Summary
Le stime del numero di nefrone rene intero sono importanti clinicamente e sperimentalmente, in quanto vi è un'associazione inversa tra il numero di nefrone e un aumentato rischio di malattie renali e cardiovascolari. Qui è dimostrato l'uso del metodo di macerazione acida, che fornisce stime rapide e affidabili del numero di nefrone renale intero.
Abstract
L'investitura di nephron si riferisce al numero totale di nefroni a cui è nato un individuo, poiché la nefrogenesi nell'uomo è completata da 36 settimane di gestazione e non si formano nuovi nefroni dopo la nascita. Il numero di nephron si riferisce al numero totale di nefroni misurati in qualsiasi momento post-parto. Sia i fattori genetici che quelli ambientali influenzano sia il numero che l'investitura dei nevi. Comprendere come i geni o i fattori specifici influenzano il processo di perdita o scomparsa di nefrogenesi e di nefrone è importante in quanto gli individui con una dotazione o un numero di nefrone inferiore sono pensati per essere ad un rischio maggiore di sviluppare malattie renali o cardiovascolari. Comprendere come le esposizioni ambientali nel corso della vita di una persona influisce sul numero di nefrone sarà anche vitale per determinare il rischio di malattia futuro. Pertanto, la capacità di valutare in modo rapido e affidabile il numero di nefratti renali interi è un requisito sperimentale di base per comprendere meglio i meccanismi che contribuiscono o promuovono la perdita di nefrogenesi o di nefrone. Qui, descriviamo il metodo di macerazione acida per la stima del numero di nefrone renale intero in base alla procedura descritta da Damadian, Shawayri e Bricker, con lievi modifiche. Il metodo di macerazione acida fornisce stime rapide e affidabili del numero di nefratti (valutati dal conteggio dei glomeruli) che sono entro il 5% di quelli determinati utilizzando metodi più avanzati, seppur costosi, come l'imaging a risonanza magnetica. Inoltre, il metodo di macerazione acida è un ottimo metodo ad alto rendimento per valutare il numero di nefrini in un gran quantità di campioni o condizioni sperimentali.
Introduction
Il nefrone è sia la struttura di base che l'unità funzionale del rene1. Strutturalmente, il nefrone è costituito dal glomerulo (capillari e podociti) che si trova all'interno della capsula del Bowman e del tubulo renale, costituito dal tubulo prossimale, dal loop di Henle e dal tubulo distale che termina nel condotto di raccolta. Funzionalmente, il ruolo del nefrone è la filtrazione e il riassorbimento di acqua ed elettroliti e la secrezione di rifiuti. In generale, la nefrogenesi è completata a 36 settimane di gestazione negli esseri umani e poco dopo la nascita in diverse specie come il topo e il ratto2. L'investitura di nefrone si riferisce al numero totale di nefroni con cui è nato un individuo, mentre il numero di nevi è il numero totale di nefroni misurati in qualsiasi momento dopo la nascita3. Il termine numero di nefrone e il numero glomerulare sono spesso usati in modo intercambiabile. Poiché c'è solo un glomerulo per nefrone, la valutazione del numero di glomeruli è un surrogato importante per stimare il numero di nefrone.
La valutazione della dotazione di nefrone e del numero di nefrone è di interesse clinico, in quanto gli studi hanno dimostrato un'associazione tra la dotazione di nefrone e i numeri di nefrone ridotti con un aumento dell'incidenza di malattie cardiovascolari4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. sulla base dei risultati nei reni all'autopsia, Brenner ha osservato che gli individui ipertesi presentavano un numero totale inferiore di nefroni rispetto agli individui normotensivi16. Così, Brenner ipotizzò che vi è una relazione inversa tra il numero di nefrone e il rischio di sviluppare ipertensione più tardi nella vita. Brenner ipotizzò anche che una riduzione del numero dei nefroni fosse compensata dai nefroni rimasti. Al fine di mantenere il normale tasso di filtrazione nel rene, i nefroni residui compensano aumentando la loro superficie glomerulare (ipertrofia glomerulare), lavorando così per mitigare qualsiasi effetto avverso della perdita di nefrone sulla funzione renale4 ,16.
