Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

लसीका Endothelial कोशिकाओं के एक प्रवाह Cytometric विश्लेषण के लिए Murine जिगर के पाचन

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58621
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, School of Medicine, 2Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य वर्णित मार्करों का उपयोग कर जिगर के भीतर लसीका endothelial कोशिका आबादी की पहचान है । हम collagenase चतुर्थ और DNase और ऊतक के एक सज्जन नख़रेबाज़ का उपयोग, प्रवाह cytometry के साथ संयुक्त, लसीका endothelial कोशिकाओं की एक अलग आबादी की पहचान ।

Abstract

जिगर के भीतर, लसीका वाहिकाओं के भीतर पोर्टल त्रय पाया जाता है, और उनके वर्णित समारोह के लिए जिगर से लिम्फ नोड्स जहां सेलुलर मलबे और एंटीजन सर्वेक्षण किया जा सकता है के मध्य द्रव को दूर करने के लिए है । हम बहुत समझ कैसे लसीका vasculature सूजन में शामिल हो सकता है और जिगर के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका समारोह में रुचि रखते हैं । हालांकि, बहुत कम जिगर या विशिष्ट मार्करों कि सेल के आधार पर एक प्रति पर जिगर LECs का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से लसीका endothelial कोशिकाओं (LECs) के अलगाव के लिए पाचन प्रोटोकॉल स्थापित प्रकाशित किया गया है । इसलिए, हम पाचन और जिगर के दाग के लिए एक विधि को अनुकूलित करने के लिए जिगर में LEC जनसंख्या का मूल्यांकन । हमें विश्वास है कि यहां उल्लिखित विधि जिगर से LECs की पहचान और अलगाव के लिए उपयोगी हो जाएगा और कैसे LECs जिगर microenvironment का जवाब के बारे में हमारी समझ को मजबूत करेगा ।

Introduction

जिगर में लसीका वाहिकाओं और LECs की भूमिका अच्छी तरह से समझ में नहीं है । जबकि लसीका वाहिकाओं पोर्टल के भीतर पाया जिगर1 के त्रय और2रोग के दौरान विस्तार, बहुत कम समारोह और जिगर के भीतर LECs के phenotype के बारे में समझ में आता है । मार्करों कि LECs3पर मुख्य रूप से पाए जाते है की खोज के साथ, homeostasis और रोग में विभिंन ऊतक niches के भीतर इन कोशिकाओं के महत्व को हमारी समझ में एक महत्वपूर्ण अंतर भरना होगा । LECs लिम्फ नोड में परिधीय सहिष्णुता को बनाए रखने में और मेटास्टेटिक ट्यूमर में एक प्रमुख भूमिका है टी कोशिकाओं के साथ सीधे बातचीत द्वारा4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. लिम्फ नोड में LECs प्रवासी वृक्ष कोशिकाओं के साथ अपनी बातचीत के माध्यम से सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा को बढ़ावा देने के कर सकते हैं14,15,16. इसलिए, LECs के लिए कई भूमिकाएं है जो ऊतकों और बातचीत जिसमें वे मौजूद है के लिए विशिष्ट हो सकता है । हालांकि, बहुत कम कैसे LECs ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत या कैसे अलग अंग प्रणालियों में LECs समारोह के बारे में समझा जाता है; इस प्रकार, जिगर या अंय अंगों के भीतर एक प्रति कोशिका के आधार पर LECs का मूल्यांकन कैसे LECs कार्यक्रम ऊतक विशिष्ट प्रतिरक्षा में प्रगति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । जबकि अधिक साहित्य है कि जिगर में LECs पर ध्यान केंद्रित करने के लिए सूक्ष्म का उपयोग करता है LECs कल्पना एक या दो मार्करों और आकृति विज्ञान17का उपयोग कर, बहुत कम किया गया है विशेष रूप से सेल आधार द्वारा एक सेल पर LECs का मूल्यांकन प्रवाह cytometry का उपयोग कर, हालांकि एक अध्ययन जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं (LSECs) और LECs18के बीच मतभेद का मूल्यांकन किया । प्रवाह cytometry द्वारा जिगर में LEC आबादी का विश्लेषण करने में सक्षम होने के नाते सामान्य homeostasis या रोग के दौरान LEC phenotype के में गहराई से अध्ययन के लिए अनुमति देता है.

