det krävs minst 4-7 dagar att observera bildandet av cytopatisk effekt (CPE) och avgörande, olika piscine virus, som är mer plats till replikera kan spridas och producera liknande CPE.

Under de senaste decennierna, har det skett en övergång från traditionella, ofta tidskrävande diagnostiska metoder såsom cellkultur, serologi och antigen detection och utbyte med snabbare och känsligare nukleinsyra baserat identifiering tester20, 21. Detta framgår av det faktum att många qPCR analyser har utvecklats som viktiga diagnostiska metoder för en mängd olika virussjukdomar hos vattenlevande djur, såsom för ISA-virus22,23, viral hemorragisk septikemi virus (VHSV)24 ,25, betanodavirus26,27 laxfisk alphavirus28, fisk iridovirus29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30, och Lymphocystis sjukdom virus (LCDV)31 . Robusta metoder för diagnos och patogen övervakning är brådskande behövs för att minska spridningen av TiLV. Sådana metoder bör möjliggöra tidig upptäckt av infektion innan kliniska symtom utvecklas och detektion av låg virus laster. Hittills har olika PCR-protokoll inklusive RT-PCR-14,32, har kapslade RT-PCR18, semi kapslade RT-PCR33och RT-qPCR32,34 utvecklats för detektion av TiLV i fiskvävnad. En jämförelse av RT-qPCR och virus isolering i mottagliga cellinjer för TiLV upptäckt visade att RT-qPCR var 1000 gånger känsligare än den virus isolering32. Även om varje publicerade PCR-protokoll har rapporterat olika känslighet för detektion av TiLV, är de flesta analyser mycket känsliga med detektionsgränserna för viral kopior på 7,5 kopior33, 7 kopior18 eller 2 kopior32 per reaktion.

Syftet med denna metoder-artikel är att förklara, i detalj, hur du utför TiLV upptäckt analyser, börjar med tilapia vävnad samling, till totalt RNA-extraktion, cDNA syntes och sedan TiLV specifika PCR baserat analyser. Särskilt har omfattande protokoll till både konventionella RT-PCR och även SYBR green-baserade RT-qPCR beskrivits att överklaga till ett brett utbud av forskare som syftar till att upptäcka TiLV. Den förstnämnda är mindre känslig men är vanligtvis ett billigare detektering alternativet. Det senare kräver mer avancerade infrastruktur såsom en kvantitativ PCR-maskin och dyrare reagenser, men det har fördelarna med att vara kvantitativ, snabb och mycket känsliga, vilket innebär att det kan användas för detektion av TiLV i sub kliniskt smittad fisk. De RT-PCR och RT-qPCR protokoll utfördes i två olika laboratorier med distinkta geografiska isolat av TiLV och inkluderade resultat höjdpunkt känslighet och reproducerbarhet av de analyser som beskrivs här.

Protocol

Användning av djur protokollet för denna studie godkändes av etikkommittén Kasetsart universitet djur under tillstånd nummer ACKU 59-veterinär-016.

Obs: Vänligen se Tabell av material för utökad information om reagenser och utrustning som föreslås för detta protokoll.

1. vävnad provsamling

  1. Avliva fisken med hjälp av en överdos av kryddnejlika olja (volymen beror på storleken på fisken och koncentration av produkter, oftast mer än 3 mL/L). Fördjupa en fjärdedel av tången och mayo saxen till 95% (v/v) etanol följt genom att bränna den utrustning som använder en spritbrännaren för att sterilisera utrustning.
    Obs: Tricaine methanesulfonate (MS-222) kan användas i stället för kryddnejlika olja.
  2. Hitta levern och skär av en liten bit (cirka 20-100 mg) eller samla 200 µL av slem med täckglaset eller kirurgiska bladet ta bort slem från främre till bakre delen av tilapia fisk och placera proverna i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
  3. Bearbeta proverna omedelbart, förvaras i en RNA stabiliserande lösning eller flytta dem till-80 ° C tills vidare användning.
    Obs: Den största uppgiften arbeta med RNA förbereder sig intakt RNA-molekyler och hålla dem oskadade hela någon efterföljande hanteringar. RNA ryggraden är medfödd känsligare för skador än DNA. Utvinning och isolering av total-RNA från vävnadsceller kräver noggrann laboratorium teknik; ta alla bestämmelser för att förhindra RNase kontaminering genom att bära handskar, använder RNase gratis vatten, reagenser, utrustning, plastartiklar, glasvaror, arbetsutrymme och genom att använda filter tips för pipettering.

2. Guanidium kaliumtiocyanat - fenol - kloroform utvinning av RNA

  1. Tillsätt 1 mL monofasiska lösning innehållande fenol och guanidin isotiocyanat i ett rör som innehåller vävnadsprov från avsnitt 1.
    Varning: Denna lösning är mycket giftigt och måste hanteras med omsorg i en LAF med skyddsutrustning och genom att bära de rätt glasögon, kläder och säkerhet skyddshandskarna.
  2. Finfördela provet i vävnad med hjälp av en vävnad mortelstöt Homogenisatorer tills homogen.
    Obs: Prover kan också vara homogeniserad med hjälp av en power Homogenisatorer kombinerat med keramiska pärlor. Säkerställa att vävnadsprov är helt homogeniseras innan du fortsätter till nästa steg eller stoppa protokollet här och lagra de fullt homogeniserade proverna vid-80 ° C tills vidare användning.
  3. Tillsätt 200 µL kloroform för fasseparation.
    FÖRSIKTIGHET kloroform är en potentiell narkotiska och är extremt farliga. Det bör hanteras med försiktighet i en LAF med skyddsutrustning samt genom att bära de rätt glasögon, kläder och säkerhet skyddshandskarna. Som en mindre giftiga alternativ, 1-Bromo-3-chloropropane kan också användas.
    Obs: Skala volymerna upp eller ned vid behov. Exempelvis om bara 500 µL av monofasiska lösning innehållande fenol och guanidin isotiocyanat användes, sedan bara Tillsätt 100 µL av kloroform i detta steg.
    1. Blanda prover väl genom inversion för 15 s.
    2. Inkubera prover för 3 min i rumstemperatur (RT).
  4. Centrifugera i 15 min på 12.000 × g och 4 ° C.
    Obs: Det bör finnas en tydlig uppdelning i en lägre organiska fasen, en vit interphase och en övre vattenfas som innehåller RNA. Denna topp fas är normalt färglös men beroende på vilken typ och mängd av homogeniserad vävnad, det kan ha en ljus rosa utseende.
  5. Överföra övre vattenskiktet (cirka 500 µL) till en färsk mikrocentrifug rör utan att störa interphasen.
    Obs: Försök inte att överföra hela vattenfasen, lämna en liten mängd för att förhindra potentiell kontaminering av RNA som innehåller vattenfasen med den organiska eller interphasen.
  6. Tillsätt 1 volym 100% isopropanol utfällning RNA.
    1. Alternativt, om mycket små mängder av vävnad användes, sedan tillsätt 1 µL (5-10 µg) RNase-fri glykogen till varje prov att främja effektiv RNA nederbörd. Detta kommer att hjälpa identifiering av RNA pelleten i steg 2,8.
      Obs: Glykogen som fungerar som bärare av RNA och kommer att förhindra små mängder RNA fastnar sidan av röret.
    2. Mix-rör väl genom inversion flera gånger.
    3. Lagra proverna för 2 h till övernattning vid-20 ° C.
  7. Centrifugera proverna för 15 min på 12 000 x g och 4 ° C.
  8. Kassera supernatanten, vara noga med att inte rubba RNA pelleten längst ned i mikrocentrifug rör.
  9. Tillsätt 1 mL 75% etanol (v/v) och blanda RNA prover genom att vända rör flera gånger.
  10. Centrifugera i 15 min på 10.000 x g och 4 ° C.
    Obs: Protokollet kan stoppas här och proverna bestående av RNA pelleten i 75% etanol kan förvaras vid-20 ° C tills vidare användning.
  11. Kassera supernatanten, att vara vaksamma för att inte rubba RNA pelleten längst ned i mikrocentrifug rör.
    1. Du kan också upprepa steg 2.9-2.11 med 70% etanol (v/v). Grundligt tvätta RNA pelleten kommer att minimera eventuell salt eller främmande förädlingsstöd som kan interferera kommer känsliga nedströms tillämpningar.
  12. Dra ut återstående etanolen med pipett och sedan lufttorka RNA pelleten i rumstemperatur längre än 5-10 min.
    Obs: alltför torkade pellets blir svårt för återsuspendering.
  13. Tillsätt 30-60 µL RNase-gratis vatten, före värmas till 55-60 ° C till solubilize RNA pelleten.
  14. Placera RNA på is för användas omedelbart eller förvaras vid-80 ° C för senare användning.

