Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Automatic Translation
Cite This Article
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Absorberende Microbiopsy prøvetagning og RNA udvinding for minimalt invasiv, samtidige blod og hud analyse

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/58614
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 4, 5, 2, 1, 1,2, 2, 1,2
1Future Industries Institute, University of South Australia, 2Faculty of Medicine, University of Queensland, 3Faculty of Health, Queensland University of Technology, 4Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Princess Alexandra Hospital, 5Australian Craniofacial Unit, Women's and Children's Hospital

Summary

I denne artikel vil vise vi hvordan absorberende microbiopsy teknik er udført og hvordan prøven kan bruges til RNA udtræk til enkel og samtidig sampling af huden og blod i en minimalt invasiv måde.

Abstract

Konventionelle hudbiopsi begrænser den kliniske forskning, der involverer kosmetisk følsomme områder eller pediatric ansøgninger på grund af dens invasionsevne. Her beskriver vi protokol for at bruge en absorberende microneedle-baseret enhed, absorberende microbiopsy, minimalt invasive stikprøver af huden og blod blanding. Vores mål er at bidrage til at lette hurtige fremskridt i klinisk forskning, oprettelsen af biomarkører for hudsygdom og mindske risikoen for klinisk forskning deltagere. I modsætning til konventionelle hud biopsi teknikker, den absorberende microbiopsy kan udføres inden for sekunder og kræver ikke intensiv træning på grund af dens enkle design. I denne rapport beskriver vi brug af absorberende microbiopsy, herunder lastning og program på frivillig. Derefter viser vi hvordan du isolere RNA fra den optagne prøve. Endelig vil demonstrere vi brugen af kvantitative reverse transkription PCR (RT-qPCR) at kvantificere mRNA udtryk niveauer af både blod (CD3E og CD19) og hud (KRT14 og TYR). De metoder, der beskriver vi udnytte off hylden kits og reagenser. Denne protokol tilbyder en minimalt invasiv tilgang til samtidige prøveudtagning af huden og blod inden for den samme absorberende microbiopsy matrix. Vi har fundet menneskelige etiske komitéer, klinikere og frivillige til at være støttende for denne tilgang til dermatologiske forskning.

Introduction

Hudbiopsi er en af de mest væsentlige teknikker i dermatologi for hud prøveudtagning og efterfølgende diagnosticering af hudsygdomme gennem histopatologisk vurdering. Biopsi teknikken indebærer en læge ved hjælp af et blad eller punch biopsi hen til ophæve den mistænksom læsion på patientens hud for undersøgelse1. Selv om teknikken er effektiv, det er meget invasiv og begrænser kliniske forskning som slutpunktet indebærer sædvanligvis molekylærbiologiske teknikker2,3. Molekylær analyse af hudsygdomme har potentialet til at levere meget specifikke biologiske oplysninger at histopatologiske analyse kan således lette drug discovery og sygdom diagnose4,5. Desuden kan prøve efterspørgsel i mest molekylærbiologiske teknikker er forholdsvis små og føre til en reduktion af brug af dyr og tillader et større antal flergangsbestemmelser. Der er derfor et klart behov for en alternativ teknik, der gør det muligt for Molekylær analyse i klinisk forskning og sænker risikoen for deltagerne.

For at løse sådanne behov i feltet, har vores gruppe udviklet en roman microneedle-baserede diagnostiske platform, absorberende microbiopsy, der giver mulighed for samling af en lille mængde af huden blandet med blod i en enkel og minimalt invasiv måde6. Formålet med denne publikation er at beskrive den absorberende microbiopsy som en prøveudtagning redskab til at lette Molekylær analyse gennem RNA udvinding i klinisk forskning.

Vi har tidligere beskrevet den første version af microbiopsy, hud microbiopsy, som består af en microneedle, lavet af en tre-lags stålplade design at udvinde små stykker af huden væv7. Nyhed i denne enhed kommer fra flere kontaktpunkter fra den microneedle, som tillader effektiv væv udvinding3. Derimod en cirkulær hud punch biopsi giver kun ét kontaktpunkt og simpelthen tårer huden uden at indfange enhver proeve i nogle tilfælde. Baseret på hud microbiopsy, udviklet vi for nylig den absorberende microbiopsy, som har både blod og hud prøveudtagning kapaciteter. Enheden har vist sig at være muligt til brug i ressource-fattige områder i en nyere epidemiologisk undersøgelse6.

