Summary
Las estimaciones del número total de Nefrona renal son importantes clínicamente y experimentalmente, ya que existe una Asociación inversa entre el número de Nefrona y un mayor riesgo de enfermedad renal y cardiovascular. En este documento, se demuestra el uso del método de maceración ácida, que proporciona estimaciones rápidas y fiables del número total de Nefrona renal.
Abstract
La investidura de Nefrona se refiere al número total de nefronas con las que nace un individuo, ya que la nefrogénesis en los seres humanos se completa por 36 semanas de gestación y no se forman nuevas nefronas después del parto. El número nefrón se refiere al número total de nefronas medidos en cualquier punto en el tiempo después del parto. Ambos factores genéticos y ambientales influyen tanto en la investidura de Nefrona como en su número. Comprender cómo influyen los genes o factores específicos en el proceso de nefrogénesis y pérdida o desaparición de Nefrona es importante, ya que se cree que las personas con una dotación o número de Nefrona más baja tienen un mayor riesgo de padecer enfermedad renal o cardiovascular. Entender cómo las exposiciones ambientales en el transcurso de la vida de una persona afecta el número de Nefrona también será vital para determinar el riesgo futuro de la enfermedad. Por lo tanto, la capacidad de evaluar el número completo de Nefrona renal de forma rápida y confiable es un requisito experimental básico para comprender mejor los mecanismos que contribuyen a o promueven la nefrogénesis o la pérdida de Nefrona. Aquí describimos el método de maceración ácida para la estimación del número entero de Nefrona renal basado en el procedimiento descrito por Damadian, Shawayri y Bricker, con ligeras modificaciones. El método de maceración ácida proporciona estimaciones rápidas y fiables del número de Nefrona (evaluados por el conteo de glomérulos) que están dentro del 5% de los que se determinan utilizando métodos más avanzados, aunque caros, como la resonancia magnética. Además, el método de maceración ácida es un excelente método de alto rendimiento para evaluar el número de Nefrona en grandes cantidades de muestras o condiciones experimentales.
Introduction
La nefrona es tanto la estructura básica como la unidad funcional del riñón1. Estructuralmente, la nefrona consiste en el glomérulo (capilares y podocitos) ubicado dentro de la cápsula del Bowman y el túbulo renal, que consiste en el túbulo proximal, el lazo de Henle, y el túbulo distal que termina en el conducto colector. Funcionalmente, el papel de la nefrona es la filtración y reabsorción de agua y electrólitos y la secreción de desechos. En general, la nefrogénesis se completa a las 36 semanas de gestación en humanos y poco después del nacimiento en varias especies como el ratón y la rata2. La investidura de Nefrona se refiere al número total de nefronas con las que nace un individuo, mientras que el número de nefronas es el número total de nebulas que se miden en cualquier momento después del parto3. El término número de Nefrona y número glomerular se utilizan a menudo indistintamente. Debido a que sólo hay un glomérulo por Nefrona, la evaluación del número de glomérulos es un sustituto importante para estimar el número de Nefrona.
La evaluación de la investidura de Nefrona y el número de Nefrona es de interés clínico ya que los estudios han demostrado una asociación entre la investidura de Nefrona y los números de nefrón reducidos con una mayor incidencia de enfermedades cardiovasculares4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. sobre la base de hallazgos en los riñones en la autopsia, Brenner observó que los individuos hipertensos presentaron con un número total más bajo de nefronas que individuos normotensivos16. Por lo tanto, Brenner presumido que existe una relación inversa entre el número de Nefrona y el riesgo de desarrollar hipertensión más adelante en la vida. Brenner también presumido que una reducción en el número de Nefrona fue compensada por las nefronas que permanecieron. Con el fin de mantener la tasa de filtración normal en el riñón, las nefronas residuales compensan aumentando su área superficial glomerular (hipertrofia glomerular), trabajando así para mitigar cualquier efecto adverso de la pérdida de Nefrona en la función renal4 ,16.
