Summary
该方案的目标是使用所述标记识别肝脏内的淋巴管内皮细胞群。我们利用胶原酶 iv 和 dnase 和组织的温和切碎, 结合流式细胞仪, 以确定一个独特的淋巴内皮细胞的群体。
Abstract
在肝脏内, 淋巴血管被发现在门静脉三位一体, 其描述的功能是去除间质液体从肝脏到淋巴结, 在那里细胞碎片和抗原可以被调查。我们非常有兴趣了解淋巴血管可能如何参与肝脏内的炎症和免疫细胞功能。然而, 很少有发现建立消化方案, 用于分离淋巴内皮细胞 (lec) 从肝脏或特定的标记, 可用于评估肝脏 lec 的基础上, 每个细胞。因此, 我们优化了肝脏消化和染色的方法, 以评估肝脏中的 lec 群体。我们相信, 这里概述的方法将有助于识别和隔离肝脏中的 lec, 并将加强我们对 lec 如何响应肝脏微环境的理解。
Introduction
淋巴管和 lec 在肝脏中的作用尚不清楚。虽然淋巴血管被发现在肝1的门静脉三位一体和扩大期间的疾病 2, 很少了解在肝脏内的 lec 的功能和表型。随着主要在 lecs3上发现的标记物的发现, 这些细胞在不同组织位中的重要性将在稳态和疾病中填补我们理解中的一个重大空白。lec 通过与 t 细胞4、5、6、7、8、9,10,11,12,13. 淋巴结中的 lec 可通过与迁移的树突状细胞14、15、16的相互作用来促进保护性免疫。因此, 有多个角色的 loec, 这可能是特定的组织和相互作用, 其中存在。然而, 对 lec 如何与组织中的免疫细胞相互作用或 lec 如何在不同器官系统中发挥作用的了解很少;因此, 在肝脏或其他器官内的每个细胞的基础上评估 lec 可能会导致 lec 如何编程组织特异性免疫的进步。虽然许多关注肝脏中 lec 的文献都使用显微镜来可视化 lec, 使用一个或两个标记和形态学 17, 但通过一项研究, 很少用流式细胞仪在细胞上专门评估细胞上的 lec评估了肝窦内皮细胞 (lsecs) 和lec 18之间的差异。通过流式细胞仪分析肝脏中的 lec 群体, 可以深入研究正常稳态或疾病期间的 lec 表型。
为了通过流式细胞仪评估 lec, 需要多个表面标记。通常情况下, lec 是可视化的表达与繁荣相关的同源毒素 1 (prox-1), 淋巴管内皮透明质酸受体 1 (lyve1) 或血管生长因子受体 3 (vegfr3) 使用显微镜。然而, 在肝脏中, 这些标记的表达并不局限于 lec。prox-1 在肝脏发育、再生和损伤19过程中广泛由肝细胞表达, lyve1 和 vegfr3 由肝正弦内皮细胞18表达。在淋巴结中, 利用流式细胞术将 lec 确定为分化 (cd) cd45 (cd31 +)、cd31 + 和 podoplanin + (pdpn)16。然而, 这种方法是太小, 无法分离肝脏中的 lec, 因为 cd45-cd1+ 细胞将捕获内皮细胞, 而肝脏中的血管内皮细胞的主要群体是 lsec。因此, 需要其他标记来区分罕见的 lec 人口和丰富的 lsec 人口。ccux32 (由成熟的 lsecs18表达) 和 cd146 (一种常见的血管内皮细胞标记, 主要由肝脏窦内皮细胞20在肝脏窦内表达, 几乎没有淋巴表达内皮细胞21) 是候选标记。
因此, 我们利用上述标记 cd45、cd31、cd146、cc到146和 pdpn 对肝脏中的 lec 进行了隔离和可视化的方法, 用于流式细胞术。我们描述了使用胶原酶 iv, dnase 1, 和机械分离肝脏组织消化成单细胞悬浮液。我们还描述了使用碘沙诺密度梯度分离非实质细胞 (npc) 和消除细胞碎片。最后, 利用多个标记, 我们确定了以 pdpn 为主要标记的最佳流式细胞术分控策略, 以肝脏中的 lec 为主要标记。
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Protocol
这里描述的所有方法都已得到科罗拉多大学安舒茨医学校园动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。
1. 材料的制备
- 在磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中制备 dnase i 的 5 mgml 溶液。
- 在点击的 ehaa 培养基中加入 5, 000 u\ l 胶原酶 iv, 制作消化混合物。
- 使用前, 将消化混合物在37°c 下加热30分钟。
- 在汉克斯平衡盐溶液 (hbss) 中加入4.8% 的牛血清白蛋白 (bsa) 和 2 mm 乙二胺四乙酸 (edta), 建立隔离缓冲液。
- 加入 100 mm 氯化铵、10 mm khco 3 和 0.1 mm edta 蒸馏 h2o, 制成红细胞 (rbc) 裂解缓冲液.