प्रवाह cytometry द्वारा LECs का मूल्यांकन करने के लिए, एकाधिक सतह मार्कर की आवश्यकता है । आमतौर पर, LECs prospero-संबंधित homeobox 1 (प्रोक्स-1), लसीका पोत endothelial hyaluronan रिसेप्टर 1 (LYVE1) या संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर 3 (VEGFR3) माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर की अभिव्यक्ति द्वारा कल्पना कर रहे हैं । हालांकि, जिगर में, इन मार्करों की अभिव्यक्ति LECs तक ही सीमित नहीं है । प्रोक्स-1 व्यापक रूप से हेपैटोसाइट्स द्वारा जिगर के विकास के दौरान व्यक्त की है, पुनर्जनन, और चोट19, और LYVE1 और VEGFR3 जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं18द्वारा व्यक्त कर रहे हैं । लिम्फ नोड में, LECs विभेदक (सीडी) CD45-, CD31 +, और podoplanin + (PDPN)16के समूहों के रूप में प्रवाह cytometry का उपयोग कर की पहचान कर रहे हैं । हालांकि, इस दृष्टिकोण भी CD45-CD31 के बाद से जिगर में LECs को अलग करने के लिए कम है + कोशिकाओं endothelial कोशिकाओं पर कब्जा होगा, और जिगर में संवहनी endothelial कोशिकाओं की प्रमुख आबादी LSECs हैं. इस प्रकार, अंय मार्करों प्रचुर LSEC आबादी से दुर्लभ LEC जनसंख्या भेद करने की जरूरत है । दोनों CD16 32/(परिपक्व LSECs18द्वारा व्यक्त) और CD146 (एक आम संवहनी endothelial सेल मार्कर है कि जिगर predominately जिगर के भीतर व्यक्त sinusoids sinusoidal कोशिकाओं20 के साथ थोड़ा लसीका द्वारा कोई अभिव्यक्ति के लिए endothelial है endothelial सेल21) परीक्षार्थी मार्कर थे ।

इसलिए, हम अलग और ऊपर मार्करों का उपयोग कर जिगर में LECs visualizing के लिए एक विधि अनुकूलित, CD45, CD31, CD146, CD16/32, और PDPN प्रवाह cytometry के लिए । हम एक एकल सेल निलंबन में collagenase IV, DNase 1, और जिगर ऊतक पाचन के लिए यांत्रिक जुदाई के उपयोग का वर्णन । हम भी गैर के अलगाव के लिए iodixanol घनत्व ढाल के उपयोग का वर्णन-parenchymal कोशिकाओं (एनपीसी) और सेलुलर मलबे को खत्म करने के लिए । अंत में, एकाधिक मार्कर का उपयोग कर, हम इष्टतम प्रवाह cytometry गेटिंग रणनीति के लिए प्रमुख मार्कर के रूप में PDPN के साथ जिगर से LECs की पहचान निर्धारित करते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां बताए गए सभी तरीकों को यूनिवर्सिटी ऑफ कोलोराडो Anschutz मेडिकल कैंपस की संस्थागत एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी (IACUC) ने मंजूरी दी है ।

1. सामग्री की तैयारी

  1. एक 5 मिलीग्राम/एमएल DNase मैं फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में का समाधान करें ।
  2. EHAA मीडिया क्लिक करने के लिए collagenase IV के ५,००० U/एमएल जोड़कर एक पाचन मिश्रण बनाओ ।
  3. उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर पाचन मिश्रण गर्म ।
  4. ४.८% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और 2 mM ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) को हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान (HBSS) में जोड़कर एक आइसोलेशन बफर बनाएं ।
  5. १०० मिमी अमोनियम क्लोराइड, 10 एमएम KHCO3, और ०.१ mm EDTA को आसुत एच2ओ जोड़कर एक लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर बनाएं ।

