Summary
पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या का अनुमान नैदानिक और प्रायोगिक रूप से महत्वपूर्ण हैं, के रूप में वहां नेफ्रॉन संख्या और गुर्दे और हृदय रोग के एक बढ़ाया जोखिम के बीच एक व्युत्क्रम संघ है । इस के साथ साथ, एसिड थकावट विधि का उपयोग करें, जो पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या के तेजी से और विश्वसनीय अनुमान प्रदान करता है, का प्रदर्शन किया है ।
Abstract
नेफ्रॉन एंडोमेंट का अर्थ होता है, एक व्यक्ति के साथ पैदा होने वाले नैफ्रन की कुल संख्या, क्योंकि मनुष्यों में वृक्कजनन गर्भकाल के ३६ सप्ताह तक पूरा हो जाता है और जन्म के बाद कोई नया नेफ्रन बनता है । वृक्कक संख्या का अर्थ होता है-जन्म के बाद किसी भी बिंदु पर मापा जाने वाला नेफ्रन की कुल संख्या । आनुवंशिक और पर्यावरणीय दोनों ही कारक नेफ्रॉन एंडोमेंट और संख्या दोनों को प्रभावित करते हैं । कैसे विशिष्ट जीन या कारकों nephrogenesis और नेफ्रॉन हानि या निधन की प्रक्रिया को प्रभावित करने के लिए कम नेफ्रॉन बंदोबस्ती या संख्या के साथ व्यक्तियों गुर्दे या हृदय रोग के विकास का एक उच्च जोखिम पर माना जाता है के रूप में महत्वपूर्ण है समझ । समझ कैसे एक व्यक्ति के जीवन भर के पाठ्यक्रम पर पर्यावरण जोखिम को प्रभावित करता है नेफ्रॉन संख्या भी भविष्य रोग जोखिम का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण होगा । इस प्रकार, पूरी तरह से गुर्दे नेफ्रॉन संख्या का आकलन करने की क्षमता जल्दी और मज़बूती से एक बुनियादी प्रयोगात्मक आवश्यकता को बेहतर बनाने के लिए तंत्र है कि योगदान करने के लिए या नेफ्रोजेनेसिस या नेफ्रॉन नुकसान को बढ़ावा देने के । यहां, हम पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या के अनुमान के लिए एसिड थकावट विधि का वर्णन दादीअन, shawayri, और bricker द्वारा वर्णित प्रक्रिया के आधार पर, मामूली संशोधनों के साथ । एसिड थकावट विधि नेफ्रॉन संख्या के तेजी से और विश्वसनीय अनुमान प्रदान करता है (के रूप में ग्लोमेरुली गिनती द्वारा मूल्यांकन) है कि उन के 5% के भीतर अधिक उंनत का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं, हालांकि महंगी, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग जैसे तरीकों । इसके अलावा, एसिड थकावट विधि बड़ी संख्या में नमूनों या प्रायोगिक स्थितियों में नेफ्रॉन संख्या का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट उच्च थ्रूपुट पद्धति है ।
Introduction
नेफ्रोन गुर्दे की बुनियादी संरचनात्मक और कार्यात्मक इकाई दोनों है1. संरचनात्मक रूप से, नेफ्रॉन ग्लोबलस (capillaries और podocytes) के शामिल है बोमन कैप्सूल और गुर्दे नलिका के भीतर स्थित, समीपस्थ नलिका से मिलकर, henle के पाश, और बाहर का नलिका जो इकट्ठा वाहिनी में समाप्त होने । कार्यात्मक, नेफ्रॉन की भूमिका पानी और इलेक्ट्रोलाइट्स के छानने का काम और पुनर्अवशोषण और कचरे का स्राव है । आमतौर पर, नेफ्रोजेनेसिस मनुष्यों में गर्भावधि के ३६ सप्ताह और कई प्रजातियों जैसे चूहे और चूहा2में जन्म के बाद शीघ्र ही पूरा हो जाता है । नेफ्रॉन एंडोमेंट की कुल संख्या है जो एक व्यक्ति के साथ पैदा होता है, जबकि नेफ्रॉन संख्या3जन्म के बाद किसी भी समय पर मापा nephrons की कुल संख्या है । नेफ्रॉन संख्या और ग्लोमेलर संख्या शब्द अक्सर interchangeably इस्तेमाल कर रहे हैं । क्योंकि वहां केवल एक स्तंभी प्रति नेफ्रॉन है, ग्लोमुली संख्या का आकलन नेफ्रॉन संख्या का अनुमान लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण किराए है ।
नेफ्रॉन एंडोमेंट और नेफ्रॉन नंबर का मूल्यांकन नैदानिक हित का है क्योंकि अध्ययनों ने नेफ्रोन एंडोमेंट और कम नेफ्रॉन नंबरों के बीच एक संघ का प्रदर्शन किया है जिसमें हृदय रोग की वृद्धि हुई है4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. शव परीक्षण में गुर्दे में निष्कर्षों के आधार पर, brenner ने कहा कि ग्रस्त व्यक्तियों से normotensive16व्यक्तियों की तुलना में nephrons की एक कम कुल संख्या के साथ प्रस्तुत किया । इस प्रकार, brenner hypothesized है कि वहां नेफ्रॉन संख्या और उच्च रक्तचाप के विकास के जोखिम के बीच एक व्युत्क्रम संबंध जीवन में बाद में है । ब्रेनर भी hypothesized है कि नेफ्रॉन संख्या में कमी के लिए nephrons है कि बने द्वारा मुआवजा दिया गया था । गुर्दे में सामान्य छानने का काम दर को बनाए रखने के लिए, अवशिष्ट nephrons अपने ग्लोबलर सतह क्षेत्र (ग्लोगुलर हाइपरट्रॉफी) में वृद्धि की भरपाई, जिससे गुर्दे समारोह पर नेफ्रॉन हानि के किसी भी प्रतिकूल प्रभाव को कम करने के लिए कार्य कर रहा है4 ,16.