2. 从小鼠肝脏制备单细胞悬浮液
- 用 co2 和颈椎脱位对小鼠进行安乐死。
- 用70% 的乙醇把老鼠喷下来弄湿它的皮毛。将鼠标的脚与解剖板上。
- 使用解剖剪刀将肛门上方约1厘米处的皮肤切割, 小心只穿过皮肤 (约1毫米)。用齿形钳将皮肤从身体上拉出, 并将剪刀插入皮肤和腹膜之间。打开剪刀将皮肤与腹膜分开, 然后将皮肤从切口切割到颈部。
- 用每个手臂下和每条腿上方的一针将皮肤固定在解剖板上。向上拉腹腔囊, 向上切向颈部。抓住肝脏的裂片, 在胸骨下面切。
注意: 如果任何肝脏将用于免疫组织化学 (ihc), 则应注意。 - 切周围的肝脏, 并从鼠标中取出肝脏, 并将其放置在4毫升的 click 的 ehaa 介质。
- 使用手术刀, 将肝脏切成约1毫米直径的碎片。
- 在肝脏中加入500μl 的消化混合物和500μl 的 dnase i (2mg/ml)。
- 在37°c 下将肝脏产肝30分钟。15分钟后, 使用5毫升移液器混合液体。
- 孵育30分钟后, 通过100μm 过滤器将消化后的样品转移到50毫升锥形管。
- 用1毫升注射器的柱塞轻轻推动剩余的部件通过过滤器。
- 用5毫升的隔离缓冲液清洗过滤器, 然后用1毫升注射器的柱塞后部轻轻推动组织通过过滤器。重复此操作, 直到使用25毫升的隔离缓冲液清洗过滤器。
- 以 400 x g离心细胞 5分钟, 小心地从上清液中吸气。
- 用 rbc 裂解缓冲液4毫升对颗粒进行再利用。在室温下将细胞孵化5分钟。
- 用10毫升的隔离缓冲液和离心机在 400 x g下清洗牢房5分钟。
- 计数血细胞仪上的细胞, 以确定完整的肝脏计数。
- 在20% 碘沙诺的5毫升中再移植细胞, 并将其分层为1毫升的 pbs。
- 在没有刹车的情况下, 以 300 x g离心电池15分钟。
- 取下 pbs 和碘沙诺之间的层, 通过100μm 过滤器将其放入新的 50 ml 锥形管中。
- 用10毫升的隔离缓冲液和离心机在 400 x g下清洗牢房5分钟。
- 用2% 的胎牛血清 (fbs) 丢弃上清液, 在500μl 的 pbs 中重新悬浮细胞。
3. 肝脏单细胞的流式细胞仪分析
- 使用血细胞仪和显微镜对细胞进行计数, 使用色氨酸蓝色排除来测量活细胞。将10μl 的细胞加入10μl 的色氨酸蓝, 并立即将其放置在血细胞计上, 并在显微镜下计数活细胞 (不是蓝色)。然后, 计算每微升的细胞数。
- 将剩余的非实质细胞中的大约500万个倾斜成96孔板的一口井。
- 以 400 x g离心细胞5分钟。
- 放弃上清液, 用2% 的 fbs 在90μl 的 pbs 中重新悬浮细胞。
- 加入反 cd45 (1: 200)、反 cd146 (1: 200)、反 cd31 (1: 200) 和 pdpn (1: 200), 在 10x2.4 g2 的10μl 或反 cc1632 (1:200) 中稀释。
请注意:在使用抗 cc162 标记抗体时, 不使用 fc 阻滞 (2.4 g2)。 - 要确定应设置正门和负门的位置, 请为每种颜色添加荧光减一 (fmo) 染色, 并添加同型对照抗体。
- 要确定活细胞和死细胞, 用活力标记染色 (例如, 幽灵红色 780)。在4°c 下将细胞培养30分钟。
- 用2% 的 fbs 用100μl 的 pbs 清洗细胞。
- 使用少量的细胞来调整激光和流式细胞仪上的补偿设置。用抗体对每个单独的荧光体和没有任何抗体的荧光体的细胞染色。
请注意:根据所使用的流式细胞仪, 应建立一个补偿矩阵, 以消除光谱重叠。 - 将样品管放在细胞仪探头上, 收集并记录所有事件。
4. 数据分析
- 观察侧散射区与向前散射区, 根据尺寸、粒度和活力标记染料对 "活" 细胞进行门控。
- 接下来, 使用 cd45 明亮紫罗兰510和 cd31 percp cy5.5, 门 cd45-cd11+ 细胞使用同型对照和 fmo 来确定正和负种群。
- 最后, 使用 cd146 v450 或 cc1632 fitc 和 pdpn apc, 取 cd146-pdpn + 或 cc16pn + 细胞, 再次使用同型对照和 fmo, 以确定正和负种群。这些细胞是 loc。