Mentre protettivo nell'ipertrofia glomerulare a breve termine, a lungo termine, porta ad un aumento della ritenzione di sodio e liquidi, un aumento del volume del fluido extracellulare e aumenti della pressione arteriosa, portando a un circolo vizioso di ulteriori aumenti in pressione capillare glomerulare, iperfiltrazione glomerulare e cicatrizzazione del nefrone (sclerosi) e lesione4,16.
Ottenere stime o conteggi di numero di nefrone offre un paio di vantaggi sperimentali: 1) fornisce informazioni sul processo di nefrogenesi, che può quindi essere collegato a specifici geni o fattori nell'embrione o nell'ambiente materno-fetale, e 2) C'è un'associazione di numero di nefrone con malattia cardiovascolare e, quindi, c'è il potenziale che le stime del numero di nefrone potrebbero essere utilizzate per predire il rischio cardiovascolare futuro2,17,18, 19 anni di , 20 il , 21 anni di , 22. oltre all'ambiente materno-fetale, diverse malattie influenzano direttamente il numero di nevi e la funzione renale, tra cui l'aterosclerosi, il diabete, l'ipertensione e anche l'invecchiamento normale2,9, 10,11,12,22,23. Pertanto, la valutazione del numero di nefrone del rene intero è importante per comprendere sia i fattori genetici che quelli ambientali che influenzano la nefrogenesi (valea dire, l'investitura del nefrone) e il numero di nefrone nel corso della vita di una persona e gli effetti risultanti sulla funzionalità renale e sulla salute cardiovascolare.
Attualmente, ci sono diversi metodi disponibili per la determinazione e la quantificazione del numero di nefrone, ciascuno con i propri vantaggi e limitazioni24,25,26,27,28 ,29,30. Metodi sofisticati per determinare il numero di nefratti renali interi includono metodi stereologici, come il metodo dissettore/frazionata e risonanza magnetica25,26. Spesso considerato il gold-standard per la determinazione del numero di nefrone rene intero, il metodo dissector/fratore è sia costoso e dispendioso in termini di tempo. I recenti progressi e il miglioramento dell'imaging e della lavorazione a risonanza magnetica hanno fornito gli strumenti per contare singolarmente ogni nefrone. Tuttavia, l'imaging a risonanza magnetica non è solo dispendioso in termini di tempo, ma anche estremamente costoso. Inoltre, sia il metodo dissettore/fratore che la risonanza magnetica richiedono competenze tecniche avanzate, limitando così l'uso di tali metodi nella maggior parte dei laboratori di ricerca.
La maggior parte dei metodi per determinare il numero di nefrone fa conteggi o stime in base all'identificazione dei glomeruli, in quanto sono facilmente identificabili strutturalmente. In questo documento, il metodo di macerazione acida per stimare il numero di nefrone in rene intero è descritto e dimostrato27. Il metodo di macerazione acida è veloce, affidabile e significativamente meno costoso rispetto ad altri metodi, come il metodo del dissettore/fratore e l'imaging a risonanza magnetica. Inoltre, il metodo di macerazione acida fornisce stime altamente ripetibili del numero di nevi che sono stati segnalati all'interno della gamma di quelli determinati utilizzando la risonanza magnetica Imaging26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le forniture e i reagenti elencati di seguito sono per la determinazione del numero di nefrone renale intero in un topo, cioè due reni. Le modifiche per l'uso del metodo di macerazione acida per ratto sono identificate con asterischi. Tutti i protocolli sperimentali sono conformi alla guida nazionale degli istituti di salute per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Mississippi Medical Center.
1. procedura di isolamento dei reni
- Pesare il topo (o altre specie) ed eutanizzare con un isoflurano (5%-8%) sovradosaggio o pentobarbital (150 mg/kg di iniezione intraperitoneale).
- Una volta che il mouse è eutanizzato, aprire la sua cavità addominale utilizzando forbici chirurgiche sottili lungo la linea mediana.
- Sollevare con cautela l'intestino e l'adiposo riproduttivo sul lato destro della cavità addominale. Per dissezione lorda, isolare il rene sinistro. Utilizzando forbici chirurgiche fini, tagliare l'arteria renale sinistra e la vena e rimuovere con cautela il rene sinistro, mettendo il rene in un opportunamente etichettato (numero del mouse/identificatore) barca di pesatura contenente fosforo-tamponata Salina (PBS).
- Ripetere la procedura per il rene destro.