2. एक माउस जिगर से एक एकल सेल निलंबन की तैयारी

  1. 2 और गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन के साथ माउस Euthanize ।
  2. अपने फर गीला करने के लिए ७०% इथेनॉल के साथ माउस नीचे स्प्रे । एक विच्छेदन बोर्ड के लिए माउस के पैर पिन ।
  3. विच्छेदन कैंची का उपयोग करने के लिए गुदा के ऊपर 1 सेमी के बारे में त्वचा में कटौती, त्वचा के माध्यम से ही कटौती सावधान जा रहा है (के बारे में 1 मिमी) । त्वचा को दांतेदार संदंश के साथ शरीर से दूर खींच और त्वचा और योनि के बीच कैंची डालें । त्वचा को योनि से अलग करने के लिए कैंची खोलें और फिर, चीरा से गर्दन तक त्वचा को काट लें ।
  4. एक हाथ और प्रत्येक पैर के ऊपर के तहत एक पिन का उपयोग कर विच्छेदन बोर्ड के लिए त्वचा पिन । पेरिटोनियल थैली खींचो ऊपर और गर्दन की ओर ऊपर की तरफ कटौती । जिगर की पालियों को पकड़ो और उरोस्थि के नीचे कट ।
    नोट: अगर लिवर के किसी भी immunohistochemistry (आइएचसी) के लिए इस्तेमाल किया जाएगा तो देखभाल की जानी चाहिए ।
  5. जिगर के आसपास कट और माउस से जिगर को हटाने और क्लिक के EHAA मीडिया के 4 मिलीलीटर में यह जगह है ।
  6. एक स्केलपेल का प्रयोग, ~ 1 मिमी व्यास के टुकड़ों में जिगर में कटौती ।
  7. पाचन मिश्रण के ५०० µ एल जोड़ें और जिगर के लिए DNase मैं (2 मिलीग्राम/एमएल) के ५०० µ एल ।
  8. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए जिगर की मशीन । 15 मिनट के बाद, एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर तरल मिश्रण ।
  9. मशीन के 30 मिनट के बाद, एक १०० µm छलनी के माध्यम से एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के माध्यम से पचा नमूना हस्तांतरण ।
  10. धीरे एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के गोताख़ोर के साथ फिल्टर के माध्यम से शेष टुकड़े धक्का ।
  11. अलगाव बफर के 5 मिलीलीटर के साथ फिल्टर धोने और धीरे एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से एक गोताख़ोर के पीछे के साथ छलनी के माध्यम से ऊतक धक्का । फ़िल्टर 25 मिली आइसोलेशन बफ़र के साथ धोया जाता है जब तक यह दोहराएँ ।
  12. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक. ध्यान से महाप्राण बंद supernatant ।
  13. आरबीसी lysis बफर के 4 मिलीलीटर के साथ गोली resuspend । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं की मशीन ।
  14. अलगाव बफर के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो और 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक ।
  15. एक hemocytometer पर कोशिकाओं गिनती पूर्ण जिगर गिनती निर्धारित करने के लिए ।
  16. 20% iodixanol के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित और उंहें पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ परत ।
  17. एक ब्रेक के बिना 15 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
  18. पंजाब और iodixanol के बीच की परत को हटा दें और उंहें एक १०० µm फिल्टर के माध्यम से, एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब में जगह ।
  19. अलगाव बफर के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो और 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक ।
  20. supernatant को छोड़ें और 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पंजाब के ५०० µ l में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें ।

3. जिगर से एकल कोशिकाओं के प्रवाह Cytometric विश्लेषण

  1. एक hemocytometer और माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना, trypan नीले अपवर्जन का उपयोग करने के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं को मापने । trypan नीले रंग के 10 µ एल करने के लिए कोशिकाओं के 10 µ एल जोड़ें और तुरंत एक hemocytometer पर उन्हें जगह है और एक खुर्दबीन के नीचे रहते कोशिकाओं (नहीं नीला) गिनती. उसके बाद, प्रति microliter कक्षों की संख्या परिकलित करें ।
  2. Aliquot लगभग ५,०००,००० शेष nonparenchymal कोशिकाओं के एक अच्छी तरह से एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट की एक ही कुआं में ।
  3. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
  4. supernatant को छोड़ें और 2% FBS के साथ पंजाब के ९० µ jk में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें ।
  5. एंटी-CD45 (1:200), एंटी-CD146 (1:200), anti-CD31 (1:200), और PDPN (1:200) 10x 2.4 g2 के 10 µ l में पतला या विरोधी CD16/32 (1:200) जोड़ें ।
    नोट: एंटी-CD16/32-लेबल एंटीबॉडी इस्तेमाल किया गया था जब कोई एफसी ब्लॉक (2.4 g2) इस्तेमाल किया गया था ।
  6. जहां सकारात्मक और नकारात्मक गेट्स सेट किया जाना चाहिए निर्धारित करने के लिए, एक प्रतिदीप्ति ऋण एक (FMO) प्रत्येक रंग और एक isotype नियंत्रण एंटीबॉडी के लिए दाग शामिल हैं ।
  7. मृत कोशिकाओं बनाम जीना निर्धारित करने के लिए, एक व्यवहार्यता मार्कर के साथ दाग (जैसे, भूत लाल ७८०) । 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन ।
  8. 2% FBS के साथ पंजाब के १०० µ एल के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  9. प्रवाह cytometer पर लेज़र और क्षतिपूर्ति सेटिंग्स समायोजित करने के लिए कक्षों की एक छोटी aliquot का उपयोग करें । प्रत्येक व्यक्ति के लिए एक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं दाग fluorophore और एक के बिना किसी भी एंटीबॉडी ।
    नोट: प्रवाह cytometer इस्तेमाल किया जा रहा है पर निर्भर करता है, एक मुआवजा मैट्रिक्स वर्णक्रमीय ओवरलैप को दूर करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए ।
  10. cytometer जांच पर नमूना ट्यूब प्लेस और इकट्ठा करने और सभी घटनाओं रिकॉर्ड ।

