Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist, lymphatische Endothelzellen Populationen innerhalb der Leber mit den beschriebenen Markern zu identifizieren. Wir nutzen Kollagenase IV und DNase und eine sanfte Zerkleinerung des Gewebes, kombiniert mit Durchflusszytometrie, um eine verschiedene Bevölkerung der lymphatische endothelial Zellen zu identifizieren.
Abstract
In der Leber Lymphgefäße befinden sich innerhalb des Portals Dreiklang, und ihre beschriebene Funktion soll interstitielle Flüssigkeit aus der Leber, die Lymphknoten zu entfernen, wo Zelltrümmer und Antigene befragt werden. Wir sind sehr daran interessiert, zu verstehen wie das lymphatische Gefäßsystem in Entzündung und Immunzelle Funktion innerhalb der Leber beteiligt sein könnten. Jedoch sehr wenig veröffentlicht wurden zur Gründung Verdauung Protokolle für die Isolierung von lymphatische Endothelzellen (LECs) aus der Leber oder spezifischer Marker, die verwendet werden, um die Leber zu bewerten LECs pro Zelle. Daher haben wir eine Methode für die Verdauung und das Beflecken der Leber für die Beurteilung die LEC-Bevölkerung in der Leber optimiert. Wir sind zuversichtlich, dass die hier beschriebene Methode nützlich für die Identifizierung und Isolierung von LECs aus der Leber ist und stärkt unser Verständnis wie LECs auf die Leber Mikroumgebung reagieren.
Introduction
Die Rolle der Lymphgefäße und LECs in der Leber ist nicht gut verstanden. Während Lymphgefäße finden Sie unter dem Portal Dreiklang aus der Leber1 und Krankheit2auszubauen, ist sehr wenig über die Funktion und den Phänotyp der LECs innerhalb der Leber verstanden. Mit der Entdeckung von Markern, die in erster Linie auf LECs3gefunden werden, wird die Bedeutung dieser Zellen in verschiedene Gewebe Nischen in Homöostase und Krankheit eine bedeutende Lücke in unserem Verständnis füllen. LECs haben eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz in den Lymphknoten und metastasierten Tumoren durch die Interaktion direkt mit T Zellen4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs in den Lymphknoten können schützende Immunität über ihre Interaktionen mit wandernden dendritischen Zellen14,15,16fördern. Daher gibt es mehrere Rollen für LECs möglicherweise spezifisch für die Gewebe und Interaktionen, in denen sie vertreten sind. Jedoch sehr wenig verstanden wie LECs mit Immunzellen im Gewebe interagieren oder LECs in verschiedenen Organsystemen Funktionsweise; so kann die Bewertung LECs auf einer Basis pro Zelle innerhalb der Leber oder andere Organe zu Fortschritte in der wie LECs Gewebe-spezifische Immunität Programm führen. Während ein Großteil der Literatur, die in der Leber auf LECs konzentriert Mikroskopie nutzt, um mit ein oder zwei Markierungen und Morphologie17LECs zu visualisieren, wurde sehr wenig getan, um speziell LECs anhand einer Zelle für Zelle Durchflusszytometrie, obwohl eine Studie bewerten Unterschiede zwischen sinusförmigen endothelial Zellen der Leber (LSECs) und LECs18bewerten. Möglichkeit, LEC Populationen in der Leber durch Durchflusszytometrie analysieren können für die eingehende Untersuchung der LEC Phänotyp bei normalen Homöostase oder Krankheit.