Mientras que la protección en la hipertrofia glomerular a corto plazo, a largo plazo, conduce a un aumento de la retención de sodio y líquido, aumento del volumen de líquido extracelular, y aumentos en la presión arterial arterial, dando lugar a un círculo vicioso de aumentos adicionales en presión capilar glomerular, hiperfiltración glomerular y cicatrización de Nefrona (esclerosis) y lesión4,16.
La obtención de estimaciones o recuentos del número de Nefrona ofrece un par de ventajas experimentales: 1) proporciona información sobre el proceso de nefrogénesis, que luego se puede vincular a genes o factores específicos en el embrión o el ambiente materno-fetal, y 2) existe una asociación de número de Nefrona con enfermedad cardiovascular y, por lo tanto, existe el potencial de que se puedan utilizar estimaciones del número de Nefrona para predecir futuros riesgos cardiovasculares2,17,18, 19 , 20 , 21 , 22. Además del ambiente materno-fetal, varias enfermedades afectan directamente el número de Nefrona y la función renal, incluyendo aterosclerosis, diabetes, hipertensión e incluso el envejecimiento normal2,9, 10,11,12,22,23. Por lo tanto, la evaluación del número entero de Nefrona renal es importante para comprender los factores genéticos y ambientales que afectan la nefrogénesis (es decir, la investidura de Nefrona) y el número de Nefrona en el transcurso de la vida de una persona y los efectos resultantes sobre la función renal y la salud cardiovascular.
Actualmente, existen varios métodos disponibles para la determinación y cuantificación del número de Nefrona, cada uno con sus propias ventajas y limitaciones24,25,26,27,28 ,29,30. Los métodos sofisticados para determinar el número completo de Nefrona renal incluyen métodos estereológicos, como el método de dessector/fraccionamiento y la resonancia magnética25,26. A menudo considerado el estándar de oro para determinar el número entero de Nefrona de riñón, el método de dessector/fraccionador es costoso y consume mucho tiempo. Los avances recientes y la mejora en la imagen y el procesamiento de la resonancia magnética han proporcionado las herramientas para contar cada Nefrona individualmente. Sin embargo, las imágenes por resonancia magnética no solo consumen mucho tiempo, sino que también son extremadamente costosas. Además, tanto el método de dessector/fraccionamiento como la imagen por resonancia magnética requieren conocimientos técnicos avanzados, limitando así el uso de tales métodos en la mayoría de los laboratorios de investigación.
La mayoría de los métodos para determinar el número de Nefrona hacen recuentos o estimaciones basadas en la identificación de glomérulos, ya que son fácilmente identificables estructuralmente. En este documento, se describe y se demuestra el método de maceración ácida para estimar el número de Nefrona en el riñón entero27. El método de maceración ácida es rápido, fiable y significativamente menos costoso que otros métodos, como el método de dessector/fraccionador y la resonancia magnética. Además, el método de maceración ácida proporciona estimaciones altamente repetibles del número de nefrona que se ha reportado que están dentro del rango de los determinados mediante la resonancia magnética26.
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Protocol
Los suministros y reactivos enumerados a continuación son para la determinación de todo el número de Nefrona renal en un ratón, es decir, dos riñones. Las modificaciones para el uso del método de maceración ácida para ratas se identifican con asteriscos. Todos los protocolos experimentales se conformaron con la guía de institutos nacionales de salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales en el centro médico de la Universidad de Mississippi.
1. procedimiento de aislamiento renal
- Pesar el ratón (u otras especies) y eutanasia con un isoflurano (5%-8%) Sobredosis o pentobarbital (150 mg/kg inyección intraperitoneal).
- Una vez que el ratón es eutanzado, abra su cavidad abdominal utilizando tijeras quirúrgicas finas a lo largo de la línea media.
- Levante cuidadosamente los intestinos y el adiposo reproductivo en el lado derecho de la cavidad abdominal. Por disección bruta, aísla el riñón izquierdo. Usando tijeras quirúrgicas finas, corte la arteria y la vena renal izquierda y retire con cuidado el riñón izquierdo, colocando el riñón en un barco de pesaje apropiadamente etiquetado (número de ratón/identificador) que contenga suero salino fosforado (PBS).