På grund af dens enkle design, den absorberende microbiopsy kan udføres inden for et par sekunder og kræver ikke omfattende uddannelse. Derudover lokalbedøvelse er ikke nødvendig, og påføringsstedet forårsage ikke ardannelse. Denne protokol giver mulighed for forskere eller læger uden relevante prøveudtagning uddannelse at få målrettet huden data for Molekylær analyse. Vi forventer microsampling enheder til at blive rutine i huden forskning i fremtiden.

Selv om microbiopsy er blevet rapporteret i andre hud sygdom undersøgelser, der involverede molekylære diagnostiske teknikker6,8,9,10, såsom humant papillomavirus DNA påvisning, denne protokol er først til at vise detaljerne i stikprøven udvinding og forarbejdning af teknikker til den absorberende microbiopsy. Yderligere, dette er den første rapport, der beskriver den relative gen udtryk profilering af huden og blod celler i microbiopsy prøver.

Protocol

Undersøgelsen blev godkendt af Metro syd menneskelige videnskabsetisk Komité og den University of Queensland menneskelige videnskabsetisk Komité (HREC-13-QPAH-551 og UQ2013001551) og den Universitet i Syd Australien menneskelige etiske komité (200607).

1. absorberende Microbiopsy fabrikation

  1. Laser cut microneedle dele fra 50 µm medicinsk-grade rustfrit stål ark og absorberende lag (filtrerpapir), henholdsvis (figur 1).
    Bemærk: Andre dele, herunder stemplet og sagen, om enheden er fremstillet med rapid prototyping teknikker, såsom 3D udskrivning.
  2. Nyd alle delene, bortset fra det sugende lag i 70% ethanol (EtOH) i 5 min og luft tørre dem i 30 min. bagefter.
  3. Samle tre-lags microneedle, med den absorberende lag i midten (figur 1a).
  4. Indsæt den forsamlede microneedle ind i slidsen af stemplet.
  5. Sætte på foråret og indsætte stemplet ind i sagen (figur 1 c). Undgå microneedle at røre noget i proceduren montering at sikre nål kvalitet.
  6. Forsegle de forsamlede absorberende microbiopsy i en pakke til γ-stråling sterilisering før brug.

2. prøveudtagning med den absorberende Microbiopsy

  1. Bære engangshandsker, og spray hænder og værktøjer som pincet, med 70% EtOH.
  2. Desinficere påføringsstedet med en alkohol-serviet.
  3. Fjerne microbiopsy fra γ-stråling steriliseret pakke uden at røre ved microneedle i processen.
  4. Indlæse enheden ved at trække stemplet for at komprimere foråret indtil der er et 'Klik' lyd og stemplet låse på plads.
  5. Målet enheden ved hud udtages, sikrer, at prøveudtagning område er i en fast position.
  6. Sikre, at enheden er omtrent vinkelret på huden og derefter anvende ≥ 1 kg af kraft til enheden på huden.
    Bemærk: Aktiveringskraft nedad ind i huden er kræves at der sker tilstrækkelig gennemtrængning af microneedle.
  7. Tryk på aftrækkeren og hold enheden på plads for et minimum af 10 s for blodprøve til at blive absorberet.
    Bemærk: Hvis enheden er udgivet før 10 s, der er mindre stikprøve erobret.

3. RNA udvinding

Bemærk: RNA ekstraktion procedurer blev ændret fra fabrikanter protokol for optimal isolering af RNA fra microbiopsied prøve. Alle reagenser og kolonne, som bruges i RNA udvinding er inkluderet i sættet, medmindre andet er angivet.