Um LECs durch Durchflusszytometrie zu bewerten, werden mehrere Oberflächenmarker benötigt. In der Regel sind LECs durch den Ausdruck von Prospero-bezogene Homeobox 1 (Prox-1), Lymphgefäßsystem endotheliale Hyaluronan Rezeptor 1 (LYVE1) oder vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor Rezeptor 3 (VEGFR3) mit Mikroskopie visualisiert. Jedoch ist der Ausdruck dieser Marker in der Leber nicht auf LECs beschränkt. Prox-1 drückt sich häufig durch Hepatozyten während Leber Entwicklung, Regeneration und Verletzungen19, und LYVE1 und VEGFR3 durch die Leber sinusförmigen Endothelzellen18ausgedrückt werden. In den Lymphknoten werden LECs durch Durchflusszytometrie als Cluster der Differenzierung (CD) identifiziert CD45 - CD31 + und Podoplanin + (PDPN)16. Dieser Ansatz ist jedoch zu gering, LECs in der Leber zu isolieren, da CD45 - CD31 + Zellen werden Endothelzellen zu erfassen, und die überwiegende Bevölkerung von vaskulären endothelialen Zellen in der Leber LSECs sind. Daher sind andere Markierungen erforderlich, um die seltenen LEC Bevölkerung aus der reichlich LSEC Bevölkerung zu unterscheiden. CD16/32 (ausgedrückt durch ausgereifte LSECs18) und CD146 (eine gemeinsame vaskulären Endothelzellen Symbol, das sich überwiegend innerhalb der Leber Sinusoide geäußerten Leber sinusförmigen Endothelzellen20 mit wenig bis kein Ausdruck von lymphatischen Endothelzellen21) wurden Kandidaten Marker.
Daher haben wir eine Methode zur Isolierung und Visualisierung LECs in der Leber, die mit den oben genannten Markierungen, CD45 CD31, CD146, CD16/32 und PDPN für Durchflusszytometrie optimiert. Wir beschreiben die Verwendung von Kollagenase IV, DNase 1 und mechanische Trenntechnik für Lebergewebe Verdauung in eine einzelne Zelle-Suspension. Wir beschreiben auch die Verwendung des Iodixanol Dichtegradient für die Isolierung von nicht-parenchymal Zellen (NPC) und Zelltrümmer zu beseitigen. Zu guter Letzt ermitteln mit mehreren Markern, wir die optimalen Fluss Cytometry gating Strategie LECs aus der Leber mit PDPN als die vorherrschende Marker zu identifizieren.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Colorado Anschutz Medical Campus genehmigt.
1. Vorbereitung der Materialien
- Machen Sie eine 5 mg/mL Lösung der DNase I Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Machen Sie eine Mischung der Verdauung durch Zugabe von 5.000 U/mL der Kollagenbildung IV, klicken Sie auf die EHAA Medien.
- Wärmen Sie die Verdauung Mischung bei 37 ° C für 30 min vor dem Gebrauch.
- Machen eine Isolierung Puffer durch Zugabe von 4,8 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), Hanks ausgewogenen Salzlösung (HBSS).
- Lyse der Erythrozyten (RBC) Puffer zu machen, durch Zugabe von Ammoniumchlorid 100 mM, 10 mM KHCO3und 0, 1 mM EDTA, H2O. destilliert
2. Vorbereitung einer einzelligen Suspension aus einer Maus-Leber
- Die Maus mit CO2 und zervikale Dislokation einschläfern.
- Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol zu sein Fell nass. Heften Sie der Maus Füße eine Dissektion Board.
- Mit einer Dissektion Schere schneiden Sie die Haut ca. 1 cm über den After, achten Sie darauf, nur durch die Haut (ca. 1 mm) schneiden. Ziehen Sie die Haut vom Körper weg mit gezahnten Zangen und legen Sie die Schere zwischen Haut und Bauchfell. Öffnen Sie die Schere um das Peritoneum die Haut trennen und dann schneiden Sie die Haut vor dem Einschnitt an den Hals.
- Heften Sie die Haut um die Dissektion-Board mit einem Pin unter jeden Arm und jedes Bein. Die Peritonealdialyse Sac hochziehen und nach oben in Richtung Hals geschnitten. Schnappen Sie sich die Lappen der Leber und schneiden nur unter dem Brustbein.
Hinweis: Vorsicht ist geboten werden, wenn eines der Leber für Immunhistochemie (IHC) verwendet wird. - Um die Leber schneiden Sie und entfernen Sie die Leber von der Maus und legen Sie sie in 4 mL klicken Sie auf die EHAA Medien.
