Summary
Estimater av hele nyre nephron tall er viktige klinisk og eksperimentelt, som det er en invers assosiasjon mellom nephron tall og en økt risiko for nyre-og hjerte-og karsykdommer. Heri, bruk av syre maserasjon metoden, som gir raske og pålitelige estimater av hele nyre nephron tall, er demonstrert.
Abstract
Nephron legat refererer til det totale antall nephrons en person er født med, som nephrogenesis hos mennesker er fullført innen 36 uker av svangerskapet og ingen nye nephrons dannes etter fødselen. Nephron nummer refererer til det totale antallet nephrons målt på et hvilket som helst tidspunkt etter fødselen. Både genetiske og miljømessige faktorer påvirker både nephron begavelse og antall. Forstå hvordan spesifikke gener eller faktorer påvirker prosessen med nephrogenesis og nephron tap eller død er viktig som individer med lavere nephron legat eller antall antas å være på en høyere risiko for å utvikle nyre-eller hjerte-og karsykdommer. Forstå hvordan miljømessige eksponeringer i løpet av en persons levetid påvirker nephron tall vil også være avgjørende for å bestemme fremtidig sykdomsrisiko. Dermed er evnen til å vurdere hele nyre nephron nummer raskt og pålitelig en grunnleggende eksperimentell krav til bedre å forstå mekanismer som bidrar til eller fremme nephrogenesis eller nephron tap. Her beskriver vi syre maserasjon metode for estimering av hele nyre nephron tall basert på prosedyren beskrevet av Damadian, Shawayri, og Bricker, med små modifikasjoner. Den syre maserasjon metoden gir raske og pålitelige estimater av nephron tall (som vurdert ved å telle glomeruli) som er innenfor 5% av de som bestemmes ved hjelp av mer avanserte, om enn dyrt, metoder som magnetisk resonans imaging. Videre er syre maserasjon metoden en utmerket høy gjennomstrømming metode for å vurdere nephron tall i et stort antall prøver eller eksperimentelle forhold.
Introduction
Nephron er både grunnleggende strukturelle og funksjonell enhet av nyre1. Strukturelt, består nephron av glomerulus (blodkar og podocytes) ligger innenfor Bowman ' s kapsel og renal tubule, bestående av proksimale tubule, loopen av Henles, og den fremre tubule som opphører i samlerøret. Funksjonelt, er rollen til nephron filtrering og reabsorpsjon av vann og elektrolytter og utskillelsen av avfall. Generelt, nephrogenesis er fullført på 36 uker av svangerskapet hos mennesker og kort tid etter fødselen i flere arter som musen og rotte2. Nephron legat refererer til det totale antall nephrons som en person er født med, mens Nephron tall er det totale antall nephrons målt til enhver tid etter fødselen3. Termen nephron nummer og glomerulær nummer brukes ofte om hverandre. Fordi det bare er én glomerulus per nephron, er vurderingen av glomeruli nummer et viktig surrogat for estimering av nephron nummer.
Vurderingen av nephron legat og nephron tall er av klinisk interesse som studier har vist en assosiasjon mellom nephron legat og reduserte nephron tall med en økt forekomst av kardiovaskulær sykdom4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. basert på funn i nyrer ved obduksjon, observerte brenner at hypertensive individer presentert med et lavere antall nephrons enn normotensive individer individer16. Brenner hypotetisk gjennomsnitt derfor at det er en invers sammenheng mellom nephron tall og risikoen for å utvikle hypertensjon senere i livet. Brenner også hypotetisk gjennomsnitt at en reduksjon i nephron tall ble kompensert for av nephrons som forble. For å opprettholde den normale filtrerings hastigheten i nyrene, vil resterende nephrons kompensere ved å øke deres glomerulær overflateareal (glomerulær hypertrofi), og dermed arbeide for å dempe enhver negativ effekt av nephron tap på nyrefunksjon4 ,16.