- Repita el procedimiento para el riñón derecho.
- Retire cada riñón de su respectivo bote de pesaje y colóquelo en una gasa quirúrgica pre-humedecido con PBS.
- Dejando el riñón en la gasa quirúrgica, retire rápidamente cualquier tejido no renal adherente (como adiposo perirenal o glándula suprarrenal) seguido de la extracción de la cápsula renal. Pesar cada riñón individualmente, registrando el peso del riñón izquierdo y derecho por separado en un cuaderno de laboratorio.
2. procedimientos de homogeneización, incubación y encadenamiento
- Una vez que se pesa cada riñón, escurrir cada bote de pesaje de PBS y volver a colocar los riñones en el bote de pesaje debidamente etiquetado. Usando una cuchilla de afeitar limpia, corta el riñón por la mitad, longitudinalmente. Coloque cada mitad del riñón hacia abajo y corte cada mitad en trozos de 2 mm o más pequeños.
- Usando el mismo navajas, recoja cuidadosamente y coloque las piezas de riñón picadas en un tubo cónico de 15 mL etiquetado (número de ratón/identificador; izquierda versus riñón derecho).
- Repite el procedimiento para el riñón opuesto, usando una nueva cuchilla de afeitar. Coloque el riñón picado en un tubo cónico de 15 mL con etiquetas separadas.
- En una campana de humos bien ventilada, añadir 5 mL de ácido clorhídrico (HCl) de 6 M a cada tubo cónico de 15 mL.
- Sustituya la tapa por el tubo cónico, agite suavemente la mezcla de riñón/HCl y coloque el tubo cónico de 15 mL en un baño de agua precalentado a 37 ° c durante 90 min (* 120 min para los riñones de rata).
- Agitar brevemente cada tubo de 15 mL cada 15 min durante la incubación con el fin de asegurar que todo el tejido esté expuesto al ácido HCl.
- Inserte una aguja de 18 G en una jeringa de 5 mL (* jeringa de 10 mL para ratas) y retire con cuidado el émbolo de la jeringa. Coloque la jeringa en un tubo cónico de 50 mL (tubo #1) en una campana extractora.
- Retire la solución de riñón/HCl del baño de agua y vierta la solución de tejido en el extremo abierto de la jeringa y ponga el tubo cónico de 15 mL a un lado en un bastidor de tubo de ensayo. Reemplace con cuidado el émbolo y empuje lentamente el émbolo para extruir la solución a través de la aguja y en el tubo #1.
- Lavar el tubo cónico de 15 mL con 5 mL de solución PBS. Agitar el PBS en el tubo cónico de 15 mL para solubilizar cualquier tejido renal restante.
- Una vez más, retire con cuidado el émbolo de la jeringa de 5 mL que contiene la aguja 18-G y vierta el contenido del tubo cónico de 15 mL en el extremo abierto de la jeringa. Reemplace cuidadosamente el émbolo y enjuague la jeringa presionando suavemente hacia abajo en el émbolo, en el tubo #1. Repite este proceso 2x (realizado 3x en total).
- Inserte una aguja de 21 G en una nueva jeringa de 5 mL (* jeringa de 10 mL para ratas) y retire con cuidado el émbolo de la jeringa. Coloque la jeringa con la aguja 21-G unida en un nuevo tubo cónico de 50 mL (tubo #2).
- Vierta el contenido de la #1 del tubo en el extremo abierto de la jeringa que contiene la aguja 21-G. Inserte con cuidado el émbolo y lave la jeringa presionando suavemente el émbolo de la jeringa y colocando la solución extruida en el tubo #2.
- Lavar el tubo #1 con 5 mL de solución PBS. Agitar el PBS en tubo #1 con el fin de solubilizar cualquier tejido renal restante.
- Una vez más, retire con cuidado el émbolo de la jeringa de 5 mL que contiene la aguja 18-G y vierta el contenido del tubo #1 en el extremo abierto de la jeringa. Reemplace cuidadosamente el émbolo y enjuague la jeringa presionando suavemente hacia abajo en el émbolo, extruir la solución en el tubo #2. Repite este proceso 2x (realizado 3x en total).
