Summary
전체 신장 네 프 론의 추정치는 네 프 론의 수와 신장 및 심혈 관 질환의 향상 된 위험 사이에 역 연관이 있기 때문에 임상적으로 그리고 실험적으로 중요 합니다. 본 원에서, 전체 신장의 네 프 론의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 추정치를 제공 하는 산 성 침 용 방법을 사용 하는 것이 입증 된다.
Abstract
네 프 론 엔 다 우먼 트는 개인이 태어난 네 프 론의 총 수를 말하며, 인간에서의 신장은 임신 36 주에 완료 되 고 출산 후에는 새로운 네 프 톤이 형성 되지 않습니다. 네 프 론 번호는 출생 후 시점에서 측정 된 네 프 론의 총 수를 지칭 한다. 유전과 환경적 요인 모두 네 프 론의 엔 다 우먼 트와 수에 영향을 미친다. 특정 유전자 또는 요인이 신 기원과 네 프 론의 손실이 나 종말의 과정에 영향을 미치는 방법을 이해 하는 것은 더 낮은 네 프 인 엔 다 우먼 트 또는 수를 가진 개인은 신장 또는 심혈 관 질환을 개발의 높은 위험에 있을 것으로 생각 됩니다. 사람의 일생 동안 환경 노출이 어떻게 네 프 론의 숫자에 영향을 미치는지 이해 하는 것은 미래의 질병 위험을 결정 하는 데에도 중요 합니다. 따라서, 전체 신장 네 프 론의 수를 신속 하 고 안정적으로 평가 하는 능력은 신 기원 또는 네 프 랭 손실을 촉진 시키거나 증진 시키는 기전을 더 잘 이해 하기 위한 기본적인 실험적 요구 사항 이다. 여기서, 우리는 Damadian, 샤이 리 및 Bricker에 의해 설명 된 절차에 기초 하 여 전체 신장의 네 프 론의 추정을 위한 산 침 용 법을 약간의 수정과 함께 설명 한다. 산 성 연 화 방법은 네 프 론의 빠르고 신뢰할 수 있는 추정치를 제공 합니다 (사 구체를 계산 하 여 평가 됨) 그 중 5% 내에서 더 고급을 사용 하 여 결정, 이기는 하지만 비싼, 자기 공명 영상과 같은 방법. 더욱이, 상기 산 침 용 법은 많은 수의 샘플 또는 실험 조건에서 네 프 론의 개수를 평가 하는 우수한 고 처리량 방법 이다.
Introduction
네 프 론의 기본 구조와 신장1의 기능 단위입니다. 구조적으로, 네 프 론의 사 구체 (모세 혈관과 세포)는 보 먼의 캡슐 내에 위치 하 고 신장 세관, 근 위 세관, Henle의 루프 및 수집 덕트로 종결 되는 말단 세관으로 구성 됩니다. 기능적으로, 네 프 론의 역할은 물과 전해질의 여과 및 재흡수와 폐기물의 분 비입니다. 일반적으로, 신장은 마우스와 쥐2와 같은 여러 종에서 출생 직후 인 간에 서 임신 36 주에 완료 됩니다. 네 프 론 엔 다 우먼 트는 개인이 태어난 네 프 론의 총 수를 말하며, 반면 네 프 론 수는 출생 후3년에 언제 든 지 측정 된 네 프 론의 총 개수입니다. 용어 네 프 론의 숫자와 사 구체 숫자는 종종 같은 의미로 사용 됩니다. 네 프 론의 사 구체 1 개만 있기 때문에, 사 구체 수의 평가는 네 프 온 수를 추정 하는 중요 한 대리 이다.