Mens beskyttende på kort sikt, glomerulær hypertrofi, på lang sikt, fører til økt natrium og væskeretensjon, økt ekstracellulære væske volum, og økninger i arteriell blodtrykk, fører til en ond sirkel av ytterligere økninger i glomerulær kapillær trykk, glomerulær hyperfiltration, og nephron arrdannelse (sklerose) og skade4,16.
Innhenting av estimater eller tellinger av nephron tall tilbyr et par eksperimentelle fordeler: 1) det gir informasjon om prosessen med nephrogenesis, som deretter kan knyttes til spesifikke gener eller faktorer i det embryo eller mors-fosterets miljø, og 2) Det er en sammenslutning av nephron tall med kardiovaskulær sykdom, og dermed er det mulig at estimater av nephron tall kan brukes til å forutsi fremtidig kardiovaskulær risiko2,17,18, 19 andre priser , 20 priser og , 21 priser og , 22. i tillegg til mors-fosterets miljø, flere sykdommer direkte innvirkning nephron tall og nyrefunksjon, inkludert aterosklerose, diabetes, hypertensjon, og til og med normal aldring2,9, 10,11,12,22,23. Dermed er vurdering av hele nyre nephron tall viktig å forstå både genetiske og miljømessige faktorer som påvirker nephrogenesis (dvs.nephron legat) og nephron nummer i løpet av en persons liv og de resulterende effektene på nyrefunksjon og kardiovaskulær helse.
For tiden er det flere metoder tilgjengelig for fastsettelse og kvantifisering av nephron nummer, hver med sine egne fordeler og begrensninger24,25,26,27,28 ,29,30. Sofistikerte metoder for å bestemme hele nyre nephron tall inkluderer stereological metoder, slik som dissector/fractionator metode, og magnetisk resonans imaging25,26. Ofte betraktet som gull-standarden for å bestemme hele nyre nephron tall, dissector/fractionator metoden er både dyrt og tidkrevende. Nylige fremskritt og forbedring i magnetisk resonans imaging og prosessering har gitt verktøyene til å telle hver nephron individuelt. Imidlertid er magnetisk resonans imaging ikke bare tidkrevende, men også svært kostbart. I tillegg krever både dissector/fractionator metode og magnetisk resonans imaging avansert teknisk ekspertise, og dermed begrense bruken av slike metoder i de fleste forskningslaboratorier.
De fleste metoder for å bestemme nephron nummer gjør tellinger eller estimater basert på identifisering av glomeruli, som de er lett identifiserbare strukturelt. I dette papiret er syre maserasjon metode for å estimere nephron tall i hele nyrene beskrevet og demonstrert27. Den syre maserasjon metoden er rask, pålitelig, og betydelig rimeligere enn andre metoder, for eksempel dissector/fractionator metode og magnetisk resonans imaging. Videre gir syre maserasjon metoden svært repeterbar estimater av nephron tall som er rapportert å være innenfor rekkevidden av de som bestemmes ved hjelp av magnetisk resonans imaging26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsyninger og reagenser listet nedenfor er for fastsettelse av hele nyre nephron tall i én mus, det vil si to nyrer. Modifiseringer for bruken av syren maserasjon metoden for rotten er kjennemerke med stjernene. Alle eksperimentelle protokoller likedannet til National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr og ble godkjent av den institusjonelle Animal Care og use Committee ved University of Mississippi Medical Center.
1. nyre isolasjons prosedyre
- Veie musa (eller andre arter) og euthanize det med en isoflurane (5%-8%) overdose eller pentobarbital (150 mg/kg intraperitoneal injeksjon).
- Når musen er euthanized, åpne bukhulen med fin kirurgisk saks langs midtlinjen.
- Løft tarmen og reproduksjons fett på høyre side av bukhulen. Ved grov disseksjon, isolere venstre nyre. Ved hjelp av fine kirurgiske saks, kutt venstre nyre arterien og vene og forsiktig fjerne venstre nyre, plassere nyrene i en hensiktsmessig merket (mus nummer/identifikator) veie båt som inneholder fosfor-bufret saltvann (PBS).
- Gjenta prosedyren for riktig nyre.
- Fjern hver nyre fra sine respektive veie båt og plassere den på et kirurgisk gasbind pre-fuktet med PBS.