- Rimuovere ogni rene dalla rispettiva barca di pesatura e posizionarlo su una garza chirurgica pre-inumidito con PBS.
- Lasciando il rene sulla garza chirurgica, rimuovere rapidamente qualsiasi tessuto non renale aderente (come adiposo perirenale o ghiandola surrenale) seguita dalla rimozione della capsula renale. Pesare ogni rene singolarmente, registrando il peso del rene sinistro e destro separatamente in un taccuino di laboratorio.
2. procedure di omogeneizzazione, incubazione e straining
- Una volta che ogni rene viene pesato, drenare ogni barca di pesatura di PBS e riportare i reni nella barca di pesatura opportunamente etichettata. Usando una lama di rasoio pulita, tagliare il rene a metà, longitudinalmente. Posizionare ogni mezzo rene rivolto verso il basso e tagliare ogni metà in pezzi di 2 mm o più piccoli.
- Utilizzando lo stesso Razorblade, raccogliere accuratamente e posizionare i pezzi di rene tritati in un etichettato 15-mL tubo conico (mouse numero/identificatore; sinistra contro rene destro).
- Ripetere la procedura per il rene opposto, utilizzando una nuova lama di rasoio. Posizionare il rene tritato in un tubo conico da 15 mL con etichetta separata.
- In un cappuccio di fumi ben ventilato, aggiungere 5 mL di acido cloridrico 6 M (HCl) ad ogni tubo conico da 15 mL.
- Sostituire il tappo al tubo conico, agitare delicatamente la miscela rene/HCl e posizionare il tubo conico da 15 mL in un bagno d'acqua preriscaldato a 37 ° c per 90 min (* 120 min per i reni del ratto).
- Agitare brevemente ogni tubo da 15 mL ogni 15 minuti durante l'incubazione per garantire che tutti i tessuti siano esposti all'acido HCl.
- Inserire un ago da 18 G in una siringa da 5 mL (* siringa da 10 mL per ratto) e rimuovere con cautela lo stantuffo della siringa. Collocare la siringa in un tubo conico da 50 mL (tubo #1) in una cappa di aspirazione.
- Rimuovere la soluzione di rene/HCl dal bagno d'acqua e versare la soluzione tissutale nell'estremità aperta della siringa e impostare il tubo conico da 15 mL da parte in un rack provetta. Sostituire con cautela lo stantuffo e spingere lentamente lo stantuffo in modo da estinare la soluzione attraverso l'ago e nel tubo #1.
- Lavare il tubo conico da 15 mL con 5 mL di soluzione PBS. Agitare il PBS nel tubo conico da 15 mL in modo da solubilizzare il tessuto renale rimanente.
- Di nuovo, rimuovere con cautela lo stantuffo dalla siringa da 5 mL contenente l'ago da 18 G e versare il contenuto dal tubo conico da 15 mL all'estremità aperta della siringa. Sostituire con cautela lo stantuffo e sciacquare la siringa spingendo delicatamente verso il basso lo stantuffo, in #1 del tubo. Ripetere questo processo 2x (eseguito 3x in totale).
- Inserire un ago da 21 G in una nuova siringa da 5 mL (* siringa da 10 mL per ratto) e rimuovere con cautela lo stantuffo della siringa. Posizionare la siringa con l'ago da 21 G inserito in un nuovo tubo conico 50 mL (tubo #2).
- Versare il contenuto dal tubo #1 all'estremità aperta della siringa contenente l'ago da 21 G. Inserire con cautela lo stantuffo e sciacquare la siringa spingendo delicatamente verso il basso lo stantuffo della siringa e posizionando la soluzione estrusa nel tubo #2.
- Lavare il tubo #1 con 5 mL di soluzione PBS. Swirl il PBS in tubo #1 in modo da solubilizzare qualsiasi tessuto renale rimanente.
- Di nuovo, rimuovere con cautela lo stantuffo dalla siringa da 5 mL contenente l'ago da 18 G e versare il contenuto dal tubo #1 all'estremità aperta della siringa. Sostituire con cautela lo stantuffo e sciacquare la siringa spingendo delicatamente verso il basso lo stantuffo, estecando la soluzione nel tubo #2. Ripetere questo processo 2x (eseguito 3x in totale).
- Portare il volume totale di tubo #2 fino a 50 mL aggiungendo ulteriori PBS, fino alla linea 50-mL su tubo #2.