네 프 론의 엔 다 우먼 트와 네 프 론의 수치는 네 프 론의 자질과 심혈 관 질환의 발병 률이 증가 하는 네 프 론의 숫자와의 연관성을 입증 한 것으로 임상적 관심을가지고 있다4,5 ,8,10,9,13 ,11,12 15. 부검에서 신장의 연구 결과에 근거 하 여, 브 레너는 고혈압 환자 들이 노 몰 하는 사람들16보다 낮은 총 수의 네 프 론을 제시 했다는 것을 관찰 했습니다. 따라서, 브 레너는 네 프 론의 수와 인생에서 나중에 고혈압을 개발의 위험 사이에 역 관계가 있다는 가설. 브 레너는 또한 네 프 론 수의 감소가 남아 있는 네 프 톤에 의해 보상 되었다는 것을 가설 했다. 신장에서 정상적인 여과 속도를 유지 하기 위해, 잔여 네 프 톤은 사 구체 표면적 (사 구체 비 대)을 증가 시 킴으로써, 신장 기능4 에 대 한 네 프 론의 부작용을 완화 하는 작용을 합니다 ,16.
단기, 사 구체 비 대에서 보호 하는 동안, 장기에, 증가 나트륨과 유체 유지에 이르게, 증가 세포 외 유동성 볼륨, 그리고 동맥 혈압 증가, 더 증가의 악순환으로 이어지는 사 구체 모 세관 압력, 사 구체 하이퍼 여과, 네 프 론의 흉터 (경화 증) 및 부상4,16.
네 프 론의 추정치 또는 개수를 구하는 것은 몇 가지 실험적 이점을 제공 합니다. 1)이는 신 기원 과정에 관한 정보를 제공 하며,이는 배아 또는 모계 태아 환경의 특정 유전자 또는 인자에 연결 될 수 있으며, 2) 심장 혈관 질병을 가진 네 프 론의 수의 협회가 있으며, 따라서, 네 프 론의 추정치는 미래의 심혈 관 위험을 예측 하는 데 사용 될 수 있는 가능성이 있다2,17,18, 19 , 20 , 21 , 22. 모계 태아 환경 외에도 몇몇 질병은 동맥 경화 증, 당뇨, 고혈압, 심지어 정상적인 노화를 포함 하는 네 프 론의 수와 신장 기능에 직접적으로 영향을 미치기 때문에2,9, 10,11,12,21. 따라서, 전체 신장 네 프 론의 평가는 사람의 삶과 결과 효과의 과정을 통해 신 기원 (즉, 네 프 론의 엔 다 우먼 트) 및 네 프 번에 영향을 미치는 유전 및 환경적 요인을 모두 이해 하는 것이 중요 합니다 신장 기능 및 심혈 관 건강에.
현재 네 프 론의 판정 및 정량화에 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있으며, 각각의 장점과 한계를가지고 있습니다.24,25, 29,27 ,29,30. 전체 신장 네 프 론 수를 결정 하기 위한 정교한 방법에는 전위/fractionator 방법, 자기 공명 영상25,26등의 입체 방법이 포함 된다. 전체 신장 네 프 론의 수를 결정 하기 위한 금-표준으로 간주 되는 경우가 많으며, dissector/fractionator 방법은 비용과 시간이 많이 소요 됩니다. 자기 공명 영상 처리 및 프로세싱의 최근의 발전과 개선은 각각의 네 프 론의 카운트를 개별적으로 하는 도구를 제공 한다. 그러나 자기 공명 이미징은 시간 소모적 일 뿐만 아니라 매우 비쌉니다. 또한, dissector/fractionator 방식과 자기 공명 영상 모두 첨단 기술 전문 지식이 필요 하므로 대부분의 연구 실험실에서 이러한 방법의 사용을 제한 합니다.
네 프 론의 숫자를 결정 하는 대부분의 방법은, 그들은 구조적으로 쉽게 식별 할 수 있기 때문에, 사 구체 식별을 기반으로 카운트 또는 추정치를 확인 합니다. 본 논문에서, 전체 신장에서 네 프 론의 수를 추정 하는 산 성 침 용 방법은도27과 설명 된다. 상기 산 침 용 법은 전위/fractionator 방법 및 자기 공명 영상과 같은 다른 방법 들 보다 빠르고, 안정적 이며, 현저히 저렴 하다. 더욱이, 상기 산 침 용 법은 자기 공명 영상 (26)을 사용 하 여 결정 된 것 들의 범위 내에 있는 것으로 보고 되는 네 프 론의 매우 반복 가능한 추정값을 제공 한다.
