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Biochemistry

एक चूहा मिथाइल-Seq मंच तनाव जोखिम से जुड़े Epigenetic परिवर्तन की पहचान करने के लिए

Published: October 24, 2018 doi: 10.3791/58617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,3, 1,2, 1
1Departments of Psychiatry and Behavioral Sciences, Johns Hopkins School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins School of Medicine, 3Department of Mental Health, Johns Hopkins School of Public Health

Summary

यहां, हम मिथाइल-Seq, एक epigenomic मंच के प्रोटोकॉल और कार्यांवयन का वर्णन करते हैं, जो पुराने तनाव के जोखिम से जुड़े epigenetic परिवर्तनों को पहचानने के लिए एक चूहे के मॉडल का उपयोग करते हैं । परिणाम प्रदर्शित करता है कि चूहे मिथाइल-Seq मंच मिथाइल मतभेद है कि चूहों में तनाव जोखिम से उत्पंन का पता लगाने में सक्षम है ।

Abstract

जानवरों की एक व्यापक विविधता के जीनोम के रूप में उपलब्ध हो जाते हैं, इन जानवरों के मॉडल में गतिशील epigenetic परिवर्तन पर कब्जा कर सकते हैं कि उपकरणों के लिए एक बढ़ती हुई जरूरत है. चूहा एक विशेष मॉडल जानवर है जहां एक epigenetic उपकरण कई औषधीय और व्यवहार अध्ययन के लिए व्यावहारिक यंत्रवत जानकारी प्रदान पूरक कर सकते हैं । इस छोर तक, हमने चूहे के लिए SureSelect टारगेट कैप्चर सिस्टम (मिथाइल-Seq के रूप में भेजा) अनुकूलित किया है, जो चूहे के जीनोम में डीएनए मिथाइल स्तर का आकलन कर सकता है । चूहा डिजाइन प्रमोटरों, CpG द्वीपों, द्वीप किनारे, और सभी RefSeq जीन से जीसी-अमीर क्षेत्रों को लक्षित ।

एक चूहे प्रयोग पर मंच को लागू करने के लिए, पुरुष Sprague Dawley चूहों 3 सप्ताह के लिए जीर्ण चर तनाव के संपर्क में थे, जिसके बाद रक्त के नमूने जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए एकत्र किए गए । मिथाइल-Seq पुस्तकालयों का निर्माण चूहे के डीएनए नमूनों से बाल काटना, अनुकूलक बंधाव, लक्ष्य संवर्धन, bisulfite रूपांतरण, और division द्वारा किया गया था । पुस्तकालयों एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच पर अनुक्रम थे और अनुक्रम पढ़ता बल दिया और तनाव में चूहों के डीएनए के बीच DMRs की पहचान करने के लिए विश्लेषण किया गया. मंच की मजबूती की पुष्टि के लिए bisulfite pyrosequencing द्वारा शीर्ष उम्मीदवार DMRs को स्वतंत्र रूप से मान्य किया गया ।

परिणाम प्रदर्शित करता है कि चूहे मिथाइल-Seq मंच एक उपयोगी epigenetic उपकरण है कि मिथाइल तनाव को जोखिम से प्रेरित परिवर्तन पर कब्जा कर सकते हैं ।

Introduction

उच्च प्रवाह अनुक्रमण में अग्रिम दोनों मॉडल और गैर मॉडल जीवों के लिए जीनोमिक दृश्यों का खजाना करने के लिए नेतृत्व किया है । ऐसे जुगाड़ की उपलब्धता ने आनुवंशिकी, तुलनात्मक जीनोमिक्स, और transcriptomics में अनुसंधान को सुगम बनाया है । उदाहरण के लिए, उपलब्ध जीनोमिक अनुक्रम हिस्टोन संशोधनों1, या bisulfite अनुक्रमण है, जो डीएनए मिथाइल द्वारा उपाय के साथ अपने सहयोग के आधार पर डीएनए को समृद्ध कि चिप Seq प्रयोगों से अनुक्रमण डेटा संरेखित करने के लिए अत्यधिक उपयोगी हैं unmethylated cytosines2के bisulfite रूपांतरण से गठित uracil का पता लगाना. हालांकि, वहां epigenomic प्लेटफार्मों के कार्यांवयन में देरी है कि प्रजातियों की व्याख्या डेटा की कमी के कारण उनके डिजाइन में उपलब्ध जीनोमिक अनुक्रमण डेटा शामिल विशेष विनियामक अनुक्रम है कि जीन समारोह को प्रभावित कर सकते हैं ।

विशेष रूप से, डीएनए मिथाइल डीएनए पर सबसे व्यापक रूप से अध्ययन epigenetic संशोधनों में से एक है कि एक methylomic मंच के निर्माण के लिए उपलब्ध जीनोमिक डेटा का लाभ उठाने कर सकते है । ऐसा ही एक उदाहरण है मानव methylome3के लिए एक सरणी आधारित मंच है, जो व्यापक रूप से ऑन्कोलॉजी से विभिन्न विषयों में मनोरोग4,5के लिए प्रयोग किया गया है. दुर्भाग्य से, गैर मानव पशु मॉडल के लिए इसी तरह के प्लेटफार्मों दुर्लभ हैं, के रूप में वहां वस्तुतः कोई व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्लेटफार्मों कि उनके प्रारंभिक डिजाइन में जीनोमिक अनुक्रम का लाभ ले लिया है ।

गैर मानव पशु मॉडल के methylomic परिदृश्य का आकलन करने के लिए एक आम विधि कम प्रतिनिधित्व bisulfite अनुक्रमण (आरआरबी)6है । इस दृष्टिकोण पूरे जीनोम bisulfite अनुक्रमण है कि, जबकि एक व्यापक methylomic परिदृश्य उपलब्ध कराने की लागत पर काबू पा, कम पढ़ने के लिए गहराई के बड़े जीन में लागत और सीमित कार्यात्मक जानकारी के कारण कवरेज प्रदान करता है 2 जीनोम के गरीब क्षेत्रों . आरआरबी शामिल प्रतिबंध डाइजेस्ट और आकार जीनोमिक डीएनए के चयन के लिए अत्यधिक GC-अमीर दृश्यों के लिए समृद्ध ऐसे CpG द्वीपों कि सामांयतः जीन प्रवर्तकों के पास पाया जाता है और जीन विनियमन7में एक भूमिका निभाने के लिए सोचा । जबकि आरआरबी विधि महत्वपूर्ण अध्ययन की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है, प्रतिबंध एंजाइमों पर अपनी निर्भरता उल्लेखनीय चुनौतियों और सीमाओं के बिना नहीं है । उदाहरण के लिए, आरआरबी में जीसी-रिच दृश्यों के संवर्धन ट्रो द्वारा प्रतिबंध एंजाइम और अनुवर्ती आकार चयन द्वारा मांयता प्राप्त विशिष्ट दृश्यों की उपस्थिति पर पूरी तरह से निर्भर है । इसका अर्थ यह है कि इन प्रतिबंध साइट्स नहीं हैं जो किसी भी जीनोमिक क्षेत्रों आकार चयन के दौरान शामिल नहीं हैं । इसके अलावा, पार प्रजातियों की तुलना चुनौती दे रहे है जब तक कि एक ही प्रतिबंध साइटों को विभिंन प्रजातियों के बीच एक ही loci में मौजूद हैं ।

आरआरबी की सीमाओं पर काबू पाने के लिए एक दृष्टिकोण एक संवर्धन विधि है कि मंच के डिजाइन में प्रकाशित जीनोमिक अनुक्रम का लाभ लेता है का उपयोग करने के लिए है । सरणी आधारित मानव मंच प्राइमर जांच एलील के लिए विशिष्ट CpGs के खिलाफ डिजाइन विशिष्ट (bisulfite रूपांतरण के बाद तटरक्षक बनाम टीजी) लक्ष्य एनीलिंग और प्राइमर विस्तार का उपयोग करता है । इसकी डिजाइन न केवल उपलब्ध मानव जीनोमिक अनुक्रम को दर्शाता है, लेकिन प्रयोग-सत्यापित नियामक क्षेत्रों ऐसे सांकेतिक शब्दों में बदलना और8ENSEMBL के रूप में जांच की कई लाइनों से हासिल की । मानव methylomic जांच में अपने व्यापक उपयोग के बावजूद, एक समान मंच मॉडल जानवरों के लिए मौजूद नहीं है । इसके अलावा, सरणी-आधारित स्वरूप जांच प्लेसमेंट के लिए उपलब्ध सतह क्षेत्र पर महत्वपूर्ण प्रतिबंध रखता है । पिछले कई वर्षों में, लक्ष्य-विशेष कब्जा जांच डिजाइन और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण की उच्च प्रवाह सुविधा द्वारा afforded गठबंधन करने के लिए प्रयास किया गया है । इस तरह के एक प्रयास अनुक्रमण-आधारित लक्ष्य संवर्धन प्रणाली माउस जीनोम (माउस मिथाइल-Seq), जो मिथाइल9,10में मस्तिष्क विशिष्ट या glucocorticoid प्रेरित मतभेदों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के लिए हुई है । अन्य मॉडल और गैर मॉडल जानवरों के लिए इसी तरह के प्लेटफार्मों इन जानवरों में epigenomic अनुसंधान की सुविधा के लिए की जरूरत है ।

यहां, हम चूहे पर methylomic विश्लेषण का संचालन करने के लिए इस उपंयास मंच के कार्यांवयन का प्रदर्शन । चूहा औषध विज्ञान, चयापचय, neuroendocrinology, और व्यवहार में एक महत्वपूर्ण पशु मॉडल के रूप में सेवा की है । उदाहरण के लिए, वहां एक बढ़ाने के लिए अंतर्निहित तंत्र है कि दवा विषाक्तता, मोटापा, तनाव प्रतिक्रिया, या नशीली दवाओं की लत को जंम दे समझने की जरूरत है । एक उच्च प्रवाह इन स्थितियों के साथ जुड़े methylomic परिवर्तन पर कब्जा करने में सक्षम मंच तंत्र की हमारी समझ में वृद्धि होगी । के बाद से चूहा जीनोम अभी भी विनियामक क्षेत्रों के लिए एनोटेशन का अभाव है, हम गैर निरर्थक प्रमोटरों, CpG द्वीप, द्वीप किनारे11, और पहले से पहचान की गई GC-चूहे मिथाइल-Seq मंच12में अमीर दृश्यों को शामिल किया ।