3. kvantifiera RNA-koncentrationen med en mikro-volym spektrofotometer

  1. Växla inställningar spektrofotometerns till RNA.
  2. Använd 1-2 µL RNase-fritt vatten som en tom.
  3. Använda 1-2 µL av varje RNA-prov för att bedöma antalet RNA.
  4. Mätningar på 230 nm, 260 nm och 280 nm för varje prov.
  5. Späd RNA till 200 ng/µL med RNase-gratis vatten.

4. Sammanfattning av kompletterande DNA (cDNA) med total-RNA

  1. Blanda 1 µg totalt RNA från protokoll 2, 2 µM oligo (dT), 0,5 mM dNTP blandning och föra den slutliga volymen 10 µL med nuclease-gratis vatten. Förbereda en RT-master-mix enligt antalet prover och kontroller ska testas för detta.
    Obs: Kontrollerna är ett minus-omvänt transkriptas prov (-RT) vari enzymet RT ersätts med nuclease-fritt vatten (se steg 4.3) och en ingen mall kontroll (NTC) vari nuclease-fritt vatten tillsätts till master-mix i stället för RNA mall.
    1. Blanda proverna väl genom pipettering följt av en kort centrifugering.
  2. Inkubera proverna vid 65 ° C för 5 min följt av en 2 minuters inkubation på is.
    1. Kort Centrifugera proverna för att samla in all vätska i botten av rören.
  3. Tillsätt 1 x omvänt transkriptas buffert, 100 U omvänt transkriptas och sista volymen av varje prov 20 µL med nuclease-gratis vatten.
    1. Blanda proverna väl genom pipettering följt av en kort centrifugering.
  4. Inkubera proverna vid 42 ° C i 60 min följt av 85 ° C i 5 min.
  5. Späd den syntetiserade cDNA till en önskad koncentration genom att tillsätta en lämplig volym av nuclease-gratis vatten och placera cDNA på is för omedelbar använda eller förvara den vid-20 ° C för senare användning.

5. TiLV konventionella PCR

  1. Använda cDNA, prover och kontroller, genereras i protokollet avsnitt 4 som mallar för en PCR-reaktion med någon av de etablerade primer par beskrivs i tabell 1, tillsammans med en DNA-polymerase val.
    Obs: En ytterligare kontroll nr-mall (NTC) bör ingå här genom att ersätta cDNA för nuclease-fritt vatten i PCR-reaktionen. En positiv kontroll, om sådana finns, bör också ingå bestående av tidigare verifierade TiLV positiva prover eller den lämpliga TiLV cDNA fragmenten klonade i till en plasmid.
  2. Förbereda en PCR-master-mix enligt riktlinjerna för DNA-polymeras systemet i bruk och antalet prover och kontroller ska testas. Denna blandning bör omfatta framåt primer, reverse primer, dNTP, MgCl2 och den valda DNA-polymerasen, tillsammans med sin buffert.
  3. Enligt riktlinjerna för den valda DNA-polymerasen, kombinera utsedda volymen av master-mix med föreslagna beloppet av cDNA prover och kontrollprover.
    Obs: Förbereder en 0,5 x reaktion överskott är ofta fördelaktigt eftersom några av master-mix förloras under pipettering.
  4. Utför PCR cykling villkoren enligt riktlinjerna för utnyttjad DNA-polymeras systemet och använda en lämplig glödgning temperatur för primers används (tabell 1). Vanligtvis är ett sådant program kommer att innebära en inledande denaturering vid 95 ° C i 2-5 min, följt av 30-40 cykler av denaturering vid 95 ° C under 30 s, glödgning vid rekommenderad temperatur för 30 s och töjning vid 72 ° C i 30 s, följt av en sista töjning vid 72 ° C i 5-10 min.
  5. Fyll på 5-15 µL av varje PCR-reaktion och en lämplig DNA-stege i till brunnar i en 1-2% agarosgel, beroende på den förväntade PCR-produkt storleken. Separata amplifierade DNA med gelelektrofores och fläcken gelen av etidiumbromid (EthBr) för att underlätta visualisering av DNA band av den förväntade storleken (tabell 1) i en gel dokumentation maskin använder UV-ljus.
    Varning: EtBr är giftiga; Det bör hanteras med försiktighet av bär lämpliga skyddskläder och skyddshandskar.
TiLV genomet målgrupp Forward primer
5' - 3'		 Reverse primer
5' - 3'		 PCR-Produktstorlek (bp) Tm
° C		 Ursprungliga referens
1 CCAAACGTTATCTCTTAATTACGCAC GCAAATATTTCTCTCATTCGCCT 1641 50 Surachetpong et al., 2017
1 CCTCATTCCTCGTTGTGTAAGT AGGAGTTGCTGTTGGGTTATAG 1000 62 Mugimba et al., 2018
2 ACTCTCTATTACCAAATACATTTACT TTACCATATATATAGTGAAGGC 1445 45 Surachetpong et al., 2017
2 GTCCAGGGCGGTATGTATTG CTTACGGCTGACAAGTCTCTAAG 834 62 Mugimba et al., 2018
3 GTTGGGCACAAGGCATCCTA TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT 250 56 Eyngor et al., 2014
3 TATGCAGTACTTTCCCTGCC TTGCTCTGAGCAAGAGTACC 491 57 Eyngor et al., 2014
3 ACCCCTTAATCCTTAATAGACCGTTA CCCATAATCCTCTATTAGAACGTCGT 1352 50 Surachetpong et al., 2017
3 GTCGAGGCATTCCAGAAGTAAG GAGCTAAGGGAACGGCTATTG 834 62 Mugimba et al., 2018
4 AGCAGCAGCAGGAGAAAGAG ACCGTCCTGTTTCTGAATGG 358 60 Nicholson et al., 2017
4 CCAAAGTTTACTCCTATTACCCAGA GCAAATCTTTCTCCAATTACCGTCT 1250 50 Surachetpong et al., 2017
4 GCCCAATGGTTCCCATATCT GCCCAATGGTTCCCATATCT 524 62 Mugimba et al., 2018
5 CCAAATGTTTCTCTTATCTCAGACTC CTTTTTCTCAGTTTACCACTTTATG 1087 57 Surachetpong et al., 2017
5 CAACTCTTAGCCTCCGGAATAC CGTTCTGCACTGGGTTACA 696 62 Mugimba et al., 2018
6 CCAAATTTTACCTCTCGCAT TCAAGCACTTAAAACTGTACC 1027 45 Surachetpong et al., 2017
6 CCCACACGACAGGACATATAG GAGTTGGCTTAGGGTGATAAGA 948 62 Mugimba et al., 2018
7 CTCTCTTTGCATTGCATACCGT GACCAATTATCCCTGCTTTCA 704 57 Surachetpong et al., 2017
7 TCCTTTAGGGATTGGCACTAAC TTCCATCGACTGCTCCTAGA 486 62 Mugimba et al., 2018
8 ACCTCATCTACACTAACATTTCCA TCATCATTACACAAATGGAGTAGCT 637 50 Surachetpong et al., 2017
8 CTTAAGGGCCATCCTGTCATC TGGCTCAAATCCCAACACTAA 476 62 Mugimba et al., 2018
9 TTGGTGATGTCACGATGGATA AGTTCTATCGCCAGCCATGT 351 60 Nicholson et al., 2017
9 ACAAGTCCGATTACTTTTTCCGC TCTTTCTCACGTCCTTAAAGTCA 530 50 Surachetpong et al., 2017
9 GATATCCTCCACATGACCCTTC GTACGTCACTTTGTGCCATTAC 261 62 Mugimba et al., 2018
10 AACCCTACTAACACCAAATATAGCT CTTTCCCTCTGACACCCTGT 450 50 Surachetpong et al., 2017
10 TCCTCTCTGTCCCTTCTGTT CAGGATGAGTGTGGCAGATTAT 276 62 Mugimba et al., 2018