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Protocol
아래 나열 된 소모품 및 시 약은 한 번의 마우스에서 전체 신장의 네 프 론의 수, 즉 두 개의 신장에 대 한 결정입니다. 쥐에 대 한 산 성 침 용 방법의 사용에 대 한 수정은 별표로 식별 됩니다. 모든 실험 프로토콜은 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 건강 가이드의 국립 연구소를 본, 미시시피 대학 의료 센터에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 신장 분리 절차
- 마우스 (또는 다른 종)의 무게를 측정 하 고이 소에 어 루 레인 (5%-8%)으로 안락사 과다 복용 또는 pentobarbital (150 밀리 그램/kg 복 강 내 주사).
- 마우스가 안락사 되 면, 중간 선을 따라 미세 수술가 위를 사용 하 여 복 강을 엽 니 다.
- 내장을 조심 스럽게 들어 올리고 지방 생식을 복 강의 오른쪽으로 올립니다. 총 해 부에 의해, 왼쪽 신장을 분리. 미세 수술가 위를 사용 하 여 왼쪽 신장 동맥과 정 맥을 자르고 왼쪽 신장을 조심 스럽게 제거 하 고 (마우스 번호/식별자) 형광체 완충 식 염 수를 포함 하는 계량 보트에 신장을 배치 합니다 (PBS).
- 오른쪽 신장에 대 한 절차를 반복 합니다.
- 각각의 계량 보트에서 각 신장을 제거 하 고 PBS로 미리 적신 수술 거 즈에 놓습니다.
- 수술 거 즈에 신장을 남겨, 신속 하 게 모든 부착 된 비 신장 조직 제거 (예: 신장 지방 또는 부 신 동맥) 신장 캡슐의 제거에 의해 다음. 각각의 신장을 개별적으로 계량 하 여 실험실 노트북에서 왼쪽과 오른쪽 신장의 무게를 개별적으로 기록 합니다.
2. 균질 화, 배양 및 변형 절차
- 각 신장이 무게 되 면, PBS의 각 계량 보트를 배수 하 고 적절 하 게 표시 된 계량 보트에 다시 신장을 배치 합니다. 깨끗 한 면도날을 사용 하 여 신장을 반으로 자르고 세로로 자릅니다. 각 신장의 절반을 아래로 향하게 하 고 각 반쪽을 2mm 또는 더 작은 조각으로 자릅니다.
- 같은 레이저 블레이드를 사용 하 여 조심 스럽게 잘게 자른 신장 조각을 수집 하 고 표시 된 15ml 원뿔 튜브 (마우스 번호/식별자를 왼쪽 대 오른쪽 신장)에 넣습니다.
- 새로운 면도날을 사용 하 여 반대 신장에 대 한 절차를 반복 합니다. 잘게 자른 신장을 별도의 표지 된 15ml 원추형 튜브에 넣습니다.
- 통풍이 잘되는 증기 후드에서 각 15ml 원추형 튜브에 6 M 염 (HCl) 산 5Ml를 추가 하십시오.
- 캡을 원추형 튜브로 교체 하 고, 신장/HCl 혼합물을 부드럽게 교 교 하 고, 15Ml 원추형 튜브를 37 ° c에서 90 분 동안 설정 된 예 열 된 수조에 넣고, 쥐 신장에는 120 min을 넣습니다.
- 모든 조직이 HCl 산에 노출 되는 것을 보장 하기 위해 인큐베이션 동안 15 분 마다 각 15Ml 튜브를 짧게 교 번 한다.
- 18g 바늘을 5ml 주사기 (쥐에 대 한 10ml 주사기)에 넣고 주사기 플런저를 조심 스럽게 제거 합니다. 주사기를 흄 후드의 50 원추형 튜브 (튜브 #1)에 넣습니다.
- 수조에서 신장/HCl 용액을 제거 하 고 티슈 용액을 주사기의 열린 끝에 붓고 15ml 원뿔형 튜브를 시험관 랙에 따로 둔다. 조심 스럽게 플런저를 교체 하 고 서서히 플런저를 밀어 바늘을 통해 용액을 압출 하 고 튜브 #1.
- 15ml 원추형 튜브를 5 mL의 PBS 용액으로 씻으십시오. 15ml 원추형 튜브에 PBS를 소용돌이 시켜 남아 있는 모든 신장 조직을 가용 화 하도록 한다.