- Incubare #2 del tubo contenente la soluzione di tessuto renale in un rack di tubi su una piastra Rocker in un frigorifero impostato a 4 ° c durante la notte (minimo 8-10 h).
3. conteggio dei glomeruli e estrapolazione del numero di nephron
- Rimuovere il tubo #2 dal frigorifero e risospendere il tessuto pellettato capovolgendo delicatamente il tubo più volte al fine di creare una soluzione omogenea. Si consiglia di contare i glomeruli entro 5 d dopo l'elaborazione.
- Con cautela aliquota 500 μL della soluzione renale in un unico pozzo di una piastra 12-well. Ripetere questo 2x, mettendo ogni aliquota in un pozzo separato in modo che ci siano tre pozzi di soluzione renale per rene, per l'analisi in triplice plicato.
- Aggiungere 500 μL di PBS a ciascuno dei tre pozzetti contenenti la soluzione renale, per una diluizione 1:1.
- Utilizzando un microscopio invertito, contare il numero di glomeruli per pozzetto. Il conteggio è aiutato utilizzando una griglia di 16 sezioni separate posizionate sul fondo di ciascun pozzo. Contare il numero di glomeruli per ogni sezione della griglia e quindi sommare il conteggio per griglia per ottenere il numero totale di glomeruli per pozzo. I glomeruli sono facilmente identificabili dalla loro struttura sferica. Ulteriori identificatori includevano una tonalità rossastra a causa di capillari riempiti di sangue, così come pre-o post-arteriole che rimangono attaccati al corpo dei singoli glomeruli (Figura 1).
- Aggiungere il numero totale di glomeruli conteggiati per ciascuno dei tre pozzetti e poi dividerli per tre per il numero medio di glomeruli per 500 μL di soluzione renale. Se la varianza nel numero medio di glomeruli per pozzo è superiore al 10%, ripetere la procedura di conteggio dei nevi, prestando molta attenzione alla natura omogenea della soluzione renale. Moltiplicare il numero di glomeruli contati per ben volte 100 per il numero medio di glomeruli per rene. Il numero totale di nefrone può essere espresso per rene o, usando il peso del rene, per mg o g di tessuto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Di seguito sono riportate le stime rappresentative del numero di nefrone del rene intero da un modello murino di ipertensione e un modello genetico di ratto della malattia renale cronica legata all'età. Le caratteristiche chiave di identificazione dei glomeruli, come una struttura sferica con o senza strutture pre-o post-arteriolari o tubolari collegate, sono evidenziate per quelle nuove al metodo di macerazione acida (Figura 1).
Nel primo esempio sperimentale, i numeri di nefrone totali sono stati determinati nei topi (maschi topi C57BL/6, 6 settimane di età) infusi con veicolo (soluzione salina) o angiotensina II per 14 giorni. Nei topi con infuso di veicoli, il numero di nefrone è stato di 12.411 ± 248 nefrini per rene, come determinato utilizzando il metodo di macerazione acida (Figura 2). Queste stime sono coerenti con gli intervalli di numero di nefrone renale intero riportati in precedenza nei topi (tabella 1). L'angiotensina ha aumentato la pressione atriale di circa 40 mmHg dopo 14 giorni di infusione ed è stata associata ad una significativa riduzione del numero di nefrone (9.122 ± 193 nefroni per rene) di quasi il 26% (Figura 2). Questi dati suggeriscono che l'infusione di angiotensina II non è solo associata all'ipertensione ma, inoltre, una significativa riduzione del numero di nefrone è associata alla perdita di nefrone dovuta alla sclerosi o alla lesione glomerulare.
Nel secondo esempio sperimentale, sono stati confermati i precedenti risultati del numero di nefrone in un modello genetico del ratto di agenesia renale, il modello eterogeneo derivato dalle scorte di agenesia renale unilaterale (HSRA) ratto. Il modello HSRA presenta fenotipi di penetranza incompleti per difetti del rene e del tratto urinario, con alcuni animali nati normali (con due reni) e altri nati con un rene. Nei ratti nati con due reni (hA-Control maschile; 12 settimane di età), le stime del numero di nefratti con il metodo di macerazione acida sono state 27.288 ± 336 nefroni per rene (Figura 3). Al contrario, nei ratti nati con un rene solitario (maschio ha-solitario; 4 settimane di età) le stime del numero di nefrone sono risultate significativamente inferiori a 24.594 ± 883 nefratti per rene (Figura 3). Le stime del numero di nefrone raggiunti in questi campioni sono anche coerenti con gli intervalli precedentemente segnalati nel ratto (tabella 1). Si noti che questi dati sono coerenti con i precedenti risultati in cui è stato riscontrato che i ratti di hA-solitari presentano una dotazione o un numero di nipoti in diminuzione (rispetto a un rene di controllo) molto probabilmente riflessivo dei fattori genetici sottostanti associati all'essere nati con un singolo rene31.