- Mit einem Skalpell schneiden Sie die Leber in ~ 1 mm Durchmesser Stücke.
- Hinzufügen von 500 µL der Verdauung Mischung und 500 µL der DNase I (2 mg/mL), um die Leber.
- Inkubieren Sie die Leber für 30 min bei 37 ° c Mischen Sie nach 15 min die Flüssigkeit mit einer 5 mL-Pipette.
- Übertragen Sie nach 30 min Inkubation verdaute Probe durch ein 100 µm-Sieb auf eine 50 mL konische Rohr.
- Schieben Sie die restlichen Stücke durch den Filter mit den Kolben einer 1-mL-Spritze.
- Waschen Sie den Filter mit 5 mL Isolierung Puffer und schieben Sie das Gewebe durch das Sieb mit der Rückseite des einen Kolben aus eine 1 mL Spritze. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Filter mit 25 mL Isolierung Puffer gewaschen wird.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 X g , für 5 min. sorgfältig aus der Überstand abgesaugt.
- Das Pellet mit 4 mL des RBC Lyse Puffer aufzuwirbeln. Inkubieren Sie die Zellen bei 5 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen mit 10 mL Isolierung Puffer und Zentrifuge bei 400 X g für 5 Minuten.
- Zählen der Zellen auf eine Hemocytometer um die Anzahl der vollen Leber festzustellen.
- Aufschwemmen Sie Zellen in 5 mL 20 % Iodixanol und Ebenen Sie anordnen mit 1 mL PBS.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 15 min ohne Bremse.
- Entfernen Sie die Schicht zwischen der PBS und der Iodixanol, und legen Sie sie, durch einen 100 µm-Filter in ein neues 50 mL konische Röhrchen.
- Waschen Sie die Zellen mit 10 mL Isolierung Puffer und Zentrifuge bei 400 X g für 5 Minuten.
- Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 500 µL PBS mit 2 % fetalen bovine Serum (FBS).
(3) durchflusszytometrischen Analyse einzelner Zellen aus der Leber
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer und einem Mikroskop verwenden Trypan blau Ausgrenzung, um lebensfähige Zellen zu messen. 10 µL Trypan blau 10 µL der Zellen hinzufügen und sofort auf ein Hemocytometer legen und die lebenden Zellen (nicht blau) unter dem Mikroskop zählen. Dann berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro Mikroliter.
- Etwa 5 Millionen Aliquot der verbleibenden Nonparenchymal Zellen in einen einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 X g für 5 min.
- Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 90 µL PBS mit 2 % FBS.
- Hinzufügen von Anti-CD45 (1: 200), Anti-CD146 (1: 200), Anti-CD31 (1: 200) und PDPN (1: 200) in 10 µL 10 x 2.4G2 oder Anti-CD16/32 (1: 200) verdünnt.
Hinweis: Kein Fc-Block (2.4G2) diente als Anti-CD16/32-markierten Antikörper verwendet wurde. - Um festzustellen, wo positive und negative Toren festgelegt werden soll, gehören Sie eine Fluoreszenz minus 1 (FMO) Fleck für jede Farbe und einen Isotype Kontrolle Antikörper.
- Um live gegen abgestorbene Zellen zu bestimmen, färben Sie mit einem Lebensfähigkeit Marker (z. B. Ghost rot 780). Inkubieren Sie die Zellen bei 4 ° C für 30 min.
- Waschen Sie die Zellen mit 100 µL PBS mit 2 % FBS.
- Verwenden Sie eine kleine aliquoten Zellen um die Einstellungen für Laser und Entschädigung auf das Durchflusszytometer anzupassen. Färben Sie die Zellen mit einem Antikörper zu jeder einzelnen Fluorophor und ohne irgendwelche Antikörper.
Hinweis: Je nach dem Durchflusszytometer verwendet wird sollte eine Vergütungsmatrix eingerichtet werden, um spektrale Überlappung zu entfernen. - Legen Sie das Probenröhrchen auf die Cytometer Sonde und sammeln zeichnen Sie alle Ereignisse auf.