- 다시 말하지만, 18g 바늘을 포함 하는 5 mL 주사기에서 플런저를 조심 스럽게 제거 하 고 15ml 원추형 튜브의 내용물을 주사기의 열린 끝에 붓는 다. 조심 스럽게 플런저를 교체 하 고 튜브 #1에 플런저를 부드럽게 밀어 주사기를 플러시. 이 과정을 2 배 반복 합니다 (총 3 배).
- 21g 바늘을 새로운 5Ml 주사기 (* 10ml의 쥐 용 주사기)에 넣고 주사기 플런저를 조심 스럽게 제거 합니다. 새로운 50-mL 원추형 튜브 (튜브 #2)에 부착 된 21g 바늘로 주사기를 놓습니다.
- 21-G 바늘을 포함 하는 주사기의 열린 끝에 튜브 #1 내용물을 붓는 다. 조심 스럽게 플런저를 삽입 하 고 주사기 플런저를 부드럽게 눌러 주사기를 세척 하 고 압출 용액을 튜브 #2에 놓습니다.
- 5 mL의 PBS 용액을 사용 하 여 세척 튜브 #1. 나머지 신장 조직을 가용 화할 수 있도록 튜브 #1에 PBS를 소용돌이.
- 다시, 18g 바늘을 포함 하는 5 mL 주사기에서 플런저를 조심 스럽게 제거 하 고 튜브 #1 내용물을 주사기의 열린 끝에 붓는 다. 조심 스럽게 플런저를 교체 하 고 부드럽게 플런저를 아래로 밀어 주사기를 플러시, 튜브 #2에 솔루션을 압출. 이 과정을 2 배 반복 합니다 (총 3 배).
- 튜브 #2에 최대 50 라인까지 PBS를 추가 하 여 최대 50 mL의 튜브 #2 총 부피를 가져옵니다.
- 신장 조직 용액을 로커 플레이트의 튜브 랙에 포함 하는 배양 관 #2 4°c에서 하룻밤 동안 설정 된 냉장고 (최소 8-10 시간).
3. 사 구체 계산 및 네 프 론의 외삽 수
- 냉장고에서 튜브 #2를 제거 하 고 균질 한 용액을 만들기 위해 튜브를 여러 번 살짝 반전 하 여 펠 레로 모 조직을 소생 시킵니다. 처리 후 5 d 내에서 사 구체를 계산 하는 것이 좋습니다.
- 조심 스럽게 12 웰 플레이트의 하나의 우물에 신장 용액의 µ L을 500. 이 2 배를 반복 하 여 각 매 취 액을 별도의 우물에 두어 신장 당 세 개의 웰이 있고 삼중 분석을 수행 합니다.
- 신장 용액을 포함 하는 3 개의 웰 각각에 500 µ L의 PBS를 추가 하 여 1:1 희석 하십시오.
- 반전 현미경을 사용 하 여, 잘 당 사 구체 수를 세어. 계수는 각 웰의 하단에 배치 된 16 개의 개별 섹션 그리드를 사용 하 여 지원 됩니다. 각 그 리딩 된 섹션 당 사 구체 수를 세어 다음 그리드 당 수를 합산 하 여 웰 당 사 구체 총 수를 얻습니다. 사 구체는 그들의 구형 구조에 의해 쉽게 식별할. 추가 식별자에는 혈액으로 채워진 모세 혈관으로 인 한 붉은 색조 뿐만 아니라 개별 사 구체 신체에 부착 된 상태를 유지 하는 사전 또는 사후 세 동맥 포함 되어 있습니다 (그림 1).
- 사 구체의 총 수를 추가 3 개의 우물의 각각에 대해 계산 후 신장 용액 500 µ L 당 사 구체의 평균 수에 대해 세 가지로 나누어. 웰 당 평균 사 구체 수의 분산이 10%를 초과할 경우, 신장 용액의 균질 한 성질에 세심 한 주의를 기울여 네 프 론의 계수 절차를 반복 합니다. 사 구체는 신장 당 사 구체 평균 수에 대 한 웰 타임즈 100에 계산 된 수를 곱합니다. 총 네 프 론의 수는 신장 당 또는, mg 또는 조직의 g 당 신장 체중을 사용 하 여 발현 될 수 있다.