SureSelect लक्ष्य संवर्धन के सफल डिजाइन और कार्यांवयन का आकलन करने के लिए (सामांय रूप से मिथाइल-Seq के रूप में संदर्भित) चूहा जीनोम के लिए मंच है, हम क्रोनिक चर तनाव (सीवी)13 के एक चूहे मॉडल कार्यरत को पहचान के लिए विभेदक methylated तनावग्रस्त और तनावग्रस्त पशुओं के बीच क्षेत्र । हमारे मंच डिजाइन, प्रोटोकॉल, और कार्यांवयन के जांचकर्ताओं जो एक जीव जिसका जीनोमिक अनुक्रम पहले से ही उपलब्ध है पर एक व्यापक और निष्पक्ष epigenetic जांच का संचालन करना चाहते हो सकता है के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन खराब व्याख्या बनी हुई है ।

Protocol

सभी प्रयोगों के अनुसार सभी प्रासंगिक विनियामक और संस्थागत दिशानिर्देश के साथ अनुपालन में पूरा किया गया, संस्थागत पशु देखभाल और चिकित्सा के जॉंस हॉपकिंस स्कूल में उपयोग समिति ।

1. पशु

  1. आयु के 4 सप्ताह में पुरुष किशोरों Sprague-Dawley चूहों प्राप्त करें । एक तापमान और आर्द्रता-नियंत्रित कमरे में एक 12 एच प्रकाश, 12 एच अंधेरे चक्र पर प्रकाश की शुरुआत के साथ ०६०० ज में पालीं में चूहा पिंजरों में जानवरों को घर । पानी के लिए विज्ञापन libitum पहुंच के साथ जानवरों को उपलब्ध कराएं ।
  2. चूहों 1 सप्ताह के लिए acclimate करने के लिए परिवहन के साथ जुड़े तनाव को कम करने की अनुमति दें । जोड़ी-घर जानवरों (N = 16) बाधा अलगाव तनाव के लिए, और उंर के 5 सप्ताह में, जीर्ण चर तनाव (सीवी) 3 सप्ताह के लिए आहार शुरू करते हैं ।

2. जीर्ण चर तनाव

  1. सीवी आहार प्रशासन सुबह (9-11 AM) में एक बार और दोपहर में एक बार (1-3 बजे) अनियमित समय में दिनचर्या अप्रत्याशित रखने के लिए । रातोंरात हल्के तनाव को शामिल । सीवी आहार में शामिल हैं: 1) 3 एक संयम सिलेंडर में एच; 2) 10 मिनट तैरना; 3) 3 एच पिंजरे झुकाव 4) 1 एच धीरे मिलाते हुए मंच; और 5) 4 ° c ठंडे कमरे में 1 ज ।
    नोट: रात के तनाव में शामिल सामाजिक भीड़ (पिंजरे प्रति 5), सामाजिक अलगाव, गीला बिस्तर, खाद्य प्रतिबंध, और रोशनी पर । तनाव आहार की एक विशिष्ट साप्ताहिक अनुसूची तालिका 1में प्रदान की जाती है ।

3. अंत में परख

  1. corticosterone के स्तर का निर्धारण (कोर्ट) का उपयोग कर पूंछ रक्त (~ ५० एमएल) एक ही समय में एकत्र नमूने (9 हूं) प्रति सप्ताह दो बार प्रयोग के दौरान, सीवी आहार से पहले के लिए आधारभूत हार्मोन का स्तर (दिन 0) की स्थापना, एक बार साप्ताहिक सीवी के बीच के दौरान (दिन 4, 11, और 18), सीवी के हर 7 दिनों के बाद (7 दिन और 14), और सीवी के समापन पर (21 दिन). दैनिक तनाव आहार से पहले रक्त के नमूने ले लीजिए ।
    1. रिया और जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए (25 दिन) इच्छामृत्यु के दौरान एक अंतिम ट्रंक रक्त का नमूना ले लीजिए ।
  2. रक्त कोशिकाओं से प्लाज्मा अलग करने के लिए सभी रक्त के नमूने (६०० x g, 4 ° c, 10 मिनट) केंद्रापसारक । प्लाज्मा (supernatant) को बाहर प्लास्टिक और नमूनों को-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  3. गल और radioimmunoassay (रिया) द्वारा कोर्ट स्तर तय करने के लिए प्लाज्मा का उपयोग करें । तनाव आहार की मजबूती को सत्यापित करने के लिए बल दिया जानवरों में 3 सप्ताह प्लाज्मा कोर्ट का स्तर ऊंचा कर रहे हैं सुनिश्चित करें.

4. व्यवहार

  1. सीवी आहार (दिन 23-24) के बाद, उच्च प्लस भूलभुलैया (EPM)14पर चिंता की तरह व्यवहार के लिए प्रत्येक जानवर का आकलन करें ।
  2. एक वीडियो कैमरा का उपयोग करना, ३०० s के लिए EPM तंत्र पर जानवरों रिकॉर्ड और केंद्र में बिताया समय स्कोर, हथियार बंद, और खुली बाहों ।

5. चूहे की डिजाइन मिथाइल-Seq

  1. UCSC जीनोम ब्राउज़र का उपयोग करना, गैर प्राप्त निरर्थक जीनोमिक निर्देशांक (चूहा नवंबर २००४ rn4 विधानसभा) CpG द्वीपों और द्वीप तटों के लिए (± 1 केबी पार्श्व CpG द्वीप), प्रवर्तकों (प्रत्येक TSS के ± 1 केबी) प्रत्येक RefSeq जीन के, और अंय दृश्यों कि से उपलब्ध हो सकता है प्रासंगिक साहित्य ।
    नोट: चूहा मिथाइल-Seq के लिए, पिछले सरणी-आधारित मिथाइल प्लेटफ़ॉर्म से अतिरिक्त GC-रिच अनुक्रम12जोड़ा गया था । 5 केबीपीएस से अधिक क्षेत्रों के लिए, ५०० बीपीएस के क्षेत्रों की बारी 1 केबीपीएस है कि छोड़ दिया गया था के बाद नमूना थे । अंतिम चूहा मिथाइल-Seq डिजाइन १११ एमबीपीएस, २,३००,००० CpGs के होते हैं; और ५९४ बीपीएस का एक औसत क्षेत्र आकार । यह लक्ष्य २२८,८०० अद्वितीय loci ।
  2. उपयुक्त जांच डिजाइन के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लक्ष्य पर कब्जा डिजाइन सॉफ्टवेयर में जीनोमिक निर्देशांक की एक संकलित सूची दर्ज करें ।

6. जीनोमिक डीएनए से चूहे मिथाइल-Seq पुस्तकालय का निर्माण

नोट: बैच प्रभाव को खत्म करने के लिए, एक ही समय में कई नमूनों की प्रक्रिया, और मास्टर ऊपर स्केल के अनुसार घोला जा सकता है । एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग डीएनए निकालें । स्तंभ या वर्षण-आधारित विधियों दोनों उच्च-गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए (260/280 अनुपात ~ १.८) उपज । phenol-आधारित विधियों का उपयोग अनुशंसित नहीं है । Elute या कम ते बफर में डीएनए resuspend (10 mm ते, ०.१ mm EDTA, पीएच ८.०) ।