- Leaving nyrene på kirurgisk gasbind, raskt fjerne eventuelle tilhenger ikke-nyre vev (for eksempel perirenal fett eller adrenal kjertel) etterfulgt av fjerning av nyre kapselen. Veie hver nyre individuelt, registrerer vekten av venstre og høyre nyre separat i en laboratorie notatbok.
2. homogenisering, Inkubasjons, og anstrengende prosedyrer
- Når hver nyre veies, avløp hver veie båt av PBS og plassere nyrene tilbake i riktig merket veie båten. Ved hjelp av en ren barberhøvel blad, kutt nyrene i to, på langs. Plasser hver nyre halvdel vendt ned og skjær hver halvdel i 2 mm eller mindre stykker.
- Ved hjelp av samme barberblad, nøye samle og plassere hakket nyre brikker i en merket 15-mL konisk rør (mus nummer/identifikator; venstre versus høyre nyre).
- Gjenta prosedyren for motsatt nyre, ved hjelp av et nytt barberblad. Plasser hakket nyre i en separat merket 15-mL konisk rør.
- I et godt ventilert avtrekks deksel tilsett 5 mL av 6 M saltsyre (HCl) syre til hvert 15 mL konisk rør.
- Sett hetten på det koniske røret, forsiktig agitere nyre/HCl blandingen, og plasser 15 mL konisk rør i et forvarmet vannbad satt til 37 ° c for 90 min (* 120 min for rotte nyrer).
- Agitere kort hvert 15-mL rør hver 15 min i løpet av inkubasjons for å sikre at alt vev utsettes for HCl acid.
- Sett en 18-G nål i en 5 mL sprøyte (* 10 mL sprøyte for rotte) og fjern stempelet forsiktig. Plasser sprøyten i et 50 mL konisk rør (rør #1) i en avtrekks hette.
- Fjern nyre/HCl-løsningen fra vannbadet og hell vevs løsningen inn i den åpne enden av sprøyten og sett 15 mL konisk rør til side i et reagensglasstativ. Erstatt stempelet forsiktig og skyv stempelet langsomt slik at det extrude gjennom nålen og inn i røret #1.
- Vask 15 mL konisk rør med 5 mL PBS løsning. Snurr PBS i 15 mL konisk rør for å solubilize eventuelle gjenværende nyre vev.
- Igjen, forsiktig fjerne stempelet fra 5-mL sprøyten inneholder 18-G nål og hell innholdet fra 15-mL konisk rør i den åpne enden av sprøyten. Erstatt stempelet og skyll sprøyten forsiktig ved å skyve stempelet forsiktig ned i rør #1. Gjenta denne prosessen 2x (utført 3x totalt).
- Sett en 21-G nål inn i en ny 5 mL sprøyte (* 10 mL sprøyte for rotte) og fjern forsiktig sprøytestempelet. Plasser sprøyten med 21-G nålen festet til et nytt 50-mL konisk rør (tube #2).
- Hell innholdet fra røret #1 inn i den åpne enden av sprøyten som inneholder 21-G nålen. Sett forsiktig inn stempelet og skyll sprøyten ved å skyve forsiktig ned på sprøytestempelet og plassere ekstrudert oppløsning i rør #2.
- Vask rør #1 med 5 mL PBS løsning. Snurr PBS i rør #1 slik solubilize eventuelle gjenværende nyre vev.
- Igjen, forsiktig fjerne stempelet fra 5-mL sprøyten inneholder 18-G nål og helle innholdet fra røret #1 inn i den åpne enden av sprøyten. Bytt forsiktig ut stempelet og skyll sprøyten ved å skyve forsiktig ned på stempelet, ekstrudering løsningen inn i rør #2. Gjenta denne prosessen 2x (utført 3x totalt).
- Bring det totale volumet av rør #2 opptil 50 mL ved å legge til ekstra PBS, opp til 50-mL linje på rør #2.
- Ruge tube #2 som inneholder nyre vevs løsningen i et tube rack på en rocker plate i et kjøleskap satt til 4 ° c over natten (minimum 8-10 h).