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Representative Results
다음은 고혈압의 확립 된 마우스 모델과 연령과 관련 된 만성 신 장병의 유전 쥐 모델에서 전체 신장 네 프 론의 대표적인 추정치입니다. 사전 또는 사후 arteriolar 또는 관 형 구조물을 부착 하거나 포함 하지 않은 구형 구조와 같은 사 구체를 식별 하는 주요 특성은 산 침 용 법에 새로운 것을 강조 합니다 (그림 1).
제 1 실험 예에 있어서, 총 네 프 론의 숫자는 14 일 동안 비 히 클 (염 분) 또는 안 지 오 텐 신 II를 포함 하는 쥐 (남성 C57BL 6 주)에서 측정 하였다. 차량 주입 마우스에서, 네 프 론 수는 산 성 침 용 법을 이용 하 여 결정 된 대로 신장 당 12411 ± 248 네 프 톤 이었다 (도 2). 이러한 추정값은 마우스에서 이전에 보고 된 전체 신장 네 프 론의 범위와 일치 합니다 (표 1). 안 지 오 텐 신 주입 후 14 일에 약 40 mmHg에 의해 심 방 압력을 증가 하 고 거의 26%의 네 프 론 수 (신장 당 9122 ± 193 네 프 톤)의 현저한 감소와 관련 되었다 (그림 2). 이러한 데이터는 안 지 오 텐 신 II 주입은 고혈압과 관련이 있을 뿐만 아니라, 네 프 론의 현저한 감소는 경화 증 이나 사 구체 부상으로 인 한 네 프 론의 손실과 관련이 있음을 시사 한다.
제 2 실험 예에서, 이전에 발견 된 네 프 론의 유전자 래 쥐 모델에서의,이 질적으로 유래 된 신장 질환 (HSRA) 쥐의 이종의 주식 파생 모델을 확인 하였다. HSRA 모델은 신장과 요로의 결함에 대 한 불완전 한 침투 표현 형을 전시, 일부 동물은 정상 태어난 되 고 (두 개의 신장) 그리고 다른 하나 개의 신장으로 태어난. 2 개의 신장 (남성 hA-대조; 12 주)으로 태어난 쥐에서, 산 성 침 용 법을 사용한 네 프 론의 추정치는 신장 당 27288 ± 336 네 프 론 이었다 (그림 3). 대조적으로, 독방 신장으로 태어난 쥐에서 (남성 하-독방; 4 주 나이) 네 프 론의 추정치는 신장 당 24594 ± 883 네 프 론에서 현저히 낮은 것으로 나타났다 (도 3). 이들 샘플에서 달성 된 네 프 론의 추정값은 또한 쥐에서 이전에 보고 된 범위와 일치 합니다 (표 1). 이러한 데이터는 이전에 발견 된 것과 일치 하는 것으로, hA-독방 쥐가 감소 된 네 프 론의 엔 다 우먼 트 또는 숫자를 전시 하는 것으로 밝혀졌다 (하나의 대조 신장에 비해) 가장 가능성이 태어난 것과 관련 된 근본적인 유전 인자의 반사 단일 신장31.
그림 1 : 전체 신장 네 프를 계산 하 고 평가 하기 위한 사 구체의 키 식별자. 사 구체는 화살표에 의해 지시 된 대로, 그들의 구형 구조에 의해 쉽게 식별 가능 합니다. 추가 식별자는 혈액 채워진 모세 혈관으로 인해 붉은 색조를 포함, 뿐만 아니라 사전 또는 사후 세 동맥 (또는 세관) 다음 처리의 본문에 부착 된 남아 있을 수 있습니다 (이의 하단에 식별 된 것과 같은) 현미경 사진). 또한이 이미지에는 세관 및 혈관의 잔재가 있습니다. 배율 = 10 배; 축척 막대 = 100 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오 .