Tabell 1. Publicerade primer par för förstärkning av TiLV cDNA använder endpoint PCR. Primer som visas i fetstil användes för att generera de representativa resultat visas i figur 3A och 3B.

6. TiLV kvantitativa Polymerase Chain Reaction (qPCR)

  1. Med hjälp av en plasmid som innehåller den lämpliga TiLV genomisk segment 3 cDNA som standard, till exempel pTiLV32, Bered en duplicerade eller triplicated 10-faldig seriell utspädning serie.
  2. Förbered en qPCR master-mix för alla prover, standarder och kontroller, med hänsyn till att reaktionerna bör utföras i duplicera eller tre exemplar utnyttja 0.4 µL nuclease-gratis vatten, 0,3 µL av forward primer, 0,3 µL av reverse primer och 5 µL av 2 x SYBR Green DNA-polymeras master-mix per reaktion.
    1. Du kan använda primers vid en koncentration på 10 µM, och informationen som primer och den standard pTiLV på följande sätt:
      Vidarebefordra primer: TiLV-112F (5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3')
      Reverse primer: TiLV-112R (5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3')
      Standard pTiLV:10 pg/µL
      Obs: Om det totala antalet prover och kontroller är 10 och kommer att utföras i exemplar, detta motsvarar en qPCR master-mix bestående av 12 µL nuclease-gratis vatten, 9 µL framåt primer, 9 µL reverse primer och 150 µL av SYBR Green DNA polymeras master-mix. Kommersiellt köpt 2 x universal SYBR Green DNA innehåller polymeras master-blandningar alla nödvändiga komponenter för qPCR reaktionen, nämligen den SYBR Green jag färga, hot-start Taq-DNA-polymeras, dNTP, MgCl2 och passiv referens färgämnen. Ljuskänsligt SYBR Green huvudmixen.
  3. Dispensera 6 µL av qPCR master-mix i qPCR remsan rör eller en 96 väl platta kompatibel med qPCR maskinen används.
  4. Tillsätt 4 µL av cDNA mall, kontroller eller seriellt utspädda TiLV standarder in i rören eller brunnar i 96 väl plattan.
  5. Stäng qPCR rören eller täta 96 väl plattan med en kompatibel plate cover för qPCR maskinen används
    1. Knacka försiktigt qPCR rören för att blanda lösningen och spinn ner qPCR rören eller 96 väl platta med en centrifug för att samla all vätska i botten av fartygen.
  6. Placera rören eller plattan i den realtid termocykel.
    1. Programmera den qPCR termocyklern att utföra en inledande denaturering vid 95 ° C för 3 min, följt av 40 cykler av 95 ° C för 10 s och 60 ° C under 30 s för primer glödgning och töjning, slutar med en smältande kurva steg 65 ° c till 95 ° C med en ökning på 0,5 ° C / 5 s.
    2. Välj SYBR som fluorophore färgämne, Välj okända som en Provtyp och infoga ett namn till ett namn i rutan exempel.
    3. Öppna locket på maskinens RT-qPCR och placera den qPCR remsan i tilldelade brunnar och Stäng locket.
  7. Utföra den RT-qPCR-analysen med de markerade villkoren. Maskinen börjar att köra efter locket har uppnått önskad temperatur. Fluorescensen av varje prov efter varje förlängning steg att följa utvecklingen av reaktionen.
    Obs: QPCR maskinen och relaterad programvara automatiskt beräknar alla parametrar för analys och visar förstärkning kurvor i realtid, medan den standardkurva och smältande kurvan kommer att genereras i slutet av qPCR cykel.
  8. Utföra dataanalys och förvärv genom första som smältande kurvor för varje prov och standard har en enhetlig topp på den förvänta temperaturen för ospädd.
    1. Utvärdera förstärkning kurvorna av proverna och standarder och ange tröskelvärdet i en region var förstärkning i cDNAs är samma i alla prover. Detta utförs normalt automatiskt av programvaran men bör kontrolleras noggrant.
    2. Beräkna antalet TiLV kopior med hjälp av standardkurvan.

Representative Results

Efter protokollet beskrivs i avsnitt 1, var döende röda hybrid tilapia visar kliniska tecken på TiLV infektion (figur 1A) euthanized av badning i en hög koncentration av kryddnejlika olja vilket fungerar som bedövningsmedel. Rapporterade kliniska symtom är varierande men de vanligaste symtomen verkar vara letargi, hud erosion och missfärgning, exophthalmia, fristående skalor, öppna sår/Lesion och onormalt beteende15,16,33, 35,36, några av dessa kan ses tydligt i figur 1A. Bukväggen har tagits bort för att samla in inre organ såsom lever, mjälte eller huvudet njure (figur 1B). Slem prover samlades också i detta skede genom att försiktigt skrapa huden från den främre till bakre av fisken med hjälp av en skyddsglaset eller kirurgiska blade37.

Figure 1
Figur 1 . Tilapia dissektion och prov samling. A. TiLV-infekterade röda hybrid tilapia med huden leisons, rodnad runt munnen och operculum, hud erosion och Korneal opacitet. B. delad röd hybrid tilapia för vävnad samling från levern (samband med blå pil), mjälte eller huvudet njure organ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Därefter det protokoll som beskrivs i avsnitt 2 för Guanidium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform utvinning av total-RNA följdes och RNA kvantifiering som beskrivs i avsnitt 3 utfördes för att bedöma provet renhet genom beräkning av renhet förhållandena och undersökning av spektral profiler (figur 2). Figur 2A visar representativa resultat från en lyckad total RNA-extraktionsförfarande, medan figur 2B representerar en dålig RNA-beredning. Nukleinsyror har absorbansen maxima på 260 medan proteiner har deras vid 280 nm. Förhållandet mellan mätningarna vid 260 nm och 280 nm anger renheten av varje prov och nyckeltal på 1,9 till 2,1 anger rent RNA som är fallet för provet i figur 2A. Lägre A260/280 nyckeltal observerats i figur 2B Ange eventuell protein eller fenol förorening kvarleva från förfarandet för RNA-extraktion. Absorbansen vid 230 nm kan vara resultatet av provet kontaminering och A260/230 nm förhållandet beräknas också av denna anledning. Detta förhållande bör vara i intervallet 2,0-2,2 för ren RNA preparat som illustreras av ett värde på 2,03 för provet i figur 2A, medan figur 2B har en låg A260/230 förhållandet 1,07 och spektral profil visar en förskjutning i tråg på 230 nm mot 240 nm vilket är ett tecken på kvarvarande guanidin eller fenol i provet. I urvalet som visas i figur 2B, kan åter utfällning RNA för att ta bort föroreningen förbättra renheten av provet.

