Bu iletişim kuralının amacı lenfatik endotel hücre popülasyonlarının içinde açıklanan işaretçileri kullanarak karaciğer belirlemektir. Biz collagenase IV ve DNaz ve yumuşak dokusu, lenfatik endotel hücreleri farklı nüfusu tanımlamak için akış sitometresi ile birlikte kıyma kullanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim
Bu makalede
Özet
Özet
Karaciğer içinde lenf damarları portal Triad'ın içinde bulunan ve açıklanan işlevlerine interstisyel sıvı karaciğer lenf düğümlerine nerede hücresel artıkları ve antijenleri ankete kaldırmaktır. Nasıl lenfatik damarlara inflamasyon ve bağışıklık hücre fonksiyon içinde karaciğer dahil anlamakta çok ilgileniyoruz. Ancak, çok az sindirim karaciğer veya karaciğer değerlendirmek için kullanılan belirli işaretleri lenfatik endotel hücrelerinin (LECs) yalıtım için protokollerin oluşturulması yayımlanmış LECs hücre başına temelinde. Bu nedenle, biz en iyi duruma getirilmiş sindirim ve karaciğer karaciğer LEC nüfus değerlendirmek için boyama için bir yöntem. Biz burada özetlenen yöntemi kimlik ve karaciğer LECs, izolasyon için yararlı olacak ve bizim anlayış nasıl yanıt LECs karaciğer microenvironment güçlendirecek eminiz.
Giriş
Lenf damarları ve LECs rolünü karaciğerde de anlaşılmış değildir. Olsa da lenf damarları karaciğer1 portal üçlü içinde bulunur ve hastalık2sırasında genişletin, çok az işlev ve LECs fenotip içinde karaciğer ile ilgili anlaşılmaktadır. Üzerinde öncelikle3LECs bulunur işaretleri keşfi ile bu hücrelerin farklı doku nişler homeostazı ve hastalık içinde önemini anlayışımızın önemli bir boşluğu dolduracaktır. LECs doğrudan T hücreleri4,5,6,7,8
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Colorado Üniversitesi Anschutz tıbbi kampüs tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlık malzemeleri
- DNaz, 5 mg/mL solüsyon yapmak ı fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).
- Tıklayın'ın EHAA medya için 5000 U/mL collagenase IV ekleyerek bir sindirim karışımı olun.
- Sindirim karışımı kullanmadan 30 dk önce için 37 ° C'de ısıtın.
- Bir yalıtım arabellek % 4.8 Sığır serum albumin (BSA) ve 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ekleyerek getirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Karaciğer Lenfleribile analiz çalışmaları öncelikle immünhistokimya frekans ve lenf damarları karaciğer çapını quantitate için kullanmış. Ancak, bu yöntem LECs değerlendirme hücre hücre olarak veya ifade birden çok işaretçileri, sitokinler, kemokinler veya transkripsiyon faktörleri için izin vermez. Bu nedenle, biz sordu olup olmadığını karaciğer LECs karaciğer izole olabilir ve akış sitometresi kullanılarak hesaplandı. Önceki çalışma lenf nodu LECs izole Liberase DL (collagenase ı-II-ve-.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
LECs genel önem bağışıklık homeostazı ve düzenleme son zamanlarda hafif25için geldi. Yayımlanmış lenfatik edebiyatının çok fazla deri ve lenf düğümlerinde odaklanmaktadır; Ancak, Lenfleribile vücut26 bulunur ve bu nedenle anlayışımız farklı organlarda önem sırasında gereklidir. İşte hücre hücre olarak aynı anda onların ifade farklı yüzey işaretleyicileri, sitokinler, kemokinler ve transkripsiyon faktörleri gibi hücre içi proteinler daha iyi anlamak için bir yöntem içinde LE.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarlar GI ve karaciğer doğuştan gelen bağışıklık programları bu projenin parasal destek için teşekkür etmek istiyorum. B.A.J.T. da R01 AI121209 tarafından finanse edilmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Tıklamalar / EHAA ortamı | Irvine Scientific | 9195 | |
| Kollajenaz IV | Worthington Biyokimya şirketi | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biyokimya şirketi | LS002145 | Deoksiribonükleaz 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Yoğunluk Gradyan Ortamı |
| V450 anti fare CD146 (klon ME-9F1) | BD biyolojik bilimler | 562232 | |
| FITC anti fare CD146 (klon ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Floresein izotiyosiyanat (FITC) |
| Pasifik Mavisi anti fare CD31(klon 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti fare CD31(klon 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-klorofil proteinleri-Siyanin 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti fare PDPN (klon 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allofikosiyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti fare CD45 (klon 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti fare CD45 (klon 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti fare CD16/32 (klon 93) | Biolegend | 101306 | Floresein izotiyosiyanat (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti fare CD16/32(klon 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-klorofil proteinleri-Siyanin 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| hayalet kırmızısı 780 canlılık boyası | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC suriye hamsterı IgG (klon SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 sıçan IgG2a (klon RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC sıçan IgG2 (klon eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti fare LYVE1 (klon 223322) | Ar-Ge D sistemleri | FAB2125A | |
| anti-fare Sitokeratin (klon EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-fare F4 / 80 (klon Cl: A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraksiyon V) | Fischer | BP1600-100 | Sığır Serumu Albümini (BSA) |
| Keçi serumu | Jackson İmmünoresearch | 017-000-121 | |
| Eşek Serumu | Jackson İmmünoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) -RBC lizis tamponu için |
| Amonyum Klorür | Fischer | A687-500 | RBC Lizis tamponu için |
| Potasyum Bikarbonat | Fischer | P184-500 | |
| Neşter | Tüyü | 2975 # 21 | |
| 100 & mu; m hücre süzgeci | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | evde/ATCC | ATCC HB-197 | FC bloğu, Fc gama + hücrelerine spesifik olmayan bağlanmayı inhibe etmek için -hibridomdan yapılmıştır |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 kuyulu plaka | Corning | 3788 | |
| 6 kuyulu plaka | Corning | 3506 | |
| 50 mL konik | Truline | TR2004 | |
| 15 mL konik | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Pipet ucu | ABD bilimsel | 1111-2721 | |
| 200 & mikro; L pipet ucu | ABD bilimsel | 1110-1700 | |
| 10 & L pipet ucu | ABD bilimsel | 1111-3700 | |
| seriolojik 10 mL pipet | greiner bio-one | 607107 | |
| seriolojik 5 mL pipet | greiner bio-one | 606107 | |
| Hücre inkübatörü | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II akış sitometresi | BD biosciences | ||
| Klinik Santrifüj | Beckman | modeli X-14R |
Kaynaklar
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