(4) Datenanalyse
- Blick auf Seite-Streuung vs. Forward Scatter Gegend, Tor auf "live" Zellen basierend auf Größe und Granularität und Lebensfähigkeit Marker-Farbstoff.
- Als Nächstes verwenden CD45 brillant violett 510 und CD31 PerCp Cy5.5, Tor auf die CD45 - CD31 +-Zellen mit dem Isotype Kontrollen und FMO um zu positive und negative Populationen zu bestimmen.
- Zu guter Letzt mit CD146 v450 oder CD16/32 FITC und PDPN APC, nehmen Sie den CD146 - PDPN + oder CD16/32-PDPN +-Zellen, wieder mit Isotype Kontrollen und FMO, um positive und negative Populationen zu bestimmen. Diese Zellen sind die LECs.
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Representative Results
Studien analysieren Leber Lymphgefäße haben in erster Linie Immunohistochemistry verwendet, um die Häufigkeit und den Durchmesser der Lymphgefäße in der Leber quantitate. Diese Methode erlaubt allerdings nicht für die Bewertung der LECs auf Basis einer Zelle für Zelle oder Ausdruck mehrerer Marker, Zytokine, Chemokine oder Transkriptionsfaktoren. Also, wir fragten ob Leber LECs isoliert aus der Leber werden konnte und mittels Durchflusszytometrie. Isolieren von Lymphknoten LECs Vorarbeiten erfolgte mittels Liberase DL (Kollagenase i-II-und-Dispase) und DNase-1 kombiniert mit der mechanischen Trennung von Lymphknoten Gewebe mit Nadeln14,16. Daher das gleiche Protokoll der Verdauung auf Lebergewebe diente oder Kollagenase IV und DNase-1 verwendet wurde, wie zuvor beschrieben, für Immunzelle isoliert von der Leber22 und die Verdauung mit einem Dichte Gradienten Trennung (Iodixanol) Schritt, gefolgt Entfernen von Hepatozyten und erhöhen Sie die Häufigkeit von anderen Zelltypen innerhalb der Leber (Abbildung 1A). Nach Leber Verdauung und Zentrifugation mit der Dichtegradient wurden die Zellen mit CD45, CD31, PDPN und CD16/32 gebeizt. CD16/32 ist beschrieben worden, um durch ausgereifte LSEC Bevölkerungen, aber nicht LEC Populationen18ausgedrückt werden. So wurden LECs als CD45-CD31 + CD16/32 gated-, PDPN + Zellen, während LSECs als CD45-CD31 + CD16 eingezäunt waren / 32 + und PDPN-(Abbildung 1A). Tore waren auf lebende Zellen (rote Geist negativ) und basierend auf Isotype Kontrollen und FMO Färbung (Abbildung 1A). LYVE-1 APC auf der LEC-Bevölkerung wurde auch bestätigt (Abbildung 1 b). Beide Methoden erlaubt die Visualisierung der LEC Bevölkerung innerhalb der Leber; die Färbung Profil der Zellen war jedoch optisch besser, bei der Verwendung von Kollagenase IV und DNase-1 als Kollagenase ich-II-und-Dispase (Abbildung 1). Daher wurden alle zukünftigen Manipulationen durchgeführt mit Kollagenase IV und DNase-1, wie im Protokoll beschrieben. Im Durchschnitt erhielten wir rund 1.300 LECs pro Gramm des Lebergewebes oder 2.200 LECs pro naiv Leber, mit dieser Methode der Verdauung.