Figure 2
Figur 2 . Spektrofotometrisk kvantifiering av total-RNA extraherade från sjuka tilapia vävnader. A. renhet nyckeltal och spektrala profiler från en framgångsrik RNA-beredning. B. som A, utom företrädare för en dålig RNA extraktionsmetod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att upptäcka TiLV av RT-PCR, ren prover som den representerade i figur 2A var omvänd transkriberas (protokoll 4) till cDNA och används som en mall för PCR-analysen som beskrivs i avsnitt 5 och representativa resultat visas i figur 3A. Primers som visas i fetstil i tabell 1 användes för att förstärka ett 491 bp fragment av TiLV genomisk segment 314. PCR-produkterna skildes med gelelektrofores och färgas med EtBr för visualisering. Figur 3A visar resultaten av en två-stegs RT-PCR med 4 cDNA prov (S1-S4), härrör från levern av diseased tilapia isolerad i Thailand, och i varje prov, en ren enda band med cirka 500 bp kan observeras och prover 1-4 är således TiLV positivt. Samma PCR-produkten erhölls från det positiva stickprov, bestående av cDNA av TiLV segment 3 klonats i en plasmid32 medan ingen mall kontroll (NTC) inte avkastning PCR-produkter. Analysen i figur 3B utfördes med hjälp av samma primers som i figur 3A men i olika laboratorier, med en one-step RT-PCR metod och med 5 RNA-prover som härrör från huvudet njure vävnad Tilapia med ursprung i egyptiska vattenbruk 15. det fastställdes med hjälp av denna upptäckt analys att prover 1, 3 och 5 är TiLV positiva medan prover 2 och 4 är TiLV negativa eftersom ingen PCR-produkt hittades på rätt storlek. Negativa kontroller, inklusive två minus omvänt transkriptas kontroller och två NTCs inte genererat någon PCR-produkter. En one-step RT-PCR-analys utfördes också inriktning tilapia ActinB gen. Kopiestorlek av 217 bp har genererats i varje prov (S1-S5) som förväntade38. Denna analys serveras som en kontroll för integriteten för de RNA-proverna samt möjliggör en semikvantitativ analys av TiLV positiva proven. Med tanke på att den genererade Tilapia ActB produkten är relativt lika, kan sedan skillnader i mängden TiLV specifika PCR-produkt som uppstår tolkas som en sann bild av mängden TiLV i ett givet vävnadsprov.

Figure 3
Figur 3 . TiLV RT-PCR. A. cDNA prover produceras från levern vävnader sjuka tilapia, ut från Thailand var skärmen för TiLV infektion med specifika primers för segment 3 (visas i fetstil i tabell 1) av TiLV med en 2-stegs RT-PCR-analys. M = markör visas i base-par; S1-S4 = prover 1-4; C1 = positiv kontroll med pTiLV som en PCR-mall; och C2 = ingen mall kontroll (NTC). B. One-step RT-PCR använder samma primers som i A och prover från huvudet njure vävnad sjuka Tilapia ut från Egypten15. M = markör visas i base-par; S1-S5 = prover 1-5. Kontroller C1-C2 minus omvänt transkriptas kontroller och C3-C4 är NTCs. nedre panelen används en one-step RT-PCR primers mot tilapia ActinB38 (se text för detaljer) producerar en PCR produkt av 217 baspar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Till skillnad från slutpunkten primärvården representerade i figur 3, qPCR analyser som förklaras i protokoll 6, mäta mängden PCR-produkten efter varje PCR-cykel. Förstärkning av mål-DNA påvisas med hjälp av fluorescerande molekyler som samverkar med DNA som genereras från varje omgång av reaktion. Här utnyttjades SYBR Green jag färga, som intercalates med dubbelsträngat DNA. Fluorescerande signalen följs under reaktionen och dess intensitet avser mängden produkt bildas 39,40,41,42,43. TiLV qPCR analyser genomfördes enligt beskrivningen i protokoll 6 i olika laboratorier använder olika SYBR Green reagenser, qPCR maskiner och prover från olika länder. De resulterande förstärkning kurvorna visas i figur 4A och 4B. Det kan noteras att för varje analys, jaga av experimentet har fyra faser: fasen linjär marken, tidiga exponentiella fasen, sena exponentiella fasen och fasen platå. Den linjära mark fasen uppstår under de tidiga cyklerna där DNA dubbelarbete ännu inte kan identifieras på grund av DNA kvantiteter producerar otillräckligt signal/bakgrund baserat. Baslinjen fluorescens beräknas under denna fas. Därefter börjar målet DNA fördubblas i koncentration med varje cykel inducera signalen att bli detekterbar ovan bakgrund och öka exponentiellt. Förstärkning effektivitet (E) en väl optimerad qPCR-analys är mycket hög (nära 100%) i början av reaktionen och förblir stabil under denna tidiga exponentiella fasen av förstärkning och det är på denna punkt att kvantifiering utförs, när reaktion effektivitet är fortfarande stabil. I senare cykler signalen börjar att plana och intensiteten av fluorescensen är inte längre korrelerad till mallen kopia startnummer eftersom reaktion komponenter är utmattad44. Mättnad kan också uppstå på grund av konkurrens från åter glödgning reaktioner, de föränderliga koncentration nyckeltal av komponenterna eller mängden enzym enheter till DNA substrat-molekyler. Möjligen, sådana parametrar redogöra för skillnaderna mellan amplifiering kurvorna för de analyser som visas i figur 4A och 4B. Kontrollerna ingår genererat inte dessa karakteristiska förstärkning kurvor.

Figure 4
Figur 4 . Förstärkning tomter att Visa ansamling av produkten över varaktigheten av realtids PCR analysen. A. förstärkning kurvor av TiLV-positiva prover som härrör från Thailand, NTCs och positiva plasmid kontroll använder en SYBR-Green jag 2-steg qPCR-analys. Diagrammet har skapats av plottning relativa fluorescens (RFU) vs. cykel nummer. B. förstärkning kurvor av TiLV positiva prover som härrör från Egypten, som i figur 3B och en NTC. Förstärkning kurvan är fluorescensen av reporter signalen normaliserade till fluorescensen av passiv ROX färgämnet ingår i analysen (Rn) kontra cykel nummer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I slutet av den qPCR termocykling på olika maskiner i varje laboratorium, data förvärvades och analyseras. Figur 5A och 5B visar representativa smältande kurvor från de analyser som utförs i varje laboratorium. Varje qPCR dator programmerades att utföra en smältande kurva analys i slutet. Detta uppnåddes genom att stegvis öka temperaturen och övervakning fluorescensen som en funktion av temperaturen. När temperaturen är tillräckligt hög för att denaturera dsDNA, registreras en stor droppe i fluorescens eftersom fluorophore molekylen frigörs. Programvaran för varje qPCR instrumentet beräknade glödgning temperaturen T (m) från smältande kurva data genom att plotta negativa första härledda vs temperaturen (figur 5). Det kan ses att i figur 5A och 5B att produkterna bildas i de olika provningssatser har enhetliga smältande övergången vid förväntad temperatur, ca 80 ° C för analysen. Inga andra toppar vid lägre temperaturer observerades. På grund av sin storlek är den Tm av primer-dimerer vanligtvis lägre än målet DNA-sekvens. Därför, denna skillnad mellan de Tms gör det lätt att identifiera potentiella primer-dimerer eller andra icke-specifik amplifiering produkter. Kontrollerna genererat inte smälta kurvor som TiLV positiva prover och standarder och kan ses som en nästan vågrät linje längst ned i listorna i figur 5A och 5B.