- Lleve el volumen total del tubo #2 hasta 50 mL añadiendo PBS adicional, hasta la línea de 50 mL en el tubo #2.
- Incubar el tubo #2 que contiene la solución de tejido renal en una rejilla de tubo en una placa basculante en un refrigerador fijado a 4 ° c durante la noche (mínimo 8-10 h).
3. conteo de glomérulos y extrapolación del número de Nefrona
- Quitar el tubo #2 del refrigerador y resuspender el tejido pelado, invirtiendo suavemente el tubo varias veces para crear una solución homogénea. Recomendamos contar los glomérulos dentro de los 5 d después del procesamiento.
- Alícuota cuidadosamente 500 μL de la solución renal en un solo pozo de una placa de 12 pozo. Repite este 2x, colocando cada alícuota en un pozo separado para que haya tres pozos de solución renal por riñón, para análisis por triplicado.
- Añadir 500 μL de PBS a cada uno de los tres pozos que contienen la solución renal, para una dilución 1:1.
- Con un microscopio invertido, cuente el número de glomérulos por pozo. El conteo se ayuda mediante el uso de una rejilla de 16 secciones separadas colocadas en la parte inferior de cada pozo. Cuente el número de glomérulos por cada sección cuadriculada y luego sume el conteo por rejilla para obtener el número total de glomérulos por pozo. Los glomérulos son fácilmente identificables por su estructura esférica. Los identificadores adicionales incluyeron un matiz rojizo debido a los capilares llenos de sangre, así como antes o después de las arteriolas que permanecen adherido al cuerpo de los glomérulos individuales (figura 1).
- Añadir el número total de glomérulos contados por cada uno de los tres pozos y luego dividirlos por tres para el número medio de glomérulos por 500 μL de solución renal. Si la varianza en el número medio de glomérulos por pozo es superior al 10%, repita el procedimiento de recuento de Nefrona, prestando mucha atención a la naturaleza homogénea de la solución renal. Multiplique el número de glomérulos contados por cada pozo 100 por el número promedio de glomérulos por riñón. El número total de Nefrona se puede expresar por riñón o, usando el peso del riñón, por mg o g de tejido.
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Representative Results
A continuación se presentan estimaciones representativas del número de Nefrona renal completa de un modelo de ratón establecido de hipertensión y un modelo de rata genética de la enfermedad renal crónica relacionada con la edad. Las características clave de identificación de los glomérulos, como una estructura esférica con o sin estructuras pre-o post-arteriolar o tubulares adjuntas, se destacan para aquellos nuevos en el método de maceración ácida (figura 1).
En el primer ejemplo experimental, los números totales de Nefrona se determinaron en ratones (machos C57BL/6, 6 semanas de edad) infundidos con vehículo (solución salina) o angiotensina II durante 14 días. En ratones con infusión de vehículo, el número de Nefrona fue de 12.411 ± 248 nefronas por riñón, según se determinó utilizando el método de maceración ácida (figura 2). Estas estimaciones son consistentes con los rangos de número de Nefrona renal completa notificados previamente en ratones (tabla 1). La angiotensina aumentó la presión auricular aproximadamente 40 mmHg después de 14 días de perfusión y se asoció con una reducción significativa en el número de Nefrona (9.122 ± 193 nefronas por riñón) de casi el 26% (figura 2). Estos datos sugieren que la infusión de angiotensina II no solo está asociada con la hipertensión, sino que, además, una reducción significativa en el número de Nefrona se asocia con la pérdida de Nefrona debida a la esclerosis o lesión glomerular.