3. telling av glomeruli og ekstrapolering av Nephron nummer
- Fjern slangen #2 fra kjøleskapet og resuspend pelleted vevet ved forsiktig å invertere røret flere ganger for å skape en homogen løsning. Vi anbefaler å telle glomeruli innen 5 d etter behandling.
- Nøye alikvot 500 μL av nyre løsningen i en enkelt brønn av en 12-brønn plate. Gjenta denne 2x, plassere hver alikvot i en egen brønn slik at det er tre brønner av nyre oppløsning per nyre, for analyse i tre eksemplarer.
- Tilsett 500 μL av PBS til hver av de tre brønnene som inneholder nyre løsningen, for en 1:1 fortynning.
- Bruk et omvendt mikroskop og Tell antall glomeruli per brønn. Telling er hjulpet ved hjelp av et rutenett av 16 separate seksjoner plassert på bunnen av hver brønn. Tell antall glomeruli per gridded del, og summer deretter antallet per rutenett for å få totalt antall glomeruli per brønn. Glomeruli er lett identifiserbare av deres sfærisk struktur. Ytterligere identifikatorer inkluderte en rødlig nyanse på grunn av blod-fylte kar, samt pre-eller post-arterioler som forblir festet til kroppen av individuelle glomeruli (figur 1).
- Legg til totalt antall glomeruli som telles per hver av de tre brønnene, og del dem deretter med tre for gjennomsnittlig antall glomeruli per 500 μL av nyre løsning. Hvis variansen i gjennomsnittlig antall glomeruli per brønn er større enn 10%, gjentar du nephron-prosedyren, med hensyn til den homogene typen nyre løsning. Multipliser antall glomeruli telles per brønn ganger 100 for gjennomsnittlig antall glomeruli per nyre. Totalt nephron tall kan uttrykkes per nyre eller ved hjelp av nyre vekt, per mg eller g av vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nedenfor er representative anslag over hele nyre nephron tall fra en etablert mus modell av hypertensjon og en genetisk rotte modell av alder-relaterte kroniske nyresykdom. Nøkkel identifiserende kjennetegn ved glomeruli, slik som en sfærisk struktur med eller uten vedlagt pre-eller post-arterioler eller rørformede strukturer, er uthevet for de som er nye til syre maserasjon metode (figur 1).
I det første eksperimentelle eksempelet ble totalt nephron tall bestemt hos mus (mannlig C57BL/6, 6 ukers alder), fylt med kjøretøy (saltvann) eller angiotensin II i 14 dager. I mus med kjøretøy, var nephron nummer 12 411 ± 248 nephrons per nyre som bestemmes ved hjelp av syre maserasjon metoden (figur 2). Disse anslagene er i samsvar med områder av hele nyre nephron tall rapportert tidligere hos mus (tabell 1). Angiotensin økte atrieflimmer ved ca 40 mmHg etter 14 dager med infusjon og var assosiert med en signifikant reduksjon i nephron tall (9 122 ± 193 nephrons per nyre) på nesten 26% (figur 2). Disse dataene tyder på at angiotensin II infusjon er ikke bare forbundet med hypertensjon, men også en betydelig reduksjon i nephron tall er forbundet med nephron tap på grunn av sklerose eller glomerulær Kader.
I den andre eksperimentelle eksempel tidligere funn av nephron nummer i en genetisk rotte modell av renal Agenesis, den heterogene lager-avledet modell av ensidig nyre Agenesis (HSRA) rotte, ble bekreftet. Den HSRA modellen viser ufullstendig penetrans fenotyper for defekter i nyre-og urinveiene, med noen dyr blir født normalt (med to nyrer) og andre født med en nyre. Hos rotter født med to nyrer (mannlig hA-kontroll, 12 ukers alder), var estimater av nephron tall ved hjelp av syre maserasjon metoden 27 288 ± 336 nephrons per nyre (Figur 3). I kontrast, hos rotter født med en enslig nyre (hann hA-ensom; 4 ukers alder) estimater av nephron tall ble funnet å være signifikant lavere ved 24 594 ± 883 nephrons per nyre (Figur 3). Estimater av nephron tall oppnådd i disse prøvene er også i samsvar med områder som tidligere er rapportert i rotte (tabell 1). Merk at disse dataene er i samsvar med tidligere funn der hA-ensom rotter ble funnet å vise redusert nephron legat eller tall (sammenlignet med en kontroll nyre) mest sannsynlig gjenspeiler de underliggende genetiske faktorene forbundet med å bli født med en enkelt nyre31.
