Summary
Het doel van dit protocol is het identificeren van lymfatische endothelial cel populaties binnen de lever beschreven markeringen gebruiken. Wij gebruiken collagenase IV en DNase en een zachte hakken van weefsel, gecombineerd met stroom cytometry, ter identificatie van een aparte populatie van lymfatische endotheliale cellen.
Abstract
Binnen de lever, lymfevaten binnen de portal triad worden gevonden, en hun beschreven functie is om de interstitiële vloeistof van de lever naar de lymfeklieren waar cellulaire puin en antigenen kunnen worden onderzocht. Wij zijn zeer geïnteresseerd in het begrip van hoe de lymfatische therapieën kan worden betrokken bij de ontsteking en immuun cel functie binnen de lever. Echter zeer weinig is gepubliceerd tot oprichting van de spijsvertering protocollen voor de isolatie van lymfatische endotheliale cellen van de lever of de specifieke markeringen die kunnen worden gebruikt voor het evalueren van de lever (LECs) LECS-server op basis van de per cel. Daarom geoptimaliseerd we een methode voor de spijsvertering en de kleuring van de lever om te evalueren van de LEC-bevolking in de lever. Wij zijn ervan overtuigd dat de hier geschetste methode nuttig voor de identificatie en de isolatie van de LECS-server uit de lever zijn zal en ons begrip van hoe de LECS-server op de lever communicatie reageren zal versterken.
Introduction
De rol van lymfevaten en de LECS-server in de lever niet goed wordt begrepen. Terwijl lymfevaten zijn te in de portal triade van de lever1 vinden en uit te tijdens ziekte2 breiden, is weinig begrepen met betrekking tot de functie en het fenotype van de LECS-server binnen de lever. Met de ontdekking van de markeringen die zijn gevonden voornamelijk op de LECS-server3, vult het belang van deze cellen binnen verschillende weefsel niches in de homeostase en ziekte een belangrijke leemte in ons begrip. LECS-server hebben een belangrijke rol bij het handhaven van perifere tolerantie in de lymfeklier en gemetastaseerde tumoren door direct interactief werken met T cellen4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs in de lymfeklier protectieve immuniteit via hun interacties met15,16van de14,van de trekkende dendritische cellen kunnen bevorderen. Daarom zijn er meerdere functies voor LECs die specifiek zijn voor de weefsels en interacties waarin ze aanwezig zijn. Maar is weinig begrepen over hoe de LECS-server interactie met immune cellen in het weefsel of hoe LECs functioneren in verschillende orgaansystemen; Dus, LECs evalueren op basis van per cel binnen de lever of andere organen kan leiden tot vooruitgang in hoe LECs program weefsel-specifieke immuniteit. Terwijl veel van de literatuur die zich op de LECS-server in de lever richt microscopie gebruikt om te visualiseren LECS-server met behulp van één of twee markeringen en morfologie17, is heel weinig gedaan om de LECS-server specifiek te evalueren op basis van cel voor cel met behulp van stroom cytometry, hoewel een studie verschillen tussen sinusvormige endotheliale cellen van de lever (LSECs) en LECs18evalueren. Kunnend analyseren LEC populaties in de lever door stroom cytometry voorziet de grondige studie van LEC fenotype tijdens normale homeostase of ziekte.
Om te beoordelen LECs door stroom cytometry, zijn meerdere oppervlakte markeringen nodig. Typisch, LECs worden gevisualiseerd door de expressie van prospero-gerelateerde homeobox 1 (Prox-1), de lymfatische vaartuig endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1) of de vasculaire endotheliale groeifactor receptor 3 (VEGFR3) met behulp van microscopie. In de lever is de uitdrukking van deze markers echter niet beperkt tot de LECS-server. ProX-1 is wijd van hepatocyten tijdens lever ontwikkeling, regeneratie en letsel19, en LYVE1 en VEGFR3 worden geuit door de endotheliale cellen van de lever sinusvormige18. In de lymfeklier, LECs worden geïdentificeerd met behulp van stroom cytometry als clusters van differentiatie (CD) CD45 - CD31 + en podoplanin + (PDPN)16. Deze aanpak is echter ook minimale LECs in de lever te isoleren omdat CD45 - CD31 + cellen endotheliale cellen vangen zal, en de overheersende bevolking van vasculaire endotheliale cellen in de lever LSECs zijn. Zo nodig andere markeringen zijn te onderscheiden van de zeldzame LEC-bevolking uit de overvloedige LSEC populatie. Zowel CD16/32 (uitgedrukt door volwassen LSECs18) en CD146 (een gemeenschappelijke vasculaire endothelial cel markering die wordt hoofdzakelijk binnen de lever sinusoïdes uitgedrukt door endotheliale cellen van de lever sinusvormige20 met weinig tot geen expressie door lymfatisch endotheliale cellen21) werden kandidaat-markeringen.
Daarom geoptimaliseerd we een methode voor het opsporen en visualiseren van de LECS-server in de lever met behulp van de bovenstaande markeringen, CD45, CD31, CD146, CD16/32 en PDPN voor stroom cytometry. We beschrijven het gebruik van collagenase IV, DNase 1 en mechanische scheiding voor leverweefsel vertering in de schorsing van een eencellige. Ook beschrijven we het gebruik van iodixanol dichtheid verloop voor de isolatie van niet-parenchymal cellen (NPC) en te elimineren cellulaire puin. Ten slotte, met behulp van meerdere markeringen, we de optimale stroom cytometry gating strategie te identificeren van de LECS-server van de lever met PDPN als overheersende markering bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Colorado Anschutz medische Campus.
1. voorbereiding van de materialen
- Maak een oplossing van 5 mg/mL van DNase ik in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Maak een mengsel van de spijsvertering door 5.000 U/mL collagenase IV aan Klik op de EHAA media toe te voegen.
- Verwarm het mengsel van de spijsvertering bij 37 ° C gedurende 30 minuten vóór gebruik.
- Een isolatie buffer maken door toevoeging van 4,8% bovien serumalbumine (BSA) en 2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) naar Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBSS).
- Een rode bloedcellen (RBC) lysis -buffermengsel maken door toevoeging van ammoniumchloride 100 mM, 10 mM KHCO3en 0.1 mM EDTA aan gedistilleerd H2O.
2. voorbereiding van de schorsing van een eencellige uit de lever van een muis
- De muis met CO2 en cervicale dislocatie euthanaseren.
- Spray de muisknop met 70% ethanol te nat zijn vacht ingedrukt. PIN van de muis voeten een dissectie-Board.
- Met behulp van dissectie schaar te knippen de huid ongeveer 1 cm boven de anus, voorzichtig om te knippen alleen via de huid (ongeveer 1 mm). Trek de huid van het lichaam met een getande Tang en voeg de schaar tussen de huid en buikvlies. Open de schaar te scheiden van de huid van het buikvlies, knip dan, de huid van de incisie aan de hals.
- PIN de huid aan het bestuur van de dissectie gebruikt één pin onder elke arm en boven elk been. De peritoneale sac optrekken en snijd omhoog naar de nek. Pak de lobben van de lever en snijd net onder het borstbeen.
Opmerking: Let erop als elk van de lever zal worden gebruikt voor immunohistochemistry (IHC). - Knippen rond de lever en de lever van de muis verwijderen en deze plaatsen in 4 mL klik van EHAA media.
- Met behulp van een scalpel, knip de lever in ~ 1 mm diameter stukken.
- Voeg 500 µL van het mengsel van de spijsvertering en 500 µL van de DNase I (2 mg/mL) bij de lever.
- Incubeer de lever gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Na 15 min, meng de vloeistof met behulp van een precisiepipet 5 mL.
- Na 30 min van incubatie, overbrengen in het verteerd monster door een zeef van 100 µm een conische tube van 50 mL.
- Duw voorzichtig de resterende stukken door het filter met de zuiger van een injectiespuit 1 mL.
- Was het filter met 5 mL isolatie buffer en duw voorzichtig het weefsel door de zeef met de achterkant van een zuiger van een injectiespuit 1 mL. Herhaal dit totdat het filter wordt gewassen met 25 mL van isolatie buffer.
- Centrifugeer de cellen bij 400 x g voor 5 min. zorgvuldig uit het supernatant gecombineerd.
- Resuspendeer de pellet met 4 mL lysis-buffermengsel van RBC. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Wassen van de cellen met 10 mL isolatie buffer en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min.
- De cellen op een hemocytometer om te bepalen van de volledige lever telling tellen.
- Resuspendeer de cellen in 5 mL 20% iodixanol en laag hen met 1 mL PBS.
- Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 15 minuten zonder een rem.
- Verwijder de laag tussen het PBS en de iodixanol en plaats hen, via een 100 µm filter, in een nieuwe conische tube van 50 mL.
- Wassen van de cellen met 10 mL isolatie buffer en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 µL van PBS met 2% foetale runderserum (FBS).
3. flow cytometrische analyse van enige cellen van de lever
- De cellen met behulp van een hemocytometer en de Microscoop, met behulp van trypan blauwe uitsluiting voor het meten van levensvatbare cellen te tellen. 10 µL van de cellen toevoegen aan 10 µL van trypan blauw en onmiddellijk plaats ze op een hemocytometer en tellen de levende cellen (niet blauw) onder een microscoop. Vervolgens Bereken het aantal cellen per microliter.
- Aliquot ongeveer 5 miljoen van de resterende nonparenchymal cellen in een enkel putje van een 96-wells-plaat.
- Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 90 µL van PBS met 2% FBS.
- Anti-CD45 (1:200), anti-CD146 (1:200), anti-CD31 (1:200) en PDPN (1:200) verdund in 10 µL van 10 x 2.4G2 of anti-CD16/32 (1:200) toevoegen.
Opmerking: Geen Fc blok (2.4G2) werd gebruikt als anti-CD16/32-gelabeld antilichaam werd gebruikt. - Om te bepalen waar de positieve en negatieve poorten moeten worden vastgesteld, bevatten een fluorescentie minus één (FMO) vlek voor elke kleur en een isotype controle antilichaam.
- Om te bepalen live versus dode cellen, vlek met een levensvatbaarheid marker (bijv ghost rode 780). Incubeer de cellen bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Wassen van de cellen met 100 µL van PBS met 2% FBS.
- Gebruik een kleine hoeveelheid cellen aan te passen de laser en compensatie-instellingen op de cytometer van de stroom. De cellen met een antilichaam aan elke afzonderlijke fluorophore en een zonder een antilichaam vlek.
Opmerking: Afhankelijk van de stroom cytometer wordt gebruikt, moet een compensatie-matrix worden vastgesteld om het verwijderen van spectrale overlap. - Plaats het monsterbuisje op de cytometer sonde en verzamelen en vastleggen van alle gebeurtenissen.
4. de gegevensanalyse
- Op zoek naar kant-scatter gebied vs. vooruit-scatter gebied, gate op "live" cellen op basis van grootte en granulariteit en levensvatbaarheid marker kleurstof.
- Vervolgens met behulp van CD45 briljante Violet 510 en CD31 PerCp Cy5.5, gate op de CD45 - CD31 +-cellen de isotype besturingselementen en FMO gebruiken om te bepalen van positieve en negatieve populaties.
- Ten slotte, met behulp van CD146 v450 of CD16/32 FITC en PDPN APC, nemen de CD146 - PDPN + of CD16/32-PDPN + cellen, opnieuw gebruikend isotype besturingselementen en FMO, om te bepalen van positieve en negatieve populaties. Deze cellen zijn de LECS-server.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studies analyseren lever lymfatische hebben hoofdzakelijk immunohistochemistry gebruikt aan het kwantificeren van de frequentie en de diameter van de lymfevaten in de lever. Echter, deze methode niet mogelijk voor de evaluatie van de LECS-server op basis van de cel-door-cel of voor de expressie van meerdere markeringen, cytokines, chemokines of transcriptiefactoren. Dus we vroegen of lever LECs kon worden geïsoleerd uit de lever en geëvalueerd aan de hand van stroom cytometry. Vorige werk isoleren lymfeklier LECs werd uitgevoerd met behulp van Liberase DL (collagenase i-II-en-dispase) en DNase 1 gecombineerd met het machinaal scheiden van de lymfeklier weefsel met naalden14,16. Daarom hetzelfde spijsvertering protocol op leverweefsel werd gebruikt, of collagenase IV en DNase 1 werd gebruikt als eerder beschreven, voor immuun cel los van de lever22 en de spijsvertering met een dichtheid verlopende scheiding (iodixanol) stap naar gevolgd verwijderen van hepatocyten en verhogen van de frequentie van andere celtypes binnen de lever (figuur 1A). Na de spijsvertering van de lever en centrifugeren met het verloop van de dichtheid, de cellen werden gekleurd met CD45, CD31, PDPN en CD16/32. CD16/32 is bestempeld te worden uitgedrukt door de volwassen populaties van LSEC, maar niet LEC populaties18. Dus, LECs waren gated als CD45-, CD31 +, CD16/32-, PDPN + cellen, terwijl LSECs als CD45-, CD31 +, CD16 waren gated / 32 + en PDPN-(figuur 1A). Poorten waren op levende cellen (ghost rode negatief) en op basis van isotype besturingselementen en FMO kleuring (figuur 1A). LYVE-1 APC op de LEC-bevolking werd ook bevestigd (figuur 1B). Beide methoden mogen de visualisatie van de LEC-bevolking binnen de lever; echter, de kleuring Profiel van de cellen was visueel beter bij het gebruik van collagenase IV en DNase 1 dan collagenase ik-II-en-dispase (Figuur 1 c). Daarom, alle toekomstige manipulaties werden uitgevoerd met behulp van collagenase IV en DNase 1, zoals beschreven in het protocol. Gemiddeld, verkregen we ongeveer 1.300 LECS-server per gram leverweefsel of 2.200 LECS-server per naïef lever, met behulp van deze methode van de spijsvertering.
Om de gating strategie en de combinatie van fluorophores te optimaliseren en te elimineren van verontreiniging van de LSECs, werden zowel CD16/32 en CD146 gebruikt. CD16/32 Fc gamma receptoren II en III en op volwassen LSECs maar niet op LECs18wordt uitgedrukt. CD16/32 kon onderscheiden van de PDPN + CD16/32-cellen van de PDPN-CD16 / 32 + cellen, met name wanneer met behulp van PDPN geconjugeerd met APC of PE en CD16/32 geconjugeerd FITC (figuur 1A), maar minder goed wanneer PDPN was geconjugeerd met PE-Cy7 (Figuur 1 c). De expressie van CD16/32 is niet gevonden op de LECS-server maar is te vinden op LSECs. FC blok gebruikt het antilichaam CD16/32 om te minimaliseren van de Fc receptor binding en de specifieke binding nonantigen van immunoglobulinen aan de Fc receptoren. Aangezien CD16/32 werd gebruikt om te visualiseren van LSECs, de niet-specifieke binding van immunoglobulinen was hoger en CD146 als alternatief voor het meten van LSECs werd geoptimaliseerd. Dus we getest CD146 geconjugeerd met V450, een marker van de vasculaire endothelial cel sterk uitgedrukt door LSECs en andere vasculaire endotheliale cellen20 maar met lage tot geen expressie door LECs23. We geoptimaliseerd eerst de kleuring van CD146 met behulp van FMO en isotype besturingselementen zowel CD16/32 en CD146 (figuur 2A). Als we alleen de CD16 geëvalueerd / 32 + cellen of de CD16/32-cellen, de CD16 / 32 + cellen waren alle CD146 + en PDPN - terwijl de CD16/32-cellen hoofdzakelijk CD146 - en PDPN- of PDPN + (figuur 2B waren). Om te bevestigen deze kleuring, werd FMO gebruikt. Door PDPN van het verwijderen van de vlek, verdwenen de bevolking PDPN + (figuur 2C). Interessant, waren er geen CD146 + PDPN + cellen, bevestigt dat CD146 niet of zeer nederig uit zich door PDPN + LECS-server. Dus, we zijn ervan overtuigd dat een van deze markeringen kunnen worden gebruikt door naar gate vasculaire endotheliale cellen in de lever.
Als u wilt verder valideren dat PDPN een geschikte marker voor LECs is, werden lever secties van muizen gekleurd met zowel PDPN (groen) en F4/80 (bruin) (figuur 3A). PDPN uitgedruktin de lymfkliertest lever het vasculaire endotheel noch de macrofagen. We konden ook onderscheiden van de cholangiocytes, die kan vlek positief voor PDPN, van lymfevaten, gebaseerd op de verschillende nucleaire structuren van de galwegen en door cytokeratin 7 kleuring (figuur 3B; rood: cytokeratin 7, groen: PDPN). Aangezien meerdere markeringen worden gebruikt voor stroom cytometry, zoals CD31, die niet is uitgedrukt door cholangiocytes24, wij zijn ervan overtuigd dat we deze cellen verwijdert uit de analyse, daarmee bevestiging dat cellen van de lever die CD45-, CD31 +, CD146 Lo/neg, CD16/32-, en PDPN + LECS-server. Tot slot, om te bewijzen dat de gekleurde cellen LECs zijn, we deze bevolking van cellen gesorteerd en kwalitatieve real-time polymerasekettingreactie gebruikt om de Vegfr3 en prox-1 expressies te evalueren. Zowel de Vegfr3 als de prox-1 werden geëvalueerd, zoals deze afschriften worden uitgedrukt door andere cellen in de lever —prox1 door de hepatocyten en Vegfr3 door de LSECS (o.a.) — maar geen andere cellen naast LECs express beide. De uitdrukking van deze beide markeerders was significant hoger in de gesorteerde bevolking dan in de gekweekte lymfkliertest macrofaag cellijn (RAW264.7), die doet niet normaal deze markers te uiten, maar is qua expressie aan gekweekte lymfkliertest LECs (Figuur 3 c ).
Figuur 1 : Representatief stroom cytometry analyse van collagenase ik-II-dispase en collagenase IV-verteerd lymfkliertest leverweefsel. (A) dit paneel toont de gating strategie, fluorescentie minus één kleuring, en isotype controls voor de procedure. (B) dit paneel toont de LYVE-1 kleuring CD16/32-PDPN + cellen. (C) dit paneel toont de laatste stroom cytometry poort na het verteren van muis levers met beide collagenase ik-II-dispase (b.v.Liberase DL) of collagenase IV en CD16/32 PerCP X PDPN PE-Cy7 waar de LECS-server CD16/32 zijn evaluatie- en PDPN +. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Identificatie van CD146 en PDPN als passende markeringen voor endotheliale cellen van de lever lymfatische. (A) dit paneel toont fluorescentie minus één en isotype besturingselementen voor CD16/32 (links) en CD146 (rechts). (B) dit paneel toont gated CD16/32 positief of negatief cellen bepaald van paneel A. Weergegeven, is de CD146XPDPN van beide populaties. (C) dit paneel toont fluorescentie min één voor PDPN om aan te tonen dat de kleuring is afwezig wanneer het antilichaam wordt niet toegevoegd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Zo lymfatische endotheliale cellen van de cellen van de identificatie van stroom PDPN +. (A) dit paneel toont representatieve immunohistochemistry van een muis lever gekleurd met PDPN (blauw/groen) en F4/80 (bruin). De lymfatische vaartuig (LV) bloedvat (BV) en de macrofaag (MF) worden aangeduid. Schaal bar = 100 µm. formaline-vaste paraffine-ingebedde weefsel was deparaffinized gedurende 20 min. in xyleen. Weefsels werden gehydrateerd water door middel van een gradiënt van ethanol, and antigeen retrieval werd uitgevoerd met behulp van pH 6 antigeen ophalen buffer in een snelkookpan voor 15 min. weefsel is geblokkeerd met behulp van 0,1% BSA en gekleurd met behulp van anti-muis PDPN en anti-muis F4/80 gedurende 1 uur op de kamer temperatuur. Anti-hamster IgG HRP en anti-konijn IgG HRP werden gebruikt als secundaire antilichamen. 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) + en Vina groen werden gebruikt voor het detecteren van de F4/80 en PDPN, respectievelijk. Weefsel was counterstained met haematoxyline en beeld op een microscoop. (B) dit paneel toont hetzelfde experiment uitgevoerd als in deelvenster A, behalve hier, PDPN in groen, cytokeratin 7 in rood en 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in het blauw wordt weergegeven. Schaal bar = 100 µm. weefsel is geblokkeerd met behulp van de ezel van de 5% en 5% geit serum en gekleurd met behulp van anti-muis PDPN (8.1.1) 1:100 en anti-muis cytokeratin 7 1:200 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Anti-hamster IgG AF647 en anti-konijn IgG-PE werden gebruikt als secundaire antilichamen. Weefsel was counterstained met DAPI en beeld. Schaal bar = 100 µm. De lymfatische vaartuig (LV) bloedvat (BV) en de gal duct (BD) worden aangeduid. (C) dit paneel toont een log vouw wijzigen in Vegfr3 en prox-1 expressie van gesorteerde lever LECS-server op basis van de kleuring van het protocol (CD45-, CD31 +, CD146lo/negen PDPN +) in vergelijking met ruwe cellen of primaire lymfkliertest lymfeklier LECS-server. Gesorteerde cellen werden doorgegeven door een kolom biopolymeer-Shredder, RNA is geëxtraheerd met behulp van een RNA extractie kit en cDNA is gemaakt met behulp van een omgekeerde transcriptie kit. Transcript overvloed was genormaliseerd naar het huishouden gen, Gapdh, voor elk monster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het algemene belang van LECs in immuun homeostase en verordening gekomen onlangs tot lichte25. Veel van de gepubliceerde lymfatische literatuur focust op de huid en lymfklieren; echter, lymfatische worden aangetroffen in het lichaam26 , en dus ons begrip van hun belang in verschillende organen nodig is. Hier laten we een methode waarin de LECS-server in de lever kunnen worden bestudeerd op basis van cel-door-cel om hun gelijktijdige uitdrukking van verschillende oppervlakte markeringen, cytokines, chemokines en intracellulaire eiwitten zoals transcriptiefactoren beter te begrijpen. Deze methode zal bruikbaar zijn voor toekomstige studies om te evalueren van de fenotype en de functie van de LECS-server in de lever bij gezondheid en ziekte.
Een van de hindernissen voor de identificatie van de LECS-server in de lever is hun relatief lage frequentie in vergelijking met andere celtypes. Hepatocyten make-up ongeveer 80% van de lever, en het verwijderen van deze cellen met behulp van dichtheid verloop (iodixanol) voordat de lever waarop een stroom cytometer minder tijd vergt en dus beter levensvatbaarheid biedt. Om te onderscheiden van de bevolking van LYVE1 + LECs in de lever van LYVE1 + LSECs, gebruikten we de markers CD16/32 en CD146 te vinden op LSECs en met lage tot geen uitdrukking door de LECS-server. Dit, in combinatie met het gebrek aan of lage uitdrukking van PDPN door een willekeurige andere endothelial cel in de lever, de validatie door stroom cytometry dat de bevolking dat wij geconstateerd LECS-server waren toegestaan. Inderdaad, stroomafwaarts transcriptionele analyse bevestigd dat deze gating strategie geproduceerd LECs (Figuur 3 c).
De isolatie van de LECS-server uit de lymfeklier is best gedaan met behulp van collagenase ik-II-en-dispase; we vonden echter dat, terwijl deze methode wordt uitgepakt LECS-server van de lever, een lever spijsvertering-protocol met collagenase IV biedt een beter downstream analyse met behulp van stroom cytometry. Met behulp van een mechanische verstoring van de lever kunnen de collagenase meer oppervlakte beter communiceren met de extracellulaire matrix-geassocieerde cellen, zoals de LECS-server, en klik op de EHAA media zonder FBS gebruiken zorgt voor de spijsvertering van de lever optreden in slechts 30 minuten. Verminderde ditmaal onderhoudt LEC levensvatbaarheid voor downstream assays zoals stroom cytometry of stroom sorteren. We konden inderdaad genoeg levensvatbare cellen om te visualiseren LECs door stroom cytometry en stroom sorteren voor downstream transcriptionele analyse te herstellen.
Gecombineerde, de scheiding van hepatocyten uit de niet-parenchymal cellen, het gebruik van collagenase type IV, en de verduidelijking en demonstratie van de markeringen die specifiek zijn voor de LECS-server in de lever en markeringen die specifiek zijn voor andere endothelial cel populaties, zoals CD16/32 en CD146, mag de juiste identificatie van de LECS-server in de lever. Deze methoden leemte een belangrijke in de literatuur over hoe LECs in de lever kunnen worden geïdentificeerd door stroom cytometry, vooral omdat de lever bevat een aantal andere cellen die uitdrukking geven aan markeringen bekend voor LECs is uniek in de lymfeknoop (prox1 en vegfr3). Daarom zal deze methoden leiden tot downstream studies over LEC leverfunctie. Bovendien, kan deze methode worden gewijzigd voor andere weefsels teneinde beter weefsel-specifieke LEC merkers en deelverzamelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank de GI en lever aangeboren immuun programma's voor monetaire steun voor dit project. B.A.J.T. wordt ook gefinancierd door R01 AI121209.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1) | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100 μm cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 mL conical | Truline | TR2004 | |
| 15 mL conical | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µL pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10 mL pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5 mL pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
- Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
- Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
- Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
- Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
- Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
- Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
- Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
- Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
- Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
- Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
- Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
- Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
- Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
- Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
- Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).