Figure 5
Figur 5 . Smälta kurva analys för att säkerställa analysens specificitet och olika PCR-produkter kan skiljas genom sina smältande funktioner. A. smälta kurva analys av TiLV-positiva prover kommer från Thailand, negativa och positiva plasmid kontroll. B. smälta kurva analys av TiLV positiva prover som härrör från Egypten, pTiLV standarder och en NTC. Diagrammen i A och B båda visar förändringen i fluorescens dividerat med förändringen i temperatur plottas mot temperatur att producera en tydlig bild av smältande dynamiken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De flesta qPCR maskiner kommer med en programvara som underlättar ytterligare utvärdering av qPCR kör och kommer att kvantifiera proverna genom att generera en standardkurva genom att automatiskt Rita cykel tröskeln (Ct) mot logaritmen av pTiLV normerna mall Kopiera nummer som visas i figur 6A och 6B för de två oberoende laboratorierna. Kortfattat, Ct är den enhet som används för att utvärdera qPCR resultat. Ct -värdet betecknar antalet cykler som krävs för att nå en inställd tröskel fluorescens signalnivå. Ju större mängden starta mall, desto färre cykler det tar att uppnå en detekterbar fluorescens. Faktiskt, prover med hög belastning av TiLV kommer att ha lägre Ct -värden än prover med TiLV såsom låg belastning i fisk med en subklinisk infektion. För att bestämma Ct -värden, dras fluorescens bakgrundsnivåerna först från rådata. Nästa, den programvara som är associerad med qPCR enheten kommer automatiskt att välja en fluorescens tröskel genom att söka data kurvorna för varje prov och införliva en Ct representerar där provet passerade tröskeln. Detta görs separat för varje analys och varje tröskelvärde bör noggrant utvärderas, säkerställa att tröskeln har fastställts i den logaritmiska delen av förstärkning kurvor och på en plats där alla kurvor är parallella. Således den specifika Ct förvärvade är ett relativt värde och det är i förhållande till den starta mall kopia nummer45, men det är också specifika för qPCR maskinen och reagenser som används, effektiviteten i den PCR-amplifieringen och känsligheten för upptäckt. Dessa parametrar bidra till de skillnader som observerats med samma analys i figur 6.

Från standard kurvorna i figur 6, regressionsanalyser, inklusive beräkning av standardkurvan backarna (m) och snappar, förstärkning effektivitetsvinster (100 x 10 (1/m -1))46 och linjäritet reaktionen utfördes. Standardkurvan analyser användes också till att bekräfta känslighet (detektionsgräns), repeterbarhet och reproducerbarhet av analysen. Teoretiskt, mängden DNA fördubblas med varje PCR cykel, vilket innebär att effektiviteten (E) är lika med 100%. Dock i praktiken uppnås en sådan perfekt effektivitet sällan på grund av suboptimal PCR förhållanden såsom DNA-polymeras hämning, föroreningar, för mycket cDNA och pipettering fel47. Typiskt, förstärkning E varierar från 90-110% för bra analyser, i figur 6A en effektivitet på 94,5% beräknades med hjälp av 8 seriellt utspädda pTiLV prover, medan, assay effektiviteten i analysen visas i figur 6B använder 7 seriellt utspädda pTiLV proverna var 101,2%. En verkningsgrad på över 100 procent är oftast på grund av PCR-hämmare i analysen. Linjär regressionsanalys av standard tomten kan också för beräkning av antalet TiLV kopior i varje prov41,42,45, som kan observeras för tre TiLV proverna visas i rött i figur 6B som är i linje med produktproverna S1, S3 och S5 visas i figur 3B.

Figure 6
Figur 6 . RT-qPCR standard kurvor. Realtids-PCR av 10-faldig seriespädningar av pTiLV, den standard som används i båda laboratorierna. A. 8 seriellt utspädda pTiLV prover testades, alla känd koncentration och korrelerad till antalet TiLV kopior / reaktion. Standardkurvan genererades av plottning log kopia nummer vs. cykel tröskel (Ct). Lutning =-3.462, R2 = 0.9992 och effektiviteten är 94.47%. B. liksom i A, utom 7 seriellt utspädda pTiLV prover (grön) testades och diagrammet visar cykelns tröskeln på y-axeln och kopia antalet TiLV (kvantitet) på x-axeln. Y-skärningspunkten = 32.327, lutning =-3.292, R2 = 0,98 och effektiviteten är 101,2%. För båda standarder kurvor används i A och B, lutningen, y-axeln och korrelationskoefficienten värden (R2) för att förstå prestanda för analysen. Ännu viktigare, bör R2 -värde nära 1 eftersom det är ett mått på Linjäriteten av standardkurvan. Lutning används för att mäta PCR effektivitet vari 100% effektivitet motsvarar en lutning på-3.32, se huvudtexten för ekvationen och ytterligare detaljer. En bra qPCR reaktion generellt har en verkningsgrad på mellan 90-110% korrelera till en lutning på mellan-3.58 och-3.10. Standardkurvan används för absolut kvantifiering av okänd TiLV positiva prover och bestämmer det exakta antalet TiLV kopior / reaktion, som är fallet för de tre TiLV positiva proverna färgad röd i B.

Discussion

TiLV rapporterades först 2014 i Israel14 och sedan dess den har identifierats i flera länder, däribland Egypten, Colombia, Indien, Malaysia, Uganda, Tanzania och Thailand15,16,18, 35 , 48. global medvetenhet, särskilt i tilapia producentländerna har placerat mer uppmärksamhet på viruset och olika begränsningar och kontrollåtgärder från statliga myndigheter har genomförts försöker förhindra spridning av TiLV. Här, har ett detaljerat protokoll för TiLV upptäckt i tilapia vävnad, som omfattar provtagning, RNA isolering, cDNA syntes, PCR och qPCR analyser förklarats. Det finns olika aspekter på dessa metoder som motiverar särskild diskussion. TiLV har identifierats i fisk som spänner över en mängd storlekar9,12,14,15,49 och arter av tilapia hittills, inklusive odlad hybrid tilapia (O. niloticus x O. aureus)11,14, Nile tilapia (O. niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 och röd tilapia (Oreochromis sp.)16,33,48,51, som liksom vilda Nile tilapia9,12, svart Tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, O. aureus och T. simonis intermedia14 och helt nyligen TiLV identifierades i vilda karp (Barbonymus schwanenfeldii)52. Vävnadsprover från inre organ (gill, mjälte, lever, hjärta, huvud njure) eller slem37 kan samlas från frisk liksom döende tilapia oavsett ålder, storlek eller arter och bearbetas för RNA isolering. Total RNA extraktion protokollet beskrivs använder här en monofasiska lösning av fenol och guanidinium kaliumtiocyanat, som är en chaotropic denatureringen agent. Vävnaderna är direkt homogeniseras i denna lösning följt av tillägg av kloroform och centrifugering att uppnå fasseparation vari en tydlig RNA som innehåller övre vattenfasen, en interphase och en lägre organiska fasen genereras. RNA är isolerad från vattenfasen med isopropanol nederbörd, följt av tvättning av återvunna RNA bli av föroreningar. Isolering av RNA genom denna metod var pionjärer av Piotr Chomczynski och Nicoletta Sacchi och blev kallad guanidinium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform utvinning53,54. Denna typ av reagens används för RNA-extraktion kan köpas kommersiellt eller gjort i laboratorium (se Tabell av material för ytterligare information). Detta protokoll tar något längre än kolumnbaserade metoder såsom kiseldioxid-baserade rening, men i allmänhet, det är mer kostnadseffektivt och ger mer RNA.