Figur 1 : Nøkkel identifikatorer for glomeruli for telling og vurdering av hele nyre nephron tall. Glomeruli er lett identifiserbare av deres sfærisk struktur, som indikert av pilene. Ytterligere identifikatorer inkluderer en rødlig nyanse på grunn av blod-fylte kar, samt pre-eller post-arterioler (eller tubuli) som kan forbli festet til kroppen av individuelle glomeruli følgende behandling (som den som er identifisert på bunnen av denne mikroskop). Også til stede i dette bildet er rester av tubuli og blodkar. Forstørrelse = 10X; Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Nephron telling i mus. (A) representativt bilde av glomeruli fra en enkelt mus nyre belagt i en 22,1 mm flat bunn brønn av en 12-brønn kultur plate, som sett ved hjelp av en invertert mikroskop. Glomeruli og renal tubuli er sett ved moderat tetthet når fortynnet med en faktor på to (0,5 mL nyre oppløsning pluss 0,5 mL 1x PBS). (B) effekten av en 14-dagers bil eller angiotensin II-infusjon på nephron tall i mannlige C57Bl/6-mus som vurdert av glomerulær telling. Angiotensin II infusjon ved 1 000 ng/kg/min (via osmotisk minipump) ble assosiert med hypertensjon og en markert en reduksjon i nephron antall i forhold til det nephron tallet i mus fylt med kjøretøy. Nephron tall i mus med kjøretøy er i samsvar med tidligere rapporterte anslag over Nephron tall i mus (tabell 1). Kjøretøy: n = 3, angiotensin II: n = 3, *p < 0,05. Feilfelt = SE. forstørrelse = 4X; Scale bar = 250 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Nephron telling i rotter. (A) representativt bilde av glomeruli fra en enkelt rotte nyre belagt i en 22,1 mm flat bunn brønn av en 12-brønn kultur plate, som sett ved hjelp av en invertert mikroskop. Glomeruli og renal tubuli er sett på en betydelig høyere tetthet i forhold til at i musen. (B) kvantifisering av det nephron antallet inne HSRA-administrere og HSRA-s rotter avsløre det nephron antallet er færre inne HSRA-s idet SAMMENLIGNET med HSRA-C rotter og forenlig med foregående resultater i denne modell31. HSRA-C, rotter født med to nyrer: n = 3; HSRA-S, rotter født med en ensom nyre: n = 3,* p < 0,05. Feilfelt = SE. forstørrelse = 4X; Scale bar = 250 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Arter | Nephron nummer per nyre | Referanse |
| Musen | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| Rat | 13000-27000 | 31, 33 |
| Sau | 200000-800000 | 23, 29, 34 |
| Gris | 1600000-4600000 | 32, 35 |
| Menneskelige | 500000-2000000 | 8-15 for alle |
Tabell 1: rapporterte områder med nephron nummer i flere arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med god eksperimentell teknikk, er syre maserasjon metoden ideelt for å estimere nephron tall i hele nyrene. Selv om nyrene er oppløst i syre, glomeruli fortsatt i stor grad intakt og er lett identifiserbare, slik at telling av individuelle glomeruli relativt enkel og grei. Syren maserasjon teknikk er spesielt fordelaktig av flere grunner. For det første er syre maserasjon metoden en rask og praktisk metode som krever relativt lite i forhold til regning og fysisk anstrengelse. Alle reagenser og forbruksvarer som kreves for å utføre syre maserasjon metoden er lett tilgjengelig i de fleste grunnleggende laboratorier, det eneste store kravet er tilgang til et invertert mikroskop for glomerulær telling. Når det gjelder regning, er det anslått at syre maserasjon metoden koster bare et par hundre dollar per dyr, som ikke er mye i forhold til kostnader forbundet med andre metoder for hele nyre glomerulær telling, for eksempel magnetisk resonans imaging, hvilke kanne omfang i tusenvis av dollar per dyr av skanning tid og teknisk ekspertise.