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Representative Results
分析肝脏淋巴管的研究主要是使用免疫组织化学来定量肝脏中淋巴管的频率和直径。然而, 这种方法不允许评价 lec 的细胞的基础上, 细胞的基础上, 或表达多个标记, 细胞因子, 趋化因子, 或转录因子。因此, 我们询问是否可以从肝脏中分离肝脏 lec, 并使用流式细胞仪进行评估。以前的工作分离淋巴结 lec 是使用自由酶 dl (胶原酶-i-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------因此, 使用了相同的肝脏组织消化方案, 或使用胶原酶 iv 和 dnase 1 如前所述, 从肝脏22免疫细胞分离, 并遵循消化与密度梯度分离 (碘沙诺) 步骤去除肝细胞, 增加肝脏内其他细胞类型的频率 (图 1 a)。在肝脏消化和离心的密度梯度后, 用 cd45、cd31、pdpn 和 cc16/32 对细胞进行染色。ccma/32 被描述为由成熟的 lsec 人群表达, 但不是由 lec 人群表达的。因此, lec 被门控为 cd45-、cd31 +、cdpn + 32、pdpn + 细胞, 而 lsecs 被门控为 cd45-、cd31 +、cc16/32+ 和 pdpn-(图 1a)。门被设置在活细胞 (幽灵红色阴性), 并基于同型对照和 fmo 染色 (图 1a)。lyve-1 apc 在 lec 种群上也得到了确认 (图 1b)。这两种方法都允许肝脏内的 lec 种群的可视化;然而, 使用胶原酶 iv 和 dnase 1 时, 细胞的染色谱在视觉上优于胶原酶 i-ii-和溶解酶 (图 1c)。因此, 所有未来的操作都是使用胶原酶 iv 和 dnase 1 执行的, 如协议中所述。使用这种消化方法, 我们平均每克肝脏组织获得约 1, 300个 lec, 或每天真的肝脏获得 2, 200个 lec。
为了优化荧光剂的门控策略和组合, 消除对 lsecs 的污染, 采用了 cc1632 和 cd146。cc1632 是 fc 伽玛受体 ii 和 iii, 在成熟的 lsec 上表达, 但不在 lec18上表达。cc16/32 可以区分 pdpn + cc1632 细胞和 pdpn-cd16/32+ 细胞, 特别是当使用与 apc 或 pe 共轭的 pdpn 和与 fitc 结合的 cc16/32 (图 1C) 时, 但当 pdpn 与 pe-cy7 结合时, 效果较差 (图 1c)。cc1632 的表达式在 lec 上找不到, 而是在 lsec 上找到。fc 块使用 cc16/32 抗体, 以最大限度地减少免疫球蛋白与 fc 受体的 fc 受体结合和非抗原特异性结合。由于 cd16/32 被用于可视化 lsecs, 免疫球蛋白的非特异性结合较高, cd146 被优化为测量 lsecs 的替代品。因此, 我们测试了 cd146 共轭到 v450, 一个血管内皮细胞标记表达高度由 lsec 和其他血管内皮细胞20 , 但低至无表达的 lec23。我们首先使用 fmo 和同型对照优化了 cd146 的染色, 包括 ccma/32 和 cd146 (图 2a)。如果我们只评估 cc16/32+ 细胞或 cc16/32-细胞, cd16/32+ 细胞均为 cd146 + 和 pdpn-而 cd16/32-细胞主要为 cdpn-或 pdpn + (图 2b)。为了证实这一染色, 使用了 fmo。通过去除污渍中的 pdpn, pdpn + 种群消失了 (图 2c)。有趣的是, 没有 cd146 + pdpn + 细胞, 证实 cd146 没有或很低的表达的 pdpn + lec。因此, 我们相信, 这两个标记中的任何一个都可以用来门出肝脏中的血管内皮细胞。
为了进一步验证 pdpn 是 lec 的适当标记, 对小鼠肝脏切片进行了 pdpn (绿色) 和 fn 80 (棕色) 染色 (图 3a)。血管内皮和巨噬细胞均未在小鼠肝脏中表达 pdpn。我们还能够区分胆管细胞, 这可以染色阳性的 pdpn, 从淋巴管, 基于胆管的独特核结构和细胞角蛋白7染色 (图 3b; 红色: 细胞角蛋白 7, 绿色: pdpn)。由于多种标记用于流式细胞术, 如 cd31, 这不是由胆管细胞24表达, 我们相信, 我们正在从分析中删除这些细胞, 从而确认从肝脏的细胞是 cd45-, cd331, cd146lo neg、ccma/32-和 pdpn + 是 lec。最后, 为了提供染色细胞是 lec 的证据, 我们对这些细胞群体进行了分类, 并利用定性实时聚合酶链反应来评价vegfr3和prox-1表达式。对 vegfr3和prox-1进行了评估, 因为这些转录结果是由肝脏中的其他细胞- -肝细胞表达的 , vegf3 由 lsecs (等人) 表达的--但除了 lec 之外, 没有其他细胞同时表达这两种记录。这两个标记在分类人群中的表达明显高于培养的小鼠巨噬细胞系 (raw264.7), 后者通常不表达这些标记, 但在表达上与培养的小鼠 lec 相似 (图3c).
图 1: 胶原酶 i-ii-溶解酶和胶原酶 iv 消化小鼠肝脏组织的代表性流式细胞仪分析.(a) 此面板显示该过程的门控策略、荧光减去一染色和同型控制。(b) 该面板显示 cdxa32-pdpn + 细胞的 lyve-1 染色。(c) 该面板显示用胶原酶 i-ii-分解酶 (例如, liberase dl) 或胶原酶 iv 消化小鼠肝脏后的最终流式细胞仪门, 并评估 cdmucp x pdpn pe-cy7, 其中 lec 为 cc16s32-和 pdpn +。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: cd146 和 pdpn 作为肝脏淋巴内皮细胞的适当标志物的鉴定.(a) 该面板显示 ccma/32 (左) 和 cd146 (右) 的荧光减和同型对照。(b) 该面板显示由a组确定的32个带门的 ccma/32 个阳性或阴性单元格。显示的是来自这两个群体的 cd146xpdpn。(c) 该面板显示荧光减 1, 用于 pdpn, 以证明在不添加抗体时不存在染色。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 将流动 pdpn + 细胞鉴定为淋巴内皮细胞.(a) 该面板显示了被 pdpn (蓝绿色) 和 fn 80 (棕色) 染色的小鼠肝脏的代表性免疫组织化学。将淋巴管 (lv)、血管 (bv) 和巨噬细胞 (mf) 标记出来。结垢杆 = 100μm. 在二甲苯中, 福尔马林固定石蜡嵌入组织被分离20分钟。通过乙醇梯度将组织水化到水中, 并在高压锅中使用 ph 6 抗原回收缓冲剂进行抗原回收 15分钟, 用 0.1% bsa 阻断组织, 用抗小鼠 pdpn 和抗小鼠 fn80 在房间内1小时进行染色温度。以抗仓鼠 igg hrp 和抗兔 igg hrp 为二级抗体。分别用 3, 3 '-二氨基苯并嗪 (dab) + 和 vina green 检测 F4/80 和 pdpn。组织被血红素反染色, 并在显微镜下成像。(b) 此面板显示与 a 组相同的实验,但此处除外, pdpn 显示为绿色, 细胞角蛋白7显示为红色, 4 ', 6 ', 6-二胺-2-苯基 (dapi) 为蓝色。结垢条 = 100μm. 使用5% 驴和5% 山羊血清阻断组织, 并使用抗小鼠 pdpn (8.1.1) 1: 100 和抗小鼠细胞角蛋白 7 1: 200 在室温下1小时染色。以抗仓鼠 igg af647 和抗兔 igg-pe 为二级抗体。用 dapi 对组织进行了反染色和成像。刻度杆 = 100μm。将淋巴管 (lv)、血管 (bv) 和胆管 (bd) 标记。(c) 该面板显示, 与 raw 细胞或原代淋巴结 lec 相比, 根据协议中的染色 (cd45-、cd31 +、cd146lo/neg和 pdpn +), 分类肝脏 lec 的vegfr3和 prox-1 表达的日志折叠变化. 分枝细胞通过生物聚合物切碎的柱, rna 被提取使用 rna 提取试剂盒, cdna 是使用逆转录酶试剂盒制成的。每个样本的家养基因gapdh都对记录丰度进行了归一化。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