जबकि अल्पावधि में सुरक्षात्मक, ग्लोबरिकल hypertrophy, लंबी अवधि में, वृद्धि हुई सोडियम और द्रव प्रतिधारण बढ़ जाती है, extracellular तरल पदार्थ की मात्रा में वृद्धि हुई है, और धमनी रक्तचाप में वृद्धि, आगे बढ़ के एक दुष्चक्र के लिए अग्रणी ग्लोगुलर केशिका दबाव, ग्लोबलर हाइपरफिल्ट्रेशन, और नेफ्रॉन स्काररिंग (स्केलेरोसिस) और चोट4,16।
नेफ्रॉन संख्या का अनुमान या गिनती प्राप्त करना कुछ प्रायोगिक लाभ प्रदान करते हैं: 1) यह नेफ्रोजेनेसिस की प्रक्रिया के बारे में जानकारी प्रदान करता है, जिसे तब भ्रूण या मातृ-भ्रूण वातावरण में विशिष्ट जीन या कारकों से जोड़ा जा सकता है, और 2) वहां हृदय रोग के साथ नेफ्रॉन संख्या का एक संघ है और, इस प्रकार, वहां संभावना है कि नेफ्रॉन संख्या का अनुमान है भविष्य हृदय जोखिम2,17,18, भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 19 , 20 , 21 , 22. मातृ-भ्रूण पर्यावरण के अलावा, कई रोगों सीधे प्रभाव नेफ्रॉन संख्या और गुर्दे समारोह, atherosclerosis सहित, मधुमेह, उच्च रक्तचाप, और यहां तक कि सामान्य उम्र बढ़ने2,9, 10,11,12,22,23। इस प्रकार, पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या का आकलन दोनों आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों है कि nephroउत्पत्ति (यानी, नेफ्रॉन एंडोमेंट) और एक व्यक्ति के जीवन के पाठ्यक्रम पर नेफ्रॉन संख्या को प्रभावित और परिणामी प्रभाव दोनों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है गुर्दे समारोह और हृदय स्वास्थ्य पर ।
वर्तमान में, नेफ्रॉन संख्या के निर्धारण और परिमाणीकरण के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं, प्रत्येक अपने फायदे और सीमाओं के साथ24,25,26,27,28 ,29,30. पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या का निर्धारण करने के लिए परिष्कृत तरीके विसारक विधि, जैसे dissector के रूप में शामिल/ अक्सर माना जाता है सोने के मानक पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या का निर्धारण करने के लिए, dissector/ हाल के अग्रिमों और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और प्रसंस्करण में सुधार के लिए प्रत्येक और हर नेफ्रॉन व्यक्तिगत गिनती करने के लिए उपकरण प्रदान की है । हालांकि, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग न केवल समय लेने वाली है, लेकिन यह भी बहुत महंगा है । इसके अलावा, दोनों dissector/प्रभाजक विधि और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग उंनत तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता है, इस प्रकार अनुसंधान प्रयोगशालाओं के बहुमत में इस तरह के तरीकों का उपयोग सीमित ।
नेफ्रॉन संख्या निर्धारित करने के अधिकांश तरीके ग्लोगुरौली की पहचान के आधार पर मायने या अनुमान बनाते हैं, क्योंकि ये आसानी से पहचाने जाने योग्य संरचनात्मक होते हैं । इस कागज में, पूरे गुर्दे में नेफ्रॉन संख्या का अनुमान लगाने के लिए एसिड थकावट विधि वर्णित है और27का प्रदर्शन किया । एसिड थकावट विधि तेजी से, विश्वसनीय है, और काफी कम अंय तरीकों से, ऐसे dissector के रूप में/ इसके अलावा, एसिड थकावट विधि नेफ्रॉन संख्या है कि चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग26का उपयोग कर निर्धारित उन की सीमा के भीतर होने की सूचना दी है की अत्यधिक repeatable अनुमान प्रदान करता है ।
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Protocol