For det andre innebærer syre maserasjon metoden betydelig mindre vev-prosessering tid sammenlignet med andre metoder for hele nyre nephron tall som dissector/fractionator metode24. Fra Start til slutt, syre maserasjon metoden krever mindre enn 24 timer av total tid, hvorav mindre enn 1-2 timer er brukt behandling nyrer og deretter telle den enkelte glomeruli per forsøksdyr. I kontrast er dissector/fractionator metoden arbeidskrevende, krever anslagsvis 15 timer med arbeid (4-6 timer snitting, 2-3 timer farging, og 4-5 timer med telling tid) per nyre, ikke inkludert 48-72 timer som trengs for å behandle nyrene i GL ycol akrylat24. På grunn av fordelene med kostnader og tid, er syre maserasjon metoden spesielt nyttig i studier der estimater av hele nyre nephron nummer må gjøres i et stort antall dyr med eller uten genetiske eller farmakologiske intervensjoner. Både kostnader og tid involvert med dissector/fractionator metoden og magnetisk resonans imaging har vært betraktet som en stor begrensende faktor i sin adopsjon i de fleste forskningslaboratorier.
Endelig, syre maserasjon metoden gir estimater av hele nyre nephron tall som er sammenlignbare med tiltak ved hjelp av mer sofistikerte metoder som magnetisk resonans imaging26. For eksempel, ved hjelp av kationiske ferritin-merking av glomeruli og tredimensjonal bildebehandling for å telle hver nephron i en enkelt nyre fra Sprague-Dawley rotte, gitt magnetisk resonans imaging i gjennomsnitt teller på 34 000 individuelle glomeruli per nyre26. I ikke-kationiske ferritin-merket nyrer, magnetisk resonans imaging gitt teller av 2 000 nephron-lignende strukturer på grunn av telling av ikke-glomerulær regioner av nyre med magnetiske signaler av lignende størrelse og form som ferritin-merket glomeruli. Når disse gjenstandene trekkes fra antallet som bestemmes av kationiske ferritin nyrer, er det effektive antallet glomeruli som fastsettes ved bruk av magnetisk resonans imaging, nærmere 32 000 nephrons per nyre26. I den samme studien ga validerings eksperimenter gjennomsnittlige glomerulær tellinger på 31 000 per nyre ved bruk av syre maserasjon metoden26. Således, syren maserasjon metoden produserer estimater av hele nyre nephron tall som er innenfor < 5% av de som bestemmes ved hjelp av State-of-the-art teknikker som magnetisk resonans imaging.
Selv om det er flere viktige fordeler forbundet med syre maserasjon metoden, bør etterforskerne også være klar over begrensningene knyttet til denne metoden. En begrensning gjelder bruk av hele nyre. Ettersom hele nyrene oppløses og homogenisert, kan ikke informasjon om den romlige fordelingen av glomeruli i nyre barken fastslås. Hvis kjenne den Intrarenal fordelingen av glomerulær volum er viktig, så bruk av magnetisk resonans imaging ville være en bedre egnet metode.
Sammenlignet med andre metoder, synes bruken av syre maserasjon metoden til litt undervurdere total nephron tall. De mindre anslagene skyldes sannsynligvis delvis oppløsningen av en liten prosentandel av glomeruli i syren eller under maserasjon av nyrene. I tillegg, med aldring eller sykdom, det er et tap av funksjonell nephrons, som, selv om det ikke bidrar til urin dannelse, kan være mer følsomme for syre maserasjon og kan bli ødelagt under behandling, og dermed bidra til lavere estimater av total nephron Nummer. Derfor bør forsiktighet brukes ved innsamling og behandling av nyrer for ikke å etterlate noen nyre vev i vivo når du hakker nyrene, eller i sprøyter når du ekstrudering vevsprøver. Total, imidlertid, undervurdering av sum nephron antallet på grunn av tissue bearbeiding fremgår å bli relativt liten.
Som telling av glomeruli bruker syre maserasjon metoden er subjektiv, kan undervurdering av nephron tall også være reflektert av observatør bias, som lett kan overvinnes ved målinger som utføres av to separate etterforskere blindet til informasjon om forsøksdyr eller tilstand. Hvis det er en betydelig bekymring for hva som utgjør en glomerulus, en alternativ tilnærming vil innebære infusjonen eksperimentelle dyr med jernoksid før dødshjelp. Når tilført intravenøst, vil jernoksid inn og bli fanget i glomerulus; dermed behandles glomeruli bør flekken mørk svart, noe som åpner for en større identifisering av glomeruli ved telling30.
Syre maserasjon metoden anslår hele nyre nephron tall basert på måling av små prøver (3 x 0,5 mL eller 1,5 mL) i motsetning til målinger av hele løsningen av nyre (50 mL). Syre maserasjon metoden er svært reproduserbar i naturen, og glomeruli teller i prøver av en enkelt nyre og innenfor eksperimentelle grupper er funnet å være svært konsekvent. Videre representative resultater rapportert i denne studien fra vill-type C57Bl/6 mus og rotter født med en enkelt nyre (figur 2 og 3) er svært konsistent med tidligere funn, samt med områder tidligere rapportert (tabell 1 )5,31. Hvis ønskelig, kan flere målinger enkelt gjøres for å bedre anslå det totale nephron antallet per nyre.
Mens syre maserasjon teknikken gir pålitelige og repeterbar estimater av nephron tall, er denne metoden ikke anbefalt for å oppnå målinger av glomerulær volum, som eksponering for syre mest sannsynlig produserer endringer i glomeruli volum. Ettersom bestemmelse av glomerulær volum er viktig for å bestemme hele nyre glomerulær overflateareal, anbefales det at slike målinger gjøres ved hjelp av histologiske og stereological metoder24,25. Spesielt stereological metoder som gjør bruk av glykol akrylat legge nyrene for å begrense vev hevelse og ekspansjon, og dermed opprettholde glomerulær geometri så nært som mulig til at in vivo.
Til slutt, en annen begrensning av syre maserasjon teknikk, og en som er felles for andre metoder for å vurdere nephron nummer, er at ingen informasjon om glomerulær funksjon (for eksempel glomerulær filtrering rate) kan fastslås fra glomeruli gang Behandlet. Således, mens individuelle glomeruli kan telles, dens funksjonell status (urin-forming eller ikke-urin-forming) kan ikke bestemmes ved hjelp av syre maserasjon metoden. På samme måte kan ingen langsgående informasjon fastslås ved hjelp av syre maserasjon metoden i enkelte mus. I stedet, separat holdene av dyrene for forskjellige tid meningene er krevde å fortjene innblikk i endre inne nephron antallet over en dyrene ' levetid eller pre-eller postgenetic eller farmakologisk intervensjon.
Oppsummert er syre maserasjon metoden en lav pris, høy gjennomstrømming, og effektiv metode for å anslå hele nyre nephron tall. The Acid maserasjon metoden gir en høy grad av reproduserbarhet som dokumentert av de to eksemplene som presenteres her, så vel som av de tidligere rapportert ved hjelp av denne metoden18,19,20,21 , 22 av , 28. mens bruken av syre maserasjon metoden ble beskrevet for bruk i musen (og rotte), kan syre maserasjon metoden også skaleres for bruk i større arter, slik som hunden og gris27,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health, National Heart, Lung, og Blood Institute (R01HL107632).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
- Hall, J. E., Guyton, A. C. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 13th, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).
- Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
- Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
- Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
- Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
- Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
- Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension? American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
- Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
- Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other? American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
- Clark, A. T., Bertram, J. F.
- Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
- Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
- Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
- Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
- Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
- Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
- Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
- Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
- Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
- Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
- Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
- Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).