I detta protokoll, kvantifiera RNA med A260 värden skissades whereby spektrofotometri värden kan indikera RNA kvalitet (A260/A280 = 1,9-2,1). Medan denna metod kommer att ge en bra indikation på prov renhet, kan inte det absolut informera om kvaliteten på den extraherade RNA. För att korrekt bestämma huruvida RNA är intakt eller delvis försämrad, prover kan vara separation av agaros gel-elektrofores vari smetar av EtBr målat 18S och 28S rRNA band indikera RNA nedbrytning. Ytterligare kontroll av RNA kvalitet kan innefatta att använda ett labb-på-ett-chip instrument. Dessutom är det också viktigt att smälta renat RNA med DNAS jag ta bort kontaminerande värd genomiskt DNA, som beroende på vilka nedströms program kan leda till felaktiga resultat. Om värd gDNA fortfarande kontaminerande RNA provet till en stor grad, en ytterligare DNaseI-behandling kan även utföras i slutet av förfarandet för RNA-extraktion (se Tabell för material).

Kompletterande DNA-syntesen kan kraftigt påverka de övergripande qPCR-resultat och är en aspekt av den metod som kan införa variation. CDNA protokollet förespråkade här består av en enda komponent set-up med oligo (dT) och således endast transcribes mRNA som innehåller polyA svansar. Det låter användarkontroll av exakt vilka komponenter som ska användas i omvänd Transkription reaktionen och detta läge av cDNA har syntes visat sig framgångsrik för TiLV upptäckt32. Ett alternativ till detta upplägg är ett kommersiellt köpte master-mix som innehåller alla komponenter som krävs för omvänd Transkription reaktionen och är mycket snabb och enkel utan vanliga flerstegs, pipettering och flera temperatur protokollet. Detta är fördelaktigt eftersom det minimerar hanteringen och främjar enhetlighet över alla prover. Sådan master-blandningar innehåller ofta både oligo(dT) och slumpmässiga primers gör det tillämpliga på olika RNA mallar och generera representativa cDNA kopior av sekvenser från hela längden av RNASEN i en population (viral och tilapia värd mRNA) och i teorin, varje önskad RNA-arter kan då mätas genom konventionell PCR eller qPCR från sådana ett urval. Denna mångsidighet är den största fördelen med en 2-stegs RT-PCR metod; Det ger en långsiktig pool som kan användas för många olika experiment. I resultaten, en one-step RT-PCR metod har varit representerat vari sekvens specifika primers (tabell 1) användes och den RT- och PCR-utfördes i en tub (se material lista). I allmänhet sekvens specifika primers tillåter en högre RT effektivitet av det särskilda målet RNA än att använda random priming, men det särskilda målet RNA är den enda som kan kvantifieras i sådana ett cDNA-prov som kan vara det enda syftet med vissa laboratorier (se En tabell av för cDNA syntes produktförslag).

Medan konventionella RT-PCR tycks användas vanligen hittills i TiLV diagnos9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR har visat sig vara ett mer kraftfullt verktyg för identifiering och kvantifiering av små mängder TiLV i fiskvävnad eller slem32,37. I allmänhet, är qPCR allmänt används i klinisk virologi diagnostiska laboratorier på grund av dess höga känslighet, specificitet, bra reproducerbarhet, stort dynamiskt omfång och hastighet21. QPCR kan finnas initialt dyrare att genomföra än konventionella RT-PCR, ger det många viktiga fördelar jämfört med konventionella PCR. den har en snabbare turn-around tid från prov till resultat och det kräver inte någon post-PCR steg. Den sistnämnda punkten innebär att det finns minimal risk för laboratoriet kontaminering och det kan lättare anpassas till hög genomströmning situationer såsom vid utbrott. Dessutom är det till sin natur mer känsliga än konventionella RT-PCR, som är av avgörande betydelse att upptäcka låga virusbelastning i subkliniska infektioner21. Detta skulle kräva en nästlade PCR-metod som kräver omvänd Transkription, två ytterligare PCR-reaktioner och sedan analys av agaros gel elektrofores. Dessa många steg tar en massa tid och öka chanserna för fel eller kontaminering. Ändå, på grund av dess höga känslighet, RT-qPCR kräver noggrann experimentell design och en grundlig förståelse av kvantifiering tekniker för att skapa exakta resultat56,57.

DNA bindande fluorophore, SYBR Green jag har visats i detta protokoll. Det är en dsDNA ospecifikt DNA bindande färgämne och analysens specificitet ligger således helt i uppsättningen av primers, vilket kan ge falskt positiva58. Därför, medan den dsDNA smältande kurva analys utförs i slutet av varje PCR är en särskilt viktig del av PCR-reaktionen eftersom det bekräftar att bara en PCR-amplikon av rätt Tm produceras (detta bör också uppnås genom gel elektrofores när nya analyser genomförs). Tm av en DNA-fragmentet är beroende av en mängd funktioner som dess längd, GC sammansättning, sekvens, strand komplementaritet, koncentration samt buffert komponenter och PCR-förstärkare. De smältande kurva analyserna i representativa resultaten från två laboratorier inte avslöja förekomsten av primer-dimerer eller andra oönskade PCR-produkter men om detta observeras med andra prover och/eller experimentella uppställningar, då analysen bör Ny optimerad. Mer avancerade qPCR teknik kräver inte ett sådant smältande kurva steg och verkligen, sedan här metoder papper skrevs, en TaqMan baserat TiLV RT-qPCR har utvecklats utnyttja två primers och en sond som gör det mycket TiLV specifika34.

Utan tvekan, primers utformad för RT-qPCR analyser är grundläggande för framgång för analys och primers här utformades utifrån offentligt tillgängliga TiLV genomisk data på den tid32. Men RNA virus är välkända uppvisar hög mutation priser och möjliga stammar kommer undan de aktuella diagnostiska testerna, som observerades för ISA-virus59. Det kommer alltid vara svårt för sådana virustyper att generera en universal pan-TiLV RT-qPCR-analys och sådana analyser kommer endast att ständigt förbättras om fler TiLV genomisk data från långtgående platser och tidsperioder blir tillgängliga.