आपूर्ति और अभिकर्मकों नीचे सूचीबद्ध एक चूहे में पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या के निर्धारण के लिए कर रहे हैं, अर्थात, दो गुर्दे । चूहे के लिए एसिड थकावट विधि के उपयोग के लिए संशोधनों तारांकों के साथ की पहचान कर रहे हैं । सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के लिए conformed और संस्थानिक पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा मिसिसिपी चिकित्सा केंद्र विश्वविद्यालय में अनुमोदित किया गया ।
1. गुर्दे पृथक्करण प्रक्रिया
- माउस (या अंय प्रजातियों) वजन और एक isoflurane (5%-8%) अधिक मात्रा में या pentobarbital (१५० मिलीग्राम/
- एक बार माउस euthanized है, इसके उदर गुहा खुले मिडलाइन के साथ ठीक सर्जिकल कैंची का उपयोग कर ।
- ध्यान से आंतों और प्रजनन वसा उदर गुहा के दाईं ओर उठा । सकल विच्छेदन से, बाईं गुर्दे को अलग । ठीक शल्य चिकित्सा कैंची का प्रयोग, बाईं गुर्दे धमनी और नस में कटौती और ध्यान से बाईं गुर्दे को हटाने, एक उचित लेबल (माउस संख्या/
- सही गुर्दे के लिए प्रक्रिया को दोहराएं ।
- अपने संबंधित वजन नाव से प्रत्येक गुर्दे निकालें और यह एक सर्जिकल जाली PBS के साथ पूर्व सिक्त पर जगह है ।
- शल्य धुंध पर गुर्दे छोड़, जल्दी से किसी भी आसंन गैर गुर्दे ऊतक (जैसे perirenal वसा या अधिवृक्क ग्रंथि) को हटाने के बाद गुर्दे कैप्सूल को निकालने के द्वारा । प्रत्येक गुर्दे व्यक्तिगत रूप से वजन, एक प्रयोगशाला नोटबुक में अलग से बाएँ और दाएँ गुर्दे के भार रिकॉर्डिंग.
2. homogenization, ऊष्मायन, और Straining प्रक्रियाओं
- एक बार प्रत्येक गुर्दा तौला है, PBS के प्रत्येक वजन नाव नाली और गुर्दे उचित लेबल नाव में वापस जगह । एक साफ उस्तरा ब्लेड का प्रयोग, छमाही में गुर्दे काट, लंबाई । प्रत्येक गुर्दे नीचे का सामना करना पड़ आधा प्लेस और 2-mm या छोटे टुकड़ों में प्रत्येक छमाही में कटौती ।
- इसी razorblade का उपयोग कर, ध्यान से इकट्ठा करने और एक लेबल 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (माउस नंबर/
- एक नया उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर, विपरीत गुर्दे के लिए प्रक्रिया को दोहराएं । कटे हुए गुर्दे को अलग से लेबल 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नली में रखें ।
- एक अच्छी हवादार धूआं हुड में, प्रत्येक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नली में 5 मिलीलीटर 6 मीटर हाइड्रोक्लोरिक (HCl) एसिड जोड़ें ।
- कैप को शंक्वाकार नली से प्रतिस्थापित करें, गुर्दे/एचसीएल मिश्रण को धीरे से उत्तेजित करें और 15-एमएल शंक्वाकार नली को ३७ ° c पर ९० मिनट के लिए एक प्रीस्ट्रिक्टेड वाटर बाथ में रखें (* चूहे के गुर्दे के लिए १२० मिनट) ।
- संक्षेप में प्रत्येक 15 मिनट में प्रत्येक 15-एमएल नली को ऊष्मायन के दौरान उत्तेजित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी ऊतक HCl एसिड के संपर्क में हैं ।
- एक 5 मिलीलीटर सिरिंज (* चूहे के लिए 10 मिलीलीटर सिरिंज) में एक 18-जी सुई डालें और सावधानी से सिरिंज प्लंजर को हटा दें । एक ५०-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (ट्यूब #1) में एक धूआं हुड में सिरिंज प्लेस ।
- किडनी/एचसीएल सॉल्यूशन को वॉटर बाथ से निकालें और टिश्यू सॉल्यूशन को सिरिंज के खुले सिरे में डालें और 15-एमएल शंक्वाकार ट्यूब को एक टेस्ट ट्यूब रैक में अलग से सेट करें । ध्यान से प्लंजर की जगह और धीरे से प्लंजर को पुश करने के रूप में सुई के माध्यम से समाधान बाहर निकालना और ट्यूब #1 में ।
- 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नली को 5 मिलीलीटर पीबीएस घोल से धोएं । 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नली में पीबीएस का भंवर करना ताकि किसी भी शेष गुर्दे के ऊतक को विलेय कर सके ।