lec 在免疫稳态和调节中的整体重要性最近被曝光25。许多发表的淋巴文献都集中在皮肤和淋巴结上;然而, 淋巴管在全身26被发现 , 因此, 我们需要了解它们在不同器官中的重要性。在这里, 我们展示了一种方法, 其中包括一种逐细胞研究肝脏中的 lec 的方法, 以更好地了解其同时表达的不同表面标记、细胞因子、趋化因子和细胞内蛋白质, 如转录因子。该方法将有助于今后的研究, 以评估表型和功能的列克在肝脏在健康和疾病期间。
与其他细胞类型相比, 肝脏中 lec 的识别障碍之一是其频率相对较低。肝细胞约占肝脏的 80%, 在流式细胞仪上运行肝脏之前, 使用密度梯度 (碘沙诺) 去除这些细胞所需的时间更少, 因此提供了更好的生存能力。为了区分肝脏中 lyve1 + lec 的种群和 lyve1 + lsecs 的数量, 我们使用了在 lsec 上发现的 ccma/32 和 cd146 标记, 并有低到无表达的 lec。这一点, 再加上肝脏中任何其他内皮细胞缺乏或低表达 pdpn, 使我们所确定的人群可以通过流式细胞仪进行验证。事实上, 下游转录分析证实, 这种门控策略产生了 lec (图 3c)。
最好用胶原酶 i-ii-并溶解酶从淋巴结中分离 lec;然而, 我们发现, 虽然这种方法确实从肝脏提取 lec, 肝脏消化方案使用胶原酶 iv 提供了一个更好的下游分析使用流式细胞术。使用肝脏的机械中断可以使胶原酶更多的表面积更好地与细胞外基质相关细胞 (如 lec) 相互作用, 并使用 click 的 ehaa 介质 (不含 fbs), 只需30分钟即可消化肝脏。这缩短的时间保持了流式细胞仪或流式分类等下游检测的 lec 生存能力。事实上, 我们能够恢复足够的活细胞, 通过流式细胞仪和流选法可视化 lec, 用于下游转录分析。
结合, 肝细胞与非实质细胞的分离, 胶原酶 iv 型的使用, 以及肝脏中相关标记和其他内皮细胞群特有标记的澄清和演示, 如 cc16/32 和cd146, 允许正确识别肝脏中的 lec。这些方法填补了关于如何通过流式细胞术识别肝脏中的 lec 的文献中的一个显著空白, 特别是因为肝脏包含许多其他细胞, 这些细胞表达的标记是淋巴结中的 lec 所独有的 (代理 1和蔬菜 3)。因此, 这些方法将导致有关肝脏 lec 功能的下游研究。此外, 该方法可以对其他组织进行改进, 以便更好地评估组织特异性 lec 标记和子集。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢 gi 和肝脏先天免疫计划为这个项目提供的资金支持。b. a. j. t. 的资金也来自 r01 ai121209。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1) | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100 μm cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 mL conical | Truline | TR2004 | |
| 15 mL conical | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µL pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10 mL pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5 mL pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
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