Figura 1 : Identificatori chiave dei glomeruli per il conteggio e la valutazione del numero di nefrone renale intero. I glomeruli sono facilmente identificabili dalla loro struttura sferica, come indicato dalle frecce. Ulteriori identificatori includono una tonalità rossastra a causa di capillari riempiti di sangue, così come pre-o post-arteriole (o tubuli) che possono rimanere attaccati al corpo dei singoli glomeruli dopo la trasformazione (come quello identificato nella parte inferiore di questo Micrografo). Anche presenti in questa immagine sono resti di tubuli e vasi sanguigni. Ingrandimento = 10X; barra di scala = 100 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Nephron conta nei topi. A) immagine rappresentativa dei glomeruli da un singolo rene di topo placcato in un pozzo a fondo piatto di 22,1 mm di una piastra di coltura a 12 well, come si vede usando un microscopio invertito. I glomeruli e i tubuli renali sono osservati a densità moderata quando diluito con un fattore di due (0,5 mL di soluzione renale più 0,5 mL di 1X PBS). B) effetto di un veicolo di 14 giorni o di un'infusione di ANGIOTENSINA II sul numero di nefrone in topi maschi topi C57BL/6 valutati per conteggio glomerulare. L'infusione di angiotensina II a 1.000 ng/kg/min (via osmotica minipump) è stata associata all'ipertensione e ha segnato una riduzione del numero di nefrone rispetto al numero di nefrone nei topi infusi con il veicolo. I numeri di nefrone nei topi infusi di veicoli sono coerenti con le stime precedentemente segnalate del numero di Nefrina nei topi (tabella 1). Veicolo: n = 3, ANGIOTENSINA II: n = 3, *p < 0,05. Barre di errore = SE. ingrandimento = 4X; barra di scala = 250 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Nephron conta nei ratti. A) immagine rappresentativa dei glomeruli da un singolo rene di ratto placcato in un pozzo a fondo piatto di 22,1 mm di una piastra di coltura a 12 well, come si vede usando un microscopio invertito. I glomeruli e i tubuli renali sono osservati a una densità significativamente maggiore rispetto a quella del topo. (B) la quantificazione del numero del nefrone nei ratti HSRA-Control e HSRA-s rivela che il numero di nefratti è inferiore in HSRA-s rispetto ai ratti HSRA-C e coerente con i precedenti risultati in questo modello31. HSRA-C, ratti nati con due reni: n = 3; HSRA-S, ratti nati con un rene solitario: n = 3,* p < 0,05. Barre di errore = SE. ingrandimento = 4X; barra di scala = 250 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| specie | Numero di nephron per rene | referenza |
| topo | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| ratto | 13000-27.000 | 31, 33 |
| Pecora | 200000-800000 | 23, 29, 34 |
| maiale | 1600000-4600000 | 32, 35 |
| Umano | 500000-2.000.000 | 8-15 a |
Tabella 1: intervalli segnalati di numero di nefrone in diverse specie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Con una buona tecnica sperimentale, il metodo di macerazione acida è ideale per stimare il numero di nefrone in rene intero. Anche se il rene viene sciolto in acido, i glomeruli rimangono in gran parte integri e sono facilmente identificabili, rendendo il conteggio dei singoli glomeruli relativamente facile e diretto. La tecnica di macerazione acida è particolarmente vantaggiosa per diversi motivi. In primo luogo, il metodo di macerazione acida è un metodo rapido e conveniente che richiede relativamente poco in termini di spesa e sforzo fisico. Tutti i reagenti e i consumabili necessari per eseguire il metodo di macerazione acida sono prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori di base, l'unico requisito importante è l'accesso a un microscopio invertito per il conteggio glomerulare. In termini di spesa, si stima che il metodo di macerazione acida costa solo un paio di centinaia di dollari per animale, che non è molto rispetto ai costi associati ad altri metodi di conteggio glomerulare del rene intero, come l'imaging a risonanza magnetica, che può variare in migliaia di dollari per animale di tempo di scansione e competenza tecnica.