Zur Optimierung der gating-Strategie und die Kombination von Fluorophore und Kontamination von LSECs zu beseitigen, wurden CD16/32 und CD146 verwendet. CD16/32 ist Fc-Gamma-Rezeptoren II und III und drückt sich auf ältere LSECs aber nicht auf LECs18. CD16/32 könnte unterscheiden die PDPN + CD16/32-Zellen aus dem PDPN-CD16 / 32 + Zellen, vor allem wenn APC oder PE konjugiert mit PDPN und CD16/32 konjugiert, FITC (Abbildung 1A), aber weniger gut als PDPN an PE-Cy7 (Abbildung 1) konjugiert war. Der Ausdruck des CD16/32 befindet sich nicht auf LECs jedoch findet sich auf LSECs. FC-Block verwendet den CD16/32-Antikörper, um die Fc-Rezeptor-Bindung und Nonantigen spezifische Bindung der Immunglobuline an die Fc-Rezeptoren zu minimieren. Da CD16/32 verwendet wurde, um LSECs zu visualisieren, die unspezifische Bindung von Immunglobulinen war höher und CD146 als Alternative zur LSECs Messung optimiert wurde. Daher haben wir CD146 konjugiert, V450, hoch von LSECs und anderen vaskulären endothelialen Zellen20 , aber mit niedrigen bis kein Ausdruck von LECs23geäußerten vaskulären endothelialen Zellen Marker getestet. Wir zunächst optimiert die Färbung des CD146 mit Steuerelementen FMO und Isotype für CD16/32 und CD146 (Abbildung 2A). Wenn wir nur die CD16 ausgewertet / 32 + Zellen oder die CD16/32-Zellen, die CD16 / 32 + Zellen waren alle CD146 + / PDPN, während die CD16/32-Zellen in erster Linie CD146 - und PDPN- oder PDPN + (Abb. 2 b waren). Um zu bestätigen, diese Färbung, diente der FMO. PDPN aus den Fleck zu entfernen, verschwunden die PDPN + Bevölkerung (Abbildung 2). Interessanterweise gab es keine CD146 + PDPN + Zellen, bestätigt, dass CD146 nicht oder sehr gering durch PDPN + LECs zum Ausdruck kommt. So sind wir zuversichtlich, dass entweder dieser Marker verwendet werden kann zum Tor, vaskulären endothelialen Zellen in der Leber.
Um weiter zu validieren, dass PDPN einen geeigneten Marker für LECs, waren Leber Abschnitte von Mäusen mit PDPN (grün) und F4/80 (braun) (Abbildung 3A) gefärbt. Gefäßendothels weder die Makrophagen in der murinen Leber PDPN ausgedrückt. Wir waren auch in der Lage, Cholangiocytes, zu unterscheiden, die für PDPN von Lymphgefäße, basierend auf unterschiedlichen atomaren Strukturen der Gallengänge und von Cytokeratin 7 Färbung positiv beflecken können (Abbildung 3 b; rot: Cytokeratin 7, grün: PDPN). Da mehrere Marker für Durchflusszytometrie, z. B. CD31, verwendet werden, die nicht durch Cholangiocytes24ausgedrückt wird, sind wir zuversichtlich, dass wir sind Zellen aus der Analyse entfernt, dadurch bestätigt, dass Zellen aus der Leber, die CD45-CD31 + CD146 Lo/Neg, CD16/32-, und PDPN + LECs sind. Schließlich um nachzuweisen, dass die gefärbten Zellen LECs sind, sortiert diese Population von Zellen und qualitative Echtzeit Polymerase-Kettenreaktion verwendet, um die Vegfr3 und Prox-1 Ausdrücke auswerten. Vegfr3 und Prox-1 wurden ausgewertet, da diese Protokolle von anderen Zellen in der Leber exprimiert werden —prox1 von Hepatozyten und Vegfr3 von LSECS (unter anderem) – aber keine anderen Zellen neben LECs express beide. Der Ausdruck dieser beiden Marker war signifikant höher in der sortierten Bevölkerung als in der kultivierten murinen Makrophagen-Zell-Linie (RAW264.7) die drückt diese Markierungen nicht normalerweise, aber ähnlich im Ausdruck kultivierten murinen LECs (Abbildung 3 ).
Abbildung 1 : Repräsentative Flow Cytometry Analyse Kollagenase ich-II-Dispase und Kollagenase IV verdaut murinen Lebergewebe. (A) dieses Panel zeigt die gating Strategie, Fluoreszenz abzüglich einer Färbung und Isotype regelt das Verfahren. (B) dieses Panel zeigt die LYVE-1-Färbung des CD16/32-PDPN +-Zellen. (C) dieser Bereich zeigt die endgültige Flow Cytometry Tor nach Maus Lebern mit entweder Kollagenase ich-II-Dispase (z.B., Liberase DL) zu verdauen oder Kollagenase IV und Bewertung CD16/32 PerCP X PDPN PE-Cy7 wo LECs CD16/32 sind- und PDPN +. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Identifikation von CD146 und PDPN als geeignete Marker für Leber lymphatische Endothelzellen. (A) dieses Panel zeigt Fluoreszenz minus eins und Isotype Steuerelemente für CD16/32 (links) und CD146 (rechts). (B) zeigt dieses Panel gated CD16/32 positive oder negative Zellen aus Panel Aermittelt. Dargestellt ist CD146XPDPN aus beiden Populationen. (C) zeigt dieses Panel Fluoreszenz minus eins für PDPN zu zeigen, dass die Färbung ist nicht vorhanden, wenn die Antikörper nicht hinzugefügt wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Identifikation des Flusses PDPN + Zellen als lymphatische Endothelzellen. (A) dieses Panel zeigt repräsentative Immunohistochemistry von einer Maus Leber gebeizt mit PDPN (blau/grün) und F4/80 (braun). Das Lymphgefäßsystem (LV), Blutgefäß (BV) und Makrophagen (MF) sind gekennzeichnet. Maßstabsleiste = 100 µm. Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Gewebe war für 20 Minuten in Xylol entparaffiniert. Gewebe wurden durch einen Farbverlauf von Ethanol Wasser hydratisiert und Antigen-Retrieval erfolgte mittels pH 6 Antigen Abruf Puffer in einem Schnellkochtopf für 15 min. Gewebe blockiert wurde mit 0,1 % BSA und befleckt mit Anti-Maus-PDPN und Anti-Maus F4/80 für 1 h bei Zimmer Temperatur. Anti-Hamster IgG HRP und Anti-Kaninchen-IgG-HRP dienten als sekundäre Antikörper. 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) + und Vina grün wurden verwendet, um die F4/80 und PDPN, bzw. zu erkennen. Gewebe wurde counterstained mit Hämatoxylin und am Mikroskop abgebildet. (B) dieses Panel zeigt das gleiche Experiment durchgeführt wie in Feld A, außer hier, PDPN in grün, Cytokeratin 7 in rot und 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in blau angezeigt. Maßstabsleiste = 100 µm. Gewebe wurde blockiert, mit 5 % Esel und 5 % Ziegenserum und befleckt mit Anti-Maus PDPN (8.1.1) 1: 100 und Anti-Maus Cytokeratin 7 1: 200 für 1 h bei Raumtemperatur. Anti-Hamster AF647 IgG und Anti-Kaninchen IgG-PE dienten als sekundäre Antikörper. Gewebe wurde counterstained mit DAPI und abgebildet. Maßstabsleiste = 100 µm. Das Lymphgefäßsystem (LV), Blutgefäß (BV) und Gallenwege (BD) sind gekennzeichnet. (C) dieses Panel zeigt eine Log-Falte ändern in Vegfr3 und Prox-1 Ausdruck von sortierten Leber LECs basierend auf die Färbung des Protokolls (CD45 - CD31 +, CD146lo/Negund PDPN +) im Vergleich zum RAW Zellen oder primären murinen Lymphknoten LECs. Sortierte Zellen wurden durch ein Biopolymer-Schreddern-Spalte übergeben, RNA wurde mit einem RNA-Extraktion-Kit extrahiert und cDNA erfolgte mit einem reversen Transkription-Kit. Transkript Fülle wurde auf das Zimmermädchen-gen, Gapdh, für jede Probe normalisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die allgemeine Bedeutung der LECs immun Homöostase und Verordnung ist vor kurzem zum leichten25gekommen. Ein Großteil der veröffentlichten lymphatischen Literatur konzentriert sich auf Haut und Lymphknoten; Allerdings Lymphgefäße findet man überall in den Körper-26 und unser Verständnis ihrer Bedeutung in verschiedenen Organen ist also erforderlich. Hier zeigen wir eine Methode in der LECs in der Leber untersucht werden können auf eine Zelle für Zelle Basis ihren gleichzeitigen Ausdruck verschiedener Oberflächenmarker, Zytokine, Chemokine und intrazelluläre Proteine wie Transkriptionsfaktoren besser zu verstehen. Diese Methode wird für zukünftige Studien zur Beurteilung der Phänotyp und die Funktion der LECs in der Leber in Gesundheit und Krankheit nützlich sein.
