Biochemistry
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एक चूहा मिथाइल-Seq मंच तनाव जोखिम से जुड़े Epigenetic परिवर्तन की पहचान करने के लिए
Chapters
Summary October 24th, 2018
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यहां, हम मिथाइल-Seq, एक epigenomic मंच के प्रोटोकॉल और कार्यांवयन का वर्णन करते हैं, जो पुराने तनाव के जोखिम से जुड़े epigenetic परिवर्तनों को पहचानने के लिए एक चूहे के मॉडल का उपयोग करते हैं । परिणाम प्रदर्शित करता है कि चूहे मिथाइल-Seq मंच मिथाइल मतभेद है कि चूहों में तनाव जोखिम से उत्पंन का पता लगाने में सक्षम है ।
Transcript
यह विधि डीएनए मिथाइलेशन पर पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए अनुक्रमण-आधारित उपकरण को डिजाइन और लागू करने का प्रदर्शन करके एपिजेनोमिक्स क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों का उत्तर देने में मदद कर सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह सरणी-आधारित प्लेटफार्मों की तुलना में डीएनए मिथाइलेशन स्तर का आकलन करने के लिए अधिक व्यापक और मात्रात्मक विधि प्रदान कर सकता है। इस तकनीक के निहितार्थ किसी भी जीव में विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं के कारण डीएनए मिथाइलेशन परिवर्तनों की पहचान की ओर विस्तार करते हैं, जिनके अनुक्रम डेटा उपलब्ध हैं।
हालांकि इस विधि डीएनए मिथाइलेशन पर तनाव के प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, यह भी इस तरह के उच्च वसा आहार और मधुमेह और हृदय रोग के रूप में शर्तों में पर्यावरण विषाक्त पदार्थों के लिए जोखिम के रूप में अंय पर्यावरणीय कारकों या शारीरिक स्थितियों के लिए लागू किया जा सकता है । डीएनए कतरनी और bioanalyzer के माध्यम से आकार की पुष्टि करने के बाद, प्रत्येक नमूने के लिए डीएनए बाध्यकारी चुंबकीय मोती के १८० माइक्रोलीटर जोड़ें, और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट । एक चुंबकीय प्लेट पर मोतियों को गोली दें, और सुपरनैंट को हटा दें।
70% इथेनॉल के 200 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। इसके बाद, मोतियों को गोली मारने के लिए एक चुंबकीय प्लेट का उपयोग करें, और जितना संभव हो उतना इथेनॉल हटा दें। तीन से पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हीट ब्लॉक में मोतियों को सुखाएं।
फिर, न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 44 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें, और सुपरनेटेंट के लगभग 42 माइक्रोलीटर एकत्र करें। एडाप्टर को लिगामेंट करने और बायोएनालाइजर के माध्यम से लिगेशन की पुष्टि करने के बाद, नमूनों को कम डीएनए-बाध्यकारी माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। फिर, 3.4 माइक्रोलीटर से नीचे के नमूने की मात्रा को कम करने के लिए एक गर्म वैक्यूम सांडर का उपयोग करें।
इसके बाद, प्रत्येक नमूने में मिथाइल-सेक्यू ब्लॉक मिक्स के 5.6 माइक्रोलीटर जोड़ें, और उन्हें थर्मल साइकिलर में इनक्यूबेट करें। टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार कैप्चर लाइब्रेरी हाइब्रिडाइजेशन मिक्स तैयार करें। फिर, प्रत्येक नमूने में कैप्चर लाइब्रेरी हाइब्रिडाइजेशन मिक्स के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें, और 16 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन अवधि के अंत में, एक नई आठ-अच्छी पट्टी ट्यूब में प्रति नमूना स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों के 50 माइक्रोलीटर जोड़कर स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोती तैयार करें। मिथाइल-सेक बाइंडिंग बफर के 200 माइक्रोलीटर के साथ मोतियों को धोएं। स्ट्रिप ट्यूब को चुंबकीय प्लेट पर रखें, और मोतियों से सुपरनिटेंट निकालें।
फिर, मिथाइल-सेक बाइंडिंग बफर के 200 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें। धोया स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों में नमूनों को जोड़ें, और उन्हें घूर्णन मिक्सर पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। जबकि नमूने मिश्रण, मिथाइल के aliquot २०० माइक्रोलीटर-Seq धोने बफर दो एक ९६ अच्छी तरह से थाली के त्रिपालित कुओं में और पूर्व गर्म करने के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस ।
नमूनों के इनक्यूबेट के बाद चुंबकीय मोतियों को चुंबकीय प्लेट से दागें और सुपरनैंट को हटा दें। फिर, मिथाइल-सेक वॉश बफर वन के 200 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मोतियों को इनक्यूबेट करें, और सुपरनैंट को हटाने के लिए एक चुंबकीय प्लेट का उपयोग करें।
इसके बाद, प्री-वार्म्ड वॉश बफर टू के 200 माइक्रोलीटर में मनका गोली को फिर से खर्च करें। फिर, मोतियों को गोली मारने के लिए चुंबकीय प्लेट का उपयोग करने से पहले एक थर्मल साइकिलर में मोतियों को इनक्यूबेट करें। धोया मोतियों के लिए मिथाइल-Seq Elution बफर के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें, और उन्हें 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