  1. नमूना तैयारी
    नोट: हर कदम डीएनए बाध्यकारी चुंबकीय मोतियों का उपयोग करने के लिए, सुनिश्चित करें कि मोतियों के लिए कमरे के तापमान के लिए आदत रहे है और अच्छी तरह से उपयोग से पहले मिश्रित कम से 30 मिनट ।
    1. कतरनी डीएनए
      1. एक fluorometer का प्रयोग करें एक नमूना प्रारंभिक डबल-असहाय डीएनए एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए । पतला > 1 gDNA के µ जी कम ते बफर (10 mm te, ०.१ mm EDTA, पीएच ८.०) कम डीएनए में microcentrifuge ट्यूबों के साथ ५० µ l के लिए ।
      2. कतरनी नमूने एक इज़ोटेर्माल sonicator (10% शुल्क चक्र, 5 तीव्रता, फट प्रति २०० चक्र, ६० एस के 6 चक्र, आवृत्ति झाडू, 4 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग कर ।
      3. डीएनए की गुणवत्ता का आकलन एक ट्रो आधारित प्रणाली है कि डीएनए का आकार और मात्रा के उपाय का उपयोग कर ।
        नोट: की सिफारिश की गई डीएनए राशि 1 µ g, या 3 µ g । अगर वहां शुरू सामग्री सीमित है, ंयूनतम इनपुट राशि > 500 एनजी होना चाहिए, के रूप में कम मात्रा में प्रतिकूल मात्रा और उत्पंन पुस्तकालयों की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा ।
    2. मरंमत डीएनए समाप्त होता है ।
      1. आइस पर एंड-रिपेयर मास्टर मिक्स तैयार करने के लिए चूहे मिथाइल-Seq किट का प्रयोग करें । प्रत्येक नमूने के लिए मिश्रण के ५२ µ एल जोड़ें और एक गर्म ढक्कन के बिना एक थर्मल साइकिल चालक में गर्मी (30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस पकड़) ।
        अंतिम-मरंमत मास्टर मिश्रण (प्रति नमूना):
        ३५.२ पानी के µ l
        अंत मरंमत बफर के 10 µ एल (10x)
        १.६ µ l च्या dNTP मिश्रण
        टी-4 डीएनए पोलीमरेज़ के 1 µ l
        2 µ l के Klenow डीएनए पोलीमरेज़
        टी-4 Polynucleotide कळेनासे के २.२ µ एल
      2. डीएनए के १८० µ l-बाध्यकारी चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर नमूनों को शुद्ध और ४०० µ एल हौसले से तैयार ७०% प्रति इथेनॉल का नमूना । प्रत्येक नमूने के लिए मोतियों की १८० µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । गोली मोती, supernatant हटाने और ७०% इथेनॉल के २०० µ एल में गोली resuspend । इथेनॉल निकालें और एक बार धोने दोहराएं ।
      3. गोली मोती के लिए एक चुंबकीय थाली का प्रयोग करें और संभव के रूप में ज्यादा इथेनॉल के रूप में हटा दें । 3 के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस heatblock में सूखी-5 मनका गोली तक मिन पूरी तरह से शुष्क है । nuclease-नि: शुल्क जल के ४४ µ l में पुनर्स्थगित और supernatant के लगभग ४२ µ l को इकट्ठा करें ।
        रोक बिंदु: डीएनए की मरंमत के बाद समाप्त होता है, नमूने और सील हो सकता है-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
    3. Adenylate 3 ' समाप्त होता है ।
      1. बर्फ पर Adenylation मास्टर मिश्रण तैयार करें । प्रत्येक नमूने के लिए 9 µ l मिश्रण जोड़ें और एक गर्म ढक्कन के बिना एक थर्मल साइकिल चालक में गर्मी (30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस पकड़).
        Adenylation मास्टर मिश्रण (प्रति नमूना):
        Klenow बफर के 5 µ l
        1 µ l के dATP
        Klenow डीएनए पोलीमरेज़ के 3 µ l
      2. डीएनए के ९० µ l-बाध्यकारी चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर नमूनों को शुद्ध और ४०० µ एल हौसले से तैयार ७०% प्रति इथेनॉल का नमूना । प्रत्येक नमूने के लिए मोतियों की ९० µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । गोली मोती, supernatant हटाने और ७०% इथेनॉल के २०० µ एल में गोली resuspend । इथेनॉल निकालें और एक बार धोने दोहराएं ।
      3. गोली मोती के लिए एक चुंबकीय थाली का प्रयोग करें और संभव के रूप में ज्यादा इथेनॉल के रूप में हटा दें । 3 के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस heatblock में सूखी-5 मनका गोली तक मिन पूरी तरह से शुष्क है । nuclease-नि: शुल्क जल के ३५ µ l में पुनर्स्थगित और supernatant के लगभग ३३.५ µ l को इकट्ठा करें ।
    4. methylated एडेप्टर Ligate ।
      1. बर्फ पर बंधाव मास्टर मिश्रण तैयार करें और प्रत्येक नमूने के लिए मिश्रण के १६.५ µ एल जोड़ें । एक गर्म ढक्कन के बिना एक थर्मल साइकिल चालक में मशीन (20 ° c 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए पकड़) ।
        बंधाव मास्टर मिश्रण (प्रति नमूना):
        २.५ पानी के µ l
        मिथाइल-Seq Methylated एडेप्टर के २.५ µ l
        टी-4 डीएनए Ligase बफर (5x) के 10 µ एल
        टी-4 डीएनए Ligase के १.५ µ एल
      2. डीएनए के ९० µ l-बाध्यकारी चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर नमूनों को शुद्ध और ४०० µ एल हौसले से तैयार ७०% प्रति इथेनॉल का नमूना । प्रत्येक नमूने के लिए मोतियों की ९० µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । गोली मोती, supernatant निकालें, और ७०% इथेनॉल के २०० µ एल में गोली resuspend । इथेनॉल निकालें और एक बार धोने दोहराएं ।
      3. गोली मोती के लिए एक चुंबकीय थाली का प्रयोग करें और संभव के रूप में ज्यादा इथेनॉल के रूप में हटा दें । 3 के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस heatblock में सूखी-5 मनका गोली तक मिन पूरी तरह से शुष्क है । nuclease-नि: शुल्क जल के 22 µ l में पुनर्स्थगित करना और supernatant के लगभग 22 µ l को इकट्ठा करना. एक विश्लेषक का उपयोग गुणवत्ता का आकलन करें ।
        नोट: यदि डीएनए की कुल राशि से कम है ५०० एनजी, कतरनी और प्रक्रिया अतिरिक्त डीएनए बाद के चरणों के साथ आगे बढ़ने से पहले । औसत डीएनए आकार 30 से अधिक बीपीएस द्वारा वृद्धि नहीं करता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि रिएजेंट नए हैं, के रूप में टी-4 डीएनए पोलीमरेज़, Klenow, और/टी-4 ligase पुराना हो सकता है ।
        बिंदु रोक: ligating methylated एडेप्टर के बाद, नमूने सील किया जा सकता है और पर संग्रहीत-20 ° c.
  2. संकरण
    1. कम डीएनए बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूबों के लिए नमूने स्थानांतरण और एक गरम वैक्यूम ध्यानी का उपयोग करने के लिए नमूना मात्रा कम से कम ३.४ µ l पुनर्गठन ३.४ µ एल के लिए नमूने
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए नमूनों को लगभग ~ 3 µ l पर ध्यान दें ताकि सभी लिक्विड वाष्पों से पहले नमूने वैक्यूम संकेंद्रन से निकाल दिए जाएं.
    2. बर्फ पर कमरे के तापमान और मिथाइल-Seq ब्लॉक मिश्रण पर संकरण बफर तैयार करें । प्रत्येक नमूने के लिए मिथाइल Seq ब्लॉक मिश्रण के ५.६ µ एल जोड़ें और थर्मल साइकिल चालक में मशीन (5 मिनट के लिए ९५ ° c, 2 मिनट के लिए ६५ ° c, ६५ ° c पकड़) ।
      संकरण बफ़र (प्रति नमूना):
      ६.६३ µ l के मिथाइल-Seq Hyb 1
      ०.२७ µ l का मिथाइल-Seq Hyb 2
      २.६५ µ l के मिथाइल-Seq Hyb 3
      ३.४५ µ l के मिथाइल-Seq Hyb 4
      मिथाइल-Seq ब्लॉक मिश्रण (प्रति नमूना):
      मिथाइल-Seq इंडेक्सिंग ब्लॉक 1 के २.५ µ l
      मिथाइल-Seq ब्लॉक 2 के २.५ µ l
      मिथाइल-Seq ब्लॉक 3 के ०.६ µ l
    3. RNase ब्लॉक मिक्स और कैप्चर लाइब्रेरी संकरण मिश्रण तैयार करें । पर कब्जा पुस्तकालय संकरण मिश्रण के 20 µ एल जोड़ें प्रत्येक नमूने के लिए और ६५ डिग्री सेल्सियस पर कम से 16 घंटे के लिए मशीन ।
      RNase ब्लॉक मिश्रण (प्रति नमूना):
      RNase ब्लॉक के ०.५ µ एल
      १.५ पानी के µ l
      कैप्चर लाइब्रेरी संकरण मिश्रण (प्रति नमूना):
      संकरण बफर के 13 µ l
      RNase ब्लॉक मिक्स के 2 µ l
      चूहा मिथाइल-Seq कब्जा पुस्तकालय के 5 µ एल
      नोट: गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को रोकने के लिए संकरण मिश्रण जोड़ते समय ६५ ° c पर प्रतिक्रियाओं को रखें ।
    4. Aliquot ५० एक नया 8 अच्छी तरह से पट्टी ट्यूब में नमूना प्रति streptavidin चुंबकीय मोतियों की µ एल । २०० µ एल मिथाइल-Seq बाइंडिंग बफ़र के साथ धो लें । गोली मोती के लिए चुंबकीय थाली का प्रयोग करें और 3 बहाकर के एक कुल के लिए प्रत्येक धोने के बीच supernatant निकालें । अंतिम धोने के बाद, मिथाइल-Seq बाइंडिंग बफ़र के २०० µ l में streptavidin मोतियों को पुनः निलंबित करें ।
    5. धोया streptavidin चुंबकीय मोतियों की २०० µ एल के लिए नमूने जोड़ें और एक घूर्णन मिक्सर का उपयोग कर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । जबकि मिश्रण, aliquot २०० µ एल मिथाइल-Seq धोने बफर 2 के तपसिल कुओं में एक ९६-अच्छी तरह से थाली प्रति नमूना और एक थर्मल साइकिल चालक में स्थान के लिए पूर्व गर्म करने के लिए ६५ ° c ।
    6. गर्मी के बाद, गोली streptavidin चुंबकीय मोती चुंबकीय प्लेट का उपयोग कर और २०० µ एल मिथाइल-Seq वॉश बफर 1 में मोतियों को पुनः स्थगित । कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मशीन । गोली और supernatant को त्यागने के लिए एक चुंबकीय प्लेट का प्रयोग करें ।
    7. धो मोती मिथाइल-Seq धो बफर 2 के साथ 3 बार: २०० µ में मनका गोली resuspend धो बफर 2 के एल (पूर्व चरण 6.2.5 में गर्म), थर्मल साइकिल चालक (६५ ° c, 10 मिनट), और गोली मोतियों में मोतियों की मशीन । एक चुंबकीय प्लेट का उपयोग कर धोने के बाद supernatant त्यागें ।
      नोट: गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को रोकने के लिए वॉश बफ़र 2 जोड़ते समय ६५ ° c पर संकरण प्रतिक्रियाओं को बनाए रखें ।
    8. 20 मिनट के लिए मिथाइल-Seq रेफरेंस बफर के २० µ l को धोकर मोतियों की माला में डालें और कमरे के तापमान पर एक नई स्ट्रिप ट्यूब पर supernatant के लिए एक चुंबकीय प्लेट का प्रयोग करें । मोतियों को त्यागें ।
      ध्यान दें: जबकि मशीनिंग, bisulfite रूपांतरण एजेंट तैयार करते हैं ।
  3. Bisulfite रूपांतरण
    नोट: एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध bisulfite रूपांतरण किट से उपयुक्त रिएजेंट और निर्देशों का उपयोग करके eluted ssDNA का bisulfite रूपांतरण निष्पादित करें.
    1. Add १३० µ l पिछले चरण से supernatant करने के लिए तैयार bisulfite कनवर्ज़न रिएजेंट । १५० µ एल प्रतिक्रियाओं में से प्रत्येक को समान रूप से दो कुओं में विभाजित । एक थर्मल साइकिल चालक में मशीन (२.५ एच, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ६४ ° c पकड़) ।
      नोट: १५० µ एल प्रतिक्रिया समरूप तापमान सुनिश्चित करने के लिए दो अलग कुओं में समान रूप से विभाजित है । २.५ घंटे के लिए मशीन के बाद, तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ना ।
    2. बाइंडिंग बफ़र के ६०० µ l को जोड़कर स्तंभों को स्पिन करने के लिए नमूने बाइंड करें और धो बफ़र के १०० µ l के साथ एक बार धोएं । सभी bisulfite रूपांतरण चरणों के बीच कॉलम (१५,००० x g, 1 min) की और प्रवाह के माध्यम से छोड़ें ।
    3. स्तंभों में Desulphonation बफ़र के २०० µ l को जोड़कर नमूने Desulphonate. 15-20 min. दोहराएँ केंद्रापसारक के लिए कमरे के तापमान पर मशीन और के माध्यम से प्रवाह को छोड़ दें ।
    4. धोने के बफर के २०० µ एल के साथ दो बार कॉलम धो लें । Elute प्रत्येक नमूने को जोड़ने के द्वारा 10 µ एल का रेफरेंस बफर कॉलम, कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए मशीनिंग, और केंद्रापसारक (१५,००० x g, 1 min) । दोहराने के रेफरेंस स्टेप के लिए कुल 20 µ एल.
    5. बर्फ पर पीसीआर रिएक्शन मास्टर मिक्स 1 तैयार करें । प्रत्येक नमूने के लिए मिश्रण के ८२ µ एल जोड़ें । निंनलिखित कार्यक्रम के साथ एक थर्मल साइकिल चालक में मशीन ।
      पीसीआर रिएक्शन मास्टर मिक्स 1 (प्रति नमूना):
      30 µ l पानी के
      ५० µ एल के मिथाइल-Seq पीसीआर मास्टर मिक्स
      1 µ l के मिथाइल-Seq PCR1 प्राइमरी च
      1 µ l के मिथाइल-Seq PCR1 प्राइमरी आर
      थर्मल साइकिल चालक कार्यक्रम:
      1 चरण, 1 चक्र: ९५ ° c 2 min
      2 चरण, 8 चक्र: ९५ ° c 30 s, ६० ° c 30 s, ७२ ° c 30 s
      चरण 3, 1 चक्र: ७२ ° c 7 min
      4 चरण, 1 चक्र: 4 ° c पकड़
    6. डीएनए के १८० µ l-बाध्यकारी चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर नमूनों को शुद्ध और ४०० µ एल हौसले से तैयार ७०% प्रति इथेनॉल का नमूना । प्रत्येक नमूने के लिए मोतियों की १८० µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । गोली मोती, supernatant हटाने और ७०% इथेनॉल के २०० µ एल में गोली resuspend । इथेनॉल निकालें और एक बार धोने दोहराएं ।
    7. गोली मोती के लिए एक चुंबकीय थाली का प्रयोग करें और संभव के रूप में ज्यादा इथेनॉल के रूप में हटा दें । 3 के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस heatblock में सूखी-5 मनका गोली तक मिन पूरी तरह से शुष्क है । nuclease-मुफ्त पानी की 21 µ एल में पुनर्स्थगित और लगभग १९.५ µ supernatant के एल इकट्ठा ।
  4. अनुक्रमण
    1. बर्फ पर पीसीआर रिएक्शन मास्टर मिक्स 2 तैयार करें । जोड़ें २५.५ µ एल मास्टर मिश्रण 2 प्रत्येक नमूने के लिए । एक थर्मल साइकिल चालक में व्यक्तिगत नमूनों और मशीन के लिए 5 µ एल वाणिज्यिक अनुक्रमण प्राइमर जोड़ें ।
      पीसीआर रिएक्शन मास्टर मिक्स 2 (प्रति नमूना):
      25 µ एल मिथाइल-Seq पीसीआर मास्टर मिक्स
      ०.५ µ एल मिथाइल-Seq आम अनुक्रमण प्राइमर
      थर्मल साइकिल चालक कार्यक्रम:
      1 चरण, 1 चक्र: ९५ ° c 2 min
      2 चरण, 6 चक्र: ९५ ° c 30 s, ६० ° c 30 s, ७२ ° c 30 s
      चरण 3, 1 चक्र: ७२ ° c 7 min
      4 चरण, 1 चक्र: 4 ° c पकड़
      नोट: अतिरिक्त चक्र (2-3) आवश्यक हो सकता है अगर शुरू डीएनए एकाग्रता की सिफारिश की मूल्यों के नीचे है ।
    2. डीएनए के ९० µ l-बाध्यकारी चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर नमूनों को शुद्ध और ४०० µ एल हौसले से तैयार ७०% प्रति इथेनॉल का नमूना । प्रत्येक नमूने के लिए मोतियों की ९० µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । गोली मोती, supernatant हटाने और ७०% इथेनॉल के २०० µ एल में गोली resuspend । इथेनॉल निकालें और एक बार धोने दोहराएं ।
    3. गोली मोती के लिए एक चुंबकीय थाली का प्रयोग करें और संभव के रूप में ज्यादा इथेनॉल के रूप में हटा दें । 3 के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस heatblock में सूखी-5 मनका गोली तक मिन पूरी तरह से शुष्क है । nuclease-फ्री वॉटर के 24 µ jk में रिसस्पेंड और supernatant के लगभग 24 µ एल कलेक्ट ।
    4. एकाग्रता और बीपी के आकार का आकलन उच्च संवेदनशीलता डीएनए का उपयोग कर एक विश्लेषक पर पहचान रिएजेंट ।
      नोट: यदि इस पुस्तकालय डीएनए की उपस्थिति का पता लगाने में विफल रहता है, अतिरिक्त डीएनए के साथ तैयारी कदम दोहराएं ।
      बिंदु रोक: शुद्धि के बाद, अनुक्रमित नमूनों सील किया जा सकता है और पर संग्रहित-20 ° c ।
    5. उपयुक्त अगली पीढ़ी sequencing प्लेटफ़ॉर्म उपयोग के लिए नमूने पूलिंग ।
      1. एक दी गई मात्रा में पुस्तकालय के आकार और मात्रा के आधार पर डीएनए molarity निर्धारित करता है, जो, कम ते बफर (6.1.1.1) के साथ पतला और 15 बजे की एक अंतिम एकाग्रता के लिए सभी नमूनों गठबंधन के लिए है, जो प्रतिविश्लेषक से एकाग्रता डेटा का उपयोग करना ।
        नोट: पुस्तकालय को बढ़ाता है की एक अधिक संवेदनशील विधि मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर कि ligated एडेप्टर लक्ष्य प्राइमरों का उपयोग करके है ।
      2. एक अगली पीढ़ी के sequencer पर लेन प्रति 4 नमूनों के लिए पर्याप्त हैं कि गलियों की संख्या पर परित नमूने चलाएँ.
        नोट: उदाहरण के लिए, यदि 16 पुस्तकालय नमूने विशिष्ट अनुक्रमित किया गया है और संयुक्त, 4 लेन पर पुस्तकालयों चलाने के लिए, लेन प्रति 4 नमूनों के बराबर ।