그림 2 : 생쥐에서 네 프 론의 계산. (A) 사 구체를 단일 마우스 신장에서 22.1의 대표적인 이미지로 서, 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 본 것 처럼 12 웰 배양 판의 잘 바닥에 도금 하였다. 사 구체 및 신장 관은 2의 요인에 의해 희석 될 때 적당 한 조밀도에서 보입니다 (신장 액의 0.5 mL 플러스 1ppbs의 0.5 mL). (B) 사 구체 계수에 의해 평가 되는 남성 C57Bl/6 마우스의 네 프 론의 숫자에 대 한 14 일간의 차량이 나 안 지 오 텐 신 II 주입의 효과. 1000 ng/kg/min에서 안 지 오 텐 신 II 주입 (삼 투 압 미니 펌프를통해 )은 고혈압과 관련이 있었고, 차량에 주입 된 생쥐의 네 프 론의 숫자에 비해 네 프 론의 숫자가 감소 하는 것으로 표시 되었습니다. 차량 주입 된 쥐의 네 프 론의 숫자는 마우스에서 이전에 보고 된 네 프 론의 추정 수와 일치 한다 (표 1). 차량: n=3 , 안 지 오 텐 신 II: n=3 < 0.05. 오류 막대 = SE 배율 = 4X; 축척 막대 = 250 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오 .
그림 3 : 네 프 론의 쥐에서 계산. (A) 단일 쥐 신장에서 사 구체를 대표 하는 이미지는 12 웰 배양 판으로 22.1-바닥에 잘 도금 되 고 거꾸로 된 현미경을 사용 하 여 볼 수 있다. 사 구체와 신장 관은 마우스에 그와 비교 하 여 현저 하 게 더 높은 조밀도에서 보입니다. (B) Hsra-제어 및 Hsra-s 쥐에서 네 프 론의 정량화는 네 프 론의 수는 Hsra-C 랫에 비하여 Hsra-s에서 더 적은 것을 밝혀이 모델 (31)의 이전 결과와 일치 하였다. HSRA C, 두 개의 신장으로 태어난 쥐: n=3 ; 하 스 라-외 톨로 태어난 쥐: n=3 , < 0.05. 오류 막대 = SE 배율 = 4X; 축척 막대 = 250 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오 .
| 종 | 신장 당 네 프 람 수 | 참조 |
| 마우스 | 9000-21000 | 28 일 17 |
| 쥐 | 13000-27000 | 31, 33 |
| 양 | 200000-800000 | 23, 29, 34 |
| 돼지 | 1600000-4600000 | 32, 35 |
| 인간의 | 500000-2000000 | 8-15 |
표 1: 여러 종의 보고 된 네 프 론의 범위.
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Discussion
좋은 실험 기법으로, 산 침 용 방법은 전체 신장의 네 프 론의 수를 추정 하는 데 이상적입니다. 신장은 산에 용 해 되지만, 사 구체는 크게 그대로 유지 하 고 쉽게 식별, 개별 사 구체 계산 상대적으로 쉽고 간단 하 게. 산 성 침 용 기법은 특히 여러 가지 이유로 유리 하다. 첫째, 산 성 침 용 법은 비용과 물리적 노력의 측면에서 상대적으로 적은을 필요로 하는 신속 하 고 편리한 방법입니다. 산 성 침 용 법을 수행 하는 데 필요한 모든 시 약과 소모품은 대부분의 기본 실험실에서 쉽게 구할 수 있으며, 사 구체 계산을 위한 도립 현미경에 대 한 접근이 유일한 주요 요구 사항입니다. 비용 측면에서, 산 침 화 방법은 동물 당 단지 몇 백 달러 비용을 추정 하 고,이는 자기 공명 영상과 같은 전체 신장 사 구체 카운팅의 다른 방법과 관련 된 비용에 비해 많은 경우, 스캔 시간 및 기술 전문성의 동물 당 수천 달러에 이르기까지 다양 할 수 있습니다.