  1. Træk stemplet og absorberende microneedle fra tilfældet af hænder forsigtigt. Sikre, at spidsen af microneedle ikke kommer i kontakt med noget under fjernelse.
  2. Fjerne de absorberende microneedle fra stemplet. Holde fast i de to huller på microneedle med en steril pincet og trække det.
  3. Sætte den intakte microneedle i et 2 mL microcentrifuge tube (ikke fra RNA isolering kit; Se Tabel af materialer) udfyldes på forhånd med 50 µL af ekstraktionsbuffer, med nål side vender mod bunden. For at minimere prøve tab, forlade røret på tøris i 5 min. før prøven.
  4. Vortex kortvarigt (3-5 s) til at fjerne nogle af de indsamlede materialer fra spidsen.
  5. Inkubér microneedle i rør på en rocker for 30 min på 42 ° C.
    Bemærk: Bufferopløsning vil blive absorberet i det sugende lag umiddelbart.
  6. Placer den øverste del af microneedle (den modsatte side fra nålen) niveau med den øverste kant af 2 mL mikrofuge røret ved hjælp af steril pincet.
  7. Luk låget af røret, så toppen af microneedle holdes på plads mellem den fælles landbrugspolitik og rør.
  8. Spin røret på 16.000 x g eller ved maksimal hastighed for 30 s til at fjerne de indsamlede materialer fra den absorberende lag af enheden.
  9. Fjerne microneedle omhyggeligt med pincet uden dypper tilbage i stødpudeopløsning. Holde røret og kassér microneedle.
  10. Der centrifugeres prøver på 3.000 x g i 2 min. Pipette supernatanten indeholdende den udpakkede RNA omhyggeligt ind i en ny microcentrifuge rør.
  11. Tilsæt 250 µL af Conditioning Buffer på rensning kolonne filter membran og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
  12. Der centrifugeres kolonne i collection tube på 16.000 x g eller ved maksimal hastighed i 1 minut.
  13. Tilsæt 50 µL af 70% EtOH i indsamlede prøven fra trin 3.9. Bland godt ved forsigtigt pipettering op og ned.
  14. Overfør blandingen (~ 100 µL) i kolonnen forprogrammerede rensning.
  15. Der centrifugeres i 2 min på 100 x g straks, efterfulgt af centrifugering ved 16.000 x g for 30 s til at fjerne gennemstrømnings-.
  16. Tilføj 100 µL af Wash Buffer 1 (W1) ind i rensning kolonnen og centrifugeres i 1 min på 8.000 x g.
  17. Forbered DNase løsning ved at tilføje 5 µL af DNase jeg bestand løsning til 35 µL af Buffer RDD i en separat microcentrifuge rør for hver prøve. Mix af forsigtigt invertere.
    Bemærk: DNase behandling er der skal udføres på kolonnen rensning i stedet for i PCR-plade bagefter, på grund af mængden af prøven.
  18. Tilføje 40 µL af DNase inkubation mix direkte i rensning kolonne membran. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
  19. Tilføje 40 µL af W1 i rensning kolonne membran. Der centrifugeres ved 8.000 x g i 15 s.
  20. Der afpipetteres 100 µL af Wash Buffer 2 (W2) i kolonnen rensning efter DNase behandling og centrifugeres i 1 min på 8.000 x g.
  21. Tilføje en anden 100 µL af W2 til rensning kolonnen og centrifugeres i 2 min på 16.000 x g. markere kolonnen rensning for enhver resterende wash buffer. Re centrifugeres ved 16.000 x g i 1 minut hvis nogen vaskebuffer forbliver.
  22. Overfør kolonnen rensning til et nyt 0,5 mL microcentrifuge rør findes i kit.
  23. Der afpipetteres 11 µL af RNase-fri vand (ikke findes i RNA isolering kit), i stedet for eluering Buffer (EB), direkte på membranen af kolonnen rensning. Blidt røre spidsen af pipetten til overfladen af membranen mens udlevering af RNase-fri vand for at sikre maksimal absorption af RNase-fri vand ind i membranen. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min.
  24. Der centrifugeres kolonnen for 1 min på 1.000 x g at distribuere RNase-fri vandet i kolonnen og derefter centrifugeres i 16.000 x g 1 min. at eluere RNA.
    Bemærk: RNA kvantificering er ikke anbefales på grund af den lille mængde af prøven.
  25. Stop punkt #1: gemme den samlede RNA prøve ved-80 ° C, hvis cDNA syntese ikke udføres umiddelbart.
    Bemærk: Undgå frysning ikke eventuelt givet den lave koncentration af RNA prøve.