Eines der Hindernisse für die Identifizierung von LECs in der Leber ist ihre relativ geringe Häufigkeit im Vergleich zu anderen Zelltypen. Hepatozyten machen etwa 80 % der Leber, und entfernen diese Zellen mit Dichtegradient (Iodixanol), bevor die Leber auf einem Durchflusszytometer ausgeführt weniger Zeit erfordert und somit bessere Lebensfähigkeit schafft. Um die Bevölkerung von LYVE1 + LECs in der Leber von LYVE1 + LSECs zu unterscheiden, verwenden wir die Marker CD16/32 und CD146 auf LSECs und mit niedrigen bis kein Ausdruck von LECs gefunden. Dies, gepaart mit der fehlende oder geringe Expression von PDPN von anderen Endothelzellen in der Leber, die Validierung durch Durchflusszytometrie, dass die Bevölkerung, die wir identifiziert LECs waren erlaubt. In der Tat bestätigt nachgelagerten transkriptionelle Analyse, dass diese gating Strategie LECs (Abbildung 3) produziert.
Die Isolation der LECs aus den Lymphknoten ist am besten mit Kollagenase ich-II-und-Dispase; Allerdings haben wir festgestellt, dass während dieser Methode LECs aus der Leber extrahiert, eine Leber Verdauung-Protokoll mit Kollagenase IV bietet eine bessere nachgelagerte Analyse mit Durchflusszytometrie. Mit einer mechanischen Störung der Leber können die Kollagenase mehr Fläche um besser mit der extrazellulären Matrix-assoziierte Zellen wie LECs, interagieren und klicken Sie auf die EHAA Medien ohne FBS mit für die Verdauung von der Leber in nur 30 min auftreten können. Verminderte diesmal unterhält LEC Lebensfähigkeit für nachgeschaltete Assays wie Durchflusszytometrie oder Strömung zu sortieren. In der Tat konnten wir wieder genug lebensfähigen Zellen um LECs durch Durchflusszytometrie und sortieren für die nachgelagerten transkriptionelle Analyse zu visualisieren.
Kombiniert, die Trennung von Hepatozyten aus der nicht-parenchymal Zellen, die Verwendung von Kollagenase Typ IV, und die Klärung und Demonstration von Marker speziell für LECs in der Leber und Marker für andere endotheliale Zell-Populationen, z. B. CD16/32 und CD146, erlaubt die korrekte Kennzeichnung der LECs in der Leber. Diese Methoden Lücke eine erhebliche in der Literatur über wie LECs in der Leber durch Durchflusszytometrie, identifiziert werden können, zumal die Leber eine Anzahl von anderen Zellen, die Marker bekannt enthält, LECs in den Lymphknoten (prox1 und eindeutig zum Ausdruck bringen VEGFR3). Daher führt diese Methoden zur nachgelagerten Studien zur Leberfunktion LEC. Darüber hinaus kann diese Methode für andere Gewebe geändert werden, um besser gewebespezifischen LEC Marker und Teilmengen zu bewerten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten den GI und Leber angeborene Immune Programme für finanzielle Unterstützung dieses Projektes danken. B.A.J.T. wird auch von R01 AI121209 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1) | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100 μm cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 mL conical | Truline | TR2004 | |
| 15 mL conical | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µL pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10 mL pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5 mL pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
- Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
- Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
- Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
- Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
- Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
- Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
- Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
- Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
- Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
- Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
- Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
- Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
- Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
- Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
- Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).
