Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Optogenetisk manipulation av neurala kretsar under övervakning sömn/vakenhet stater hos möss
Chapters
Summary June 19th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här, vi beskriver metoder för optogenetisk manipulation av vissa typer av nervceller under övervakning av sömn/vakenhet stater i möss, presentera vårt senaste arbete på sängen kärnan i stria terminalis som ett exempel.
Transcript
Detta förfarande kan hjälpa oss att identifiera funktionen av specifika neuro krets som är inblandade i sömn vakenhet förordningen med mindre invasiv manipulation och hög tidsmässiga upplösning. Denna metod tillåter oss övervakningen yta EEG i realtid i samband med manipulering av en specifik neuro krets för att undersöka orsakssamband mellan kretsar och sömn vakenhet stater. Shota Kodani ska demonstrera ingreppet.
Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa, applicera salva på djurets ögon och använda öronstänger och näsa stift till stereotaktisk apparat för att stabilisera huvudet av den sövda musen på en absorberande pad. När huvudet är fast i läge, gör en mid-sagittal snitt i hårbotten för att bekräfta att skärningspunkten mellan sutura sagittalis och sutura coronalis eller sutura lambdoidea är i en horisontell linje på samma nivå. För att undvika en positioneringsspalt, justerar du näsknyt- och öronstängerna vid behov.
Sedan använda serafin klämmor till hålla huden öppen desinficera den exponerade ytan av skallen för att möjliggöra kraniala suturer som ska visualiseras tydligare. För att injicera den adeno-associerade virusvektorn, ladda en etanolsteriliserad 10 milliliterspruta med två mikroliter mineralolja, följt av den experimentella virusvolymen som ska injiceras. Använd mikroinjektionspumpen för att justera spetsen på mikroinjektionsnålen på bregma och notera koordinaterna som ursprungspunkt.
Flytta sedan spetsen till det angivna injektionsstället och placera nålspetsen på positionen. Markera skallen vid injektionsstället och använd en tandborr som är utrustad med en 0,7 millimeters hårdmetallskärare för att borra ett hål i skallen med ungefär två millimeters diameter. Efter att ha tagit bort blod från runt hålet med en bomullspinne, flytta långsamt nålen till sängkärnan i stria terminalis eller BSNT och injicera långsamt den utsedda volymen av viruslösning.
Låt sedan nålen vara på plats i fem minuter så att lösningen kan infiltrera BNST-vävnaden tillräckligt innan nålen dras tillbaka försiktigt. För elektroencefalogram, eller EEG, och elektromyogram, eller EMG, elektrodimplantation, löd först två rostfria ståltrådar från vilka en millimeter isolering har tagits bort från båda ändar till EMG-elektroderna och placera elektrodernas mitt på bregma. Markera sedan positionen för varje EEG-elektrod.
För att bestämma positionen för det optiska fiberimplantatet, fäst en optisk fiber ferrule till manipulatorn och rotera manipulatorarmen till ett plus eller minus 30 graders vinkel mot en horisontell linje. Sätt fiberspetsen på bregma och spela in koordinaterna. Flytta spetsen till den riktade insättningslinjen och markera positionen på skallen och placeringen för ankarskruven bredvid införingsstället.
Använd tandborren för att borra skallen på varje plats och använd manipulatorn för att försiktigt sätta in fibern för optik tills den når över BNST. Ferrule bör vila på resterande kranium. Säkra fibern till skallen med en ankarskruv, var noga med att inte bryta dura eller skada någon vävnad.
Täck sedan fibern och skruva med foto-härdbara tandcement. Därefter borra hål för EEG/ EMG-elektroder och sätt in spetsen på den första elektroden i ett hål. Hålla implantatet med en hand, applicera cyanoakrylatlim på utrymmet mellan skallen och elektroden och sätt in elektroden resten av vägen, var noga med att inte skada någon vävnad.
När alla elektroder har placerats, täck omkretsen av elektroderna och de optiska fibrerna med ytterligare cyanoakrylat lim och cyanoakrylat accelerant för att undvika att orsaka avbrott vid ferrule till optisk kabel och elektrod till bly tråd anslutningszoner. Nu utsätter nackmusklerna, och sätt in trådarna för EMG elektroden under muskeln. Justera längden på EMG-elektroden så att den passar precis under nuchalmusklerna och fyll implantaten med mer cyanoakrylatlim och accelerant.
Placera sedan musen på en värmedyna med övervakning tills full recompensy. För EEG/ EMG övervakning under foto-excitation av riktade nervceller, först använda en skalär för att justera laserintensiteten och använda en ferrule att tjudra spetsen på laserkabeln till en oanvänd fiber. Bekräfta att det inte finns plats vid korsningen mellan fibern och kabeln.
Efter 20 minuter, avger den uppvärmda lasern till intensiteten checker och justera intensiteten till 10 milliwatt per millimeter i kvadrat. Ställ in ljuspulsens varaktighet till 10 millisekunder, viloperioden till 40 millisekunder, cykeln till 20 och upprepningen till 20. Ändra laserläget till transistorlogik och bekräfta att ljuspulser avges från fibern som styrs av mönsterregulatorn.
Anslut den implanterade elektroden och kabeladaptern, täck sedan korsningen med ljust ogenomträngligt material för att förhindra laserläckage. Och när lasern är klar, flytta mössen till den experimentella kammaren för EEG / EMG-inspelning. För att bedöma latensen till vakenhet från icke snabba ögonrörelser eller snabb ögonrörelsesömn, begränsa inspelningstiden och optimerad plats vinna tid och låt mössen röra sig fritt i den experimentella kammaren i minst en timme.
Under försöksperioden övervakar du EEG- och EMG-signalerna i samma inspelningsskärm. Utvärdera musens tillstånd som vakenhet, icke snabba ögonrörelser sömn, eller snabba ögonrörelser sömn med hjälp av vinna kontroll för varje våg för att underlätta för att skilja varje stat. För mätning av den icke snabba ögonrörelsen sova till vakenhet latens, observera stabil icke snabba ögonrörelser sova i 40 sekunder, sedan slå på mönstergeneratorn för foto stimulering och bekräfta laser utsläpp till de implanterade optiska fibrer.
Spela sedan in EEG/EMG-signalerna tills sömntillståndet ändras till vakenhet. Här representerade EEG/EMG spår före och efter foto stimulering under icke snabba ögonrörelser sömn visas. En hög spänning och långsam frekvens EEG med inga EMG signaler, representerar icke snabba ögonrörelser sömn.
Foto stimulering utlöste en akut övergång till vakenhet ungefär två sekunder efter stimulering i channelrhodopsin-2 uttrycker möss medan kontroll möss inte visa denna övergång, vilket tyder på att excitation av BNST GABA nervceller under icke snabba ögonrörelser sömn utlöser en snabb induktion av vakenhet. Omvänt, foto stimulering under snabba ögonrörelser sömn hade ingen effekt så en övergång effekt endast framkommit i icke snabba ögonrörelser sömn. Det är viktigt att ta hand om exakta koordinationer för virusinjektionen och optikfiberimplantationsstegen.
EEG/EMG-spåren som fångas in under sömnanalysen kan användas för att bedöma fotomanipulationens konsekvenser på de olika vaksamma tillstånden hos möss. Denna teknik kommer också att hjälpa oss att identifiera andra komponenter och kretsar som deltar i regleringen av sömn vakenhet stater. Använd skyddsglasögon för att undvika laserskador i ögat och se till att alltid autoklavera sterilisera den adeno-associerade virusvektorbehållaren efter användning.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