En el segundo ejemplo experimental, se confirmaron los hallazgos previos del número de Nefrona en un modelo de rata genética de agenesia renal, el modelo heterogéneo derivado de la agenesia renal unilateral (HSRA) de rata. El modelo HSRA exhibe fenotipos de penetrancia incompleta para los defectos del riñón y las vías urinarias, con algunos animales que nacen normales (con dos riñones) y otros nacidos con un riñón. En ratas nacidas con dos riñones (macho hA-control; 12 semanas de edad), las estimaciones del número de Nefrona utilizando el método de maceración ácida fueron 27.288 ± 336 nefronas por riñón (figura 3). Por el contrario, en ratas nacidas con un riñón solitario (macho hA-solitario; 4 semanas de edad) se descubrió que el número de Nefrona era significativamente menor en 24.594 ± 883 nefronas por riñón (figura 3). Las estimaciones del número de Nefrona obtenidas en estas muestras también son consistentes con los rangos notificados previamente en la rata (tabla 1). Tenga en cuenta que estos datos son coherentes con los hallazgos previos en los que se encontró que las ratas de hA-solitaria exhiben una menor dotación de Nefrona o números (en comparación con un riñón de control), lo más probable es que refleje los factores genéticos subyacentes asociados con nacer con un solo riñón31.
Figura 1 : Identificadores clave de glomérulos para el conteo y la evaluación del número entero de Nefrona renal. Los glomérulos son fácilmente identificables por su estructura esférica, como indican las flechas. Los identificadores adicionales incluyen un matiz rojizo debido a los capilares llenos de sangre, así como pre-o post-arterioles (o túbulos) que pueden permanecer adherida al cuerpo de los glomérulos individuales después del procesamiento (como el identificado en la parte inferior de este micrografo). También están presentes en esta imagen los restos de túbulos y vasos sanguíneos. Aumento = 10X; barra de escala = 100 μm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Nephron contando en ratones. (A) imagen representativa de los glomérulos a partir de un solo ratón en un solo riñón bañado en un pozo de fondo plano de 22,1 mm de una placa de cultivo de 12 pozo, como se ve utilizando un microscopio invertido. Los glomérulos y los túbulos renales se observan a una densidad moderada cuando se diluyen por un factor de dos (0,5 mL de solución renal más 0,5 mL de 1x PBS). (B) efecto de un vehículo de 14 días o infusión de angiotensina II en el número de Nefrona en ratones C57BL/6 masculinos evaluado por conteo glomerular. La infusión de angiotensina II a 1.000 ng/kg/min (vía minibomba osmótica) se asoció con hipertensión y una reducción del número de Nefrona en comparación con el número de Nefrona en ratones infundidos con vehículo. Los números de Nefrona en ratones con infusión de vehículos son consistentes con las estimaciones previamente notificadas del número de Nefrona en ratones (tabla 1). Vehículo: n = 3, angiotensina II: n = 3, *p < 0,05. Barras de error = SE. magnificación = 4X; barra de escala = 250 μm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Nephron contando en ratas. (A) imagen representativa de los glomérulos a partir de una sola rata de riñón bañada en un pozo de fondo plano de 22,1 mm de una placa de cultivo de 12 pozo, como se ve utilizando un microscopio invertido. Los glomérulos y los túbulos renales se observan con una densidad significativamente mayor en comparación con el del ratón. (B) la cuantificación del número de Nefrona en ratas HSRA-control y HSRA-s revela que el número de Nefrona es menor en HSRA-s en comparación con las ratas HSRA-C y consistente con los hallazgos anteriores en este modelo31. HSRA-C, ratas nacidas con dos riñones: n = 3; HSRA-S, ratas nacidas con un riñón solitario: n = 3,* p < 0.05. Barras de error = SE. magnificación = 4X; barra de escala = 250 μm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Especies | Número de Nefrona por riñón | Referencia |
| Ratón | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| Rata | 13000-27000 | 31, 33 |
| Ovejas | 200000-800.000 | 23, 29, 34 |
| Cerdo | 1,600,000-4,600,000 | 32, 35 |
| Humano | 500000-2000000 | 8-15 |
Tabla 1: rangos reportados de número de Nefrona en varias especies.