In secondo luogo, il metodo della macerazione acida comporta un minor tempo di lavorazione dei tessuti rispetto ad altri metodi di numero di nefratti renali interi, come il metodo del dissettore/frazionata24. Dall'inizio alla fine, il metodo di macerazione acida richiede meno di 24 ore di tempo totale, di cui meno di 1-2 ore vengono spesi per la lavorazione dei reni e quindi il conteggio dei singoli glomeruli per animale sperimentale. Al contrario, il metodo dissettore/frazionamento è intensivo di manodopera, richiedendo una stima di 15 ore di manodopera (4-6 ore di sezionamento, 2-3 ore di colorazione e 4-5 ore di conteggio) per rene, non includendo le 48-72 ore necessarie per l'elaborazione dei reni in GL ycol metacrilato24. A causa dei vantaggi del costo e del tempo, il metodo di macerazione acida è particolarmente utile negli studi in cui le stime del numero di nefrone renale intero devono essere effettuate in un gran quantità di animali con o senza interventi genetici o farmacologici. Sia il costo che il tempo di utilizzo del metodo del dissettore/fratore e della risonanza magnetica sono stati considerati un importante fattore limitante nella loro adozione nella maggior parte dei laboratori di ricerca.
Infine, il metodo di macerazione acida fornisce stime del numero di nefratti renali interi che sono paragonabili a misure che utilizzano metodi più sofisticati come l'imaging a risonanza magnetica26. Ad esempio, utilizzando l'etichettatura cationica di ferritina dei glomeruli e l'elaborazione tridimensionale delle immagini per contare ogni nefrone in un singolo rene dal ratto di Sprague-Dawley, l'imaging a risonanza magnetica ha prodotto in media conteggi di 34.000 singoli glomeruli per Rene26. Nei reni non cationici con etichetta ferritina, l'imaging a risonanza magnetica ha prodotto conteggi di 2.000 strutture simili a nephron a causa del conteggio di regioni non glomerulari di rene con segnali magnetici di grandezza simile e forma come glomeruli etichettati con ferritina. Quando questi artefatti vengono sottratti dai conteggi determinati dai reni cationici con l'etichetta ferritina, il numero effettivo di glomeruli determinati, utilizzando l'imaging a risonanza magnetica, è più vicino a 32.000 nefroni per rene26. In questo stesso studio, esperimenti di validazione hanno prodotto conteggi glomerulari medi di 31.000 per rene utilizzando il metodo di macerazione acido26. Così, il metodo di macerazione acida produce stime del numero di nefratti renali interi che si trovano entro < 5% di quelli determinati utilizzando tecniche all'avanguardia come la risonanza magnetica.
Anche se ci sono diversi vantaggi chiave associati al metodo di macerazione acida, gli investigatori dovrebbero anche essere consapevoli delle limitazioni associate a questo metodo. Una limitazione riguarda l'uso di rene intero. Poiché l'intero rene viene sciolto e omogeneizzato, non è possibile determinare le informazioni riguardanti la distribuzione spaziale dei glomeruli all'interno della corteccia renale. Se si conosce la distribuzione intrarenale del volume glomerulare è importante, quindi l'uso di imaging di risonanza magnetica sarebbe un metodo più adatto.
Rispetto ad altri metodi, l'uso del metodo di macerazione acida sembra sottovalutare leggermente il numero di nefrone totale. Le stime più piccole sono probabilmente dovute, in parte, alla dissoluzione di una piccola percentuale di glomeruli nell'acido o durante la macerazione del rene. Inoltre, con l'invecchiamento o la malattia, c'è una perdita di nefroni funzionali, che, pur non contribuendo alla formazione delle urine, possono essere più sensibili alla macerazione acida e possono essere distrutti durante la lavorazione, contribuendo così a ridurre le stime del totale del nefrone numero. Pertanto, la cura deve essere utilizzata durante la raccolta e la lavorazione dei reni in modo da non lasciare alcun tessuto renale in vivo durante il taglio del rene, o nelle siringhe durante l'estrusione di campioni di tessuto. Nel complesso, tuttavia, la sottovalutazione del numero di nefrone totale dovuto alla lavorazione tissutale sembra essere relativamente piccola.
Poiché il conteggio dei glomeruli utilizzando il metodo della macerazione acida è soggettivo, la sottovalutazione del numero di nefratti può anche essere riflettente della polarizzazione dell'osservatore, che può essere facilmente superata dalle misurazioni eseguite da due investigatori separati accecati a informazioni relative a animali o condizioni sperimentali. Se vi è una preoccupazione significativa in merito a ciò che costituisce un glomerulo, un approccio alternativo comporterebbe l'inutilizzo di animali sperimentali con ossido di ferro prima dell'eutanasia. Quando infuso per via endovenosa, l'ossido di ferro entrerà e diventerà intrappolato nel glomerulo; Pertanto, i glomeruli trasformati devono macchiare il nero scuro, permettendo una maggiore identificazione dei glomeruli quando contano30.
Il metodo di macerazione acida stima il numero di nefrone renale intero in base alla misurazione di piccoli campioni (3 x 0,5 mL o 1,5 mL) rispetto alle misurazioni dell'intera soluzione di rene (50 mL). Il metodo di macerazione acida è altamente riproducibile in natura, e i glomeruli contano all'interno di campioni di un singolo rene e all'interno di gruppi sperimentali sono trovati per essere altamente coerenti. Inoltre, i risultati rappresentativi riportati nello studio in esame da topi di tipo Wild topi C57BL/6 e ratti nati con un singolo rene (Figura 2 e 3) sono altamente coerenti con i risultati precedenti, nonché con gli intervalli precedentemente segnalati (tabella 1 )5,31. Se lo si desidera, ulteriori misurazioni potrebbero essere fatte facilmente per stimare meglio il numero totale di nefrone per rene.
Mentre la tecnica di macerazione acida fornisce stime affidabili e ripetibili del numero di Nefrina, questo metodo non è raccomandato per ottenere misurazioni del volume glomerulare, poiché l'esposizione a acido più probabile produce alterazioni del volume glomerulo. Poiché la determinazione del volume glomerulare è importante per determinare l'intera superficie glomerulare renale, si raccomanda che tali misurazioni siano effettuate utilizzando metodi istologici e stereologici24,25. In particolare, i metodi stereologici che fanno uso di glicole metacrilato incorporano i reni al fine di limitare il gonfiore e l'espansione tissutale e, quindi, mantenere la geometria glomerulare il più vicino possibile a quella in vivo.
Infine, un'altra limitazione della tecnica di macerazione acida, e una che è comune ad altri metodi di valutazione del numero di nefratti, è che nessuna informazione riguardante la funzione glomerulare (come la velocità di filtrazione glomerulare) può essere accertata dai glomeruli una volta Elaborato. Così, mentre i singoli glomeruli possono essere conteggiati, il suo stato funzionale (formazione di urina o non-formazione di urina) non può essere determinato utilizzando il metodo di macerazione acida. Analogamente, non possono essere accertate informazioni longitudinali utilizzando il metodo di macerazione acida nei singoli topi. Invece, gruppi separati di animali in vari punti temporali sono necessari per ottenere informazioni sui cambiamenti nel numero di nefrone sulla durata di vita di un animale o sull'intervento pre-o postgenetico o farmacologico.
In sintesi, il metodo di macerazione acida è un metodo a basso costo, ad alta produttività ed efficiente per stimare il numero di nefrone renale intero. Il metodo di macerazione acida fornisce un alto grado di riproducibilità, come evidenziato dai due esempi presentati qui, così come da quelli precedentemente segnalati utilizzando questo metodo18,19,20,21 , 22 anni di , 28. mentre l'uso del metodo di macerazione acida è stato descritto per l'uso nel topo (e nel ratto), il metodo di macerazione dell'acido può anche essere ridimensionato per l'uso in specie più grandi, come il cane e il maiale27,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dagli istituti nazionali di salute, cuore nazionale, polmone, e Blood Institute (R01HL107632).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
- Hall, J. E., Guyton, A. C. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 13th, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).
- Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
- Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
- Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
- Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
- Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
- Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension? American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
- Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
- Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other? American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
- Clark, A. T., Bertram, J. F.
- Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
- Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
- Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
- Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
- Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
- Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
- Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
- Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
- Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
- Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
- Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
- Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).