둘째, 상기 산 침 용 법은 상기 dissector/fractionator 방법 (24)과 같은 전체 신장의 네 프 론의 다른 방법에 비해 조직 처리 시간이 현저히 적게 수반 된다. 처음부터 끝까지, 산 성 침 용 법은 총 시간의 24 시간 미만이 필요 하며,이 중 1-2 시간은 신장 처리에 소요 되 고 실험 동물 당 개별 사 구체를 세는 데 소비 됩니다. 대조적으로, 디스 섹터/fractionator 방법은 노동 집약적 이다, 신장 당 4-6 시간 (절편, 2-3의 염색 시간 및 4-5 시간의 소요 시간)을 필요로 하며, gl에서 신장을 처리 하는 데 필요한 48-72 시간을 포함 하지 않음 ycol 메타 크 릴레이 트24. 비용과 시간의 장점 때문에, 산 침 용 방법은 유전적 또는 약리학 적 개입 유무에 관계 없이 많은 수의 동물에서 전체 신장 네 프 론의 추정치를 만들 필요가 있는 연구에서 특히 유용 하다. Dissector/fractionator 방법과 자기 공명 영상과 관련 된 비용과 시간은 대부분의 연구 실험실에서 채택 되는 중요 한 제한 요소로 간주 되었습니다.
마지막으로, 상기 산 침 용 법은 자기 공명 영상 (26)과 같은 보다 정교한 방법을 사용 하 여 측정에 필적 하는 전체 신장의 네 프 론의 추정치를 제공 한다. 예를 들어, 사 구체 및 3 차원 이미지 처리의 양이온 페리 틴 라벨링을 사용 하 여 스 프랫 그-다우 래 쥐에서 단일 신장의 모든 네 프 론의 계산, 자기 공명 영상 당 평균 34000 개별 사 구체 신장26. 비 양이온 페리 틴 표지 신장에서, 자기 공명 영상으로 인해 페리 틴 표지 사 구체와 유사한 크기와 모양의 자기 신호와 신장의 비 사 구체 영역의 카운트에 2000 네 프 온 같은 구조를 산출. 이러한 아티팩트는 양이온 페리 틴 표지 신장에 의해 결정 된 카운트에서 감산 되는 경우, 사 구체 결정의 유효 수, 자기 공명 영상을 사용 하 여, 신장26당 32000 네 프 론에 가깝다. 이 같은 연구에서, 검증 실험은 산 성 침 용 법26을 사용 하 여 신장 당 31000의 평균 사 구체 카운트를 산출 했습니다. 따라서, 상기 산 침 용 법은 자기 공명 영상 화와 같은 최첨단 기술을 사용 하 여 결정 된 그 중 < 5% 내에 있는 전체 신장의 네 프 론의 추정치를 생성 한다.
산 침 용 방법과 관련 된 몇 가지 주요 이점이 있지만, 조사자는 또한이 방법과 관련 된 한계를 알고 있어야 합니다. 한 가지 제한은 전체 신장의 사용에 관한 것입니다. 전체 신장이 용 해 되 고 균질 화 됨에 따라, 신장 피 질 내에서 사 구체의 공간적 분포에 관한 정보는 결정 될 수 없다. 사 구체 부피의 신장 내 분포를 아는 것이 중요 하다 면 자기 공명 화상 진 찰을 사용 하는 것이 더 적합 한 방법이 될 것입니다.
다른 방법 들에 비해, 산 성 침 용 법의 사용은 총 네 프의 수를 약간 과소 평가 하는 것으로 보인다. 작은 추정치는 부분적으로, 산에서 사 구체 또는 신장의 침 강 중에 작은 비율의 용 해로 인해 가능성이 높습니다. 또한, 노화 또는 질병에는 기능성 네 프 론의 손실이 있는데,이는 소변 형성에 기여 하지 않지만, 산 침 용에 더 민감 할 수 있고 가공 중에 파괴 될 수 있으며, 따라서 총 네 프 론의 낮은 추정치에 기여 수. 따라서 신장을 수집 하 고, 조직 샘플을 압출 할 때 주사기에 신장 조직을 남기지 않도록 신장 처리를 할 때에는 치료를 사용 해야 한다. 전반적으로, 그러나, 조직 처리에 기인한 총 네 프 론의 수의 과소 평가는 상대적으로 작은 것으로 나타난다.