7. एक अगली पीढ़ी sequencer पर अनुक्रमण

  1. नमूने के लिए संस्थागत अनुक्रमण कोर मिथाइल-Seq लाइब्रेरी, एक अगली पीढ़ी sequencing मशीन पर sequencing के बाद क्लस्टरिंग के लिए भेजें ।

8. विश्लेषण DMRs की पहचान करने के लिए

  1. 15Bismark को लागू करने, जो एक आंतरिक अनुक्रम16,17के रूप में २.० Bowtie आह्वान, कच्चे इनपुट संरेखित करने के लिए bisulfite-परिवर्तित, प्लस-किनारा जीनोम पढ़ता है । संरेखण के बाद, गुणवत्ता नियंत्रण करने और प्रत्येक CpG को अनुमानित मिथाइल मान असाइन करने के लिए Bismark_methylation_extractor का उपयोग करें ।
  2. बी एस-Seq पैकेज18 के साथ DMRs की एक सूची उत्पंन में कंडक्टर । 3 लगातार CpGs और P-मान < 0.05 से अधिक होने पर आधारित DMRs को फ़िल्टर करें ।
    नोट: एक DMR सूची है कि जीनोमिक निर्देशांक, निकटतम RefSeq जीन के लिए दूरी, प्रत्येक DMR के भीतर CpGs की संख्या, CpG में औसत% DMR मिथाइल मूल्य के दो तुलना समूहों के लिए (जैसे, बल दिया बनाम तनाव), पी मूल्य, और शामिल उत्पंन एफडीआर (गलत खोज दर) मान । सत्यापन के लिए pyrosequencing प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए DMR सूची, यानी, जीनोमिक निर्देशांकों का उपयोग करें ।

9. Bisulfite Pyrosequencing द्वारा मांयता

  1. प्राइमरी डिजाइन
    1. bisulfite पीसीआर और pyrosequencing के लिए डिजाइन प्राइमर । पीसीआर प्राइमरों (बाहर और नेस्टेड) के दो सेट डिजाइन ताकि नेस्टेड पीसीआर एक DMR के 150-400 बीपीएस बढ़ाना होगा ।
      नोट: सामांय में, डिजाइन प्राइमर कम से कम 24 के साथ लंबी कुर्सियां है लंबे समय-5 गैर लगातार है जी (सी रिवर्स प्राइमर के लिए है) अनुक्रम जटिलता के नुकसान से कम एनीलिंग तापमान के लिए खाते में । नेस्टेड प्राइमरों में से एक बायोटिन-लेबल और HPLC-शुद्ध किया जाएगा । हालांकि, मानक प्राइमरों पहले एक agarose जेल पर प्रतिक्रियाओं को हल करके पीसीआर कदम का अनुकूलन करने के लिए आदेश दिया जाना चाहिए ।
      1. डिजाइन pyrosequencing परख प्राइमर इतना है कि यह पूरक biotinylated बस 1 किनारा-2 कुर्सियां CpGs के ऊपर लक्ष्य को परख सकता है । डिजाइन एकाधिक pyrosequencing प्राइमरों के रूप में आवश्यक है, के रूप में प्रत्येक pyrosequencing प्राइमर मज़बूती से परख 30 बीपीएस बहाव कर सकते हैं ।
    2. Rt1-m4 के लिए, निम्न का उपयोग करें:
      rRT1M4 बाहर – F TGTAYGATTTTGGTTATYGTAAAT
      rRT1M4 बाहर – R AACTTACAAATTTCACCAACTCA
      rRT1M4 नेस्टेड – च GTGGGTTAYGTGGATAATATATAG
      rRT1M4 नेस्टेड – R AATCACTTACCATTCTCTCTCTAACTA
      rRT1M4 Pyro1 TAYGTGGATAATATATAGAT
      rRT1M4 Pyro2 GATAGTTATTTGGYGAGTTAG
      rRT1M4 Pyro3 GAGTATTTGGAGGAGTTGAT
      rRT1M4 Pyro4 GGATTTTAATATTTGGT
  2. चूहे के रक्त gDNA के bisulfite रूपांतरण के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करें ।
    नोट: bisulfite रूपांतरण कदम निम्न संशोधनों के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट से अनुकूलित किया गया है: चरण 1 में, जोड़ें 50 – 100 रक्त gDNA के एनजी और 20 µ के लिए पानी के साथ पतला l चरण 9, elute 20 µ l प्रति नमूना ।
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार bisulfite रूपांतरण एजेंट तैयार करें और पतला gDNA के साथ संयोजित करें. थर्मल साइकिल चालक में मशीन (२.५ एच, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ६४ ° c पकड़) ।
    2. स्पिन कॉलम में परिवर्तित gDNA के लिए बाध्यकारी बफर जोड़ें और केंद्रापसारक (१५,००० x g, 1 मिनट) । कॉलम धो एक बार फिर कॉलम में Desulphonation बफर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए गर्मी । केंद्रापसारक (१५,००० x जी, 1 मिनट) ।
    3. धोने के बफर और केंद्रापसारक (१५,००० x g, 1 मिनट) के साथ कॉलम धो लें । दोहराएं (१५,००० एक्स जी, 2 मिनट) केंद्रापसारक के साथ कदम धो लो । 20 µ l रेफरेंस बफर और केंद्रापसारक जोड़ें (१५,००० x g, 1 min) to elute.
  3. पीसीआर प्रवर्धन
    1. बाहर की तैयारी करें पीसीआर मास्टर मिक्स । जोड़ें २१.५ µ मास्टर मिश्रण के एल के लिए ३.५ µ l bisulfite-परिवर्तित gDNA और भागो थर्मल साइकिल चालक कार्यक्रम ।
      बाहर पीसीआर मास्टर मिक्स:
      १६.२५ पानी के µ l
      पोलीमरेज़ बफर के २.५ µ l [10x]
      ०.५ µ l के dNTP [10 mM]
      1 आगे प्राइमर के µ एल [०.१ µ m]
      रिवर्स प्राइमर के 1 µ l [०.१ µ m]
      ०.२५ µ l के Taq डीएनए पोलीमरेज़ [५००० U/एमएल] ।
      थर्मल साइकिल चालक कार्यक्रम:
      1 चरण, 1 चक्र: ९४ ° c 4 min
      चरण 2, ४७ चक्र: ९४ ° c 1 मिनट, ५३ ° c 30 s, ७२ ° c 1 min
      चरण 3, 1 चक्र: ७२ ° c 8 मिनट, 4 ° c पकड़
    2. नेस्टेड पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करते हैं । पीसीआर के बाहर से नमूना के 2 µ एल के लिए मास्टर मिश्रण के 23 µ एल जोड़ें और बाहर पीसीआर थर्मल साइकिल चालक कार्यक्रम दोहराने । जेल ट्रो (1x ताे बफर, 1% agarose जेल) के माध्यम से पीसीआर उत्पाद की गुणवत्ता का आकलन करें ।
      नेस्टेड पीसीआर मास्टर मिक्स:
      १७.७५ पानी के µ l
      पोलीमरेज़ बफर के २.५ µ l [10x]
      ०.५ µ l के dNTP [10 mM]
      1 आगे प्राइमर के µ एल [०.१ µ m]
      रिवर्स प्राइमर के 1 µ l [०.१ µ m]
      ०.२५ µ l के Taq डीएनए पोलीमरेज़ [५००० यू/
      नोट: के लिए पीसीआर नेस्टेड, या तो आगे या रिवर्स प्राइमर biotinylated होना चाहिए ।
  4. Pyrosequencing
    1. बाध्यकारी बफर के ३८ µ एल, पानी की ३५ µ एल, और नमूना प्रति streptavidin-लेपित sepharose मोतियों की 2 µ एल युक्त एक मास्टर मिश्रण बनाओ । एक ९६-वेल प्लेट में, नेस्टेड पीसीआर उत्पाद के मास्टर मिक्स और 5 µ एल के ७५ µ एल जोड़ें । 15-60 मिनट के लिए एक प्लेट शेखर पर हिलाओ ।
    2. जबकि मिलाते हुए, एक pyrosequencing परख प्लेट के कुओं में प्राइमर (०.५ µ एम, एनीलिंग बफर में पतला) के 12 µ एल जोड़ें ।
    3. मिलाने के बाद, बाइंडिंग रिएक्शन वॉश बफ़र्स का उपयोग करके वाश चरण निष्पादित करें । जगह पानी से भरा गर्त में वैक्यूम उपकरण तो थाली से नमूने इकट्ठा । ७०% इथेनॉल, NaOH (०.२ मीटर), और Tris एसीटेट बफर (10 मिमी, पीएच ७.४) युक्त आधे से भरा गर्त में जलमग्न वैक्यूम उपकरण । वैक्यूम और एच एस परख प्लेट में जगह वैक्यूम उपकरण से डिस्कनेक्ट मोती हस्तांतरण करने के लिए ।
    4. गर्मी ब्लॉक पर प्लेस प्लेट और ८० डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए मशीन की अनुमति दें प्लेट 5 मिनट के लिए शांत करने के लिए तो पायरो कार्यक्रम शुरू करते हैं ।

Representative Results

चूहा मिथाइल-Seq मंच का एक सफल कार्यांवयन कई मानदंडों पर निर्भर करता है । चित्रा 1 अध्ययन के समग्र कार्यप्रवाह से पता चलता है और आगे बढ़ने से पहले की जरूरत है कि विशिष्ट गुणवत्ता नियंत्रण (QC) चरणों पर प्रकाश डाला गया. पहले कारकों में से एक पर विचार करने के लिए पशु मॉडल और तनाव आहार है, जो epigenetic परिवर्तन है कि methylome भर में होने की भयावहता का निर्धारण की मजबूती है । चूंकि हमारे जानवर का काम हमारे पिछले प्रेक्षण पर predicated है कि corticosterone (कोर्ट) एक्सपोजर डीएनए मिथाइल19,20में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, हमारे जीर्ण चर तनाव (सीवी) आहार के लिए पर्याप्त कठोरता के उत्पादन की जरूरत है ऊंचा प्लाज्मा कोर्ट के स्तर के साथ चूहों पर जोर दिया । एक ठेठ साप्ताहिक सीवी आहार 1 तालिका में दिखाया गया है और सुबह, दोपहर में दैनिक तनाव के शामिल है, और रात है कि लगातार आदी होना और कम तनाव प्रतिक्रिया को रोकने के लिए बदल रहे हैं । 3 सप्ताह के दौरान आहार, बल दिया जानवरों का मतलब प्लाज्मा बैठूंगा के काफी ऊंचा स्तर की प्रदर्शनी [दिन 4 – 21, नियंत्रण: ३२.७ ३.७ एनजी/एमएल, तनाव: १०३.० ११.९ एनजी/एमएल (SEM मतलब), पी = २.२ x 10-4, चित्रा 2a) उन पर जोर से, जानवरों पर नियंत्रण । लगातार, इन जानवरों ने भी अधिक से अधिक चिंता की तरह व्यवहार को दिखाया ऊंचा प्लस भूलभुलैया (EPM), के रूप में काफी अधिक समय EPM की बंद बाहों में और खुले बाहों में कम समय बिताया द्वारा संकेत (चित्रा बी) । इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि सीवी जोखिम महत्वपूर्ण अंत-स्रावी और व्यवहार परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व, हमें यह जांचना है कि क्या इन परिवर्तनों को विशिष्ट डीएनए मिथाइल हस्ताक्षर के साथ जुड़े थे अग्रणी ।

हम कई चौकियों पर जोर देते हैं जो मिथाइल-Seq पुस्तकालय के सफल निर्माण के लिए महत्वपूर्ण हैं । डीएनए की पर्याप्त मात्रा के साथ शुरू, sonication के रूप में, एकाधिक धोने/शुद्धि, लक्ष्य संवर्धन, और bisulfite रूपांतरण कदम क्रमिक समाप्त पुस्तकालय में डीएनए की मात्रा को कम करने के लिए आवश्यक है । हालांकि कई पीसीआर प्रवर्धन कदम डीएनए टेम्पलेट की हानि को कम, अत्यधिक पीसीआर चक्र संख्या उच्च डुप्लिकेट पढ़ता परिचय कर सकते हैं. वर्तमान चूहे मिथाइल-Seq अध्ययन के लिए, २ ग्राम रक्त gDNA प्रति चूहे का प्रयोग किया गया. हम ध्यान दें कि मिथाइल-Seq पुस्तकालयों ५०० एनजी के रूप में कम के रूप में डीएनए राशि शुरू करने के साथ किया जा सकता है । छोटे प्रारंभिक सामग्री उपयोगकर्ताओं FACS द्वारा अलग डीएनए से पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है (प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई) या सुई घूंसे, हालांकि बाद अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों की एक अपर्याप्त राशि के उत्पादन का खतरा बढ़ जाता है. QC नमूना के 1 एल के ट्रो द्वारा किया जाता है एक विश्लेषक है, जो डीएनए आणविक वजन प्रदान करता है, मात्रा, और molarity । तीन महत्वपूर्ण चरणों कि के उपयोग की आवश्यकता होती है विश्लेषक हैं: 1) डीएनए के पर्याप्त बाल काटना सुनिश्चित करने के लिए निम्नलिखित sonication कदम (~ १७० bp, लाल, चित्रा 3); 2) निम्नलिखित अनुकूलक बंधाव कदम (~ २०० बीपी, नीला, चित्रा 3) की कतरनी डीएनए के औसत आकार में एक बदलाव से संकेत दिया उनके बाद प्रवर्धन पीसीआर द्वारा सुनिश्चित करने के लिए; और 3) निंनलिखित अंतिम पुस्तकालय शुद्धि कदम मात्रा और अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय के आकार को सुनिश्चित करने के लिए ।

आर संकुल BSSeq और BSmooth में bisulfite sequencing डेटा18का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया । वे उपकरण और विधियों क्रम पढ़ता संरेखित करने के लिए, गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन, और अवकलन methylated क्षेत्रों (DMRs) की पहचान शामिल है । BSmooth सॉफ्टवेयर Bowtie २.०16,17 एक आंतरिक अनुक्रम CpG-स्तर माप सारांश प्राप्त करने के लिए संरेखण के रूप में, कच्चे इनपुट के संरेखण द्वारा bisulfite-परिवर्तित जीनोमिक दृश्यों को पढ़ता है । संरेखित पढ़ता है तब कठोर गुणवत्ता नियंत्रण कार्यविधियों के माध्यम से फ़िल्टर की गई व्यवस्थित sequencing और आधार-कॉलिंग त्रुटियों की पहचान करने के लिए जो प्रवाह विश्लेषणों विषम कर सकते हैं । भूखंडों की एक श्रृंखला को छानने की इस प्रक्रिया में नेत्रहीन सहायता के लिए उत्पंन कर रहे हैं । sequencing मैट्रिक्स भी प्रासंगिक जानकारी जैसे संरेखित पढ़ता,% लक्ष्य, और प्रति CpG कवरेज, दूसरों के बीच में (तालिका 2) दस्तावेज़ के लिए जनरेट किया गया है । एक बार जब डेटा फ़िल्टर कर रहे हैं, एक चिकनी/सामांयीकरण एल्गोरिथ्म किया जाता है, जहां हर CpG एक अनुमानित मिथाइल मूल्य सभी QC के आधार पर सौंपा है एक नमूना और अनुमान से पड़ोसी CpGs से पढ़ता है और अधिक सटीक बुला के लिए मिथाइल का स्थिति यहां तक कि मामलों में जहां अनुक्रम कवरेज कम है । यह मान प्रत्येक CpG साइट पर मिथाइल की प्रायिकता का एक स्मूथ्ड अनुमान प्रदान करता है. दो उपचार समूहों और रैंकिंग जीनोमिक क्षेत्रों के बीच प्रत्येक नमूने के स्मूथ्ड मिथाइल अनुमानों के माध्य की तुलना करके कम से सबसे काफी अलग, DMRs की एक सूची (तालिका 3) जेनरेट की जाती है.

बल दिया और तनाव में समूहों के बीच शीर्ष DMR चूहा प्रमुख histocompatibility जीन Rt1 के प्रवर्तक में स्थित था -m4, बल दिया पशुओं से सभी CpGs भर में उच्च मिथाइल स्तर का प्रदर्शन पशुओं (चित्रा 4a) । मिथाइल-Seq प्लेटफ़ॉर्म और डेटा विश्लेषण के सफल कार्यान्वयन की पुष्टि करने के लिए, प्राइमरों को DMR के खिलाफ डिजाइन किया गया था, और तनाव वाले जानवरों के पूरे पलटन में रक्त डीएनए मिथाइल स्तर (मिथाइल-Seq द्वारा अनुक्रमित 8 और 8 क्रमानुसार नहीं) bisulfite pyrosequencing द्वारा मूल्यांकन किया गया. परिणाम 12 CpGs परख (5.1-10.4 परिवर्तन% मिथाइल, P < 0.037, figure 4B) में से 10 भर में डीएनए मिथाइल में उल्लेखनीय वृद्धि प्रदर्शित करता है । KEGG मार्ग विश्लेषण नाममात्र महत्वपूर्ण DMRs के सभी पर प्रदर्शन के लिए तनाव से जुड़े रास्ते की पहचान की थी । लगातार, DMR-जुड़े मार्ग मधुमेह, हृदय रोग, और कैंसर (तालिका 4) के रूप में पुरानी तनाव जोखिम, के साथ जुड़े रोगों फंसा । 21 , 22 , 23 epigenetic डेटा और तनाव के लिए जोखिम की डिग्री के बीच एक संघ का प्रदर्शन करने के लिए, CpG-10 में मिथाइल स्तर प्रत्येक जानवर के लिए मतलब 3 सप्ताह कोर्ट के स्तर की तुलना में थे । परिणाम अंत में स्रावी और मिथाइल डेटा (R2= ०.५४, P = 0.001, चित्रा 5) के बीच एक मामूली संबंध दिखाया ।

Figure 1
चित्रा 1: चूहा मिथाइल-Seq मंच के लिए समग्र योजनाबद्ध कार्यप्रवाह । जीनोमिक डीएनए के एक जी पर बल दिया और नियंत्रण चूहों के रक्त से निकाले पहले अनुक्रमण, विश्लेषण, और लक्ष्य पहचान के लिए मिथाइल-Seq पुस्तकालयों के निर्माण के लिए कार्रवाई की है । डीएनए की एक और १०० एनजी bisulfite pyrosequencing द्वारा की पहचान की epigenetic लक्ष्य के स्वतंत्र सत्यापन के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: जीर्ण चर तनाव (सीवी) के लिए जोखिम अंत में चूहों में और व्यवहार परिवर्तन की ओर जाता है । (क) corticosterone (बैठूंगा) के कई नमूने 3 सप्ताह सीवी आहार की मजबूती का प्रदर्शन करते हैं । दैनिक तनाव आहार से पहले सुबह में रक्त के नमूने एकत्र किए गए । (ख) तनावग्रस्त पशुओं को अधिक समय तक बंद बाहों में और कम समय में उन्नत प्लस भूलभुलैया (EPM) की खुली बाहों में बिताया. प्रत्येक जानवर के लिए डेटा बिंदु के साथ Boxplots दिखाया जाता है । सांख्यिकी महत्व के लिए छात्र का टी-टेस्ट किया गया । * p < 0.05, * * p < 0.01, और * * * p < 0.001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: कतरनी और एडाप्टर के Quantitation-एक विश्लेषक पर ligated चूहे डीएनए । लाल और नीले curves एक इज़ोटेर्माल sonicator और अनुकूलक बंधाव, क्रमशः में कतरनी के बाद जीनोमिक डीएनए (लाल) की मात्रा और आकार दिखाते हैं । प्रत्येक पंक्ति एक नमूना का प्रतिनिधित्व करता है और लाल और नीला घटता कई चरणों के दौरान डीएनए की हानि दोनों को प्रतिबिंबित (अंत-मरंमत, 3 '-adenylation, और नमूना क्लीनअप) और एडाप्टर के बंधाव के कारण बीपी का आकार में वृद्धि । तेज चोटियों पर 25 बीपी और १५०० बीपी मानक मार्करों है कि लोड हो रहा है बफर करने के लिए जोड़ा गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सीवी-प्रेरित epigenetic परिवर्तन चूहे मिथाइल-Seq से पाए जाते हैं । (क) चूहे मिथाइल-Seq डेटा के विश्लेषण ने जीन Rt1m4 के प्रवर्तक को तनावग्रस्त (लाल) और नियंत्रण (नीला) चूहों के बीच एक विभेदक methylated क्षेत्र (DMR) के रूप में फंसाया. Rt1m4 DMR (गुलाबी छायांकित क्षेत्र) के लिए चित्रमय उत्पादन प्रत्येक CpG (ऊर्ध्वाधर ग्रे लाइन), प्रत्येक समूह में चार नमूने (लाल या नीली लाइनें), और प्रत्येक जानवर के लिए% मिथाइल स्तर (लाल या नीला डॉट) प्रदर्शित करता है । (ख) DMR के भीतर बारह CpGs को bisulfite pyrosequencing द्वारा मान्य किया गया. बार रेखांकन मतलब SEM के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, और एक छात्र के टी परीक्षण सांख्यिकीय महत्व के लिए प्रदर्शन किया गया । * P < 0.05. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण CpG पर% डीएनए मिथाइल के बीच एक मामूली संबंध दिखाया-10 Rt1m4 के और 3 सप्ताह मतलब दोनों पर बल दिया और नियंत्रण जानवरों (N = 16) के प्लाज्मा कोर्ट स्तर । तनाव जानवरों से डेटा लाल हलकों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सप्ताह Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 दिन 6 Day 7
हूँ संयम तैरना शीत कक्ष तैरना संयम बरतन तैरना
बजे बरतन पिंजरे झुकाव संयम बरतन शीत कक्ष संयम शीत कक्ष
रात भर खाद्य प्रतिबंधित गीला बिस्तर अलगाव पर प्रकाश भीड़ पर प्रकाश गीला बिस्तर

तालिका 1: जीर्ण चर तनाव आहार (सीवी) की एक विशिष्ट साप्ताहिक अनुसूची ।

अनुक्रमण मैट्रिक्स तनाव1 नियंत्रण1
(n = 4) (n = 4)
युग्मित अंत पढ़ता है (प्रति) ८९,२९०,३९७ ८०,१६५,६७४
विशिष्ट रूप से मैप किए गए युग्मित अंत पढ़ता (UMPER) ३९,२००,२५५ ३५,०१३,४०६
संरेखण दर/मानचित्रण दक्षता (UMPER/ ४४% ४४%
डुप्लिकेट पढ़ता (% UMPER) ७३% ६५%
डुप्लीकेट UMPER १०,४८१,०३१ १२,३०६,०१८
औसत पढ़ें गहराई कवरेज (x) (ARDC) 6x 6x
CpGs (N) १२,०५६,८७८ १२,०५६,८७८
ARDC (x) of CpGs 2x 2x
कम से CpGs 10 के साथ पढ़ता है (N) ४८१,३८३ ५९५,८५०
ARDC (X) के साथ CpGs के कम से 10 पढ़ता 19 19
लक्ष्य CpGs पर (जांच लक्ष्य क्षेत्रों के साथ पूर्ण ओवरलैप) १,९२३,८७२ २,००७,६३८
पर लक्ष्य ARDC (x) of CpGs 7x 8x
लक्ष्य CpGs पर कम से 10 पढ़ता (N) के साथ ४२८,२४९ ५३१,४१९
पर लक्ष्य ARDC (x) के साथ CpGs के ंयूनतम 10 पुस्तकें 18x 18x
लक्ष्य पर (प्रति 1 या अधिक आधार जोड़ी जांच लक्ष्य क्षेत्रों के साथ ओवरलैप) (UMPER) ८,२७७,७१५ ९,३६९,५२३
लक्ष्य पर% (डुप्लिकेट UMPER का) ७८% ७७%
लक्ष्य (कुल आधार मैप किए गए) Mb १२५ Mb १२८ Mb
लक्ष्य औसत पर गहराई से कवरेज पढ़ें (x) (ARDC) 9x 10x
1 प्रत्येक समूह में विषयों में औसत के आधार पर अनुक्रमणित मीट्रिक्स

तालिका 2: sequencing मैट्रिक्स से प्राप्त चूहे मिथाइल-Seq प्लेटफ़ॉर्म ।

Chr प्रारंभ अंत जीन दूरी areaStat meanDiff तनाव नियंत्रण दिशा
chr20 १,६४४,२४६ १,६४४,३९० RT1-M4 in_gene ९३.०३ ०.२२ ०.३३ ०.११ लाभ
chr5 १६०,३६१,३५२ १६०,३६१,५६४ LOC690911 in_gene -७०.७५ -०.१९ ०.७२ ०.९१ नुकसान
chr3 ६१,१३८,२८१ ६१,१३८,३३० RGD1564319 २६५५६९ ६१.७९ ०.२१ ०.९४ ०.७२ लाभ
chr2 १४३,०६४,८११ १४३,०६५,०१० Ufm1 ८५६९ -५९.४८ -०.११ ०.१३ ०.२४ नुकसान
chr7 ३०,७६४,१११ ३०,७६४,२८४ Ntn4 in_gene ५७.०४ ०.२१ ०.९४ ०.७३ लाभ
chr17 १२,४६९,११२ १२,४६९,२१८ Idnk ४१९९६ -५०.९१ -०.१३ ०.७४ ०.८८ नुकसान
chr7 ४७,१०१,७२५ ४७,१०१,९३० Pawr in_gene -५०.५४ -०.१२ ०.६४ ०.७६ नुकसान
chr5 ७६,१११,२४८ ७६,१११,८२२ Txndc8 १५१७०३ -५०.३८ -०.११ ०.८५ ०.९६ नुकसान
chr11 ८०,६४०,१३२ ८०,६४०,३५६ Dgkg in_gene -५०.०७ -०.१६ ०.७३ ०.८९ नुकसान
chr8 ७१,७५९,२४८ ७१,७५९,४११ Mir190 २१०२२६ -४७.८४ -०.१७ ०.५८ ०.७५ नुकसान

तालिका 3: शीर्ष 10 विभेदक methylated क्षेत्रों । प्रत्येक DMR के लिए, आउटपुट तालिका बाएँ से दाएँ स्तंभ से पता चलता है: गुणसूत्र स्थान (chr), निर्देशांक (प्रारंभ/अंत), जीन का नाम, प्रतिलेखन प्रारंभ साइट से दूरी, विभेदक क्षेत्र के आँकड़े के बीच तनाव और नियंत्रण समूह (areaStat), मतलब विभेदक मिथाइल (meanDiff), पर बल दिया और नियंत्रण समूहों (तनाव/नियंत्रण), और नियंत्रण से मिथाइल परिवर्तन की दिशा के लिए प्रत्येक DMR भर में मिथाइल स्तर का मतलब है ।

KEGG मार्ग की शर्तें जीन गणना % पी-मान Benjamini
मधुमेह
प्रकार द्वितीय मधुमेह 12 ०.१ ३.६ एक्स 10-4 ९.८ एक्स 10-3
हृदय रोग
संवहनी चिकनी मांसपेशी संकुचन 18 ०.१ १.६ एक्स 10-3 ३.६ एक्स 10-2
Arrhythmogenic सही वेंट्रिकुलर cardiomyopathy (ARVC) 13 ०.१ ४.० एक्स 10-3 ७.१ एक्स 10-2
फैली cardiomyopathy 14 ०.१ ७.६ एक्स 10-3 १.२ एक्स 10-1
ंयूरॉन समारोह
दीर्घकालिक potentiation 11 ०.१ १.५ एक्स 10-2 १.४ एक्स 10-1
संकेतन
MAPK संकेतन मार्ग ३५ ०.२ २.४ एक्स 10-4 ९.९ एक्स 10-3
कैल्शियम संकेतन मार्ग 22 ०.१ १.२ एक्स 10-2 १.४ एक्स 10-1
Chemokine संकेतन मार्ग 21 ०.१ १.२ एक्स 10-2 १.३ एक्स 10-1
कैंसर
कैंसर में रास्ते ४२ ०.३ ४.१ एक्स 10-5 ३.४ एक्स 10-3
तंत्रिकाबंधार्बुद 15 ०.१ ४.४ एक्स 10-5 २.४ एक्स 10-3
गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर 10 ०.१ ७.९ एक्स 10-3 १.१ एक्स 10-1
कोलोरेक्टल कैंसर 13 ०.१ ८.४ एक्स 10-3 १.१ एक्स 10-1
पुरानी माइलॉयड ल्यूकेमिया 12 ०.१ १.२ एक्स 10-2 १.३ एक्स 10-1

तालिका 4: चूहे से पहचाने गए DMRs के KEGG मार्ग विश्लेषण मिथाइल-Seq ।

Discussion

इस अध्ययन में हमने चूहे के जीनोम के लिए मिथाइल-Seq प्लेटफॉर्म तैयार किया और उसे कार्यान्वित कर रहे हैं. तनाव का एक चूहा मॉडल के साथ अपनी उपयोगिता का प्रदर्शन करके, हम प्रदर्शन किया है कि प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक पाइपलाइन दो तुलना समूहों के बीच विभेदक methylated क्षेत्रों प्रदान कर सकते हैं ।

मंच के एक सफल कार्यांवयन सुनिश्चित करने के लिए, कई महत्वपूर्ण कदम को मनाया जाना चाहिए । पहला, प्रारंभिक डीएनए गुणवत्ता और मात्रा अंतिम मिथाइल-Seq पुस्तकालय की गुणवत्ता और मात्रा पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है । हम एक fluorometer, बजाय एक spectrophotometer का इस्तेमाल किया, यह सुनिश्चित करने के लिए कि हमारे डीएनए माप दोहरे असहाय डीएनए की मात्रा वर्तमान प्रतिबिंबित । के रूप में आणविक आकार और बाल काटना और एडाप्टर बंधाव के बाद के बाद डीएनए की मात्रा को मापने के लिए किया गया था विश्लेषक । इन चरणों के बीच आणविक आकार "shift" की पुष्टि करने के बाद चरणों में एडाप्टर मध्यस्थता पीसीआर से गुजरना होगा कि प्रत्येक डीएनए टुकड़ा के सिरों पर एडेप्टर की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है. एडाप्टर बंधाव चरण के अंत में शेष डीएनए की मात्रा भी महत्वपूर्ण है, के बाद से कम से १०० पुस्तकालय उत्पाद के एनजी इस कदम पर की जरूरत है सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त मात्रा लक्ष्य संवर्धन और bisulfite रूपांतरण चरणों के बाद उपलब्ध है । पुस्तकालय को अगली पीढ़ी के sequencer पर बाद में clustering के लिए ठीक से पतला किया जा सकता है ताकि एक अंतिम उच्च संवेदनशीलता माप निर्मित मिथाइल-Seq पुस्तकालय पर किया गया था । अंत में, bisulfite pyrosequencing विश्लेषणात्मक पाइपलाइन की सटीकता का आकलन करने के लिए एक उच्च मात्रात्मक, स्वतंत्र विधि के रूप में नियोजित किया गया था । अंतिम सत्यापन का उपयोग कर मूल नमूनों और अतिरिक्त जानवरों का उपयोग कर प्रतिकृति सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम है कि प्रयोग डीएनए मिथाइल में जैविक रूप से महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता लगा सकते हैं ।

हम भी प्रोटोकॉल से विचलन की स्थिति में कई दिशानिर्देश शामिल हैं या समस्याओं का सामना कर रहे हैं । सबसे पहले, यह अंत की मरंमत के दौरान बहुत अधिक डीएनए खोने के लिए संभव है, अनुकूलक बंधाव, या चुंबकीय मनका शुद्धि कदम । वैकल्पिक रूप से, डीएनए की मात्रा शुरू छोटे हो सकता है (< 200 एनजी) सीमित ऊतक/डीएनए की उपलब्धता या इस तरह के प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटाई के रूप में विभिंन संवर्धन विधियों के कार्यांवयन के कारण । दो पुस्तकालय प्रवर्धन कदम के दौरान चक्र संख्या में वृद्धि के लिए पुस्तकालय निर्माण प्रोटोकॉल भर में डीएनए या कम शुरू डीएनए राशि के अत्यधिक नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति करने में सक्षम हो सकता है । हालांकि, नहीं एक अतिरिक्त 2 से अधिक-3 चक्र की सिफारिश कर रहे हैं, के रूप में अत्यधिक प्रवर्धन टेंपलेट डुप्लिकेट की संख्या में वृद्धि के लिए नेतृत्व की संभावना है अनुक्रम जा रहा है । इन डुप्लिकेट्स को प्रतिशत मिथाइल परिकलनों में पक्षपात को रोकने के लिए संरेखण चरण के दौरान छोड़ दिया जाता है । दूसरा, अगर औसत डीएनए आकार से अधिक 30 बीपीएस द्वारा वृद्धि नहीं करता है, यह सुनिश्चित करें कि रिएजेंटों नए हैं, के रूप में टी-4 डीएनए पोलीमरेज़, Klenow, और/ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रतिस्थापन एजेंट उपयोग किए जा सकते हैं ।

इसके अतिरिक्त, यह अनुमान लगाया DMRs pyrosequencing द्वारा सत्यापित नहीं हो सकता है कि संभव है, जहां डीएनए मिथाइल मतभेद मौजूद नहीं है या विश्लेषण द्वारा भविष्यवाणी की तुलना में काफी कम हैं । उंमीदवार क्षेत्रों के गरीब मांयता कई जीनोम के लिए बहुत आम समस्या है व्यापक विश्लेषण, जैसे जब pyrosequencing परिणाम अंतर मिथाइल की पुष्टि नहीं करते है या प्रभाव का आकार है कि विश्लेषण के द्वारा भविष्यवाणी की तुलना में बहुत छोटा है । BSmooth एक विश्लेषणात्मक पैकेज है कि "चिकनी" एकाधिक CpGs की एक खिड़की के पार में मिथाइल का स्तर है । वर्तमान प्रयोग के लिए, BSmooth एक DMR जिसका मिथाइल स्तर bisulfite pyrosequencing द्वारा मांय किया गया फंसाया । हालांकि, वहां की संभावना BSmooth और pyrosequencing द्वारा सत्यापित उन द्वारा अनुमानित मिथाइल स्तर के बीच विसंगतियों होगा । विसंगतियों को स्मूथिंग फंक्शन से उत्पंन होता है जो एक DMR के भीतर CpGs के सभी भर में औसत मिथाइल मूल्यों का अनुमान लगाता है, जिसमें लगातार CpGs है जो डीएनए मिथाइल में ५०% से अधिक या CpGs से अलग हो सकती है जिनके कारण मिथाइल मूल्यों को छोड़ दिया गया था उप-थ्रेशोल्ड गहराई पढ़ें. आर-MethylKit24 के रूप में संकुल CpGs के छोटे खिड़कियों या यहां तक कि एकल CpGs जिनकी मिथाइल स्तर pyrosequencing द्वारा मांय उन लोगों के साथ सहसंबंधी बनाना पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विभिंन संकुल को लागू करने और उनके अनुमानित क्षेत्रों या pyrosequencing द्वारा अंतर मिथाइल के CpGs परीक्षण डेटा की मजबूती सुनिश्चित करेगा । वैकल्पिक रूप से, मूल मिथाइल-Seq लायब्रेरीज़ को पढ़ने और पढ़ने की गहराई बढ़ाने के लिए पढ़ी गई फ़ाइलों में जोड़ा जा सकता है । के बाद से मिथाइल स्तर के निर्धारण अर्द्ध मात्रात्मक और पढ़ता है की संख्या से तय कर रहे है [(# of CpGs)/(# of TpGs + CpGs)], एक दिया CpG के लिए पढ़ने की गहराई बढ़ाने के अपने प्रतिशत मिथाइल मूल्य की सटीकता में वृद्धि होगी । इस अध्ययन में, हम केवल CpGs जिसका मिथाइल मूल्यों को कम से निर्धारित किया गया था दस पढ़ता है और प्रत्येक CpG के लिए 19x की एक समग्र पढ़ें कवरेज हासिल की ।

चूहे मिथाइल-Seq प्लेटफॉर्म अपनी सीमाओं के बिना नहीं है । हालांकि यह पूरे जीनोम bisulfite अनुक्रमण से अधिक लागत प्रभावी है, यह काफी अंय तरीकों की तुलना में अधिक महंगा है । फिर भी, लागत का सबसे sequencer पर गलियों की खरीद के लिए और कब्जा प्रणाली के लिए नहीं था । पर निर्भर करता है पढ़ें गहराई आवश्यक है, के साथ पार ऊतक तुलना की आवश्यकता कम बड़ी के कारण (25-70%) मतभेद12 डीएनए मिथाइल में, लागत प्रति लेन और अधिक नमूनों को मल्टीप्लेक्स द्वारा कम किया जा सकता है और एक उच्च क्षमता मंच का उपयोग कर । इसके अलावा, नमूना तैयारी अन्य तरीकों की तुलना में अधिक समय लेने वाली है. जबकि अन्य pulldown दृष्टिकोण है कि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण शामिल करने के लिए समान, जोड़ा bisulfite रूपांतरण और शुद्धि चरणों कार्य लोड करने के लिए जोड़ें. कुल मिलाकर, मिथाइल-Seq मंच पूरे जीनोम अनुक्रमण करने के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प है और अधिक से अधिक २,३००,००० CpGs, जो microarray आधारित प्लेटफार्मों द्वारा परख उन से काफी अधिक है पर आधार जोड़ी संकल्प प्रदान करता है । तारीख करने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव और माउस मिथाइल-Seq प्लेटफार्मों को समूल मस्तिष्क में25,26, माउस ब्रेन9में neurodevelopmental जीन, और रक्त-मस्तिष्क में अल्कोहल पर निर्भर परिवर्तन दस्तावेज़ का इस्तेमाल किया गया है ग्लुकोकोर्तिकोइद का लक्ष्य10. इसके अलावा, प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा अनुक्रम मांयता की परवाह किए बिना विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित करने की क्षमता यह पार प्रजातियों की तुलना के लिए एक आदर्श मंच बनाता है । इस अध्ययन के लिए, हमने चूहे के लिए मिथाइल-Seq प्लेटफ़ॉर्म तैयार किया है, जिसके लिए जीनोम-वाइड methylomic टूल के लाभ के बिना कई औषधीय, चयापचयी और व्यवहारिक प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाता है । हमारे डेटा बताते है कि यह तनाव का एक चूहा मॉडल में DMRs का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और ऐसे समग्र प्लाज्मा कोर्ट के स्तर के रूप में अंय शारीरिक मानकों को संबद्ध ।

मिथाइल-Seq प्लेटफार्म उन अनुक्रमित जीनोम के साथ पशुओं में epigenetic प्रयोगों के लिए आदर्श है जिनके पास नियामकीय क्षेत्रों का दस्तावेजीकरण पर्याप्त प्रायोगिक प्रमाण नहीं है । जब ऐसे क्षेत्र उपलब्ध कराए जाते हैं, तो अतिरिक्त क्षेत्र कस्टम-डिज़ाइन और वर्तमान संस्करण से अनुलग्न हो सकते हैं । इसके अलावा, मंच तुलनात्मक जीनोमिक्स के लिए आदर्श है, के बाद से लक्ष्य संवर्धन प्रतिबंध एंजाइम मांयता द्वारा विवश नहीं है । उदाहरण के लिए, किसी भी जीन के प्रवर्तक क्षेत्र के हित की परवाह किए बिना कब्जा किया जा सकता है कि क्या यह एक विशिष्ट प्रतिबंध साइट बंदरगाह । इसी तरह, किसी भी नियामक क्षेत्रों, जैसे माउस या मानव में पहचाने गए, जो ब्याज के जीनोम में संरक्षित कर रहे है पर कब्जा किया जा सकता है ।

Disclosures

पांडुलिपि टेक्नोलॉजीज टेक्नोलॉजीज से एक प्रतियोगिता पुरस्कार का हिस्सा है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन NIH ग्रांट MH101392 (RSL) और निंनलिखित पुरस्कार और नींव से समर्थन द्वारा वित्त पोषित किया गया: एक NARSAD युवा अन्वेषक पुरस्कार, मार्गरेट ऐन कीमत अन्वेषक कोष, जेंस वाह मूड विकारों विद्वान कोष के माध्यम से चार्ल्स टी. Bauer फाउंडेशन, बेकर फाउंडेशन, और परियोजना मैच फाउंडेशन (RSL) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Radioimmuno assay (RIA) MP Biomedicals 7120126 Corticosterone, 125I labeled
Master Pure DNA Purification Kit Epicentre/Illumina MC85200
Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath USA Scientific 2510-1102 Used with 1.5 mL tubes
Vortex Genie 2 Fisher 12-812 Vortex Mixer
Ethyl alcohol, Pure Sigma-Aldrich E7023 100% Ethanol, molecular grade
Centrifuge 5424 R Eppendorf - Must be capable of 20,000 x g
Qubit 2.0 ThermoFisher Scientific Q32866 Fluorometer
Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher Scientific Q32850
Qubit dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Scientific Q32851 High sensitivity DNA detection reagents
Qubit Assay Tubes ThermoFisher Scientific Q32856
SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit Agilent Technologies G9651A Reagents for preparing the Methyl-Seq library
SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library Agilent Technologies 931143 RNA baits for enrichment of rat targets
IDTE, pH 8.0 IDT DNA 11-05-01-09 10 mM TE, 0.1 mM EDTA
DNA LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021
Covaris E-series or S-series Covaris - Isothermal sonicator
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25) Covaris 520045
Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade) Quality Biological 351-029-721
Veriti 96 Well-Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA-Binding magnetic beads
96S Super Magnet ALPAQUA A001322 Magnetic plate for purification steps
2200 TapeStation Agilent Technologies G2965AA Electrophresis-based bioanalyzer
D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5582
D1000 ScreenTape High Sensitivity Agilent Technologies 5067-5584
D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5583
D1000 Reagents High Sensitivity Agilent Technologies 5067-5585
DNA110 SpeedVac ThermoFisher Scientific - Vacuum Concentrator
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads Invitrogen 65601 Streptavidin magnetic beads
Labquake Tube Rotator ThermoFisher Scientific 415110Q Nutator Mixer is also acceptable
EZ DNA Methylation-Gold Kit Zymo Research D5006 Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers
Illumina Hi-Seq 2500 Illumina - Next-generation sequencing machine
PCR and Pyrosequencing Primers IDT DNA Variable
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units New England BioLabs M0267L
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set New England BioLabs N0446S
Pyromark MD96 QIAGEN - Pyrosequencing machine
Ethyl Alcohol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200 70% Ethanol solution
Sodium Hydroxide Pellets Sigma-Aldrich 221465 0.2 M NaOH denature buffer solution
Tris (Base) from J.T. Baker Fisher Scientific 02-004-508 10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution
PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96) QIAGEN 972807 Reagents required for pyrosequencing
PyroMark Annealing Buffer QIAGEN 979009
PyroMark Binding Buffer (200 mL) QIAGEN 979006
Streptavidin Sepharose High Performance Beads GE Healthcare 17-5113-01 Streptavidin-coated sepharose beads
PyroMark Q96 HS Plate QIAGEN 979101 Pyrosequencing assay plate
Eppendorf Thermomixer R Fisher Scientific 05-400-205 Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207)
SureDesign Website Agilent Technologies - Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)
UCSC Genome Browser University of California Santa Cruz - rat Nov 2004 rn4 assembly
Agilent Methyl-Seq Protocol Agilent Technologies - https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf

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जैव रसायन अंक १४० Epigenetics डीएनए मिथाइल चूहा मिथाइल-Seq तनाव neuroendocrinology
एक चूहा मिथाइल-Seq मंच तनाव जोखिम से जुड़े Epigenetic परिवर्तन की पहचान करने के लिए
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Carey, J. L., Cox, O. H., Seifuddin, … More

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