- फिर से ध्यान से प्लंजर को 18-जी सुई युक्त 5-एमएल सिरिंज से निकालें और 15 एमएल वाले शंक्वाकार ट्यूब से सामग्री को सिरिंज के खुले सिरे में डालें । ध्यान से प्लंजर की जगह और धीरे से प्लंजर पर नीचे धक्का द्वारा सिरिंज फ्लश, ट्यूब #1 में. इस प्रक्रिया 2x दोहराएं (कुल 3x प्रदर्शन) ।
- एक नई 5 मिलीलीटर सिरिंज में एक 21-जी सुई डालें (* चूहे के लिए 10 मिलीलीटर सिरिंज) और सावधानी से सिरिंज प्लंजर को दूर. एक नई ५०-एमएल शंक्वाकार ट्यूब (ट्यूब #2) में संलग्न 21-जी सुई के साथ सिरिंज रखें ।
- ट्यूब #1 से सामग्री 21-जी सुई युक्त सिरिंज के खुले अंत में डालो । ध्यान से प्लंजर डालें और सिरिंज प्लंजर पर नीचे धकेलने और ट्यूब #2 में extruded समाधान रखने के द्वारा सिरिंज फ्लश ।
- धोने ट्यूब #1 PBS समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ । भंवर में पीबीएस ट्यूब #1 तो के रूप में किसी भी शेष गुर्दे ऊतक solubilize करने के लिए ।
- फिर से, ध्यान से 5-एमएल सिरिंज 18-जी सुई युक्त से प्लंजर निकालें और ट्यूब #1 से सामग्री सिरिंज के खुले अंत में डालना । ध्यान से प्लंजर की जगह और धीरे से प्लंजर पर नीचे धक्का द्वारा सिरिंज फ्लश, ट्यूब #2 में समाधान extruding । इस प्रक्रिया 2x दोहराएं (कुल 3x प्रदर्शन) ।
- ट्यूब #2 की कुल मात्रा ५० मिलीग्राम तक अतिरिक्त pbs जोड़कर ले, ५०-एमएल लाइन पर tube #2.
- इन्क्यूबेट ट्यूब #2 एक ट्यूब रैक में एक रॉकर प्लेट पर में गुर्दे के ऊतकों के समाधान से युक्त एक रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस रात में सेट (ंयूनतम 8-10 एच) ।
3. ग्लोगुली की गिनती और नेफ्रॉन संख्या के बहिर्वेशन
- एक समरूप समाधान बनाने के क्रम में ट्यूब #2 को फ्रिज से निकालें और पेलेटेड ऊतक को ट्यूब को धीरे से उलटा करके कई बार रिसस्पेंड कर दें । हम प्रसंस्करण के बाद 5 डी के भीतर ग्लोगुली गिनती की सलाह देते हैं ।
- ध्यान से एक 12-अच्छी तरह से प्लेट की एक अच्छी तरह से में गुर्दे के समाधान के ५०० μL का aliquot । इस 2x दोहराएं, एक अलग अच्छी तरह से एक aliquot रखने इतना है कि वहां गुर्दे के प्रति गुर्दे के समाधान के तीन कुओं रहे हैं, triplicate में विश्लेषण के लिए ।
- एक 1:1 कमजोर पड़ने के लिए, गुर्दे के समाधान वाले तीन कुओं में से प्रत्येक के लिए PBS के ५०० μL जोड़ें ।
- एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग, प्रति अच्छी तरह से गुउली की संख्या की गणना । गिनती एक अच्छी तरह से प्रत्येक के तल पर रखा 16 अलग वर्गों का एक ग्रिड का उपयोग करके सहायता प्राप्त है. प्रत्येक ग्रिडडेड अनुभाग के अनुसार गुउरुली की संख्या की गणना करें और तब प्रति ग्रिड गणना का योग करें जिससे कि ग्लोगुरौली की कुल संख्या को अच्छी तरह से प्राप्त किया जा सके । ग्लोगुली उनकी गोलाकार संरचना से आसानी से पहचाने जा सकने वाले हैं । अतिरिक्त पहचानकर्ताओं में रक्त से भरे केशिकाओं के कारण लाल रंग के साथ-साथ पूर्व या पश्च-धमनीओलों का भी समावेश होता है जो व्यक्ति समूह के शरीर से जुड़े रहते हैं (चित्र 1) ।
- तीन कुओं में से प्रत्येक के प्रति गिना गुउली की कुल संख्या में जोड़ें और फिर उंहें तीन से विभाजित प्रति ५०० μL गुर्दे के समाधान की औसत संख्या के लिए । यदि प्रति कूप ग्लोगुली की औसत संख्या में प्रसरण 10% से अधिक है, तो नेफ्रोन-काउंटिंग प्रक्रिया को दोहराएं, गुर्दे के घोल की सजातीय प्रकृति पर बारीकी से ध्यान दे । एक अच्छी तरह से प्रति गुर्दे ग्लोगुली की औसत संख्या के लिए १०० के अनुसार गिउरुली की संख्या गुणा । कुल नेफ्रॉन संख्या प्रति गुर्दे व्यक्त किया जा सकता है या, गुर्दे के वजन का उपयोग, प्रति मिलीग्राम या ऊतक के जी.