4. डेटा विश्लेषण

  1. साइड-स्कैटर क्षेत्र बनाम आगे-तितर बितर क्षेत्र, "लाइव" कोशिकाओं पर आकार और दानेदार और व्यवहार्यता मार्कर डाई के आधार पर गेट पर देख रहे हैं ।
  2. अगले, CD45 शानदार वायलेट ५१० और CD31 PerCp cy 5.5, CD45 पर गेट-CD31 + isotype नियंत्रण और सकारात्मक और नकारात्मक आबादी निर्धारित करने के लिए FMO का उपयोग कर कोशिकाओं का उपयोग कर ।
  3. अंत में, CD146 v450 या CD16/32 FITC और PDPN APC का उपयोग कर, ले CD146-PDPN + या CD16/32-PDPN + कोशिकाओं, फिर से isotype नियंत्रण और FMO का उपयोग कर, सकारात्मक और नकारात्मक आबादी का निर्धारण करने के लिए । ये कोशिकाएँ LECs हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

अध्ययन जिगर लसीका का विश्लेषण मुख्य रूप से immunohistochemistry का इस्तेमाल किया है आवृत्ति और जिगर में लसीका वाहिकाओं के व्यास quantitate । हालांकि, यह विधि किसी कक्ष-दर-कक्ष के आधार पर या एकाधिक मार्कर, साइटोकिंस, chemokines, या प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति के लिए LECs के मूल्यांकन के लिए अनुमति नहीं देती । इसलिए, हमने पूछा कि क्या जिगर LECs जिगर से अलग किया जा सकता है और प्रवाह cytometry का उपयोग कर मूल्यांकन । पिछले काम लिम्फ नोड LECs अलग Liberase डीएल (collagenase मैं-द्वितीय और dispase) और DNase 1 सुई14,16के साथ लिम्फ नोड ऊतक के यांत्रिक जुदाई के साथ संयुक्त का उपयोग किया गया था । इसलिए, जिगर ऊतक पर एक ही पाचन प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया गया था, या collagenase IV और DNase 1 पहले वर्णित के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जिगर22 से प्रतिरक्षा कोशिका अलगाव के लिए और एक घनत्व ढाल जुदाई (iodixanol) कदम के साथ पाचन पीछा हेपैटोसाइट्स निकालें और जिगर के भीतर अन्य कोशिका प्रकार की आवृत्ति में वृद्धि (आंकड़ा 1a). जिगर पाचन और घनत्व ढाल के साथ केंद्रापसारक के बाद, कोशिकाओं CD45, CD31, PDPN, और CD16 के साथ दाग थे/ CD16/32 को परिपक्व LSEC आबादी द्वारा व्यक्त किया जाना बताया गया है, लेकिन नहीं LEC आबादी18। इस प्रकार, LECs के रूप में gated थे CD45-, CD31 +, CD16/32-, PDPN + कोशिकाओं, जबकि LSECs थे gated के रूप में CD45-, CD31 +, CD16/32 + और PDPN-(चित्रा 1a) । गेट्स लाइव कोशिकाओं (भूत लाल नकारात्मक) पर सेट और isotype नियंत्रण और FMO धुंधला (आंकड़ा 1a) पर आधारित थे । LYVE-1 LEC जनसंख्या पर APC भी पुष्टि (आंकड़ा 1b) था । दोनों तरीकों जिगर के भीतर LEC जनसंख्या के दृश्य की अनुमति दी; हालांकि, कोशिकाओं के धुंधला प्रोफ़ाइल नेत्रहीन बेहतर जब collagenase चतुर्थ और DNase 1 से collagenase मैं-II और dispase (चित्रा 1C) का उपयोग कर रहा था । इसलिए, भविष्य में सभी जोड़तोड़ collagenase IV और DNase 1 का उपयोग कर, के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया । औसतन, हम लगभग १,३०० LECs प्राप्त प्रति ग्राम जिगर ऊतक या २,२०० LECs प्रति भोली जिगर, इस पाचन विधि का उपयोग कर ।

गेटिंग रणनीति और fluorophores का संयोजन और LSECs के संदूषण को समाप्त करने के लिए ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, दोनों CD16/32 और CD146 का उपयोग किया गया । CD16/32 एफसी गामा रिसेप्टर्स द्वितीय और तृतीय है और परिपक्व LSECs पर नहीं LECs18पर व्यक्त की है । CD16/32 PDPN-CD16 से PDPN + CD16/32-कोशिकाओं को भेद सकता है, खासकर जब PDPN संयुग्मित का उपयोग करने के लिए APC या पीई और CD16/32 संयुग्मित करने के लिए FITC (आंकड़ा 1a), लेकिन कम अच्छी तरह से जब PDPN था संयुग्मित को पीई-Cy7 (चित्रा 1C) । CD16/32 की अभिव्यक्ति LECs पर नहीं मिली है लेकिन LSECs पर पाया जाता है । एफसी ब्लॉक CD16/32 एंटीबॉडी का उपयोग करता है एफसी रिसेप्टर बाइंडिंग और प्रतिजन इम्युनोग्लोबुलिन के विशिष्ट बंधन एफसी रिसेप्टर्स को कम करने के लिए । चूंकि CD16/32 LSECs कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, इम्युनोग्लोबुलिन के गैर विशिष्ट बंधन उच्च था और CD146 LSECs उपाय करने के लिए एक विकल्प के रूप में अनुकूलित किया गया था । इसलिए, हम परीक्षण CD146 संयुग्मित V450, संवहनी endothelial सेल मार्कर द्वारा अत्यधिक व्यक्त LSECs और अंय संवहनी endothelial कोशिकाओं को20 लेकिन कम के साथ नहीं अभिव्यक्ति के लिए23LECs । हम पहले दोनों CD16/32 और CD146 (चित्रा 2a) के लिए FMO और isotype नियंत्रण का उपयोग कर CD146 के दाग अनुकूलित । यदि हम केवल CD16/32 + कोशिकाओं या CD16/32-कोशिकाओं का मूल्यांकन किया, CD16/32 + कोशिकाओं थे सभी CD146 + और PDPN-जबकि CD16/32-कोशिकाओं को मुख्य रूप से CD146 थे-और या तो PDPN-या PDPN + (चित्रा बी) । इस दाग की पुष्टि करने के लिए, FMO इस्तेमाल किया गया था । दाग से PDPN निकाल कर PDPN + जनसंख्या गायब हो गई (चित्रा 2c). दिलचस्प है, वहां कोई CD146 + PDPN + कोशिकाओं, पुष्टि कर रहे थे कि CD146 नहीं है या बहुत PDPN द्वारा व्यक्त नीच + LECs । इस प्रकार, हमें विश्वास है कि या तो इन मार्करों के जिगर में बाहर संवहनी endothelial कोशिकाओं गेट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