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Discussion
Con una buena técnica experimental, el método de maceración ácida es ideal para estimar el número de Nefrona en todo el riñón. Aunque el riñón se disuelve en ácido, los glomérulos permanecen en gran parte intactos y son fácilmente identificables, haciendo que el conteo de glomérulos individuales sea relativamente fácil y sencillo. La técnica de maceración ácida es particularmente ventajosa por varias razones. En primer lugar, el método de maceración ácida es un método rápido y conveniente que requiere relativamente poco en términos de gasto y esfuerzo físico. Todos los reactivos y consumibles necesarios para realizar el método de maceración ácida están disponibles en la mayoría de los laboratorios básicos, siendo el único requisito importante el acceso a un microscopio invertido para el conteo glomerular. En términos de gasto, se estima que el método de maceración ácida cuesta sólo un par de cientos de dólares por animal, que no es mucho en comparación con los costos asociados con otros métodos de conteo glomerular entero del riñón, tales como imágenes por resonancia magnética, que puede variar en miles de dólares por animal de tiempo de escaneo y experiencia técnica.
En segundo lugar, el método de maceración ácida implica significativamente menos tiempo de procesamiento de tejido en comparación con otros métodos de número de Nefrona renal completa, como el método de dessector/fraccionamiento24. De principio a fin, el método de maceración ácida requiere menos de 24 horas de tiempo total, de los cuales se gastan menos de 1-2 horas procesando los riñones y luego contando los glomérulos individuales por animal experimental. Por el contrario, el método de disección/fraccionamiento es laborioso, requiriendo una estimación de 15 horas de mano de obra (4-6 horas de seccionamiento, 2-3 horas de tinción, y 4-5 horas de conteo) por riñón, sin incluir las 48-72 horas necesarias para procesar los riñones en GL metacrilato de ycol24. Debido a las ventajas del costo y el tiempo, el método de maceración ácida es especialmente útil en estudios en los que se deben realizar estimaciones del número entero de Nefrona renal en grandes cantidades de animales con o sin intervenciones genéticas o farmacológicas. Tanto el costo como el tiempo involucrado con el método de dessector/fraccionamiento y la resonancia magnética se han considerado un factor limitante importante en su adopción en la mayoría de los laboratorios de investigación.
Por último, el método de maceración ácida proporciona estimaciones del número completo de Nefrona renal que son comparables a las medidas que utilizan métodos más sofisticados como la resonancia magnética26. Por ejemplo, utilizando el etiquetado catiónico de ferritina de los glomérulos y el procesamiento de imágenes tridimensionales para contar cada Nefrona en un solo riñón de la rata Sprague-Dawley, la imagen por resonancia magnética arrojó en promedio recuentos de 34.000 glomérulos individuales por riñón26. En los riñones no catiónicos con etiquetado de ferritina, las imágenes por resonancia magnética produjeron recuentos de 2.000 estructuras parecidas a las nefronas debido al conteo de regiones no glomerulares de riñón con señales magnéticas de magnitud y forma similares a las de los glomérulos etiquetados con ferritina. Cuando estos artefactos se restan de los recuentos determinados por los riñones catiónicos con la etiqueta de ferritina, el número efectivo de glomérulos determinados, utilizando imágenes por resonancia magnética, está más cerca de 32.000 nefronas por riñón26. En este mismo estudio, los experimentos de validación produjeron recuentos glomerulares promedio de 31.000 por riñón utilizando el método de maceración ácida26. Por lo tanto, el método de maceración ácida produce estimaciones del número total de Nefrona renal que se encuentran dentro de < 5% de los que se determinan utilizando técnicas de vanguardia como la resonancia magnética.
Aunque hay varias ventajas clave asociadas con el método de maceración ácida, los investigadores también deben ser conscientes de las limitaciones asociadas con este método. Una limitación se relaciona con el uso de riñón entero. A medida que todo el riñón se disuelve y homogeneiza, no se puede determinar la información sobre la distribución espacial de los glomérulos dentro de la corteza renal. Si es importante conocer la distribución intrarrenal del volumen glomerular, entonces el uso de imágenes por resonancia magnética sería un método mejor adaptado.