Slutligen är det viktigt att köra dubbla eller om möjligt, tre exemplar reaktioner i både intra och inter qPCR analyser. Om Ct värdena är mycket höga, då är användningen av replikat särskilt viktigt att fastställa att PCR-reaktionen är tillförlitliga och reproducerbara. I allmänhet om data från replikerar reaktioner varierar mer än 0.5 cykler, reaktionerna bör upprepas och om Ct värdena varierar konsekvent > 0,5 cykler i replikerar, analysen bör optimeras igen. Användning av en integrerad qPCR pipettering robot hjälper oerhört med problemet, men det är en lyx-verktyg. Som med alla experiment är inkludering tillräckliga och lämpliga kontrollerna av yttersta vikt att utveckling av robusta molekylära analyser, särskilt i diagnostiska laboratorier där sådana analyser måste vara ackrediterade. Kontrollerna bör omfatta positiva (positivt TiLV prov, TiLV plasmid standard) och negativa kontroller (NTC och -RT) prover samt detektion av endogena tilapia städning gener. Sådana kontroller kan inte underskattas och bör inkluderas i varje försök att ordentligt förstå kvaliteten i varje steg av analysen och korrekt tolka resultaten.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma till institutet av veterinärmedicinsk bakteriologi, Vetsuisse fakultet, universitetet i Bern för deras stöd. Detta arbete finansierades av kommittén för akademiska främjande av tidiga karriär forskare och jämställdhet vid Vetsuisse fakulteten, universitetet i Bern med 120% modell medel tilldelas PN. WS och PR stöds av Center for Advanced Studies för jordbruk och livsmedel, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under högre utbildning forskning främjande och nationell forskning University projekt i Thailand, Office av högre utbildning kommissionen, Undervisningsministeriet, Thailand. Vi vill tacka Dr Kwanrawee Sirikanchana för hennes berättande och Piyawatchara Sikarin för redigering av video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue collection Step 1
Tricaine methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 An alternative to clove oil. 
Step 1.1
RNAlater stabilization solution Thermo Fisher Scientific   AM7020 For storing tissues if they cannot be processed immediately
Step 1.3
RNA extraction Step 2
TRIreagent Sigma-Aldrich  Step 2.1
TRIzol Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) 15596026 Step 2.1
GENEzol Geneaid GZR100 Step 2.1
Trisure Bioline BIO-38032 Step 2.1
Homemade solution  -  - 94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate
30.45 g/L  (400 mM) ammonium thiocyanate
8.20 g/L  (100 mM) sodium acetate
380 mL/L  (38 % v/v) phenol
50 mL/L (5 % v/v) glycerol
1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0
Store up to 2 years at 4oC
Step 2.1
MagNA Lyser Green Beads Roche 3358941001 An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below
Step 2.2
Lysing Matrix D, 2 mL Tube MP BIOMEDICALS 116913050
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Step 2.3
Chloroform RCI Labscan AR1027E-G2.5L Step 2.3
1-Bromo-3-chloropropane Sigma-Aldrich B9673 A less toxic alternative to chloroform
Step 2.3
Isopropanol (GC) ≥ 99.8 % Sigma-Aldrich 59300 Step 2.6
Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) Merck KGaA (EMSURE) 1.09634.2500 Step 2.6
Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767) Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific) R0551 Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation
optional
Ethanol (purity (GC) ≥ 99.9 % Sigma-Aldrich (EMD Millipore) 1.00983 Step 2.9
Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) Merck (EMSURE) 1.00983.2500 Step 2.9
Nuclease-free water Promega P1193 Step 2.13
Nuclease-free water Multicell 809-115-CL Step 2.13
Ambion TURBO DNA-free kit  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) AM1907 Can be performed at the end of the RNA extraction protocol
optional
cDNA synthesis Step 4
Viva cDNA Synthesis Kit Vivantis cDSK01 Step 4.1 & 4.3
ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover Toyobo A1172K An alternative option 
see discussion
ReverTra Ace qPCR RT Kit Toyobo FSQ-101 An alternative option 
see discussion
AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase  Agilent Technologies 600107 An alternative option 
PCR Step 5
DNA polymerase systems: Step 5.2
   - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)  14001012a Step 5.2
   - GoTaq Mastermix Promega M7122 Step 5.2
Separate PCR mixture components: Step 5.2
10mM dNTP Mix Vivantis NP2409 Step 5.2
25mM MgCl2 Thermo Fisher Scientific R0971 Step 5.2
10X Taq Buffer with KCl Thermo Fisher Scientific 00348114 Step 5.2
Taq DNA polymerase Vivantis PL1202 Step 5.2
   - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq Thermo Fisher Scientific  AB1454 One step RT-PCR exemplified in Figure 3B
Gel electrophoresis: For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4
Ethidium Bromide solution (10 mg/mL) Thermo Fisher Scientific 17898 Step 5.5
Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer: Step 5.5
   - Tris Vivantis PR0612-1KG Step 5.5
   - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur) Merck KGaA (EMSURE) 1.00063.2500 Step 5.5
   - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BIO-RAD 161-0729 Step 5.5
Agarose Vivantis PC0701-100G Step 5.5
DNA ladders and markers Vivantis NL1405 Step 5.5
DNA gel loading dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611 Step 5.5
qPCR Step 6
PowerUP SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) A25779 Exemplified in Figures 4-6B
Step 6.2
iTaq Universal SYBR Green Supermix BIO-RAD 1725120 Exemplified in the video and in Figures 4-6A
Step 6.2
Equipment 
Dounce tissue grinder pestle Sigma-Aldrich P1110 Protocol 2
MagNA Lyser Instrument Roche 3358976001 An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above
Step 2.2
FastPrep-24 5G Homogenizer MP BIOMEDICALS 116005500
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf Eppendorf 5427R Protocol 2
Step 2.4, 2.7 & 2.10
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf Eppendorf 5418R
Heat box Labnet AccuBlock Digital Dry Bath Protocol 2
Step 2.13
Microvolume spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) Nanodrop 2000 Protocol 3
Step 3.1 - 3.4
PCR machine BIO-RAD T100 Thermal Cycler Protocol 5
Step 5.4
Power supply BIO-RAD PowerPac HC Protocol 5
Step 5.5
Horizontal gel electrophoresis BIO-RAD Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu Protocol 5
Step 5.5
Mini microcentrifuge Corning LSE 6766 Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 & 6
Step 6.5.1
Microcentrifuge LioFuge LM-60 Step 6.5.1
qPCR machine and software Thermo Fisher Scientific 7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0 Protocol 6
Step 6.6-6.8
qPCR machine and software BIO-RAD CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software
General Materials 
Mayo scissors Step 1.1-1.2
Forceps Step 1.1-1.2
Pipette Rainin Pipette-Lite XLS
Aerosol-barrier pipette tips Sigma-Aldrich Z333328, Z333336, Z333344
Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAO. The State of World Fisheries and Aquaculture, 2014. Opportunities and Challenges. , Rome. (2014).
  2. FAO. The State of World Fisheries and Aquaculture, 2016. Contributing to Food Security and Nutrition for all. , Rome. (2016).
  3. WorldBank. FISH TO 2030: Prospects for Fisheries and Aquaculture. Agriculture and Environmental Services Discussion Paper 03. , (2013).
  4. Wing-Keong, N., Nicholas, R. A review of the nutrition and feeding management of farmed tilapia throughout the culture cycle. Reviews in Aquaculture. 5 (4), 220-254 (2013).
  5. Cleasby, N., et al. The socio-economic context for improving food security through land based aquaculture in Solomon Islands: A peri-urban case study. Marine Policy. 45, 89-97 (2014).
  6. Ponzoni Raul, W., et al. Genetic improvement of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) with special reference to the work conducted by the WorldFish Center with the GIFT strain. Reviews in Aquaculture. 3 (1), 27-41 (2011).
  7. Hounmanou, Y. M. G., et al. Tilapia lake virus threatens tilapiines farming and food security: Socio-economic challenges and preventive measures in Sub-Saharan Africa. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 493, 123-129 (2018).