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Representative Results
नीचे उच्च रक्तचाप के एक स्थापित माउस मॉडल और उंर से संबंधित क्रोनिक गुर्दा रोग के एक आनुवंशिक चूहा मॉडल से पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या के प्रतिनिधि अनुमान हैं । ग्लोमेरुली की प्रमुख पहचान की विशेषताओं, जैसे कि एक गोलाकार संरचना के साथ या बिना संलग्न पूर्व या पोस्ट-arteriolar या ट्यूबलर संरचनाओं, एसिड थकावट विधि के लिए उन नए के लिए प्रकाश डाला जाता है (चित्रा 1).
पहले प्रयोगात्मक उदाहरण में, कुल नेफ्रॉन संख्या चूहों में निर्धारित किया गया (पुरुष C57BL/6, उंर के 6 सप्ताह) वाहन (खारा) या 14 दिनों के लिए एंजियोटेन्सिन द्वितीय के साथ संचार । वाहन-संचार चूहों में, नेफ्रॉन संख्या १२,४११ ± २४८ nephrons प्रति गुर्दे के रूप में एसिड थकावट विधि का उपयोग कर निर्धारित किया गया था (चित्रा 2) । ये अनुमान पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या की श्रेणियों के साथ संगत है पहले चूहों में रिपोर्ट (तालिका 1) । एंजियोटेन्सिन लगभग ४० एमएमएचजी द्वारा एट्रियल दाब को 14 दिनों के बाद बढ़ाया गया और नेफ्रॉन संख्या (९,१२२ ± १९३ nephrons प्रति गुर्दे) में लगभग 26% की उल्लेखनीय कमी के साथ जुड़ा हुआ था (चित्रा 2) । इन आंकड़ों से पता चलता है कि एंजियोटेंसिन द्वितीय आसव केवल उच्च रक्तचाप से संबंधित नहीं है, बल्कि, नेफ्रॉन संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी काठिन्य या ग्लोबलर चोट के कारण नेफ्रॉन हानि से जुड़ी है ।
दूसरे प्रयोगात्मक उदाहरण में, गुर्दे की एजेनेसिस के एक आनुवंशिक चूहा मॉडल में नेफ्रॉन संख्या के पिछले निष्कर्षों, एकतरफा गुर्दे अजनन (hsra) चूहा के विषमांगी स्टॉक व्युत्पन्न मॉडल की पुष्टि की गई । Hsra मॉडल गुर्दे और मूत्र पथ के दोषों के लिए अधूरा प्रवेश फीनोटाइप दर्शाती है, कुछ जानवरों के साथ सामांय जंम (दो गुर्दे के साथ) और अंय एक गुर्दा के साथ पैदा होने जा रहा है । दो गुर्दों (नर हा नािंत्रण; 12 सप्ताह की आुा) के साथ जन्मे चूहों में एसिड थकावट पद्धति का इस्तेमाल करते हुए नेफ्रॉन संख्ाा का अनुमान २७,२८८ ± ३३६ प्रति गुर्दा था (चित्र 3) । इसके विपरीत, एक एकाकी गुर्दा (नर हा-एकांत; 4 सप्ताह की आयु) के साथ जन्मे चूहों में नेफ्रॉन संख्या का अनुमान २४,५९४ ± ८८३ प्रति गुर्दा (चित्र 3) में काफी कम पाया गया । इन नमूनों में प्राप्त नेफ्रॉन संख्या के अनुमान भी चूहे में पहले रिपोर्ट की गई श्रेणियों के अनुरूप हैं (सारणी 1) । ध्यान दें कि इन आंकड़ों पिछले निष्कर्षों के साथ संगत कर रहे है जिसमें हा-एकांत चूहों प्रदर्शन करने के लिए पाया गया नेफ्रॉन बंदोबस्ती या संख्या (एक नियंत्रण गुर्दा की तुलना में) सबसे अंतर्निहित आनुवंशिक पैदा होने के साथ जुड़े कारकों की संभावना चिंतनशील पाए गए एक सिंगल किडनी31के साथ ।
चित्रा 1 : पूरे गुर्दे के नेफ्रॉन नंबर की गणना और आकलन के लिए ग्लोगुरौली के प्रमुख पहचानकर्ता । ग्लोगुली अपनी गोलाकार संरचना द्वारा आसानी से पहचाने जाने योग्य हैं, जैसा कि तीरों ने संकेत दिया है । अतिरिक्त पहचानकर्ताओं में रक्त से भरे केशिकाओं के कारण लाल रंग, साथ ही पूर्व या बाद में धमनीओलों (या नलिकाओं) को शामिल किया जाता है जो प्रसंस्करण के बाद व्यक्ति समूह के शरीर से जुड़े रह सकते हैं (इस तरह के तल पर पहचाने गए एक माइक्रोग्राफ) । इसके अलावा इस छवि में मौजूद नलिकाओं और रक्त वाहिकाओं के अवशेष हैं । आवर्धन = 10X; स्केल पट्टी = १०० μm इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : चूहों में नेफ्रॉन गिनती । (क) 12-कूप कल्चर प्लेट के २२.१-एमएम के समतल-तली कुएं में एक ही चूहे के गुर्दे से ग्लोगुरौली की प्रतिनिधि छवि, जैसा कि उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए देखा गया है । स्तंभी और गुर्दे नलिकाओं मध्यम घनत्व में देखा जाता है जब दो के एक कारक द्वारा पतला (गुर्दा समाधान के ०.५ मिलीलीटर प्लस 1x pbs के ०.५ मिलीलीटर) । (ख) ग्लोबलर गणना के अनुसार, पुरुष C57Bl/6 चूहों में नेफ्रॉन संख्या पर 14 दिन के वाहन या एंजियोटेन्सिन द्वितीय आसव का प्रभाव । १,००० ng/kg/min पर एंजियोटेंसिन द्वितीय आसव (ऑस्मोटिक minipump केमाध्यम से) उच्च रक्तचाप के साथ जुड़ा हुआ था और वाहन के साथ संचार चूहों में नेफ्रॉन संख्या की तुलना में नेफ्रॉन संख्या में कमी के रूप में चिह्नित । वाहन में नेफ्रॉन संख्या-संचार चूहों चूहों में नेफ्रॉन संख्या के पहले रिपोर्ट अनुमान के अनुरूप है (तालिका 1) । वाहन: n = 3, एंजियोटेंसिन द्वितीय: n = 3, *p < ०.०५ । त्रुटि पट्टी = SE. आवर्धन = 4X; स्केल पट्टी = २५० μm इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : चूहों में नेफ्रॉन गिनती । (क) 12-कूप कल्चर प्लेट के एक २२.१-एमएम के समतल-तली कूप में प्लेटेड एक चूहे के गुर्दे से ग्लोगुली की प्रतिनिधि छवि, जैसा कि उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए देखा गया है । ग्लोगुली और वृक्क नलिकाओं को माउस की तुलना में काफी उच्च घनत्व में देखा जाता है । (ख) एचएसआरए-कंट्रोल और एचएसआरए-एस चूहों में नेफ्रॉन संख्या का परिमाणन यह दर्शाता है कि एचएसआरए-सी चूहों की तुलना में एचएसआरए-एस में नेफ्रॉन संख्या कम है और इस मॉडल मेंपिछले निष्कर्षों के अनुरूप है । HSRA-C, दो गुर्दे के साथ पैदा हुए चूहों: n = 3; HSRA-S, एक अकेले गुर्दे के साथ पैदा चूहों: n = 3,* p < 0.05 । त्रुटि पट्टी = SE. आवर्धन = 4X; स्केल पट्टी = २५० μm इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
| प्रजातियां | प्रति गुर्दे नेफ्रॉन संख्या | संदर्भ |
| माउस | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| चूहा | 13000-27000 | 31, 33 |
| भेड़ | 200000-800000 | 23, 29, 34 |
| सुअर | 1600000-4600000 | 32, 35 |
| मानव | 500000-2000000 | 8-15 |
सारणी 1: कई प्रजातियों में नेफ्रॉन संख्या की सूचना दी गई है ।
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Discussion
अच्छी प्रयोगात्मक तकनीक के साथ, एसिड थकावट विधि पूरे गुर्दे में नेफ्रॉन संख्या का आकलन करने के लिए आदर्श है । हालांकि गुर्दे एसिड में भंग हो जाता है, ग्लोमरूली काफी हद तक बरकरार रहती है और आसानी से पहचाने जाते हैं, जिससे व्यक्तिगत ग्लोगुरौली की गिनती अपेक्षाकृत आसान और सीधी होती है । एसिड थकावट तकनीक कई कारणों के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है । सबसे पहले, एसिड थकावट विधि एक तेजी से और सुविधाजनक तरीका है कि खर्च और शारीरिक प्रयास के मामले में अपेक्षाकृत कम की आवश्यकता है । सभी अभिकर्मकों और एसिड थकावट विधि करने के लिए आवश्यक उपभोग्य सामग्रियों सबसे बुनियादी प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध हैं, केवल बड़ी आवश्यकता के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा रहा है ग्लोमेलर गिनती । खर्च के मामले में, यह अनुमान है कि एसिड थकावट विधि सिर्फ जानवर है, जो एक बहुत जब पूरे गुर्दे ग्लोमेलर गिनती के अंय तरीकों के साथ जुड़े लागत की तुलना में नहीं है प्रति सौ डॉलर के एक जोड़े की लागत चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के रूप में, जो समय और तकनीकी विशेषज्ञता स्कैनिंग के प्रति पशु डॉलर के हजारों में रेंज कर सकते हैं ।
दूसरा, एसिड थकावट विधि काफी कम ऊतक-प्रसंस्करण समय के रूप में पूरी गुर्दे नेफ्रॉन संख्या के अंय तरीकों की तुलना में शामिल है dissector/ शुरू से खत्म करने के लिए, एसिड थकावट विधि कुल समय के 24 घंटे से भी कम की आवश्यकता है, जिनमें से कम से 1-2 घंटे का प्रसंस्करण खर्च किया जाता है गुर्दे और फिर प्रयोगात्मक जानवर प्रति व्यक्ति ग्लोमेरूलाई गिनती । इसके विपरीत, dissector/fractionator विधि श्रम प्रधान है, प्रसव के एक अनुमान के अनुसार 15 घंटे (sectioning के 4-6 घंटे, धुंधला के 2-3 घंटे की आवश्यकता है, और 4-5 समय की गिनती के घंटे) गुर्दा प्रति, ४८ सहित नहीं-७२ जीएल में गुर्दे की प्रक्रिया की जरूरत घंटे ycol methacrylate24. लागत और समय के लाभ के कारण, एसिड थकावट विधि अध्ययन में विशेष रूप से उपयोगी है जहां पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या के अनुमान के साथ या आनुवंशिक या औषधीय हस्तक्षेप के बिना पशुओं की बड़ी संख्या में किया जाना चाहिए । दोनों लागत और समय dissector के साथ शामिल/fractionator विधि और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग सबसे अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उनके गोद लेने में एक प्रमुख सीमित कारक माना गया है ।
अंत में, एसिड थकावट विधि पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या का अनुमान है कि चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग जैसे अधिक परिष्कृत तरीकों का उपयोग कर उपायों के लिए तुलनीय है26प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, प्रगुली और तीन आयामी छवि प्रसंस्करण के धनायनी ferritin-लेबलिंग का उपयोग sprague से एक एकल गुर्दे में हर नेफ्रॉन-dawley चूहा गणना करने के लिए, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग प्रति के औसत गिनती पर मिले ३४,००० किडनी26। गैर-cationic ferritin-लेबल गुर्दे, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग में २,००० नेफ्रोन की तरह संरचनाओं की गिनती के कारण सामने आए गुर्दे के गैर-ग्लोमेरुलर क्षेत्रों की गणना के साथ चुंबकीय संकेतों के समान परिमाण और आकार के रूप में ferritin-लेबल glomerular । जब इन कलाकृतियों को धनायनी ferritin-लेबल गुर्दों द्वारा निर्धारित गणना से घटाया जाता है, तो चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग का उपयोग करके निर्धारित ग्लोमेरुली की प्रभावी संख्या, प्रति गुर्दा26के ३२,००० nephrons के करीब है । इसी अध्ययन में, विधिमान्यकरण प्रयोगों में अम्ल थकावट विधि26का उपयोग करते हुए प्रति गुर्दा ३१,००० की औसत ग्लोमेरक्यूलर गणना हुई । इस प्रकार, एसिड थकावट विधि पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या है कि चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग जैसे अत्याधुनिक तकनीकों का उपयोग कर निर्धारित उन में से < 5% के भीतर है का अनुमान पैदा करता है ।
हालांकि एसिड थकावट विधि के साथ जुड़े कई प्रमुख लाभ कर रहे हैं, जांचकर्ताओं भी इस विधि के साथ जुड़े सीमाओं के बारे में पता होना चाहिए । एक सीमा पूरी गुर्दे के उपयोग से संबंधित है । के रूप में पूरे गुर्दे भंग और homogenized है, गुर्दे प्रांतस्था के भीतर गुुरुली के स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी निर्धारित नहीं किया जा सकता । यदि यह जानने के लिए कि ग्लोमेरेक्यूलर मात्रा का इंट्रारेनल वितरण महत्वपूर्ण है, तो चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग का उपयोग एक बेहतर अनुकूल तरीका होगा ।
अन्य तरीकों की तुलना में, एसिड थकावट विधि का उपयोग करने के लिए थोड़ा कुल नेफ्रॉन संख्या को कम करने के लिए प्रकट होता है । छोटे अनुमानों की संभावना है, भाग में, एसिड में या गुर्दे के थकावट के दौरान एक छोटे से समूह के ग्लोमेरुली के विघटन के लिए । इसके अलावा, उंर बढ़ने या रोग के साथ, वहां कार्यात्मक nephrons, जो, हालांकि मूत्र गठन के लिए योगदान नहीं, एसिड थकावट के प्रति अधिक संवेदनशील हो सकता है और प्रसंस्करण के दौरान नष्ट हो सकता है, इस प्रकार कुल नेफ्रॉन के कम अनुमानों के लिए योगदान के नुकसान है संख्या. इस प्रकार, देखभाल का उपयोग किया जाना चाहिए जब इकट्ठा और प्रसंस्करण गुर्दे इतना के रूप में किसी भी गुर्दे के ऊतकों को छोड़ने के लिए नहीं जब गुर्दे काट, या सिरिंज में जब ऊतक के नमूनों extruding. कुल मिलाकर, तथापि, ऊतक प्रसंस्करण के कारण टोटल नेफ्रॉन संख्या का कम अनुमान लगाना अपेक्षाकृत छोटा प्रतीत होता है ।
चूंकि एसिड थकावट विधि का प्रयोग करते हुए ग्लोमेरुली की गणना व्यक्तिपरक है, इसलिए नेफ्रॉन संख्या का कम अनुमान लगाना भी पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह को प्रतिबिंबित कर सकता है, जिसे दो पृथक जांचकर्ताओं द्वारा निष्पादित किए जा रहे मापन द्वारा आसानी से दूर किया जा सकता है । प्रयोगात्मक पशु या स्थिति के बारे में जानकारी. यदि कोई महत्वपूर्ण चिंता की बात है के रूप में क्या एक समूह का गठन, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में शामिल होने के प्रयोगात्मक जानवरों के साथ लौह ऑक्साइड इच्छामृत्यु से पहले । जब नसों में संचार, आयरन ऑक्साइड में प्रवेश और ग्लोरियस में फंस जाएगा; इस प्रकार, संसाधित गुुरुली गहरे काले दाग चाहिए, जब30की गिनती में ग्लोगुली की एक बड़ी पहचान के लिए अनुमति दी ।
एसिड थकावट विधि पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या छोटे नमूनों की माप के आधार पर अनुमान (3 x ०.५ मिलीलीटर या १.५ मिलीलीटर) के रूप में गुर्दे के पूरे समाधान के मापन के लिए विरोध (५० मिलीलीटर) । एसिड थकावट विधि उच्च प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रकृति में है, और ग्लोमेरुली एक ही गुर्दे के नमूनों के भीतर गिना जाता है और प्रयोगात्मक समूहों के भीतर अत्यधिक सुसंगत होना पाया जाता है । इसके अलावा, प्रतिनिधि परिणाम जंगली प्रकार से वर्तमान अध्ययन में रिपोर्ट C57Bl/6 चूहों और एक एकल गुर्दे के साथ पैदा हुए चूहों (चित्रा 2 और 3) अत्यधिक पिछले निष्कर्षों के साथ संगत कर रहे हैं, साथ ही साथ के रूप में पहले की रिपोर्ट पर्वतमाला (तालिका 1 )5,31। यदि वांछित, अतिरिक्त माप आसानी से बेहतर करने के लिए किया जा सकता है गुर्दे प्रति कुल नेफ्रॉन संख्या का अनुमान है ।
जबकि एसिड थकावट तकनीक नेफ्रॉन संख्या के विश्वसनीय और repeatable का अनुमान प्रदान करता है, इस विधि को ग्लोमेरुलर मात्रा का माप प्राप्त करने के लिए अनुशंसित नहीं है, के रूप में एसिड के लिए जोखिम सबसे अधिक संभावना है कि glomerular मात्रा में परिवर्तन का उत्पादन । के रूप में ग्लोबलर मात्रा का निर्धारण पूरे गुर्दे ग्लोबलर सतह क्षेत्र का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है, यह अनुशंसा की जाती है कि इस तरह के माप ऊतकीय और stereological तरीकों का उपयोग कर बनाया जा24,25। विशेष रूप से, stereological तरीकों कि ग्लाइकोल methacrylate एंबेड गुर्दे का उपयोग करने के क्रम में ऊतक सूजन और विस्तार को सीमित करने के लिए और, इस प्रकार, के रूप में के रूप में संभव के रूप में बंद के रूप में ग्लोमेलर ज्यामिति बनाए रखने के लिए कि vivo में।
अंत में, एसिड थकावट तकनीक की एक और सीमा है, और एक कि नेफ्रॉन संख्या का आकलन करने के अंय तरीकों के लिए आम है, यह है कि ग्लोमेरुलर समारोह के बारे में कोई जानकारी (जैसे ग्लोमेरुलर छानने का काम दर) ग्लोमेरुली से एक बार पता लगाया जा सकता है संसाधित. इस प्रकार, जबकि एक व्यक्ति गुउली गिना जा सकता है, इसकी कार्यात्मक स्थिति (मूत्र बनाने या गैर मूत्र बनाने) एसिड थकावट विधि का उपयोग कर निर्धारित नहीं किया जा सकता है । इसी प्रकार, व्यक्तिगत चूहों में अम्ल थकावट विधि का उपयोग करते हुए किसी अनुदैर्घ्य सूचना का पता नहीं लगाया जा सकता । इसके बजाय, पशुओं के अलग समूहों के विभिंन समय बिंदुओं पर एक जानवर की उंर या पूर्व या postgenetic या औषधीय हस्तक्षेप पर नेफ्रॉन संख्या में परिवर्तन में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं ।
संक्षेप में, एसिड थकावट विधि एक कम लागत, उच्च throughput, और कुशल विधि के लिए पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या का अनुमान है । एसिड थकावट विधि दो उदाहरण के द्वारा सबूत के रूप में reproducibility की एक उच्च डिग्री प्रदान करता है यहां प्रस्तुत किया है, साथ ही साथ उन पहले इस विधि का उपयोग कर रिपोर्ट18,19,20,21 , 22 , 28. जबकि एसिड थकावट विधि का उपयोग माउस में उपयोग के लिए वर्णित किया गया था (और चूहा), एसिड थकावट विधि भी बड़ी प्रजातियों में उपयोग के लिए पहुंचा जा सकता है, जैसे कुत्ते और सुअर के रूप में27,३२।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम स्वास्थ्य, राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और रक्त संस्थान (R01HL107632) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
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