मोतियों को गोली मारने के लिए एक चुंबकीय प्लेट का उपयोग करें, और सुपरनिटेंट को एक नई स्ट्रिप ट्यूब में स्थानांतरित करें। सबसे पहले, पहले एकत्र किए गए सुपरनेट में बिसुलफिट कन्वर्जन रिएजेंट के 130 माइक्रोलीटर जोड़ें। 150-माइक्रोलीटर प्रतिक्रियाओं को समान रूप से दो कुओं में विभाजित करें।
फिर, थर्मल साइकिलर में प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें। स्पिन कॉलम के नमूनों को बांधने के लिए बाइंडिंग बफर के 600 माइक्रोलीटर का उपयोग करें, और वॉश बफर के 100 माइक्रोलीटर के साथ कॉलम धोएं। फिर, स्तंभों को अपकेंद्रित्र करें, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
इसके बाद, कॉलम में डिसल्फोशन बफर के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर 15 से 20 मिनट के लिए स्तंभों को इनक्यूबेट करें। वॉश बफर के 200 माइक्रोलीटर के साथ कॉलम को दो बार धोएं।
फिर, कॉलम में एल्यूशन बफर के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट, और अपकेंद्रित्र। टेक्स्ट प्रोटोकॉल के हिसाब से पीसीआर रिएक्शन मास्टर मिक्स तैयार करें।
फिर, प्रत्येक नमूने में मास्टर मिश्रण के 82 माइक्रोलीटर जोड़ें, और एक थर्मल साइकिलर में नमूनों को इनक्यूबेट करें। सबसे पहले टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार पीसीआर मास्टर मिक्स टू को बर्फ पर तैयार करें। फिर, प्रत्येक नमूने में, पीसीआर मास्टर मिक्स दो के 25.5 माइक्रोलीटर जोड़ें और वाणिज्यिक अनुक्रमण प्राइमर के पांच माइक्रोलीटर, और एक थर्मल साइकिलर में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
एक बायोएनालाइजर पर उच्च संवेदनशीलता डीएनए डिटेक्शन रिएजेंट्स के साथ नमूनों की डीएनए एकाग्रता का आकलन करें। मिथाइल-एसईक्यू पुस्तकालयों को अगली पीढ़ी के अनुक्रमक पर अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत किया जाता है। बिसुलफाइड बदलने और पीसीआर के सत्यापन के नमूनों को बढ़ाने के बाद, बाइंडिंग बफर, पानी और स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित सेफारोज मोतियों के साथ एक मास्टर मिश्रण तैयार करें।
इसके बाद 96-वेल प्लेट में मास्टर मिक्स के 75 माइक्रोलीटर और नेस्टेड पीसीआर प्रोडक्ट के पांच माइक्रोलीटर डालें और प्लेट को 15 से 60 मिनट तक प्लेट शेकर पर हिलाएं। जबकि प्लेट हिलाता है, एक पायरोसक्वेंसीइंग परख प्लेट के कुओं में प्राइमर के 12 माइक्रोलीटर जोड़ें। मिलाने के बाद, पानी से भरे गर्त में एक वैक्यूम उपकरण रखें, फिर उपकरण को बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं के साथ प्लेट में रखें।
इसके बाद, वैक्यूम टूल को 70% इथेनॉल, सोडियम हाइड्रोक्साइड और ट्रिस-एसीटेट बफर युक्त आधे भरे गर्त में जलमग्न करें। वैक्यूम डिस्कनेक्ट करें, और मोतियों को स्थानांतरित करने के लिए एचएस पायरोसक्वेंसीइंग परख प्लेट में वैक्यूम टूल रखें। प्लेट को हीट ब्लॉक पर रखें, और दो मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
अंत में, प्लेट को पायरो कार्यक्रम शुरू करने से पहले पांच मिनट तक ठंडा करने की अनुमति दें। इस प्रोटोकॉल में, मिथाइल-सेक्यू पुस्तकालयों के विश्लेषण ने तनावग्रस्त और अस्ट्रेस्ड जानवरों के बीच अंतरमिथाइलेटेड क्षेत्रों, या डीएमआर की एक रैंक सूची प्रदान की और DMRs के एक चित्रमय भूखंड। बिसुलफिट पाइरोसक्वेंसी के माध्यम से सत्यापन से पता चला कि तनावग्रस्त जानवरों ने सभी सीपीजी में उच्च मिथाइलेशन स्तर प्रदर्शित किया।
सीपीजी 10 में मिथाइलेशन का स्तर भी प्रत्येक जानवर के लिए मतलब तीन सप्ताह के कॉर्ट स्तरों की तुलना में किया गया । परिणाम इंगित करते हैं कि एंडोक्राइन और मिथाइलेशन डेटा के बीच मामूली संबंध है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, डीएनए कतरनी और एडाप्टर लिगेशन चरणों के बीच औसत डीएनए आकार में वृद्धि की तुलना करना और अनुक्रमण से पहले पर्याप्त पुस्तकालय मात्रा सुनिश्चित करना याद रखना महत्वपूर्ण है।
इस प्रक्रिया के बाद, अन्य समान दृष्टिकोणों को उपन्यास प्रश्नों का उत्तर देने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि चूहा न्यूरोडेवलपमेंट पर पर्यावरणीय विषाक्त पदार्थों का प्रभाव। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने एपिजेनेटिक्स के क्षेत्र में शोधकर्ताओं को किसी भी गैर-मॉडल या मॉडल जीवों में जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन परिवर्तनों का पता लगाने के लिए साधन प्रदान किए जहां जीनोमिक दृश्य उपलब्ध हैं। यह न भूलें कि तापमान के प्रति संवेदनशील एंजाइमों के साथ काम करने के लिए शून्य से 20 डिग्री फ्रीजर में उपयोग और भंडारण के दौरान बर्फ पर भंडारण की आवश्यकता होती है।
लक्ष्य पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल आरएनए मोती बर्फ पर विगलन और भंडारण की आवश्यकता है, जबकि उपयोग में और शूंय से ८० डिग्री फ्रीजर में दीर्घकालिक भंडारण ।
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