사 구체를 계산 하는 것은 산 성 침 용 법을 사용 하 여 주관적으로, 네 프 론의 과소 평가는 또한 관찰자 바이어스의 반사 될 수 있으며,이는 두 개의 별개의 조사자에 의해 수행 되는 측정에 의해 용이 하 게 극복 될 수 있다. 실험 동물 또는 상태에 관한 정보. 사 구체을 구성 하는 것에 대 한 중요 한 우려가 있는 경우, 대안적 접근법은 안락사 전에 산화 철을 갖는 실험적 동물을 주입 하는 것을 수반할 것 이다. 정 맥에 주입 될 때, 산화 철은 들어가고 사 구체에 갇혀 될 것입니다; 따라서, 처리 된 사 구체는 어두운 검정 얼룩 해야, 사 구체의 더 큰 식별을 허용30.
상기 산 침 용 법은 신장의 전체 용액 (50 mL)의 측정에 반대 되는 작은 샘플 (3 x 0.5 mL 또는 1.5 mL)의 측정에 기초한 전체 신장 네 프 론의 수를 추정 한다. 산 침 용 법은 자연에서 매우 재현성이 높고, 사 구체는 단일 신장의 샘플 내에서 실험 그룹 내에서 매우 일관성이 있는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 단일 신장으로 태어난 야생 형 C57Bl/6 마우스와 쥐 로부터 본 연구에서 보고 된 대표적인 결과 (도 2 및 3)는 이전에 보고 된 범위 뿐만 아니라 이전의 연구 결과와 매우 일관성이 있다 (표 1 )5,31. 원할 경우, 추가 측정은 신장 당 총 네 프 론의 수를 더 잘 추정 하기 위해 쉽게 만들어질 수 있습니다.
산 침 용 기술은 네 프 론의 신뢰할 수 있고 반복 가능한 추정치를 제공 하는 동안,이 방법은 사 구체 부피의 측정을 얻기 위한 권장 하지 않습니다, 산에 노출은 대부분의 가능성을 생산 하는 구 스의 볼륨. 사 구체 부피의 결정은 전체 신장 신 구 표면적을 결정 하는 데 중요 하므로, 이러한 측정은 조직학 및 입체 방법24,25를 사용 하 여 수행 하는 것이 좋습니다. 특히, 글리콜 메타 크 릴레이 트를 사용 하는 입체 방법은 조직 팽 윤 및 팽창을 제한 하기 위해 신장을 포함 하 고, 따라서 생체 내에서가능한 한 가깝게 사 구체 기하학을 유지 한다.
마지막으로, 산 침 용 기술의 또 다른 제한은 네 프 론의 숫자를 평가 하는 다른 방법에 공통적 인 하나, 사 구체 기능에 대 한 정보 (사 구체 여과 속도 등)는 사 구체에서 확인할 수 있습니다 한 번 처리. 따라서, 개별적인 사 구체는 계산 될 수 있지만, 그의 기능적 상태 (소변 형성 또는 비 소변 형성)는 산 성 침 용 법을 사용 하 여 결정할 수 없다. 마찬가지로, 개별 마우스에서 산 성 침 용 방법을 사용 하 여 길이 정보를 확인할 수 없습니다. 대신, 다양 한 시점에서 동물의 개별 그룹은 동물의 수명 또는 사전 또는 사후 유전학 적 개입을 통해 네 프 론의 수의 변화에 대 한 통찰력을 얻기 위해 필요 합니다.
요약 하자면, 상기 산 침 용 법은 전체 신장 네 프 론의 수를 추정 하는 저비용, 고 처리량 및 효율적인 방법 이다. 상기 산 침 용 법은 여기에 제시 된 두 가지 예에 의해 입증 된 바와 같이 높은 재현성을 제공 하며,이 방법을 사용 하 여 이전에 보고 된 것 뿐만 아니라18,19,20,21 , 22 , 28. 상기 산 침 용 법을 사용 하 여 마우스 (및 랫 트)에 사용 하는 것을 설명 하였으나, 상기 산 침 용 법은 개 및 돼지27,32등의 큰 종에서 사용 하기 위해 또한 스케일링 될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 사업은 건강의 국가 학회, 국가 심장, 폐 및 혈액 학회에 의해 부분적으로 지원 되었습니다 (R01HL107632).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
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