  8. OIE. Tilapia Lake Virus (TiLV) - a novel orthomyxo-like virus. OIE technical disease cards. , http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Internationa_Standard_Setting/docs/pdf/A_TiLV_disease_card.pdf (2018).
  9. Mugimba, K. K., et al. Detection of tilapia lake virus (TiLV) infection by PCR in farmed and wild Nile tilapia (Oreochromis niloticus) from Lake Victoria. Journal of Fish Diseases. , (2018).
  10. Koesharyani, I., Gardenia, L., Widowati, Z., Khumaira,, Rustianti, D. D. Studi kasus infeksi tilapia lake virus (tilv) pada ikan nila (Oreochromis niloticus). Jurnal Riset Akuakultur. 13 (1), 85-92 (2018).
  11. OIE. Tilapia lake virus disease (TiLV), Chinese Taipei. Immediate Notification. , http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?reportid=24033 (2017).
  12. OIE. Tilapia Lake Virus Disease (TiLV), Peru. Immediate Notification. , (2018).
  13. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), e00431-e00416 (2016).
  14. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  15. Nicholson, P., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Egyptian fish farms experiencing high mortalities in 2015. Journal of Fish Diseases. 40 (12), 1925-1928 (2017).
  16. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  17. Tattiyapong, P., Dachavichitlead, W., Surachetpong, W. Experimental infection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and red tilapia (Oreochromis spp.). Veterinary Microbiology. 207, 170-177 (2017).
  18. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  19. Thangaraj, R. S., et al. Derivation of two tilapia (Oreochromis niloticus) cell lines for efficient propagation of Tilapia Lake Virus (TiLV). Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 492, 206-214 (2018).
  20. Hanson, L. A., Rudis, M. R., Vasquez-Lee, M., Montgomery, R. D. A broadly applicable method to characterize large DNA viruses and adenoviruses based on the DNA polymerase gene. Virology Journal. 3, 28-28 (2006).
  21. Josko, D. Molecular virology in the clinical laboratory. Clinical Laboratory Science. 23 (4), 231-236 (2010).
  22. Munir, K., Kibenge, F. S. Detection of infectious salmon anaemia virus by real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 117 (1), 37-47 (2004).
  23. Snow, M., et al. Developement, application and validation of a Taqman real-time RT-PCR assay for the detection of infectious salmon anaemia virus (ISAV) in Atlantic salmon (Salmo salar). Developments in Biologicals. 126, discussion 325-136 133-145 (2006).
  24. Matejusova, I., McKay, P., McBeath, A. J., Collet, B., Snow, M. Development of a sensitive and controlled real-time RT-PCR assay for viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) in marine salmonid aquaculture. Diseases of Aquatic Organisms. 80 (2), 137-144 (2008).
  25. Garver, K. A., et al. Development and validation of a reverse transcription quantitative PCR for universal detection of viral hemorrhagic septicemia virus. Diseases of Aquatic Organisms. 95 (2), 97-112 (2011).
  26. Dalla Valle, L., et al. Development of a sensitive and quantitative diagnostic assay for fish nervous necrosis virus based on two-target real-time PCR. Veterinary Microbiology. 110 (3-4), 167-179 (2005).
  27. Hodneland, K., Garcia, R., Balbuena, J. A., Zarza, C., Fouz, B. Real-time RT-PCR detection of betanodavirus in naturally and experimentally infected fish from Spain. Journal of Fish Diseases. 34 (3), 189-202 (2011).
  28. Hodneland, K., Endresen, C. Sensitive and specific detection of Salmonid alphavirus using real-time PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 131 (2), 184-192 (2006).
  29. Wang, X. W., Ao, J. Q., Li, Q. G., Chen, X. H. Quantitative detection of a marine fish iridovirus isolated from large yellow croaker, Pseudosciaena crocea, using a molecular beacon. Journal of Virological Methods. 133 (1), 76-81 (2006).
  30. van Beurden, S. J., et al. Development and validation of a real-time PCR assay for the detection of anguillid herpesvirus 1. Journal of Fish Diseases. 39 (1), 95-104 (2016).
  31. Ciulli, S., et al. Development and application of a real-time PCR assay for the detection and quantitation of lymphocystis disease virus. Journal of Virological Methods. 213, 164-173 (2015).
  32. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  33. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 476, 111-118 (2017).
  34. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 497, 184-188 (2018).
  35. Behera, B. K., et al. Emergence of Tilapia Lake Virus associated with mortalities of farmed Nile Tilapia Oreochromis niloticus (Linnaeus 1758) in India. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 484, 168-174 (2018).
  36. Ferguson, H. W., et al. Syncytial hepatitis of farmed tilapia, Oreochromis niloticus (L.): a case report. Journal of Fish Diseases. 37 (6), 583-589 (2014).
  37. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 486, 75-80 (2018).
  38. Yang, C. G., et al. Evaluation of reference genes for quantitative real-time RT-PCR analysis of gene expression in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Gene. 527 (1), 183-192 (2013).
  39. Bustin, S. A. Real-time, fluorescence-based quantitative PCR: a snapshot of current procedures and preferences. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (4), 493-498 (2005).
  40. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
  41. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 95-125 (2006).
  42. Mackay, I. M., Arden, K. E., Nitsche, A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research. 30 (6), 1292-1305 (2002).
  43. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  44. Bustin, S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 25 (2), 169-193 (2000).
  45. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Research. 6 (10), 986-994 (1996).
  46. Rutledge, R. G., Côté, C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves. Nucleic Acids Research. 31 (16), e93-e93 (2003).
  47. Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).
  48. Amal, M. N. A., et al. A case of natural co-infection of Tilapia Lake Virus and Aeromonas veronii in a Malaysian red hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. mossambicus) farm experiencing high mortality. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 485, 12-16 (2018).
  49. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 473, 430-432 (2017).
  50. OIE. Tilapia Lake Virus disease (TiLV), Philippines. Immediate Notification. , (2017).
  51. OIE. Tilapia lake virus disease (TiLV), Malaysia. Immediate Notification. , https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?page_refer=MapFullEventReport&reportid=24809 (2017).
  52. Abdullah, A., et al. First detection of tilapia lake virus (TiLV) in wild river carp (Barbonymus schwanenfeldii) at Timah Tasoh Lake, Malaysia. Journal of Fish Diseases. 41 (9), 1459-1462 (2018).
  53. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  54. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  55. Del-Pozo, J., et al. Syncytial Hepatitis of Tilapia ( Oreochromis niloticus L.) is Associated With Orthomyxovirus-Like Virions in Hepatocytes. Veterinary Pathology. 54 (1), 164-170 (2017).
  56. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  57. Purcell, M. K., Getchell, R. G., McClure, C. A., Garver, K. A. Quantitative polymerase chain reaction (PCR) for detection of aquatic animal pathogens in a diagnostic laboratory setting. Journal of Aquatic Animal Health. 23 (3), 148-161 (2011).
  58. Simpson, D. A., Feeney, S., Boyle, C., Stitt, A. W. Retinal VEGF mRNA measured by SYBR green I fluorescence: A versatile approach to quantitative PCR. Molecular Vision. 6, 178-183 (2000).
  59. Kibenge, M. J., et al. Discovery of variant infectious salmon anaemia virus (ISAV) of European genotype in British Columbia, Canada. Virology Journal. 13, 3 (2016).

Tags

Fråga 141 tilapia Tilapia sjön virus miljövetenskap diagnos RT-PCR RT-qPCR orthomyxo-liknande virus
Upptäckt av Tilapia sjön Virus använder konventionella RT-PCR och SYBR Green RT-qPCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nicholson, P., Rawiwan, P.,… More

Nicholson, P., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR. J. Vis. Exp. (141), e58596, doi:10.3791/58596 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter