Summary
Målet med denne protokol er at identificere lymfe endotel cellepopulationer i leveren ved hjælp af beskrevet markører. Vi udnytte collagenase IV og DNase og en blid hakning af væv, kombineret med flowcytometri, for at identificere en særskilt population af lymfatisk endotelceller.
Abstract
Inden for leveren, lymfekar findes inden for portalen triad og deres beskrevne funktion er at fjerne interstitiel væske fra leveren til lymfeknuderne hvor celleaffald og antigener kan være overvåget. Vi er meget interesseret i at forstå, hvordan lymfe Vaskulaturen kan være involveret i inflammation og immun celle fungerer i leveren. Imidlertid meget lidt er blevet offentliggjort om oprettelse af fordøjelsen protokoller til isolering af lymfatisk endotelceller (LECs) fra leveren eller specifikke markører, der kan bruges til at evaluere leveren LECs på basis af pr. celle. Derfor, vi optimeret en metode for fordøjelsen og farvning af leveren for at vurdere befolkningens LEC i leveren. Vi er overbeviste om, at metoden beskrevet her vil være nyttigt for identifikation og dyrkning af LECs fra leveren og vil styrke vores forståelse af hvordan LECs reagere på den lever mikromiljø.
Introduction
Lymfekar og LECs rolle i leveren er ikke velbeskrevet. Mens lymfekar findes inden for portalen Triaden af leveren1 og udvide under sygdom2, er meget lidt forstået med hensyn til funktion og fænotype af LECs inden for leveren. Med opdagelsen af markører, der findes primært på LECs3, vil betydningen af disse celler i forskellige væv nicher i homøostase og sygdom fylde en betydelig kløft i vores forståelse. LECs har en vigtig rolle i bevarelsen perifere tolerance i lymfeknuderne og i metastatisk tumorer ved at interagere direkte med T celler4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs i lymfeknude kan fremme beskyttende immunitet via deres interaktioner med vandrende dendritiske celler14,15,16. Derfor er der flere roller for LECs, som kan være specifikke for væv og interaktioner hvor de er til stede. Men meget lidt er forstået om hvordan LECs omgås immun celler i vævet eller hvordan LECs fungere i forskellige organsystemer; således kan evaluere LECs på pr. celle basis i leveren eller andre organer føre til fremskridt i hvordan LECs program væv-specifik immunitet. Mens meget af den litteratur, der fokuserer på LECs i leveren bruger mikroskopi til at visualisere LECs ved hjælp af en eller to markører og morfologi17, har gjort meget lidt for at evaluere specifikt LECs på grundlag af flowcytometri, selv om en undersøgelse en celle ved celle vurdere forskelle mellem leveren sinusformet endothelial celler (LSECs) og LECs18. At være i stand til at analysere LEC populationer i leveren ved flowcytometri giver mulighed for en tilbundsgående undersøgelse af LEC fænotype under normal homøostase eller sygdom.
For at vurdere LECs ved flowcytometri, er flere overflade markører nødvendige. Typisk er LECs visualiseret ved udtryk for prospero-relaterede HOXD 1 (Prox-1), lymfatisk fartøj endotel hyaluronan receptor 1 (LYVE1) eller vaskulær endotel vækstfaktor receptor 3 (VEGFR3) ved hjælp af mikroskopi. I leveren er udtryk for disse markører ikke begrænset til LECs. Prox-1 udtrykkes bredt af hepatocytter under leveren udvikling, regenerering og skade19, og LYVE1 og VEGFR3 er udtrykt af leveren sinusformet endotelceller18. I lymfeknuderne, LECs identificeres ved hjælp af flowcytometri som klynger af differentiering (CD) CD45-, CD31 + og podoplanin + (PDPN)16. Denne fremgangsmåde er imidlertid alt for minimal at isolere LECs i leveren, da CD45 - CD31 + celler vil fange endotelceller, og den fremherskende befolkning af vascular endothelial celler i leveren er LSECs. Således andre markører er nødvendige for at skelne de sjældne LEC befolkning fra den rigelige LSEC befolkning. Både CD16/32 (udtrykt ved modne LSECs18) og CD146 (en fælles vaskulære endotel celle markør, der er overvejende udtrykt i leveren sinusoids af leveren sinusformet endotelceller20 med lidt at ingen udtryk af lymfe endotelceller21) blev kandidat markører.
Derfor, vi optimeret en metode til at isolere og visualisere LECs i leveren ved hjælp af den ovenstående markører, CD45, CD31, CD146, CD16/32 og PDPN for flowcytometri. Vi beskriver brugen af collagenase IV, DNase 1 og mekanisk separation for levervævet fordøjelsen i en enkelt celle suspension. Vi beskriver også brugen af iodixanol tæthed farveforløb til isolation af ikke-parenkymalt celler (NPC) og at fjerne celleaffald. Endelig bestemme bruger flere markører, vi den optimale flow flowcytometri gating strategi til at identificere LECs fra leveren med PDPN som den fremherskende markør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Colorado Anschutz Medical Campus.
1. forberedelse af materialer
- Gøre en 5 mg/mL opløsning af DNase I fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Gøre en fordøjelsen blanding ved at tilføje 5.000 U/mL collagenase IV kliks EHAA medier.
- Varm fordøjelsen blanding ved 37 ° C i 30 min før brug.
- Gøre en isolation buffer ved at tilføje 4,8% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) at Hanks' afbalanceret saltopløsning (HBSS).
- Gøre en røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer ved at tilføje 100 mM ammoniumklorid, 10 mM KHCO3og 0,1 mM EDTA til destilleret H2O.
2. forberedelse af en enkelt celle Suspension fra en mus lever
- Aflive mus med CO2 og cervikal dislokation.
- Sprøjte ned mus med 70% ethanol til våd dens pels. PIN musens fødder til en dissektion bestyrelse.
- Ved hjælp af dissektion saks til at skære huden omkring 1 cm over anus, være omhyggelig med at skære kun gennem huden (ca. 1 mm). Trække huden væk fra kroppen med tandet pincet og indsætte saks mellem hud og bughinden. Åbn saks for at adskille huden fra bughinden og derefter skære huden fra indsnit til halsen.
- PIN hud til dissektion bestyrelsen ved hjælp af en pin under hver arm og over hvert ben. Træk den peritoneale sac og klip opad mod halsen. Grab lapper i leveren og skære lige under brystbenet.
Bemærk: Omhu bør tages, hvis nogen af leveren vil blive brugt til Immunhistokemi (IHC). - Skær omkring leveren og fjerne leveren fra musen og placere den i 4 mL af kliks EHAA medier.
- Ved hjælp af en skalpel, skær leveren i ~ 1 mm diameter stykker.
- Tilsættes 500 µL af blandingen, fordøjelse og 500 µL af DNase I (2 mg/mL) til leveren.
- Inkuber leveren i 30 minutter ved 37 ° C. Efter 15 min. Bland væsken ved hjælp af 5 mL pipette.
- Efter 30 min inkubation, overføre fordøjet prøven gennem en 100 µm si til en 50 mL konisk slange.
- Skub forsigtigt de resterende stykker gennem filteret med stemplet af en 1-mL sprøjte.
- Vask filteret med 5 mL af isolation buffer og forsigtigt skubbe væv gennem sien med bagsiden af en stemplet fra en 1 mL sprøjte. Gentag dette, indtil filteret vaskes med 25 mL af isolation buffer.
- Der centrifugeres celler på 400 x g for 5 min. omhyggeligt Aspirér off supernatanten.
- Resuspenderes med 4 mL af RBC lysisbuffer. Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 5 min.
- Cellerne vaskes med 10 mL af isolation buffer, og der centrifugeres ved 400 x g i 5 min.
- Tælle celler på en hemocytometer til at bestemme den fulde lever tælle.
- Resuspend celler i 5 mL 20% iodixanol og lag dem med 1 mL PBS.
- Der centrifugeres celler på 300 x g i 15 min. uden bremse.
- Fjern lag mellem PBS og iodixanol og placere dem, gennem en 100 µm filter, ind i en ny 50 mL konisk rør.
- Cellerne vaskes med 10 mL af isolation buffer, og der centrifugeres ved 400 x g i 5 min.
- Supernatanten og resuspend celler i 500 µL af PBS med 2% føtal bovint serum (FBS).
3. flow Cytometric analyse af enkelt celler fra leveren
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og mikroskop, benytter trypan blå udelukkelse til at måle levedygtige celler. Tilføje 10 µL af celler til 10 µL af trypan blå og straks placerer dem på en hemocytometer og tælle de levende celler (ikke blå) under et mikroskop. Derefter beregne antallet af celler pr. microliter.
- Alikvot ca 5 millioner af de tilbageværende nonparenchymal celler i en enkelt brønd af en 96-brønd plade.
- Der centrifugeres celler ved 400 x g i 5 min.
- Supernatanten og resuspend celler i 90 µL af PBS med 2% FBS.
- Tilføje anti-CD45 (1:200), anti-CD146 (1:200), anti-CD31 (1:200) og PDPN (1:200) opløses i 10 µL af 10 x 2.4G2 eller anti-CD16/32 (1:200).
Bemærk: Ingen Fc blok (2.4G2) blev brugt, da anti-CD16/32-mærket antistof blev brugt. - For at afgøre, hvor der fastsættes positive og negative gates, omfatte et fluorescens minus én (FMO) pletten for hver farve og en isotype kontrol antistof.
- For at bestemme live versus døde celler, pletten med en levedygtighed markør (fx ghost røde 780). Inkuber celler ved 4 ° C i 30 min.
- Cellerne vaskes med 100 µL af PBS med 2% FBS.
- Brug en lille alikvot af celler til at justere indstillingerne laser og kompensation på flow-Flowcytometret. Pletten celler med et antistof til hvert enkelt fluorophore og en uden nogen antistof.
Bemærk: Afhængigt af flow forskellige anvendes, bør der etableres en kompensationsmatrix fjerne spektrale overlapning. - Placer prøveglas på forskellige sonden og indsamle og registrere alle begivenheder.
4. dataanalyse
- Ser man på side-scatter vs forward scatter område, gate på "live" celler baseret på størrelse og detaljeringsgrad og levedygtighed markør farvestof.
- Næste, ved hjælp af CD45 strålende Violet 510 og CD31 PerCp Cy5.5, gate på CD45 - CD31 + celler ved hjælp af isotype kontrol og FMO for at bestemme positive og negative populationer.
- Endelig bruger CD146 v450 eller CD16/32 FITC og PDPN APC, tage CD146 - PDPN + eller CD16/32-PDPN + celler, igen med isotype kontrol og FMO, til at bestemme positive og negative populationer. Disse celler er LECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Undersøgelser analysere lever lymfevejene har primært brugt Immunohistokemi til at kvantificere frekvens og diameter af lymfekar i leveren. Denne metode tillader imidlertid ikke til evaluering af LECs på grundlag af celle-by-celle eller udtryk for flere markører, cytokiner, kemokiner eller transkriptionsfaktorer. Derfor, vi spurgte om leveren LECs kunne isoleres fra leveren og evalueret ved hjælp af flowcytometri. Tidligere arbejde isolere lymfeknude LECs blev udført ved hjælp af Liberase DL (collagenase i-II-og-dispase) og DNase 1 kombineret med den mekaniske adskillelse af lymfeknude væv med nåle14,16. Derfor, den samme fordøjelse protokollen om levervæv blev brugt, eller collagenase IV og DNase 1 blev brugt som tidligere beskrevet for immun celle isolation fra den lever22 og fulgt fordøjelse med en tæthed gradient separation (iodixanol) trin til fjerne hepatocytter og øge hyppigheden af andre celletyper i leveren (figur 1A). Efter lever fordøjelse og centrifugering med tæthed farveforløb, blev cellerne farves med CD45, CD31, PDPN og CD16/32. CD16/32 er blevet beskrevet for at udtrykkes ved modne LSEC populationer, men ikke LEC populationer18. Således LECs var gated som CD45-, CD31 +, CD16/32-, PDPN + celler, mens LSECs var gated som CD45-, CD31 +, CD16 / 32 + og PDPN-(figur 1A). Gates var indstillet på levende celler (ghost rød negativ) og baseret på isotype kontrol og FMO farvning (figur 1A). LYVE-1 APC på befolkningens LEC blev også bekræftet (figur 1B). Begge metoder tilladt visualisering af LEC befolkning inden for leveren; profilen farvning af celler var dog visuelt bedre, når du bruger collagenase IV og DNase 1 end collagenase jeg-II-og-dispase (figur 1 c). Derfor, alle fremtidige manipulationer blev udført ved hjælp af collagenase IV og DNase 1, som beskrevet i protokollen. I gennemsnit fået vi cirka 1.300 LECs per gram af levervævet eller 2,200 LECs pr. naive leveren, ved hjælp af denne fordøjelsen metode.
At optimere gating strategi og kombination af fluorophores og eliminere forurening af LSECs anvendtes både CD16/32 og CD146. CD16/32 Fc gamma receptorer II og III og udtrykkes på modne LSECs, men ikke på LECs18. CD16/32 kunne skelne PDPN + CD16/32-cellerne fra PDPN-CD16 / 32 + celler, især når du bruger PDPN konjugeret til APC eller PE og CD16/32 konjugeret FITC (figur 1A), men mindre godt Hvornår PDPN blev konjugeret til PE-Cy7 (figur 1 c). Udtryk for CD16/32 findes ikke på LECs men er fundet på LSECs. FC blok bruger CD16/32 antistof til at minimere Fc receptor binding og nonantigen specifikke binding af immunoglobuliner til Fc-receptorer. Da CD16/32 blev brugt til at visualisere LSECs, ikke-specifik binding af immunoglobuliner var højere og CD146 var optimeret som et alternativ til at måle LSECs. Derfor, vi har testet CD146 konjugeret til V450, vaskulære endotel celle markør udtrykt meget af LSECs og andre vaskulære endotel celler20 men med lav til ikke udtryk af LECs23. Vi først optimeret farvning af CD146 ved hjælp af FMO og isotype kontrolelementer for både CD16/32 og CD146 (figur 2A). Hvis vi evalueret kun CD16 / 32 + celler eller CD16/32-celler, CD16 / 32 + celler var alle CD146 + og PDPN - mens CD16/32-celler var primært CD146 - og enten PDPN- eller PDPN + (figur 2B). For at bekræfte denne farvning, blev FMO brugt. Ved at fjerne PDPN fra pletten, forsvandt PDPN + befolkningen (figur 2 c). Interessant nok, var der ingen CD146 + PDPN + celler, bekræfter, at CD146 ikke eller meget kærlig udtrykkes ved PDPN + LECs. Dermed, vi er overbeviste om, at en af disse markører kan bruges til gate ud vaskulære endotel celler i leveren.
For at validere yderligere, at PDPN er en relevant markør for LECs, var leveren sektioner fra mus farves med både PDPN (grøn) og F4/80 (brun) (figur 3A). Vaskulære endotel hverken makrofager udtrykt PDPN i murine leveren. Vi var også i stand til at skelne mellem cholangiocytes, som kan plette positiv for PDPN, fra lymfekar, baseret på de forskellige nukleare strukturer i galdegangene og af cytokeratin 7 farvning (figur 3B, red: cytokeratin 7, grøn: PDPN). Da flere markører bruges til flowcytometri, såsom CD31, som ikke er udtrykt ved cholangiocytes24, vi er overbeviste om, at vi fjerner disse celler fra analysen, hvilket bekræfter at celler fra leveren, der er CD45-, CD31 +, CD146 Lo/neg, CD16/32-, og PDPN + er LECs. Endelig, for at dokumentere at de farvede celler er LECs, vi sorteret denne population af celler og anvendes kvalitative real-time polymerase kædereaktion til at evaluere Vegfr3 og prox-1 udtryk. Både Vegfr3 og prox-1 blev evalueret, som disse udskrifter er udtrykt af andre celler i leveren —prox1 af hepatocytter og Vegfr3 af LSECS (blandt andre) — men ingen andre celler udover LECs udtrykke begge. Udtryk for begge disse markører var betydeligt højere i de sorterede befolkning end i kulturperler murine makrofager cellelinje (RAW264.7), som udtrykker ikke normalt disse markører, men lignende i udtryk til kulturperler murine LECs (figur 3 c ).
Figur 1 : Repræsentant flow flowcytometri analyse af collagenase jeg-II-dispase og collagenase IV-fordøjet murine leveren væv. (A) dette panel viser den gating strategi, fluorescens minus én farvning, og isotype styrer under proceduren. (B) dette panel viser LYVE-1 farvning af CD16/32-PDPN + celler. (C) dette panel viser den endelige flow flowcytometri gate efter fordøje mus lever med enten collagenase jeg-II-dispase (f.eks.Liberase DL) eller collagenase IV og evaluere CD16/32 PerCP X PDPN PE-Cy7 hvor LECs er CD16/32- og PDPN +. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Identifikation af CD146 og PDPN som passende markører for leveren lymfe endotelceller. (A) dette panel viser fluorescens minus one og isotype styringer til CD16/32 (venstre) og CD146 (til højre). (B) dette panel viser gated CD16/32 positive eller negative celler bestemmes fra panelet A. Vist er CD146XPDPN fra begge befolkningsgrupper. (C) dette panel viser fluorescens minus én til PDPN at demonstrere at farvning er fraværende når antistoffet er ikke tilføjet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Identifikation af flow PDPN + celler som lymfe endotelceller. (A) dette panel viser repræsentative Immunhistokemi fra en mus lever farves med PDPN (blå/grøn) og F4/80 (brun). Lymfatisk fartøj (LV), blodkar (BV) og makrofager (MF) er mærket. Skalalinjen = 100 µm. Formalin-fast paraffin-embedded væv var deparaffinized i 20 min. i xylen. Væv var hydreret for at vand gennem et forløb af ethanol, og antigen hentning blev udført ved brug af pH 6 antigen hentning buffer i en trykkoger for 15 min. væv blev blokeret ved hjælp af 0,1% BSA og farves ved hjælp af anti-mus PDPN og anti-mus F4/80 i 1 time ved stuetemperatur temperatur. Anti-hamster IgG HRP og anti-kanin IgG HRP blev brugt som sekundære antistoffer. 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) + og Vina grøn blev brugt til at registrere F4/80 og PDPN, henholdsvis. Væv var counterstained med hæmatoxylin og afbildet på et mikroskop. (B) dette panel viser den samme eksperiment udføres som i panelet , undtagen her, PDPN er vist i grøn, cytokeratin 7 i rød og 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i blå. Skalalinjen = 100 µm. væv blev blokeret ved hjælp af 5% æsel og 5% ged serum og farves ved hjælp af anti-mus PDPN (8.1.1) 1: 100 og anti-mus cytokeratin 7 1:200 i 1 time ved stuetemperatur. Anti-hamster IgG AF647 og anti-kanin IgG-PE blev brugt som sekundære antistoffer. Væv var counterstained med DAPI og afbildet. Skalalinjen = 100 µm. Lymfatisk fartøj (LV), blodkar (BV) og galdegang (BD) er mærket. (C) dette panel viser en log fold ændre i Vegfr3 og prox-1 udtryk fra sorterede leveren LECs baseret på farvning i protokol (CD45-, CD31 +, CD146lo/negog PDPN +) i forhold til rå celler eller primære murine lymfeknude LECs. Sorterede celler blev overført gennem en polymer-neddeling kolonne, RNA blev udvundet ved hjælp af en RNA udvinding kit og cDNA foregik ved hjælp af en reverse transkription kit. Udskrift overflod var normaliseret til husholdning genet, Gapdh, for hver prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LECs overordnede betydning i immun homøostase og forordning har for nylig kommet til lys25. Meget af den offentliggjorte lymfe litteratur fokuserer på huden og lymfeknuder; dog lymfevejene findes i hele kroppen26 , og således, vores forståelse af deres betydning i forskellige organer er nødvendig. Her viser vi en metode, hvor LECs i leveren kan studeres på en celle-by-celle grundlag for bedre at forstå deres samstemmende udtryk for forskellige celleoverflademarkører, cytokiner, kemokiner og intracellulære proteiner som transkriptionsfaktorer. Denne metode vil være nyttig for fremtidige undersøgelser at vurdere fænotype og funktion af LECs i leveren under sundhed og sygdom.
En af forhindringerne for identificering af LECs i leveren er forholdsvis lav hyppighed i forhold til andre celletyper. Hepatocytter fyldes op omkring 80% af leveren, og at fjerne disse celler ved hjælp af tæthed farveforløb (iodixanol) før kører leveren på en flow forskellige kræver mindre tid og således giver bedre levedygtighed. For at kunne skille befolkning af LYVE1 + LECs i leveren fra LYVE1 + LSECs, brugte vi markører CD16/32 og CD146 fundet på LSECs og med lav til ikke udtryk af LECs. Dette, kombineret med manglende eller lav udtryk af PDPN af alle andre endotel celler i leveren, tilladt validering ved flowcytometri at befolkningen vi identificeret var LECs. Downstream transcriptional analyse bekræftet, at denne gating strategi produceret LECs (figur 3 c).
Isolering af LECs fra lymfeknude er bedst sker ved hjælp af collagenase jeg-II-og-dispase; Vi fandt dog, at mens denne metode uddrag LECs fra leveren, en lever fordøjelsen protokol bruger collagenase IV giver en bedre downstream analyse ved hjælp af flowcytometri. Ved hjælp af en mekanisk afbrydelse af leveren tillader collagenase mere areal til bedre interagere med de ekstracellulære matrix-associerede celler, som LECs, og ved hjælp af kliks EHAA medier uden FBS tillader for fordøjelsen af leveren til at opstå på kun 30 min. Denne nedsat tid vedligeholder LEC levedygtighed for downstream assays som flowcytometri eller flow sortering. Ja, vi var købedygtig genoprette nok levedygtige celler for at visualisere LECs ved flowcytometri og flow sortering for downstream transcriptional analyse.
Kombineret, adskillelse af hepatocytter fra de ikke-parenkymalt celler, brugen af collagenase type IV, og afklaring og demonstration af markører specifikke for LECs i leveren og markører specifikke for andre endotel cellepopulationer, såsom CD16/32 og CD146, tillod den korrekt identifikation af LECs i leveren. Disse metoder udfylde en betydelig kløft i litteraturen om hvordan LECs i leveren kan identificeres ved flowcytometri, især da leveren indeholder en række andre celler, der udtrykker markører kendt for at være unikke for LECs i lymfeknude (prox1 og vegfr3). Derfor, disse metoder vil føre til downstream undersøgelser vedrørende LEC leverfunktionen. Desuden, kan denne metode ændres til andre væv for bedre at kunne vurdere væv-specifikke LEC markører og undersæt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke GI og leveren medfødte immun programmer til støtte for dette projekt. B.A.J.T. er også finansieret af R01 AI121209.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1) | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100 μm cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 mL conical | Truline | TR2004 | |
| 15 mL conical | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µL pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10 mL pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5 mL pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
- Tanaka, M., Iwakiri, Y.
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
- Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
- Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
- Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
- Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
- Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
- Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
- Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
- Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
- Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
- Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
- Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
- Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
- Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
- Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
- Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).