En comparación con otros métodos, el uso del método de maceración ácida parece subestimar ligeramente el número total de Nefrona. Las estimaciones más pequeñas son probablemente debidas, en parte, a la disolución de un pequeño porcentaje de glomérulos en el ácido o durante la maceración del riñón. Además, con el envejecimiento o la enfermedad, hay una pérdida de nefronas funcionales, que, aunque no contribuyen a la formación de orina, pueden ser más sensibles a la maceración ácida y pueden ser destruidos durante el procesamiento, contribuyendo así a las estimaciones más bajas de la nefrona total Número. Por lo tanto, se debe tener cuidado al recolectar y procesar los riñones para no dejar ningún tejido renal in vivo al cortar el riñón, o en las jeringas al extruir muestras de tejido. En general, sin embargo, la subestimación del número total de Nefrona debido al procesamiento de tejidos parece ser relativamente pequeña.
Dado que el recuento de glomérulos que utilizan el método de maceración ácida es subjetivo, la subestimación del número de Nefrona también puede reflejar el sesgo de los observadores, que se puede superar fácilmente mediante mediciones realizadas por dos investigadores independientes cegados a información sobre animales o condiciones experimentales. Si hay una preocupación significativa en cuanto a lo que constituye un gloulus, un enfoque alternativo implicaría el ingreso de animales experimentales con óxido de hierro antes de la eutanasia. Cuando se infunde por vía intravenosa, el óxido de hierro entrará y se verá atrapado en el gloulus; por lo tanto, los glomérulos procesados deben teñir negro oscuro, lo que permite una mayor identificación de glomérulos al contar30.
El método de maceración ácida estima el número entero de Nefrona renal en función de la medición de muestras pequeñas (3 x 0,5 mL o 1,5 mL) en contraposición a las mediciones de toda la solución de riñón (50 mL). El método de maceración ácida es altamente reproducible en la naturaleza, y los glomérulos cuentan dentro de las muestras de un solo riñón y dentro de los grupos experimentales se encuentra que son altamente consistentes. Además, los resultados representativos notificados en el presente estudio de ratones C57Bl/6 silvestres y ratas nacidas con un solo riñón (figura 2 y 3) son altamente consistentes con hallazgos previos, así como con rangos previamente reportados (tabla 1 )5,31. Si se desea, se podrían realizar mediciones adicionales fácilmente para estimar mejor el número total de Nefrona por riñón.
Si bien la técnica de maceración ácida proporciona estimaciones fiables y repetibles del número de Nefrona, este método no se recomienda para obtener mediciones de volumen glomerular, ya que la exposición al ácido probablemente produce alteraciones en el volumen de glomérulos. Dado que la determinación del volumen glomerular es importante para determinar el área superficial glomerular completa del riñón, se recomienda que dichas mediciones se hagan utilizando métodos histológicos y estereológicos24,25. En particular, los métodos estereológicos que hacen uso del glicol metacrilato incrustan los riñones con el fin de limitar la hinchazón y la expansión del tejido y, por lo tanto, mantener la geometría glomerular lo más cerca posible de la in vivo.
Por último, otra limitación de la técnica de maceración ácida, y una que es común a otros métodos de evaluación del número de Nefrona, es que no se puede determinar información sobre la función glomerular (como la tasa de filtración glomerular) a partir de los glomérulos una vez Procesado. Por lo tanto, aunque se pueden contar los glomérulos individuales, su estado funcional (formación de orina o no formación de orina) no se puede determinar utilizando el método de maceración ácida. Del mismo modo, no se puede determinar información longitudinal utilizando el método de maceración ácida en ratones individuales. En su lugar, se requieren grupos separados de animales en varios puntos de tiempo para obtener información sobre los cambios en el número de Nefrona sobre la vida de un animal o la intervención pre o postgenética o farmacológica.
En Resumen, el método de maceración ácida es un método de bajo costo, alto rendimiento y eficiente para estimar el número entero de Nefrona renal. El método de maceración ácida proporciona un alto grado de reproducibilidad, como demuestran los dos ejemplos presentados aquí, así como los notificados previamente utilizando este método18,19,20,21 , 22 , 28. Si bien se describió el uso del método de maceración ácida para su uso en ratones (y ratas), el método de maceración ácida también se puede escalar para su uso en especies más grandes, como el perro y el cerdo27,32.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por los institutos nacionales de salud, corazón nacional, pulmón, y el Instituto de sangre (R01HL107632).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
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