आगे मांय करने के लिए कि PDPN LECs के लिए एक उपयुक्त मार्कर है, चूहों से जिगर वर्गों दोनों PDPN (हरा) और F4/80 (ब्राउन) (चित्र 3ए) के साथ दाग थे । न तो नाड़ी endothelium और न ही मैक्रोफेज ने murine यकृत में PDPN व्यक्त की. हम भी cholangiocytes भेद करने में सक्षम थे, जो PDPN के लिए सकारात्मक दाग कर सकते हैं, लसीका वाहिकाओं से, पित्त नलिकाओं की अलग परमाणु संरचनाओं पर आधारित है और द्वारा cytokeratin 7 धुंधला (चित्रा 3 बी; लाल: cytokeratin 7, ग्रीन: PDPN) । के बाद से एकाधिक मार्करों प्रवाह cytometry के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे CD31, जो24cholangiocytes द्वारा व्यक्त नहीं है, हमें विश्वास है कि हम विश्लेषण से इन कोशिकाओं को हटा रहे हैं, जिससे कि जिगर से कोशिकाओं की पुष्टि कर रहे हैं कि CD45-, CD31 +, CD146 lo/नेग, CD16/32-, और PDPN + LECs हैं । अंत में, सबूत है कि सना हुआ कोशिकाओं LECs है प्रदान करने के लिए, हम कोशिकाओं की इस आबादी को हल और गुणात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया Vegfr3 और प्रोक्स-1 के भाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया । दोनों Vegfr3 और प्रोक्स-1 का मूल्यांकन किया गया, के रूप में इन टेप जिगर में अंय कोशिकाओं द्वारा व्यक्त कर रहे है-prox1 द्वारा हेपैटोसाइट्स और Vegfr3 द्वारा LSECS (अंय लोगों के अलावा)-लेकिन कोई अंय कोशिकाओं LECs एक्सप्रेस दोनों । इन दोनों मार्करों की अभिव्यक्ति में काफी अधिक था क्रमबद्ध जनसंख्या में से कल्चरल murine मैक्रोफेज सेल लाइन (रॉ 264.7) जो आम तौर पर इन मार्करों व्यक्त नहीं करता है, लेकिन अभिव्यक्ति में समान है के लिए कल्चरल murine LECs (चित्रा 3 सी ).

Figure 1
चित्रा 1 : collagenase I-II के प्रतिनिधि प्रवाह cytometry विश्लेषण-dispase और collagenase IV-पचता murine जिगर ऊतक । (क) इस पैनल गेटिंग रणनीति, प्रतिदीप्ति ऋण एक धुंधला, और प्रक्रिया के लिए isotype नियंत्रण से पता चलता है । (ख) इस पैनल के LYVE-1 CD16/32-PDPN + कोशिकाओं के दाग से पता चलता है । (ग) इस पैनल के अंतिम प्रवाह cytometry गेट से पता चलता है या तो collagenase I-II-dispase (eg, Liberase DL) या collagenase IV के साथ माउस जिगर को पचाने के बाद और CD16 का मूल्यांकन करने के लिए 32 PerCP X PDPN PE-Cy7 जहां LECs है CD16/32-और PDPN + । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : जिगर लसीका endothelial कोशिकाओं के लिए उपयुक्त मार्करों के रूप में CD146 और PDPN की पहचान । (A) यह पैनल CD16/32 (बाएं) और CD146 (दाएं) के लिए प्रतिदीप्ति शूंय से एक और isotype नियंत्रण दिखाता है । (ख) इस पैनल से पता चलता है gated CD16/32 सकारात्मक या नकारात्मक कक्ष A. से निर्धारित कोशिकाओं दिखाया गया है दोनों आबादी से CD146XPDPN है. (ग) यह पैनल PDPN के लिए प्रतिदीप्ति शूंय से पता चलता है प्रदर्शित करने के लिए कि धुंधला जब एंटीबॉडी नहीं जोड़ा है अनुपस्थित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : लसीका endothelial कोशिकाओं के रूप में प्रवाह PDPN + कोशिकाओं की पहचान । (क) यह पैनल एक माउस से प्रतिनिधि immunohistochemistry से पता चलता है जिगर PDPN के साथ सना हुआ (नीला/हरा) और F4/ लसीका पोत (एल. वी.), रक्त वाहिका (बी. वी.), और मैक्रोफेज (एमएफ) लेबल हैं । स्केल बार = १०० µm. Formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड ऊतक xylene में 20 मिनट के लिए किया गया । ऊतकों को इथेनॉल के एक ढाल के माध्यम से पानी के लिए हाइड्रेटेड थे, और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति 15 मिनट के लिए एक दबाव कुकर में पीएच 6 प्रतिजन पुनर्प्राप्ति बफर का उपयोग किया गया था । ऊतक ०.१% BSA और विरोधी माउस PDPN और विरोधी माउस का उपयोग कर बंद कर दिया था F4/ तापमान. विरोधी हंसटर आईजीजी एचआरपी और विरोधी खरगोश आईजीजी एचआरपी माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया । 3, 3 '-Diaminobenzidine (ढाब) + और बीन ग्रीन F4/80 और PDPN, क्रमशः का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया । ऊतक hematoxylin के साथ counterstained और एक खुर्दबीन पर imaged था । (ख) यह पैनल एक ही पैनल में एक के रूप में प्रदर्शन किया प्रयोग से पता चलता है , यहां छोड़कर, PDPN हरे रंग में दिखाया गया है, लाल रंग में cytokeratin 7, और 4 ', 6-diamidino-2-नीले रंग में phenylindole (DAPI) । स्केल बार = १०० µm. ऊतक 5% गधा और 5% बकरी सीरम और विरोधी माउस PDPN (8.1.1) 1:100 और विरोधी माउस cytokeratin 7 1:200 कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए उपयोग दाग का उपयोग कर बंद कर दिया गया था । विरोधी हंसटर आईजीजी AF647 और विरोधी खरगोश आईजीजी-पीई माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया । ऊतक DAPI और छवि के साथ counterstained था । स्केल बार = १०० µm । लसीका पोत (एल. वी.), रक्त वाहिका (बी. वी.), और पित्त वाहिनी (BD) लेबल हैं । (ग) इस पैनल से पता चलता है Vegfr3 और प्रोक्स में एक लॉग गुना परिवर्तन - हल जिगर LECs से प्रोटोकॉल में दाग पर आधारित (CD45-, CD31 +, CD146lo/नेग, और PDPN +) कच्चे कोशिकाओं या प्राथमिक murine लिम्फ नोड LECs की तुलना में । क्रमबद्ध कोशिकाओं के माध्यम से पारित किया गया एक गैर बहुलक-कतरन स्तंभ, आरएनए एक आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर निकाला गया था, और सीडीएनए एक रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग किया गया था. प्रतिलिपि बहुतायत हर नमूने के लिए गृह व्यवस्था जीन, Gapdh, के लिए सामान्यीकृत था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रतिरक्षा homeostasis और विनियमन में LECs का समग्र महत्व हाल ही में25प्रकाश में आया है । प्रकाशित लसीका साहित्य के अधिकांश त्वचा और लिम्फ नोड्स पर केंद्रित है; हालांकि, लसीका पूरे शरीर में पाए जाते है और26 , इस प्रकार, विभिंन अंगों में उनके महत्व की हमारी समझ की जरूरत है । यहाँ हम एक विधि दिखाते हैं जिसमें जिगर में LECs एक कोशिका-दर-कोशिका आधार पर बेहतर ढंग से अलग सतह मार्करों, साइटोकिंस, chemokines, और intracellular प्रोटीन जैसे प्रतिलेखन कारकों की उनकी समसामयिक अभिव्यक्ति को समझने के लिए अध्ययन किया जा सकता है. यह विधि स्वास्थ्य और रोग के दौरान यकृत में LECs के phenotype और कार्य का आकलन करने के लिए भावी अध्ययनों के लिए उपयोगी होगी.

जिगर में LECs की पहचान के लिए बाधाओं में से एक अन्य कोशिका प्रकार की तुलना में उनके अपेक्षाकृत कम आवृत्ति है. हेपैटोसाइट्स जिगर के बारे में ८०% श्रृंगार, और इन कोशिकाओं को हटाने घनत्व ढाल का उपयोग कर (iodixanol) एक प्रवाह cytometer पर जिगर चलाने से पहले कम समय की आवश्यकता है और, इस प्रकार, बेहतर व्यवहार्यता प्रदान करता है । LYVE1 + LSECs से जिगर में LYVE1 + LECs की आबादी भेद करने के लिए, हम CD16 पर पाया मार्करों CD146/32 और LSECs और कम से कोई अभिव्यक्ति के साथ के साथ प्रयोग किया जाता है । यह, कमी या जिगर में किसी भी अंय endothelial कोशिका द्वारा PDPN के कम अभिव्यक्ति के साथ युग्मित, प्रवाह cytometry द्वारा मांयता है कि जनसंख्या हम LECs थे पहचान की अनुमति दी । दरअसल, बहाव transcriptional विश्लेषण की पुष्टि की है कि इस गेटिंग रणनीति LECs (चित्रा 3सी) का उत्पादन किया ।

लिम्फ नोड से LECs का अलगाव सबसे अच्छा collagenase मैं-II और dispase का उपयोग किया जाता है; हालांकि, हमने पाया है कि, जबकि इस विधि जिगर से LECs निकालने करता है, एक जिगर पाचन collagenase IV का उपयोग कर प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry का उपयोग कर एक बेहतर बहाव विश्लेषण प्रदान करता है । जिगर की एक यांत्रिक व्यवधान का उपयोग कर collagenase अधिक सतह क्षेत्र बेहतर extracellular मैट्रिक्स के साथ बातचीत करने के लिए अनुमति देता है-जुड़े कोशिकाओं, LECs की तरह, और क्लिक करें EHAA मीडिया का उपयोग कर FBS बिना जिगर के पाचन के लिए अनुमति देता है केवल 30 मिनट में होते हैं । यह कम समय प्रवाह cytometry या छंटाई प्रवाह की तरह बहाव परख के लिए LEC व्यवहार्यता रखता है । दरअसल, हम काफी व्यवहार्य कोशिकाओं को ठीक करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा LECs कल्पना और बहाव transcriptional विश्लेषण के लिए छंटाई प्रवाह कर रहे थे ।

संयुक्त, गैर से हेपैटोसाइट्स की जुदाई-parenchymal कोशिकाओं, collagenase प्रकार चतुर्थ का उपयोग करें, और स्पष्टीकरण और विशिष्ट मार्करों का प्रदर्शन जिगर और मार्करों में LECs के लिए विशेष अंय endothelial सेल आबादी, जैसे CD16/ CD146, जिगर में LECs की उचित पहचान की अनुमति दी । इन तरीकों के बारे में कैसे जिगर में LECs प्रवाह cytometry द्वारा पहचाना जा सकता है के बारे में साहित्य में एक महत्वपूर्ण अंतर को भरने, विशेष रूप से जिगर अंय कोशिकाओं है कि व्यक्त मार्करों लिम्फ नोड में LECs के लिए अद्वितीय होने के लिए जाना जाता है की एक संख्या में शामिल है (prox1 और vegfr3) । इसलिए, इन तरीकों के बहाव जिगर LEC समारोह के बारे में अध्ययन करने के लिए नेतृत्व करेंगे । इसके अतिरिक्त, इस विधि के लिए अंय ऊतकों के लिए संशोधित किया जा सकता है क्रम में बेहतर ऊतक विशिष्ट LEC मार्करों और सबसेट का मूल्यांकन ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इस परियोजना के मौद्रिक समर्थन के लिए सैनिक और जिगर जंमजात प्रतिरक्षा कार्यक्रमों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । B.A.J.T. भी R01 AI121209 द्वारा वित्तपोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clicks/EHAA media Irvine Scientific 9195
Collagenase IV Worthington Biochemical corporation LS004188
DNase I Worthington Biochemical corporation LS002145 Deoxyribonuclease 1
OptiPrep Sigma Aldrich D1556 Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1) BD biosciences 562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1) Biolegend 134706 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) Biolegend 102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390) Biolegend 102420 Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) Biolegend 127410 Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) Biolegend 101306 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93) Biolegend 101324 Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye TONBO biosceinces 3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) Biolegened 402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) Biolegend 400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a) ebioscience 1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322) R&D systems FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) abcam ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) Bio-rad MCA497
BSA (fraction V) Fischer BP1600-100 Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum Jackson Immunoresearch 017-000-121
Donkey Serum Jackson Immunoresearch 017-000-121
EDTA VWR E177 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride Fischer A687-500 for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate Fischer P184-500 for RBC Lysis buffer
Scalpel Feather 2975#21
100 μm cell strainer Fischer 22363549
2.4G2 in house/ATCC ATCC HB-197 FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta biologicals S11550
96 well plate Corning 3788
6 well plate Corning 3506
50 mL conical Truline TR2004
15 mL conical Falcon 352196
1 mL Pipete tip USA scientific 1111-2721
200 µL pipete tip USA scientific 1110-1700
10 µL pipete tip USA scientific 1111-3700
seriological 10 mL pipete greiner bio-one 607107
seriological 5 mL pipete greiner bio-one 606107
Cell incubator Fischer Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer BD biosciences
Clinical Centrifuge Beckman coulter model X-14R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
  2. Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
  3. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  4. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  5. Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
  6. Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
  7. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
  8. Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
  9. Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
  10. Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
  11. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  12. Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
  13. Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
  14. Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
  15. Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
  16. Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
  17. Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
  18. Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
  19. Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
  20. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  21. Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
  22. Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
  23. Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
  24. Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
  25. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
  26. Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४३ जिगर लसीका endothelial कोशिकाओं प्रवाह cytometry जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं collagenase IV
लसीका Endothelial कोशिकाओं के एक प्रवाह Cytometric विश्लेषण के लिए Murine जिगर के पाचन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Finlon, J. M., Burchill, M. A.,… More

Finlon, J. M., Burchill, M. A., Tamburini, B. A. J. Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (143), e58621, doi:10.3791/58621 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter