Summary
علينا أن نظهر أسلوباً لإيداع الإشريكيّة القولونية الجرثومي الأغشية الحيوية في الأنماط المكانية التعسفي بدقة عالية باستخدام التحفيز البصري لبناء السطح-التصاق وراثيا المرمزة.
Abstract
الهيكل المكاني والزخرفة تلعب دوراً هاما في الأغشية الحيوية البكتيرية. هنا علينا أن نظهر أسلوب موجوداً لاستزراع الأغشية الحيوية كولاي إلى الأنماط المكانية التعسفي في عالية الدقة المكانية. يستخدم الأسلوب بناء أوبتوجينيتيك مشفرة جينياً-بدون-Ag43 — أن الأزواج تشكيل بيوفيلم في كولاي إلى تحفيز الضوئية بالضوء الأزرق. ونحن بالتفصيل عملية تحويل كولاي مع بدون-Ag43، إعداد البنية البصرية المطلوبة، والبروتوكول لاستزراع الأغشية الحيوية منقوشة باستخدام البكتيريا بدون-Ag43. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن منقوشة الأغشية الحيوية مع قرار مكانية أدناه 25 ميكرومترات على مختلف الأسطح والبيئات، بما في ذلك الدوائر المغلقة، دون الحاجة إلى ميكروفابريكيشن، ومرافق غرفة نظيفة، أو المعالجة السطحية. التقنية ملائمة ومناسبة للاستخدام في التطبيقات التي التحقيق أثر هيكل بيوفيلم، وتوفير رقابة الانضباطي على الزخرفة بيوفيلم. على نطاق أوسع، كما أن التطبيقات المحتملة في الحيوية والتعليم والفن الحيوي.
Introduction
الأغشية الحيوية المرفقة بسطح المجتمعات للميكروبات، وهي معروفة جيدا لاقتران وظيفة بنية قوية على. الهندسة المكانية والزخرفة للأغشية الحيوية تقوم دور هام في وظيفة المجتمع الشامل (والعكس بالعكس)1. طول الصغيرة جداول المشاركة في هيكل بيوفيلم – بناء على أمر من عشرات ميكرون2– جعل التحكم الانضباطي ومريحة من بيوفيلم الزخرفة مشكلة صعبة. هنا ندلل على بروتوكول يسمح للأغشية الحيوية أن يكون التحديد منقوشة في هندستها التعسفي، استناداً إلى الإضاءة الضوئية.
يستخدم البروتوكول المعروضة هنا بدون-Ag433، بناء أوبتوجينيتيك أن الأزواج تشكيل بيوفيلم في بكتيريا كولاي الإضاءة الضوئية بقيادة التعبير عن Ag43 (أدهيسين جينات مسؤولة عن التصاق السطحية وبيوفيلم تشكيل) تحت السيطرة لبدون4 (منظم النسخي يسيطر عليها الإضاءة الضوئية). الطريقة ملائمة للاستخدام ويمكن السطحي نمط الأغشية الحيوية على مختلف البيئات، بما في ذلك الدوائر المغلقة الثقافة (شفاف). مقارنة مع طرق الترسيب الخلية الموجودة، مثل ترسب المستندة إلى الحبرية5 أو سطح بريباتيرنينج/العلاج6، لا تتطلب مرافق غرفة نظيفة أو ميكروفابريكيشن بدأون-Ag43 ولا تتطلب مواد تتجاوز تلك المتاحة لمختبر الميكروبيولوجيا نموذجية. وقادر على نمط مع قرار مكانية أدناه 25 ميكرومتر، تقترب بالأبعاد المكانية ميكروكولونيس في القائمة بطبيعة الحال الأغشية الحيوية2. وعموما، هذا الأسلوب يوفر القدرة على التعامل مع هيكل بيوفيلم، ثم يفتح طرقاً عديدة لدراسة ميكروكولوجي في المجتمعات البكتيرية7. بالإضافة إلى ذلك، قد توفر الأغشية الحيوية منقوشة منصة ملائمة لمهندس الحيوية مفيدة8،9. في هذه الورقة، ونحن مناقشة البروتوكول الأساسية المطلوبة للزخرفة الأغشية الحيوية باستخدام بدون-Ag43 ومعالجة التعديلات المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها المتعلقة بالأسلوب.
Protocol
1-التحضير لبدون-Ag43 السلالات البكتيرية
- تحويل بدون-Ag43 إلى سلالة كولاي الفائدة (الشكل 1).
- تنمو سلالة استنساخ تستضيف بلازميد بدون-Ag43 (يمكن الحصول عليها من مستودع بلازميد) بتطعيم السلالة في مرق LB تستكمل مع 50 ميكروغرام/مل بالسبيكتينوميسين (رطل + المواصفات) في أنبوب ثقافة (بين عشية وضحاها في حاضنة تهز ~ 250 لفة في الدقيقة، 37 درجة مئوية). ثم، استخدم مجموعة مينيبريب لحصاد بلازميد المنقي بدون-Ag4310.
- اختر سلالة كولاي من الفائدة تكون منقوشة. وحتى الآن، تم التحقق من بدأون-Ag43 للعمل في MG16553 و BW25113.
- استخدام بروتوكول مؤسس لتوليد المختصة (مثل، كيميائيا المختصة11 أو12من اليكتروكومبيتينت) الأرصدة المختار سلالة كولاي (مثلاً، MG1655).
- تحويل Ag43 بدون بلازميد البكتيريا المختصة11،12، تليها الانتعاش ح 1، وطبق على رطل + لوحات أجار المواصفات. السماح للمستعمرات تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- مخزن بدون-Ag43 تحول السلالات.
- تطعيم مستعمرة واحدة لبدون-Ag43 من رطل + المواصفات بلايت أجار إلى رطل + المواصفات مرق في أنبوب ثقافة وأنها تنمو في حاضنة تهز (في ~ 250 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية) إلى المرحلة الأسية (OD600 ~0.4-0.8).
- إعداد المخزون لتخزين سلالة بدون-Ag43 تحول في-80 درجة مئوية طويلة الأجل عن طريق خلط 1 مل ثقافة مع 1 مل من 50% والغليسيرول العقيمة في البرد أنبوب للحصول على الجلسرين 25% الأسهم الثلاجة. تخزين هذا في ثلاجة-80 درجة مئوية.
- إذا والبلازميدات إضافية (مثلاً، البلازميدات مراسل الفلورسنت) بحاجة إلى أن تتحول، وإنشاء خلايا المختصة11،12 من بدون-Ag43 تحولت سلالة وكرر عملية التحول11 , 12 والبلازميدات إضافية حسب الحاجة.
ملاحظة: إذا كان استخدام انهانسر8، من الممكن كوترانسفورم متعددة والبلازميدات (بما في ذلك بدون-Ag43) في وقت واحد؛ ومع ذلك، تحول متزامن لا ينصح باستخدام طرق التحويل الكيميائي، كما يعني الحجم الكبير لبدون-Ag43 (> 10 kB) تنخفض كفاءة التحويل.
2-إعداد إعداد جهاز العرض البصري للبكتيريا المضيئة
- الحصول حاضنة بكتيرية مع الجدران غير شفافة وفتحه لتمرير الكابلات، وقادرة على الأداء داخل الحاضنات البكتيرية، وتركيب جهاز عرض محمول وكمبيوتر محمول مزودة ببرامج لإسقاط العرض التقديمي (انظر الجدول من المواد). عند اختيار جهاز الإسقاط وحاضنة، ضمان أن مسافة التركيز الحد الأدنى للعرض أقل من ارتفاع الداخلية للحاضنة.
- وضع جهاز الإسقاط داخل الحاضنة في الجزء السفلي، مع الإشارة الفتحة مباشرة التصاعدي، في السقف، وفيه قاعة الثقافة بيوفيلم المرفقة (الشكل 2).
- بدوره متصل إصلاح جهاز الإسقاط في المكان قبل بناء هيكل مع الكهربية ضوئية قاعدة متصلة بوظيفة رأسي، وظيفة أفقية أي مسامير في جهاز الإسقاط (الشكل 2). لاحظ أنه يمكن تعديل هذا التشكيل تبعاً لأجزاء جهاز الإسقاط/المتوفرة. وفي نهاية المطاف، الشرط الرئيسي أن الإسقاط ثابت متين بالقرب من الأسفل للحاضنة، مع الفتحة مشيراً إلى أعلى.
- الاتصال الكمبيوتر المحمول عن طريق كابل الشاشة (مثلاً، HDMI) جهاز الإسقاط داخل الحاضنة.
- إذا السطوح – لا سيما الحد الأقصى – الداخلية للحاضنة العاكسة (مثلاً، سطح مصقول معدني)، غطاء لهم مع الأسطح غير لامع الظلام للتقليل من انعكاسات.
- استخدم الشريط لإرفاق صحن فارغ 'الطباعة' ثقافة الحد الأقصى للحاضنة. لاحظ أنه، مع جهاز الإسقاط، هناك عدة طرق مقبولة لإرفاق طبق ثقافة؛ التأكد من أن السطح السفلي شفافة لقاعة الثقافة، حيث يحدث الإضاءة، لا تغطي.
- ضبط التركيز على جهاز الإسقاط بتحول مقبض التركيز حيث أن الطائرة التركيز يتزامن مع السطح السفلي للطبق الثقافة بيوفيلم (مثل، لوحة جيدا) يعلق على الحد الأقصى للحاضنة (الشكل 2). البروجيكتور ينبغي إلقاء الضوء على صورة حادة، وغير واضح على الجزء السفلي من الطبق الثقافة. إزالة الطبق الثقافة 'الطباعة' مرة واحدة وقد تم تحسين التوقعات.
- استخدام برامج الكمبيوتر المحمول، توجيه جهاز الإسقاط لإلقاء الضوء على مجال الرؤية الكاملة مع الإضاءة الزرقاء الحد الأقصى (مثلاً، RGB = [0، 0، 255]) بعرض شريحة أزرق الكامل.
- قياس شدة الإضاءة لجهاز الإسقاط باستخدام عداد طاقة ضوئية حسب وضع الرأس فوتوديتيكتور في السقف حاضنة والقراءة الكثافة على مقياس الطاقة المقابلة معايرة للطول الموجي الضوء 460 نانومتر. اتبع الإرشادات على الاتصال ومعايرة photodetector لمقياس الطاقة المحددة المستخدمة.
- تقليل الإضاءة المحيطة (مثلاً، إيقاف تشغيل أضواء الغرفة أو مكان الحاضنة بعيداً عن مصادر الضوء) بقدر الإمكان قبل إجراء قياسات كثافة الإضاءة.
- ضبط شدة الإضاءة تستخدم عامل تصفية كثافة الطبيعية لتعديل وضعها في الفتحة جهاز الإسقاط. قم بتدوير عامل التصفية لضبط كثافة الإضاءة تقاس بمقياس الطاقة، حتى يقرأ شدة الإضاءة في وسط منطقة الضوء الأزرق المتوقعة 50 μW/سم2.
ملاحظة: في حين أنه من الممكن لضبط شدة الإضاءة باستخدام قيم RGB الأزرق أقل في نهاية البرنامج، باستخدام عامل تصفية بينما تعظيم قيمة RGB الأزرق يتميز بتحقيق أقصى قدر من التباين الضوئي للنظام بين مضيئة مقابل. المناطق الداكنة. - رسم التعسفي أنماط استخدام برنامج العرض التقديمي/جهاز العرض على الكمبيوتر المحمول وعرض هذه الأنماط على الحد الأقصى للحاضنة، باستخدام جهاز الإسقاط.
ملاحظة: ينبغي الانتباه بيوفيلم تشكيل المناطق مع الإضاءة الزرقاء الحد الأقصى (مثلاً، RGB = [0، 0، 255])، غير بيوفيلم تشكيل المناطق مع لا الإضاءة (مثلRGB = [0, 0, 0]).
3-استزراع الأغشية الحيوية منقوشة
- قبل الإضاءة، إعداد البكتيريا بدون-Ag43، بدءاً من المخزون المجمد والغليسيرول، ذلك لأنها موثوق بها التي يتسبب فيها في أواخر المرحلة النمو الأسى للإضاءة (الشكل 3A).
- خط سلالة بدون-Ag43 من الأسهم والغليسيرول على رطل + لوحات أجار المواصفات. السماح للمستعمرات تنمو بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية).
ملاحظة: تأكد من هنا حتى الخطوة ثقافة الإضاءة، الخلايا البقاء في الظلام قدر الإمكان – فترات قصيرة في الإضاءة المحيطة (مثلاً، سوبديلوشن) تكون مقبولة. - تطعيم مستعمرة للبكتيريا بدون-Ag43 من صفيحة أجار في رطل + المواصفات مرق وتنمو الثقافة بين عشية وضحاها إلى مرحلة ثابتة (في حاضنة تهز ~ 250 لفة في الدقيقة، 37 درجة مئوية، ح ~ 16).
- سوبديلوتي ثقافة بنسبة 1:1,000 مع رطل + المواصفات مرق (مثلاً، إضافة 1 ميكروليتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 1 مل من رطل جديدة + المواصفات).
- السماح بثقافة سوبديلوتيد تنمو حتى أواخر المرحلة الأسية وبداية ثابتة (OD ~ 1.0، ح ~ 6 في حاضنة هز ~ 250 لفة في الدقيقة، 37 درجة مئوية).
- أثناء انتظار للثقافة أن تنمو، تحضير الوسائط M63 مع 1 x M63 الأملاح 1 مم MgSO4، الجلوكوز 0.2%، 0.1% كاسامينو الأحماض و 50 ميكروغرام/مل بالسبيكتينوميسين في الماء (ضمان الأجزاء المكونة عقيمة).
- سوبديلوتي ثقافة المرحلة المتأخرة الأسى بنسبة 1: 100 مع وسائط الإعلام M63 تكملة مع 50 ميكروغرام/مل بالسبيكتينوميسين. ثم، إدخال تمييع في طبق ثقافة بيوفيلم (مثلاً، "الماصة؛" العينة المخففة في صفيحة جيدا).
ملاحظة: وحدات التخزين اللازمة لهذا سوبديلوشن 1: 100 تعتمد على الطبق الثقافة المستخدمة (مثلاً، إذا كان استخدام لوحة جيدا البوليستيرين 6-جيدا [غير----زراعة الأنسجة تعامل]، عينة واحدة تتطلب إضافة 20 ميكروليتر من الثقافة إلى 2 مل M63 + المواصفات، كما معيار حجم لوحة 6-جيدا جيدا ~ 2 مل).
- خط سلالة بدون-Ag43 من الأسهم والغليسيرول على رطل + لوحات أجار المواصفات. السماح للمستعمرات تنمو بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية).
- كما العينات جاهزة الآن للإضاءة، الشريط الطبق الثقافة إلى الحد الأقصى للحاضنة، التأكد من أن السطح في الجزء السفلي من الصحن شفاف للإضاءة من الأسفل بجهاز الإسقاط.
ملاحظة: من المهم التأكد من أن الحد الأقصى للحاضنة لا تعكس، لتقليل الإضاءة طائشة. يمكن أيضا أن يخفض الإضاءة طائشة باستخدام ألواح الجدران الأسود كأطباق الثقافة، على الرغم من أن هذا ليس ضروريا تماما – إذا كان استخدام هذه اللوحات، ضمان السطح السفلي الشفافية. - تسمح الأغشية الحيوية للثقافة في الحاضنة بين عشية وضحاها (ح 16 مع لا تهتز عند 37 درجة مئوية). لاحظ أن بعض أجهزة العرض تصبح أقل موثوقية في ارتفاع درجات الحرارة. إذا كان هذا هو الحال، الثقافة عند درجات حرارة منخفضة (مثلاً، 30 درجة مئوية)، مع الأخذ في الاعتبار أن فترة حضانة المرض قد تحتاج إلى زيادة، واعتماداً على سلالة كولاي .
4-تصوير منقوشة الأغشية الحيوية
- بعد نمو عينات بيوفيلم بين عشية وضحاها، إزالة الطبق الثقافة من الحاضنة. سوف يكون الطبق البكتيريا بيوفيلم يعلق على سطحه السفلي حيث أنه قد تم مضيئة، فضلا عن البكتيريا العوالق فرقت في وسائل الإعلام السائلة المذكورة أعلاه.
- تجاهل الخلايا العوالق بإزالة الوسائط السائلة من طبق الثقافة (مثلاً، يسفط برفق مع ماصة).
- شطف العينة 2 x مع حل مخزنة الفوسفات مالحة (PBS) لإزالة الخلايا العالقة المتبقية (الشكل 3B) عن طريق بيبيتينج برفق في برنامج تلفزيوني، متبوعاً بالطموح.
- إذا فلوريسسينتلي هي معلم الخلايا، مباشرة صورة العينات استخدام fluorescence مجهرية13 (مثلاً، واسع المجال13، ثلاثي الأبعاد [كنفوكل]14، إلخ).
ملاحظة: الفلورسنت الأغشية الحيوية يمكن أيضا الحفاظ على استخدام وسيلة متزايدة تقوية ذاتيا. تطبيق قطره واحدة من تركيب وسائط لنموذج بيوفيلم، وتغطية ذلك مع ساترة زجاجية، مع الحرص على عدم التقاط أي فقاعات تحت، والسماح تتصلب بين عشية وضحاها قبل التصوير. - إذا لم يتم تمييزها الخلايا البكتيرية المستخدمة فلوريسسينتلي، تطبيق الكريستال البنفسجي وصمة عار تقنية15 (الشكل 3B) لتعزيز التباين بيوفيلم قبل التصوير.
5-بروتوكول التعديلات/البدائل
- تنمو البكتيريا بدون-Ag43 على الأسطح المختلفة.
- وضع الزجاج أو كوبونات (PDMS) بولي-ثنائي ميثيل-siloxane (مثلاً، كوفيرسليبس أو شرائح رقيقة من PDMS) إلى لوحات جيدا قبل إضافة عينة/الإضاءة البكتيرية، واتبع نفس البروتوكول كما كان من قبل لنمط بدون-ag43 الأغشية الحيوية على الزجاج و PDMS.
- تنمو البكتيريا بدون-Ag43 داخل دائرة ثقافة المغلقة، وتتسم بالشفافية.
- إنشاء قالب دائرة ثقافة ل PDMS.
- إنشاء دائرة ثقافة أساسية، تولد العفن عن طريق إرفاق موشور الثابت، مستطيلة بسطح مستو (المنشور سوف يصبح تجويف في PDMS بمثابة قاعة الثقافة حالما يتم تحويل القالب). لاحظ أنه يمكن ملفقة قوالب دائرة الثقافة أكثر تعقيداً باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة16.
- صوت تجويف PDMS تتدفق PDMS العفن والسماح له بعلاج (بروتوكول الطباعة حجرية ناعمة مفصلة، انظر في جوف "قاعدة تعليم العلوم"16).
- تقليم أي PDMS الزائدة ولكمه قنوات المدخل/المخرج في قاعة تجويف/الثقافة والسندات التجويف على سطح مستو (مثلاً، الزجاج/البوليستيرين) عن طريق الضغط بشدة PDMS على سطح مسطح، ترك التجويف بين السطح بعد علاج، و الحد الأقصى PDMS كقاعة الثقافة بيوفيلم.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الترابط أكثر دواما استناداً إلى بلازما العلاج16 ، ولكن الرقائق ثم لن تكون قابلة لإعادة الاستخدام. - يتبع البروتوكول الثقافة قبل، استخدام المحاقن مع الإبر نصيحة كليلة (بدلاً من ماصة) لإدخال العينة البكتيرية في الدائرة الثقافة/الشطف مع المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (الشكل 3).
- إذا كان استخدام تجويف المرتهن مؤقتاً، استخدام الضغط السلبي الوحيد بالنسبة لسحب السائل إلى خارج الغرفة، لضمان إلا يصبح التجويف unbonded من سطح الزجاج/البوليستيرين الكامنة.
- إنشاء قالب دائرة ثقافة ل PDMS.
- تنمو البكتيريا بدأون-Ag43 استخدام النبائط فيلم لإنارة منظم.
- تصميم نمط بيوفيلم استخدام كندي البرمجيات المتوافقة مع خدمة طباعة طابعة/النبائط فيلم. وينبغي تصميم الفيلم النبائط واضحة في المناطق حيث بيوفيلم هو المقصود المراد طباعتها، والأسود/معتم في أماكن أخرى. عند الانتهاء، إرسال الملف النبائط بخدمة الطابعة/الطباعة وانتظار عودة النبائط المادية.
- إصدار تعليمات لجهاز الإسقاط لإلقاء الضوء على مجال رؤية كاملة مع الإضاءة الزرقاء الحد الأقصى (مثلاً، RGB = [0، 0، 255]) باستخدام برامج الكمبيوتر المحمول.
- قطع منطقة الاهتمام من أكبر الأفلام النبائط والشريط مباشرة إلى الجزء السفلي من ثقافة بيوفيلم طبق قبل إدخال العينة البكتيرية للإضاءة بين عشية وضحاها (3D الشكل). الثقافة الأغشية الحيوية كما كان من قبل، وإزالة النبائط بعد استزراع، قبل التصوير.
Representative Results
كما يتضح في الشكل 4A، استخدمت البكتيريا بدون-Ag43 لتوليد الأغشية الحيوية منقوشة في ألواح البوليسترين جيدا مع إضاءة البروجيكتور (تم تعيين جهاز العرض لإلقاء الضوء على نمط بولكا دوت)، مصورة عن طريق الفحص المجهري برايتفيلد مع كريستال البنفسجي وصمة كعامل تباين، والأسفار مجهرية باستخدام البكتيريا الأحمر-فلوري-البروتين-وإذ يعرب عن. يمكن أيضا تصويرها عينات بيوفيلم نيون استخدام الفحص المجهري [كنفوكل]14 للحصول على صور بيوفيلم ثلاثي الأبعاد (الشكل 4 باء). في الشكل 4، نحن توضيح الزخرفة عالية الدقة الممكنة باستخدام النبائط فيلم لتوفير الإضاءة منقوشة إلى عينة بيوفيلم. أخيرا، وفي الشكل 4 و 4E، نظهر أمثلة للزخرفة على الزجاج والأسطح PDMS، فضلا عن الدوائر المغلقة من الثقافة PDMS – توضيح هذه الأنواع المختلفة من البيئات التي يمكن فيها تطبيق الزخرفة بدون-Ag43.
رقم 1: إعداد البكتيريا بدون-Ag43 (المادة 1 من البروتوكول)- إعداد بدون-Ag43 البكتيريا قادرة على تشكيل بيوفيلم ينظم الضوء ينطوي على تنقية بلازميد بدون-Ag43 من مضيف استنساخ سلالة وتحويلها إلى سلالة كولاي الفائدة، وإنشاء مخزون الثلاجة البكتيرية للمدى الطويل التخزين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: إعداد التشكيل البصري بيوفيلم عينة الإضاءة (المادة 2 من البروتوكول)- أن البنية البصرية يقع داخل حاضنة البكتيري ويتكون من بروجيكتور متصل بالكمبيوتر ينير عينة بيوفيلم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الثقافة البروتوكول للزخرفة الأغشية الحيوية (القسم 3 من البروتوكول)- (أ) الموافقة المسبقة للإضاءة وتعد البكتيريا بدون-Ag43 قبل الزخرفة بأنها موثوق بها التي يتسبب فيها في مرحلة النمو السليم. (ب) بعد ليلة وضحاها مضيئة في النمو، بيوفيلم منقوشة سيكون حاضرا في الجزء السفلي من الطبق الثقافة، جنبا إلى جنب مع الخلايا العوالق في وسائل الإعلام السائلة، وبعد بعض مزيد من المعالجة، بيوفيلم جاهز للتصوير. (ج) كبديل للوحات وأيضا، يمكن مثقف الأغشية الحيوية في دوائر الثقافة المغلقة مثل تجويف PDMS مصبوب. في هذه الحالة، يمكن استخدام المحاقن التي تعلق على الإبر نصيحة فظة الأخذ بالعينة وتدفق السوائل خارج الدائرة. (د) كبديل لأنماط الإضاءة المستندة إلى جهاز الإسقاط، يمكن أيضا إنشاء أنماط بتصوير فيلم فوتوماسكس مباشرة إلى الجزء السفلي من دوائر الثقافة بيوفيلم. وفي هذه الحالة، ينبغي إعداد جهاز الإسقاط لإضاءة الضوء الأزرق عبر الحقل الكامل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: نتائج تمثيلية للأغشية الحيوية منقوشة باستخدام بدون-Ag43- تم الحصول على نتائج كافة استخدام عبئا مضيف MG1655 كولاي . واستخدمت البكتيريا بدون-Ag43 (A) لتوليد الأغشية الحيوية منقوشة في ألواح البوليسترين جيدا مع إضاءة البروجيكتور (تم تعيين جهاز العرض لإلقاء الضوء على نمط بولكا دوت)، مصورة عن طريق الفحص المجهري برايتفيلد مع البنفسجي كريستال وصمة عار عامل تباين، والأسفار مجهرية باستخدام البكتيريا الأحمر-فلوري-البروتين-وإذ يعرب عن. يتم تصويرها عينات بيوفيلم نيون (ب) مع الفحص المجهري [كنفوكل] الحصول على صور ثلاثية الأبعاد بيوفيلم. يمكن منقوشة الأغشية الحيوية ذات الدقة العالية (ج) مع النبائط فيلم لتوفير الإضاءة منقوشة إلى عينة بيوفيلم. يمكن أن تكون منقوشة الأغشية الحيوية (د) على الزجاج والأسطح PDMS. يمكن منقوشة الأغشية الحيوية (E) في دوائر الثقافة المغلقة. وهذا الرقم تم تكييف من العمل السابق3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المشكلة | الأسباب/الحلول المحتملة |
| إنشاء بدون-Ag43 إلى سلالة المضيف-لا مستعمرات | انخفاض تركيز بلازميد--التحقق من تركيز بلازميد في مطياف. ينبغي أن تسفر عن مينيبريب نموذجية لبدون-Ag43 على الأقل 100 نانوغرام/ميكروليتر؛ استخدام ما يصل إلى 10-100 نانوغرام للتحول |
| الاختيار/طبعة جديدة من الخلايا المختصة: الخلايا المختصة ينبغي أن يكون التحول الكفاءة على الأقل 10 ^ 6 زيمبابوي/ميكروغرام التحقق من استخدام بلازميد قياسية مثل pUC19--إذا لم يكن كذلك، طبعة جديدة من الخلايا المختصة | |
| خطأ (مستوى) المضادات الحيوية على طبق أجار رطل--تأكد من استخدام 50 ميكروغرام/مل بالسبيكتينوميسين للتحديد | |
| إضاءة البروجيكتور يتحول خارج/غير متناسقة بين عشية وضحاها | قم بتعطيل برامج إشكالية مثل: التحديث التلقائي البرمجيات/OS بين عشية وضحاها، وتصفية الضوء الأزرق الليلي |
| جهاز العرض قد يكون المحموم--تعيين حاضنة لانخفاض درجة الحرارة أثناء العرض قيد التشغيل (مثلاً 30 درجة مئوية بدلاً من 37 درجة مئوية)-ملاحظة الإسقاط كمصدر الحرارة يمكن أن أسخن حاضنة بعد تعيين نقطة | |
| إزالة لا لزوم لها مصادر الرطوبة من الحاضنة، كما قد تؤثر هذه الإلكترونيات جهاز الإسقاط | |
| لا/انخفاض مستويات بيوفيلم تشكيل بعد الإضاءة بين عشية وضحاها، ولا يوجد نمو الخلايا العوالق أما (أي سائل واضح) | خطأ (مستوى) المضادات الحيوية--تأكد من استخدام 50 ميكروغرام/مل بالسبيكتينوميسين |
| تحقق من كل ما يضاف إلى الوصفة M63 بشكل صحيح | |
| لا/انخفاض مستويات بيوفيلم تشكيل بعد الإضاءة بين عشية وضحاها، والخلايا العوالق فقط (أي سائل غائمة) | تحقق الضوء مستوى الإسقاط ينبغي أن ينير الضوء الأزرق في 50 μW/سم ^ 2 في الطول الموجي نانومتر 460 |
| حاول ترك البكتيريا تنمو لوقت أقصر/أطول بعد 1: 1000 رطل سوبديلوشن خطوة قبل إضافة إلى M63 | |
| ريستريك البكتيريا في لوحة رطل، بدء من مستعمرة جديدة لتوليد ثقافة المرحلة ثابتة بين عشية وضحاها | |
| ضمان جهاز الإسقاط وتعمل دائماً بين عشية وضحاها--انظر النقطة أعلاه | |
| أنماط بيوفيلم غامض، ومستويات عالية من الضوضاء الخلفية | تقليل ضوء شارد من نظام الإضاءة الضوئية، وتغطية الأسطح العاكسة الداخلية للحاضنة |
| النظر في استخدام الإضاءة المنظم القائم على النبائط (مقابل المستندة إلى جهاز العرض) | |
| تحقق من جهاز العرض بشكل صحيح تركز على السطح السفلي لقاعة الثقافة بيوفيلم |
الجدول 1: المشتركة وإصلاحها.
Discussion
وفي ضوء الحاجة إلى أدوات البحث التي تسمح بتحكم بنية بيوفيلم، قدمنا بروتوكولا سهلة الاستخدام للزخرفة الأغشية الحيوية البكتيرية التي تستخدم في بناء أوبتوجينيتيك بدون-Ag43. مع هذه التقنية، يمكن منقوشة الأغشية الحيوية كولاي بصريا في مختلف البيئات السطحية، بما في ذلك الدوائر المغلقة، مع قرار مكانية أدناه 25 ميكرومتر.
وإجمالا، يمكن تقسيم هذا البروتوكول إلى أربعة أقسام رئيسية: (1) إعداد البكتيريا بدون-Ag43، (2) إعداد البصرية والثقافة إنشاء الأجهزة وخطوات النمو البكتيري قبل الإضاءة (3) الإضاءة (4) بعد انتهاء يشطف والتصوير.
الجزء الحاسم من القسم 1 هو نجاح تحويل بلازميد بدون-Ag43 إلى سلالة كولاي من الفائدة. وهذا يسر بعزل بلازميد النقية عالية الجودة وتوليد الخلايا المختصة عالية الجودة للتحول (الجدول 1، استكشاف الأخطاء وإصلاحها).
جزءا حاسما من القسم 2 هو الأمثل لتركيب جهاز الإسقاط حتى يتم ضبط شدة الإضاءة إلى 50 μW/سم2 في الطول الموجي نانومتر 460، وجهاز الإسقاط ويتركز بشكل صحيح في ذروة عينة بيوفيلم. ملاحظة أن في هذا البروتوكول، يصف لنا إنشاء إضاءة مقلوب حيث البروجيكتور يضيء الضوء من أسفل إلى أعلى، واتجاه العينة بيوفيلم. وميزة هذا التشكيل أن الضوء يحتاج إلى السفر عبر الجزء السفلي من الطبق الثقافة قبل الوصول إلى سطح تشكيل بيوفيلم فقط. الإضاءة من فوق يعني أنه سيتعين على ضوء السفر عبر وسائل الإعلام السائلة فوق سطح بيوفيلم، الذي، خلال مسار النمو، يحصل غائم مع خلايا العوالق. وبالإضافة إلى هذه الشواغل، من المهم أيضا تقليل ضوء شارد في التشكيل البصري، قدر الإمكان، على سبيل المثال، بالتستر على الأسطح العاكسة في المناطق داخلية الحضانة – وهذا يساعد على الحصول على أدق الأغشية الحيوية منقوشة. وفي هذا الصدد، يمكن الحصول أكثر وضوحاً بيوفيلم أنماط أيضا باستخدام النبائط للتحكم في الإضاءة الزخرفة (3D الشكل، الشكل 4). تشمل القضايا المشتركة التي تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها مشكلات الوثوقية الإسقاط في درجات حرارة أعلى (مثلاً، 37 درجة مئوية)، الذي يمكن التقليل بحضانة نمو بيوفيلم عند درجات حرارة منخفضة (مثلاً، 30 درجة مئوية)، فضلا عن برامج الكمبيوتر التي يتسبب تحديثات نظام التشغيل أو الضوء الأزرق التصفية خلال النمو بين عشية وضحاها (الجدول 1). من المهم أيضا أن نلاحظ أنه، اعتماداً على نموذج الإسقاط وحاضنة المستخدمة، من الممكن أيضا أن الحرارة المتولدة من البروجيكتور سيؤدي إلى درجة حرارة داخلية أعلى من الحاضنة ضبط درجة الحرارة، والتي قد تحتاج إلى تصحيح.
جزءا حاسما من القسم 3 هو الحصول على العينات البكتيرية يمكن الاعتماد عليها وقابلة للتكرار قبل الناجم عن الإضاءة. ولهذا السبب، من المستحسن للحصول على مستعمرات الاستنساخ من البكتيريا Ag43 بدون streaking بها على صفيحة أجار وثم استخدام الخطوات ثقافة السائل لضمان أن البكتيريا مضيئة المستحث في أواخر المرحلة النمو الأسى في التكرار طريقة.
أخيرا، جزء أساسي من القسم 4 جيدا، ولكن أيضا بلطف، يغسل العوالق الخلايا المتبقية بعد بيوفيلم الزخرفة البروتوكول؛ وهكذا، من المستحسن القيام بالعديد من الخطوات شطف لطيف مع برنامج تلفزيوني.
مقارنة بالتقنيات الموجودة للخلية الزخرفة5،6، بيوفيلم الضوئية الزخرفة بدون-Ag43 على أساس ما حاجز منخفض معقول من الدخول لاستخدام، حيث أنها لا تتطلب ميكروفابريكيشن، مرافق غرفة نظيفة، ومجمع الكيمياء، أو المعالجة السطحية، حتى الآن لا تزال قادرة على نمط بدقة عالية (25 ميكرومتر) المرتبطة عادة بتقنيات ميكروفابريكيشن. ويمتد الأسلوب العمل السابقة بشأن التصويرية البكتيرية للتحكم في التعبير الجيني17. حاليا، Ag43 بدون بلازميد يقتصر على كولاي، كما أنه يستخدم مصدر pUC المستندة للنسخ المتماثل، ولكن بدون و Ag43 كلاهما متوافق في سائر أنواع الجراثيم (سلبية الغرام). التقنيات الوراثية متاحة لاحتمال إدخال تشكيل بيوفيلم ينظم الضوء على مختلف أنواع الجراثيم، ويمثل اتجاه ممكن للبحوث في المستقبل. آخر الحد المحتملة لهذه التقنية أنه يعمل عن طريق زيادة تكوين بيوفيلم في سلالات مع تشكيل بيوفيلم الأصلية ضعيفة (مثلاً، MG1655 كولاي). ومع ذلك، يكون سلالات مع تشكيل بيوفيلم أصلية قوية شكل الأغشية الحيوية بغض النظر عن ظروف الإضاءة، ويحول دون تشكيل بيوفيلم منقوشة باستخدام بدأون-Ag43 كما هو موضح هنا؛ حتى الآن قد لا يزال يثبت تقنيات أوبتوجينيتيك المطبقة في تنظيم تشكيل بيوفيلم. ونلاحظ أنه في سياقات أخرى، قد تكون أساليب بديلة للزخرفة بيوفيلم المتاحة، مثل عن طريق بصري ج-دي-GMP التحوير18.
عموما، سوف تكون الزخرفة بدون-Ag43 على أساس مناسب للاستخدام في التطبيقات التي التحقيق أثر هيكل بيوفيلم على وظيفة1 ، وعليه، يمكن أن تستفيد من التحكم الانضباطي الزخرفة بيوفيلم-ذات أهمية خاصة مثال لتسليط الضوء على دراسة الإيكولوجيا الميكروبية في الأغشية الحيوية2. وتشمل التوجهات المستقبلية مما يجعل الحيوية منقوشة8،9 و/أو المجتمعات البكتيرية منظم. وتشمل التطبيقات البديلة لهذا البروتوكول موجوداً أيضا بيو-الفن19، نظراً لإمكانات جمالية واضحة، فضلا عن علوم الحياة الرسمية والتعليم20،،من2122. من منظور التربية، البروتوكول الموصوفة هنا يجمع بين العديد من التقنيات ذات الصلة (ثقافة البكتيرية، التحول، والبصريات/أوبتوجينيتيكس) وهي أيضا قابلة للتمديد مجزأة (مثلاً، تشمل ميكروفلويديكس).
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الزجاج دال وحاء – كيم وعم أ.، تشوكسى أ، راجان س. ومفاتيح باء لتلك الاقتراحات المفيدة ومختبر سبورمان للوصول إلى المجهر [كنفوكل]. وعلاوة على ذلك، تقر الكتاب الدعم المقدم من جامعة ستانفورد بيو-X باوز ومقدمة سرفيسز الزمالات، المعهد الوطني للصحة (R21-منظمة العفو الدولية-139941)، وجمعية السرطان الأمريكية (RSG-14-177-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
| MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center - Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
| RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
| LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
| Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
| Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
| M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
| Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
| Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
| Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
| 6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
| PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
| 1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
| Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
| Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
| Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
| Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
| Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
| Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
| Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
| Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
| 1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
| 1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
| Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
| Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
| Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture |
| Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
| Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Christensen, B. B., Haagensen, J. A. J., Heydorn, A., Molin, S. Metabolic commensalism and competition in a two-species microbial consortium. Applied and environmental microbiology. 68 (5), 2495-2502 (2002).
- Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Ohlendorf, R., Vidavski, R. R., Eldar, A., Moffat, K., Möglich, A. From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression. Journal of Molecular Biology. 416 (4), 534-542 (2012).
- Xu, T., et al. Construction of high-density bacterial colony arrays and patterns by the ink-jet method. Biotechnology and Bioengineering. 85 (1), 29-33 (2004).
- Gu, H., Hou, S., Yongyat, C., Detore, S., Ren, D. Patterned Biofilm Formation Reveals A Mechanism for Structural Heterogeneity in Bacterial Biofilms. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 29 (35), 11145-11153 (2013).
- Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 64 (4), 847-867 (2000).
- Nguyen, P. Q., Botyanszki, Z., Tay, P. K. R., Joshi, N. S. Programmable biofilm-based materials from engineered curli nanofibres. Nature Communications. 5, 4945 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13, 515-523 (2014).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. New York, NY. (2010).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experiments. 47, e2437 (2011).
- JoVE Science Education Database. Bioengineering. Soft Lithography. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Huang, Y., Xia, A., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Kac, E. Signs of Life: Bio Art and Beyond. , MIT Press. Cambridge, MA. (2007).
- Lee, S. A., et al. Trap it!: A Playful Human-Biology Interaction for a Museum Installation. Proceedings of the 33rd Annual ACM Conference on Human Factors in Computing Systems. , 2593-2602 (2015).
- Cira, N. J., et al. A Biotic Game Design Project for Integrated Life Science and Engineering Education. PLOS Biology. 13 (3), e1002110 (2015).
- Bybee, R. W. The next generation science standards and the life sciences. Science and Children. 50 (6), 7 (2013).