4. cDNA syntese

  1. Optø frosne prøven på is (fra trin 3.25).
  2. Syntetisere cDNA fra total RNA med cDNA syntese kit efter nedenstående fremgangsmåde.
  3. Forberede mastermix: 11 µL af total RNA, 4 µL af 5 x TransAmp Buffer, 1 µL af reverse transkriptase, 4 µL DNase/RNase-fri vand. Bland forsigtigt af pipettering.
  4. Køre reverse transkription på en apparater, der termisk cycler: 25 ° C i 10 min, 42 ° C i 15 min, efterfulgt af en sidste reverse transkriptase inaktivering skridt på 85 ° C i 5 min.
  5. Stop punkt #2: gemme den omvendte transskriberede prøve ved-80 ° C indtil brug.

5. qPCR reaktion og dataanalyse

Bemærk: Primere for qPCR reaktioner var designet til at spænde intron grænser for at undgå forstærkningen af genomisk DNA ved hjælp af NCBI Primer BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Reference gen anvendes i denne undersøgelse er RPLP0 (Se afsnittet diskussion for flere oplysninger).

  1. Optø frosne prøven på is (fra trin 4.5).
  2. Udføre qPCR med qPCR master mix kit efter nedenstående fremgangsmåde.
  3. Forberede master mix indeholdende followings pr. reaktion: 5 µL af 2 x qPCR mastermix, 0,4 µL af 10 µM fremad primer, 0,4 µL af 10 µM omvendt primer, 2,2 µL DNase-frit vand. Bland forsigtigt af pipettering. Opsætning af prøverne i tre.
  4. Der afpipetteres 8 µL af den master mix i hver brønd med en 384-godt PCR plade første og derefter 2 µL cDNA fra hver prøve (ialt 10 µL pr. brønd).
    Bemærk: Ingen template control (NTC) og ingen reverse transkriptase kontrol (-RT) er inkluderet som negative kontroller.
  5. Forsegle pladen med selvklæbende film, og centrifugeres kort.
  6. Køre forstærkning reaktion på en real-time termisk cycler: 95 ° C i 2 min. (polymerase aktivering), efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ° C til 5 s (denaturering), 60 ° C i 10 s (glødning) og 72 ° C i 10 s (forlængelse).
  7. Beregne RNA-koncentrationen af prøver ved interpolering fra en standardkurve, der er forberedt fra skabeloner med kendte koncentrationer.
    1. Oprette et Nyt eksperiment i softwaren.
    2. Klik på Definer og sat op standarder at etablere seriel fortynding for plader.
    3. Vælge og arrangere brøndene standarder og prøver. Klik på Anvend.
    4. Klik på analyser i fanen resultat at vurdere standardkurven. Bekræfte skråning, Rasmussen2 værdi, forstærkning effektivitet og fejl opfylder de eksperimentelle kriterier.
    5. Kontrollere mængderne af de ukendte prøver visuelt på standardkurven baseret på deres Ct-værdier.
      Bemærk: Opførelse af standardkurven, herunder valg af fortyndingsfaktoren, er udført efter publicerede protokoller11,12,13.
  8. Udføre gen expression analyse af mRNA ved hjælp af metoden ΔCt (Ct er normaliseret til et refence gen).
    1. Subtrahere Ct værdi af målet gen fra Ct værdi af henvisning for at opnå ΔCt værdien.
    2. Middelværdier ΔCt af tekniske replikater.
    3. Plot og analysere genekspression med statistik software11,14 (Se Tabel af materialer).
      Bemærk: Alternativt gen expression analyse udføres ifølge publicerede protokoller13.

Representative Results

Vi har tidligere rapporteret, at microneedle af huden microbiopsy trænger hud ca 500 µm dyb7. Microneedle design af huden microbiopsy er meget lig, på absorberende microbiopsy (figur 2a). Mens den absorberende microbiopsy bestod af en absorberende lag i midten for blod absorption, indeholdt hud microbiopsy en kanal for mekaniske erobring af huden væv. Brug af absorberende lag også ført til en lille forskel i dimensionen microneedle (absorberende: 1,50 x 0,50 x 0.21 mm vs hud: 1,50 x 0,50 x 0,15 mm).

Figur 2b viser anvendelsen websteder 5 min efter absorberende og hud microbiopsies blev anvendt på den venstre Volare arm af mandlige frivillige. På grund af ligheden mellem de to microneedle design var ansøgning websteder fra begge enheder sammenlignelige, med mindre erythema. Begge ansøgning websteder var ikke mærkbar efter 48 h med ingen ar venstre bag. Dette understøtter hypotesen om at denne minimalt invasive enhed har potentiale til at hjælpe skærmen flere ansøgning websteder eller udføres på en regelmæssig basis.

Figur 2 c viser et repræsentativt billede af den absorberende lag af den absorberende microbiopsy efter anvendes på volar arm af en mandlig frivillige. Som vist i figur, et par små stykker af huden blev fanget nær spidsen af microneedle, og nogle blod blev absorberet i filtrerpapir. Dette indikerer, at enheden er trængt ind i huden og fangede både hud og blod samtidig inden for den samme absorberende microbiopsy matrix. Figur 2d viser en efter prøveudtagning hud microbiopsy, den forrige generation af microbiopsy, til sammenligning. Kanal af huden microbiopsy erobrede et lille stykke af huden, men mængden af blod på microneedle var lille i forhold til den absorberende microbiopsy. Begge ansøgning websteder var ikke mærkbar inden for 48 timer. I eksperimentet, den absorberende microbiopsy blev anvendt en 10-s tidsrum efter ansøgning, mens huden microbiopsy blev straks løsladt efter påføring på grund af forskellen i design.

Som vist i figur 3a, to grupper af absorberende microbiopsy var involveret i dette eksperiment baseret på programprotokol: 'Pressemeddelelse' og ' 10-s bedrift '. For gruppen 'Pressemeddelelse' blev enheden anvendt ved hjælp af den samme oprindelige hud microbiopsy protokol, med enheden bliver fjernet fra påføringsstedet umiddelbart efter ansøgning. For ' 10-s bedrift ' gruppe, enheden blev holdt på plads efter ansøgning om 10 s for at forbedre indsamlingen af prøven. De to grupper af absorberende microbiopsy blev sat op til at demonstrere, hvordan ansøgning tilgang kunne påvirke beløbet, prøve. 10-s bedrift tid blev valgt som klinisk rimelig tid at vise, at ansøgningen tid påvirker mængden af inddrivelige prøve.

Mængden af RNA inddrives fra de to absorberende microbiopsy grupper var 0,33 ± 0,39 ng 'Pressemeddelelse' og 1,43 ± 0,88 ng for ' 10-s bedrift ' (figur 3a, n = 20), hvilket tyder på en 4-fold stigning med ekstra bedrift tid. Dette indikerer, at anvende den absorberende enhed med 10-s bedrift gang resulterede i flere RNA ekstraheret. Forskellen kan være på grund af tilstedeværelsen af øgede blodprøve i det sugende lag (figur 3 c). Ja, gruppen 'Pressemeddelelse' (figur 3b) har undladt at opkræve en lignende mængde blod med den absorberende lag i forhold til ' 10-s bedriften ' gruppe (figur 3 c). Det skal også bemærkes, at de fleste straks frigivet microbiopsies var tæt på x-aksen, tyder de var negative begivenheder eller vises et meget lavt antal RNA. Derfor valideres resultatet den hypotese, at bedriften tid ville have indflydelse på udførelsen af enheden, da det kan tage tid for blodet at blive absorberet af den absorberende lag.

Da enheden blev designet for blod og hud prøveudtagning, blev qPCR brugt til at registrere udtryk for hud og blod biomarkører for begge enheder til sammenligning. Vi brugte tyrosinase, TYR, som en biomarkør for melanocytter og KRT14 som en biomarkør for keratinocytter i levedygtige epidermis. Hud microbiopsy prøver blev inkluderet i forsøget for sammenligning. Som vist i figur 4, selv om huden og absorberende microbiopsies blev anvendt forskelligt på grund af forskellen i design, udtrykket niveauer for både hud biomarkører TYR og KRT14 var sammenlignelige for begge enheder, som angivet af den data. Hvide blodlegemer biomarkører (CD3E, T-celler og CD19, B-celler) fandtes for at være mere fremherskende i absorberende microbiopsy prøver end i huden microbiopsy prøver. Dette resultat tyder på, at den absorberende microbiopsy klarede sig bedre i blod samling men stadig fastholdt kapacitet til at indfange hud i forhold til huden microbiopsy (n = 5).

Figure 1
Figur 1. Fabrikation af absorberende microbiopsy. en a tre-lags microneedle. (b) alle dele af enheden. c de forsamlede absorberende microbiopsy. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Den absorberende microbiopsy var i stand til at fange hud-og blodprøver samtidig uden at efterlade et ar på venstre Volare arm af mandlige frivillige. (a) en sammenligning mellem microneedles af absorberende og hud microbiopsies. b anvendelse websteder venstre af absorberende og hud microbiopsies 5 min efter programmet. (c, d) Microneedles af absorberende og hud microbiopsies efter ansøgning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Den absorberende microbiopsy fanget mere blod og RNA prøve når anvendes til 10-s. a 10-s efter ansøgning bedrift gang resulterede i en større mængde af RNA end frigive enheden straks (n = 20). Fejllinjer udgør S.D. fra middelværdien (***p< 0,0001). (b, c) Repræsentative billeder af den absorberende microbiopsies efter ansøgning med 'Pressemeddelelse' og ' 10-s bedrift ' tilgange. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Sammenligning af mRNA udtryk niveauer mellem hud og absorberende microbiopsies (n = 5). Gen-ekspression havde været normaliseret med reference gen RPLP0. Fejllinjer udgør S.D. fra middelværdien (*p< 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Disse resultater viser, at den absorberende microbiopsy kan bruges som et værktøj til enkel og minimalt invasiv prøveudtagning af huden og blod blanding til molekylær karakterisering. Enheden ansøgning i overensstemmelse med vores protokol er afgørende for at opnå pålidelige resultater, som det fremgår af forskellen i RNA beløb tilbagebetalt med forskellige applikationsprotokoller (figur 3). Når prøven ekstraheres, er den efterfølgende prøve behandling trin for RNA udvinding meget lig etablerede protokoller15,16. Ud fra de første trin i RNA udvinding, der er ændret for den absorberende microbiopsy, er en anden vigtig ændring brugen af RNase-fri vand til at forbedre resultaterne for efterfølgende ansøgninger. Derudover er det værd at nævne, at den reference gen anvendes i denne undersøgelse er RPLP0. RPLP0, hvis funktion er kendt for forskellige celle og væv typer17, er blevet rapporteret som et passende gen til brug i ikke-melanom hudkræft og forstadier læsioner18.

En af de vigtigste begrænsninger for enheden er fjernelse af microbiopsy fra den enhed, som er tidskrævende og potentielt øger chancen for at prøve tab, især for følsomme prøver som RNA. Problemet kan dog overvindes ved Pre-køling alle sterile billedbehandling værktøjer såsom 2 mL microcentrifuge rør, på tøris.

Brugen af den absorberende microbiopsy er enkle og kræver ikke intensiv træning. Konventionelle biopsi er ikke nødvendigt, da microbiopsy tillader Molekylær karakterisering med etablerede molekylære diagnose teknikker, såsom RT-qPCR. For yderligere at kvantificere og demonstrere prøveudtagning evnen af absorberende microbiopsy, blev tidligere litteratur, der involverede RNA udvinding fra menneskelige hudvæv undersøgt. Fra en typisk 3.0 eller 4.0 mm hud punch biopsi, tre undersøgelser har rapporteret ekstraheret RNA beløbene varierede fra 50 til 200 ng per mg af hud væv19,20,21. Sammenligning med 1,43 ng af RNA, der blev gendannet fra den absorberende microbiopsy i gennemsnit (figur 3), vægten af stikprøven hudvævet forventes at vifte fra 0,29-115 µg baseret på de samme forhold som RNA til væv fra huden punch biopsi undersøgelser.

Denne protokol er ikke uden potentielle faldgruber, selvom nogle af problemerne kan løses nemt. For eksempel, foreslog RNA udvinding data en betydelig variation selv med 10-s bedrift tid (figur 3). For at løse problemet, indebærer en potentiel løsning optimering program-protokollen. Parametre såsom kraft påføres huden og holde tid skal testet og optimeret til at reducere variationer i stikprøven udvinding. Andre potentielle spørgsmålet er fjernelse af microbiopsy fra den enhed, som kan påvirke prøve integritet og nyttiggørelse. Selv om at fjerne microbiopsy for RNA udvinding er en effektiv metode, hele proceduren er kedelig, og prøven kan blive udsat for forurening i processen. Ændring af prøve behandling protokol ønskes derfor stærkt for at sikre prøve integritet og forhindre tab af prøven.

Når de ovennævnte to spørgsmål behandles, forventes det, at enheden bliver et standard redskab for klinisk forskning. Det er vigtigt at bemærke, at enheden optager både hud og blodprøve samtidigt og dette bør tages i betragtning, når du analyserer genekspression data. Afslutningsvis, beskriver denne protokol detaljerne i udfører absorberende microbiopsy som en nem og minimalt invasive værktøj til kombineret hud og udtagning af blodprøve og den efterfølgende prøve behandling for relativ gen expression profilering.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende NHMRC stipendier APP1109749 og APP1111216, University of Queensland Centennial legat og internationale Postgraduate Research Scholarship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling
Absorbent Microbiopsy Trajan Scientific and Medical N/A https://www.trajanscimed.com/
Whatman filter paper, Grade 1 Sigma Aldrich WHA1001325 N/A
RNA extraction
PicoPure RNA Isolation Kit ThermoFisher KIT0214 Including all buffer soltuions described in protocol
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher 10977015 Improving RNA quality in RNA elution step
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile Thomas Scientific 1226S74 N/A
Microcentrifuge 5415R Eppendorf Z605212 N/A
cDNA synthesis
SensiFAST cDNA Synthesis Kit Bioline BIO-65053 N/A
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855196 N/A
qPCR reaction and data analysis
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit Bioline BIO-94005 Including reagents described in qPCR reaction steps
MicroAmp Optical Adhesive Film ThermoFisher Scinentific 4311971 N/A
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate ThermoFisher Scinentific 4343370 N/A
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher Scinentific 4485694 N/A
GraphPad Prism (v6.04) GraphPad N/A; Windows version Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps
PCR primers
RPLP0 F Sigma Aldrich N/A ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC
RPLP0 R Sigma Aldrich N/A CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG
TYR F Sigma Aldrich N/A TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA
TYR R Sigma Aldrich N/A AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC
KRT14 F Sigma Aldrich N/A CCT CCT CCC AGT TCT CCT
KRT14 R Sigma Aldrich N/A ACA CCA CCT TGC CAT CG
CD3E F Sigma Aldrich N/A CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG
CD3E R Sigma Aldrich N/A GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG
CD19 F Sigma Aldrich N/A TTC TGC CTG TGT TCC CTT G
CD19 R Sigma Aldrich N/A GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
  2. Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
  3. Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
  4. Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
  5. Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
  6. Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
  7. Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
  8. Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
  9. Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334 (2017).
  10. Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107 (2013).
  11. GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
  12. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).
  13. Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
  14. GraphPad Statistics Guide. , (1995).
  15. Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
  16. Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
  17. Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
  18. Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631 (2017).
  19. Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
  20. Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438 (2011).
  21. Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).
Absorberende Microbiopsy prøvetagning og RNA udvinding for minimalt invasiv, samtidige blod og hud analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lei, B. U. W., Yamada, M., Hoang, V. L. T., Belt, P. J., Moore, M. H., Lin, L. L., Flewell-Smith, R., Dang, N., Tomihara, S., Prow, T. W. Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis. J. Vis. Exp. (144), e58614, doi:10.3791/58614 (2019).… More

Lei, B. U. W., Yamada, M., Hoang, V. L. T., Belt, P. J., Moore, M. H., Lin, L. L., Flewell-Smith, R., Dang, N., Tomihara, S., Prow, T. W. Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis. J. Vis. Exp. (144), e58614, doi:10.3791/58614 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter