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Bioengineering

pDawn-Ag43 का उपयोग करते हुए उच्च-रिज़ॉल्यूशन नमूनों वाली फिल्मी साठा

Published: October 23, 2018 doi: 10.3791/58625
Automatic Translation
1, 1
1Department of Bioengineering, Stanford University

Summary

हम एक उच्च संकल्प के साथ मनमाने ढंग से स्थानिक पैटर्न में ई कोलाई बैक्टीरियल फिल्म जमा करने के लिए एक विधि प्रदर्शित एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सतह-आसंजन के निर्माण की ऑप्टिकल उत्तेजना का उपयोग कर ।

Abstract

स्थानिक संरचना और पैटर्न बैक्टीरियल फिल्म में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । यहां हम उच्च स्थानिक संकल्प में मनमाने ढंग से स्थानिक पैटर्न में संवर्धन ई. कोलाई के लिए एक सुलभ विधि प्रदर्शित करता है । तकनीक का उपयोग करता है एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग optogenetic का निर्माण-pDawn-Ag43-कि दंपति ई. कोलाई में फिल्म निर्माण नीले प्रकाश से ऑप्टिकल उत्तेजना के लिए । हम विस्तार pDawn-Ag43 के साथ ई. कोलाई बदलने के लिए प्रक्रिया, आवश्यक ऑप्टिकल सेट अप की तैयारी, और संवर्धन नमूनों pDawn-Ag43 बैक्टीरिया का उपयोग कर फिल्म के लिए प्रोटोकॉल । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, 25 माइक्रोन के नीचे एक स्थानिक संकल्प के साथ फिल्म, microfabrication की आवश्यकता के बिना, संलग्न कक्षों सहित विभिन्न सतहों और वातावरण पर नमूनों किया जा सकता है, साफ कमरे की सुविधा, या सतह से इलाज । तकनीक सुविधाजनक और अनुप्रयोगों है कि फिल्म संरचना के प्रभाव की जांच में उपयोग के लिए उपयुक्त है, फिल्म पैटर्न पर स्वरित्र नियंत्रण प्रदान करते हैं । अधिक मोटे तौर पर, यह भी जैव भौतिक, शिक्षा में संभावित अनुप्रयोगों, और बायो आर्ट है ।

Introduction

गैर-फिल्म रोगाणुओं के सतह से जुड़े समुदाय हैं, और उनकी मजबूत संरचना के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है-समारोह युग्मन । स्थानिक ज्यामिति और फिल्म के पैटर्न समग्र समुदाय समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है (और इसके विपरीत)1। छोटे लंबाई तराजू-माइक्रोन के दसियों के आदेश पर फिल्म संरचना में शामिल-2-बनाओ स्वरित्र और एक चुनौतीपूर्ण समस्या patterning के सुविधाजनक नियंत्रण । यहां हम एक प्रोटोकॉल है कि फिल्म के लिए अनुमति देता है ठीक मनमाने ढंग से geometries, ऑप्टिकल रोशनी के आधार पर पैटर्न में प्रदर्शित करता है ।

प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत pDawn-Ag433, एक optogenetic का निर्माण का उपयोग करता है कि ई. कोलाई बैक्टीरिया में Ag43 की अभिव्यक्ति ड्राइविंग द्वारा ऑप्टिकल रोशनी में फिल्म गठन (एक adhesin जीन सतह आसंजन और फिल्म के लिए जिंमेदार गठन)4 pDawn के नियंत्रण के तहत (एक transcriptional नियामक ऑप्टिकल रोशनी द्वारा नियंत्रित) । विधि का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है और विभिन्न सतह वातावरण, संलग्न (पारदर्शी) संस्कृति मंडलों सहित पर फिल्म पैटर्न कर सकते हैं । इस तरह की छोटी बूंद के रूप में मौजूदा सेल जमाव तरीकों की तुलना में,5 या सतह पैटर्न/उपचार6, pDawn-Ag43 microfabrication या साफ कमरे की सुविधा की आवश्यकता नहीं है और उन से परे सामग्री की आवश्यकता नहीं है एक ठेठ सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला के लिए उपलब्ध है । यह 25 माइक्रोन के नीचे एक स्थानिक संकल्प के साथ पैटर्न में सक्षम है, स्वाभाविक रूप से मौजूदा2फिल्म में microcolonies के स्थानिक आयाम आ । कुल मिलाकर, इस तकनीक को, जो बैक्टीरिया समुदायों में microecology अध्ययन करने के लिए कई रास्ते खोलता है, जो फिल्म संरचना में हेरफेर करने की क्षमता प्रदान करता है7। इसके अतिरिक्त, नमूनों की फिल्म एक सुविधाजनक मंच है जिस पर उपयोगी सामग्री8,9इंजीनियर के लिए प्रदान कर सकते हैं । इस पत्र में, हम बुनियादी pDawn-Ag43 और पता संभावित संशोधनों और विधि से संबंधित समस्या निवारण का उपयोग कर फिल्म पैटर्न के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल पर चर्चा ।

Protocol

1. pDawn-Ag43 बैक्टीरियल उपभेदों की तैयारी

  1. रूपांतरण pDawn-Ag43 ब्याज की एक ई. कोलाई तनाव में (चित्रा 1) ।
    1. एक क्लोनिंग तनाव pDawn-Ag43 प्लाज्मिड (एक प्लाज्मिड भंडार से प्राप्य) एक संस्कृति ट्यूब में पौंड शोरबा ५० inoculating/एमएल μg (पौंड + कल्पना) के साथ पूरक में तनाव spectinomycin द्वारा विकसित (एक मिलाते हुए मशीन में रात भर ~ २५० rpm, ३७ डिग्री सेल्सियस) । फिर, एक miniprep किट का उपयोग करने के लिए शुद्ध pDawn-Ag43 प्लाज्मिड10फसल ।
    2. ब्याज की एक ई. कोलाई तनाव का चयन पैटर्न होगा । इस प्रकार अब तक, pDawn-Ag43 MG16553 और BW25113 में काम करने के लिए सत्यापित किया गया है ।
    3. एक स्थापित प्रोटोकॉल का प्रयोग करें सक्षम उत्पंन (जैसे, रासायनिक सक्षम11 या electrocompetent12) स्टॉक्स चुना ई. कोलाई तनाव के (जैसे, MG1655) ।
    4. रूपांतरण pDawn-Ag43 सक्षम जीवाणु11,12में प्लाज्मिड, 1 एच वसूली के बाद, और पौंड + कल्पना आगर प्लेट पर प्लेट । कालोनियों को ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ने की अनुमति दें ।
  2. pDawn-Ag43 रूपांतरित उपभेदों की दुकान ।
    1. Inoculate pDawn की एक कॉलोनी-एक पौंड + कल्पना आगर थाली से Ag43 में एक संस्कृति ट्यूब में पौंड + कल्पना शोरबा और यह एक मिलाते हुए मशीन में विकसित (~ २५० rpm, ३७ डिग्री सेल्सियस) घातीय चरण (OD600 ~ ०.४-०.८) ।
    2. pDawn-Ag43 में रूपांतरित तनाव को स्टोर करने के लिए स्टॉक तैयार करें-८० ° c लंबे समय तक एक क्रायो-ट्यूब में ५०% बाँझ ग्लिसरॉल की 1 मिलीलीटर के साथ संस्कृति के 1 मिलीलीटर मिश्रण द्वारा एक 25% ग्लिसरॉल फ्रीजर स्टॉक प्राप्त करने के लिए. एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में यह स्टोर ।
    3. यदि अतिरिक्त plasmids (जैसे, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर plasmids) को तब्दील करने की जरूरत है, सक्षम कोशिकाओं11,pDawn से12 बनाने-Ag43 बदल तनाव और दोहराने परिवर्तन की प्रक्रिया11 , आवश्यकतानुसार अतिरिक्त plasmids के लिए 12 .
      नोट: यदि electroporation8का उपयोग कर रहा है, यह cotransform के लिए संभव है एकाधिक plasmids (सहित pDawn-Ag43) एक साथ; हालांकि, एक साथ परिवर्तन अनुशंसित नहीं है रासायनिक परिवर्तक विधियों का उपयोग करते हुए, के रूप में बड़े आकार (> 10 kB) pDawn-Ag43 का अर्थ है परिवर्तन क्षमता कम कर रहे हैं ।

2. प्रोजेक्टर रोशन बैक्टीरिया के लिए ऑप्टिकल सेट अप की तैयारी

  1. गैर पारदर्शी दीवारों के साथ एक जीवाणु मशीन प्राप्त करने और केबल, एक पोर्टेबल फिटिंग और बैक्टीरियल मशीन के अंदर काम करने में सक्षम प्रोजेक्टर, और एक प्रस्तुति के लिए सॉफ्टवेयर के साथ सुसज्जित लैपटॉप के लिए एक छेद-प्रक्षेपण ( की तालिका देखें सामग्री) । जब प्रोजेक्टर और मशीन का चयन, यह सुनिश्चित करें कि प्रोजेक्टर की ंयूनतम फोकस दूरी मशीन की आंतरिक ऊंचाई से कम है ।
  2. तल पर मशीन के अंदर प्रोजेक्टर प्लेस, एपर्चर के साथ सीधे ऊपर की ओर इशारा करते हुए, छत, जहां फिल्म संस्कृति चैंबर (चित्रा 2) संलग्न है पर ।
  3. जगह में प्रोजेक्टर के निर्माण से एक ऑप्टिकल breadboard एक ऊर्ध्वाधर पोस्ट करने के लिए जुड़े आधार के साथ, बारी में एक क्षैतिज पोस्ट करने के लिए जुड़ा हुआ है जो प्रोजेक्टर में शिकंजा (चित्रा 2) । ध्यान दें कि इस सेट-अप को प्रोजेक्टर/उपलब्ध भागों के आधार पर संशोधित किया जा सकता है । अंत में, महत्वपूर्ण आवश्यकता है कि प्रोजेक्टर मजबूती से मशीन के नीचे के पास तय है, ऊपर की ओर इशारा करते एपर्चर के साथ ।
  4. प्रदर्शन केबल के माध्यम से लैपटॉप कनेक्ट (जैसे, HDMI) मशीन के अंदर प्रोजेक्टर के लिए ।
  5. यदि सतहों-विशेष रूप से छत-मशीन के इंटीरियर के चिंतनशील है (जैसे, धातु पॉलिश सतह), उंहें डार्क मैट के साथ कवर प्रतिबिंब को कम करने के लिए सतहों ।
  6. टेप का प्रयोग करें मशीन की छत के लिए एक ' खाली ' डमी संस्कृति पकवान देते हैं । ध्यान दें कि, प्रोजेक्टर के साथ के रूप में, वहां एक संस्कृति पकवान संलग्न करने के लिए कई स्वीकार्य तरीके हैं; सुनिश्चित करें कि संस्कृति कक्ष के पारदर्शी नीचे की सतह, जहां रोशनी होती है, शामिल नहीं है ।
  7. केंद्रित घुंडी इतना है कि ध्यान में रखते हुए विमान के नीचे की सतह के साथ मेल खाती है ध्यान केंद्रित दस्ता मोड़ द्वारा प्रोजेक्टर पर ध्यान समायोजित करें (जैसे, एक अच्छी तरह से थाली) मशीन की छत से जुड़ी (चित्रा 2) । प्रोजेक्टर संस्कृति पकवान के तल पर एक तेज, गैर धुँधली छवि रोशन करना चाहिए । एक बार प्रक्षेपण अनुकूलित किया गया है ' डमी ' संस्कृति पकवान निकालें ।
  8. लैपटॉप सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, प्रोजेक्टर प्रत्यक्ष अधिकतम नीले रोशनी के साथ देखने का पूरा क्षेत्र रोशन करने के लिए (जैसे, RGB = [0, 0, २५५]) एक पूर्ण ब्लू स्लाइड पेश करके ।
  9. मशीन की छत पर photodetector सिर रखकर एक ऑप्टिकल बिजली मीटर का उपयोग कर प्रोजेक्टर की दीप्ति तीव्रता को मापने और इसी शक्ति मीटर पर तीव्रता पढ़ने के तरंग दैर्ध्य ४६० एनएम प्रकाश करने के लिए तुले हुए । जोड़ने और इस्तेमाल विशिष्ट बिजली मीटर के लिए photodetector जांच पर निर्देशों का पालन करें ।
    1. परिवेश प्रकाश कम (जैसे, कमरे रोशनी बंद कर देते हैं, या प्रकाश स्रोतों से दूर मशीन जगह) के रूप में ज्यादा संभव के रूप में रोशनी तीव्रता माप बनाने के लिए पहले ।
  10. एक समायोज्य तटस्थ घनत्व प्रोजेक्टर एपर्चर पर रखा फिल्टर का उपयोग कर रोशनी की तीव्रता को समायोजित करें । रोशनी की तीव्रता बिजली मीटर द्वारा मापा समायोजित करने के लिए फ़िल्टर घुमाएँ, जब तक ब्लू-लाइट अनुमानित क्षेत्र के केंद्र में रोशनी की तीव्रता पढ़ता ५० μW/
    नोट: जबकि यह सॉफ्टवेयर के अंत पर कम नीले आरजीबी मूल्यों का उपयोग करके रोशनी की तीव्रता को समायोजित करने के लिए संभव है, एक फिल्टर का उपयोग करते हुए नीले आरजीबी मूल्य को अधिकतम करने के बीच प्रणाली के ऑप्टिकल कंट्रास्ट को अधिकतम करने का फायदा है रोशन बनाम डार्क क्षेत्र ।
  11. लैपटॉप पर प्रस्तुति/प्रोजेक्टर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मनमाना पैटर्न ड्रा और मशीन की छत पर इन नमूनों को प्रदर्शित, प्रोजेक्टर का उपयोग कर ।
    नोट:-फिल्म बनाने क्षेत्रों अधिकतम नीले रोशनी (जैसे, आरजीबी = [0, 0, २५५]) के साथ तैयार किया जाना चाहिए, गैर-फिल्म-कोई रोशनी के साथ क्षेत्रों के गठन (जैसे, rgb = [0, 0, 0]) ।

3. संवर्धन नमूनों वाली फिल्म

  1. रोशनी से पहले, pDawn-Ag43 बैक्टीरिया तैयार, ग्लिसरॉल फ्रीजर स्टॉक से शुरू है, ताकि वे मज़बूती से रोशनी के लिए देर से घातीय विकास चरण (आंकड़ा 3ए) में प्रेरित कर रहे हैं ।
    1. लकीर एक pDawn-Ag43 ग्लिसरॉल स्टॉक से पौंड + कल्पना आगर प्लेटों पर तनाव । कालोनियों को रात भर बढ़ने की अनुमति दें (३७ ° c) ।
      ध्यान दें: यहां से दीप्ति संस्कृति कदम जब तक, सुनिश्चित कोशिकाओं परिवेश रोशनी में अधिक से अधिक के रूप में अंधेरे में रहना-संक्षिप्त अवधि (जैसे, उपकमजोर पड़ने के लिए) स्वीकार्य हैं ।
    2. Inoculate pDawn की एक कॉलोनी पौंड + कल्पना शोरबा में एक आगर थाली से Ag43 बैक्टीरिया और संस्कृति विकसित रात में स्थिर चरण के लिए (एक मिलाते हुए मशीन में ~ २५० rpm, ३७ ° c, के लिए ~ 16 एच) ।
    3. 1 के अनुपात में संस्कृति को पतला: पौंड + कल्पना शोरबा के साथ 1000 (जैसे, ताजा पौंड के 1 मिलीलीटर के लिए रातोंरात संस्कृति के 1 μL जोड़ + कल्पना) ।
    4. देर घातीय/जल्दी स्थिर चरण (आयुध डिपो ~ १.०, ~ २५० rpm, ३७ डिग्री सेल्सियस में एक मिलाते हुए मशीन में ~ 6 घंटे तक विकसित करने के लिए पतला संस्कृति की अनुमति दें) ।
    5. जबकि संस्कृति के बढ़ने के लिए प्रतीक्षा कर रहा है, 1x M63 लवण, 1 मिमी MgSO4, ०.२% ग्लूकोज, ०.१% casamino एसिड, और ५० μg/एमएल spectinomycin पानी में (सुनिश्चित घटक भागों बाँझ हैं) के साथ M63 मीडिया तैयार करते हैं ।
    6. M63 मीडिया ५० μg/एमएल spectinomycin के साथ पूरक के साथ 1:100 के अनुपात में देर से घातीय-चरण संस्कृति पतला । फिर, एक फिल्म संस्कृति डिश में कमजोर पड़ने परिचय (जैसे, एक अच्छी तरह से थाली में पतला नमूना पिपेट) ।
      नोट: इस 1:100 उपकमजोर पड़ने के लिए आवश्यक मात्रा में संस्कृति डिश पर निर्भर करते थे (जैसे, अगर एक 6 अच्छी तरह से polystyrene अच्छी तरह से थाली का उपयोग [गैर ऊतक-संस्कृति का इलाज], एक एकल नमूना M63 के 2 मिलीलीटर के लिए संस्कृति के 20 μL जोड़ने की आवश्यकता होगी + कल्पना, के रूप में एक 6-अच्छी तरह से थाली के मानक अच्छी तरह से मात्रा ~ 2 मिलीलीटर है) ।
  2. के रूप में नमूनों अब रोशनी के लिए तैयार हैं, टेप मशीन की छत के लिए संस्कृति पकवान, यह सुनिश्चित करना है कि पकवान के तल पर सतह के नीचे से प्रदीप्ति के लिए पारदर्शी है प्रोजेक्टर द्वारा ।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि मशीन की छत चिंतनशील नहीं है, आवारा रोशनी को कम करने के लिए । आवारा रोशनी भी संस्कृति व्यंजन के रूप में काले दीवारों प्लेट का उपयोग करके कम किया जा सकता है, हालांकि यह सख्ती से आवश्यक नहीं है-अगर ऐसी प्लेटों का उपयोग कर, नीचे की सतह पारदर्शी सुनिश्चित करते हैं ।
  3. रात भर मशीन में संस्कृति के लिए ' की अनुमति दें (कोई मिलाते के साथ 16 एच, ३७ डिग्री सेल्सियस पर) । ध्यान दें कि कुछ प्रोजेक्टर उच्च तापमान पर कम विश्वसनीय हो जाते हैं । यदि यह मामला है, कम तापमान पर संस्कृति (जैसे, 30 डिग्री सेल्सियस), ध्यान में रखते हुए कि मशीन समय वृद्धि की आवश्यकता हो सकती है, ई. कोलाई तनाव के आधार पर ।

4. इमेजिंग नमूनों की फिल्म

  1. फिल्म के नमूने के रातोंरात वृद्धि के बाद, मशीन से संस्कृति पकवान हटा दें । डिश अपने नीचे की सतह से जुड़ी है, जहां यह रोशन किया गया है, साथ ही planktonic के ऊपर तरल मीडिया में फैलाया बैक्टीरिया के साथ फिल्म बैक्टीरिया होगा ।
  2. लिक्विड मीडिया को कल्चरल डिश से निकालकर planktonic कोशिकाओं को त्यागें (उदा., धीरे से एक पिपेट के साथ aspirating करके).
  3. एक फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) समाधान के साथ नमूना 2x कुल्ला करने के लिए शेष planktonic कोशिकाओं को दूर (चित्र बी) पंजाब में धीरे से pipetting द्वारा, आकांक्षा के बाद ।
  4. यदि कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट टैग कर रहे हैं, सीधे छवि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी13 (जैसे, व्यापक क्षेत्र13, 3-डी फोकल14, आदि) का उपयोग कर नमूने ।
    नोट: फ्लोरोसेंट फिल्म भी एक आत्म सख्त बढ़ते माध्यम का उपयोग कर संरक्षित किया जा सकता है । एक फिल्म के नमूने को बढ़ते मीडिया की एक बूंद लागू करें, यह एक गिलास coverslip के साथ कवर, ध्यान रखने के नीचे किसी भी बुलबुले पर कब्जा नहीं है, और यह इमेजिंग से पहले रातोंरात कठोर करने की अनुमति ।
  5. यदि बैक्टीरियल कोशिकाओं का इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट टैग नहीं कर रहे हैं, क्रिस्टल वायलेट दाग तकनीक15 (चित्र बी) लागू करने के लिए इमेजिंग से पहले के विपरीत फिल्म को बढ़ाने के लिए ।

5. प्रोटोकॉल संशोधनों/

  1. विभिन्न सतहों पर pDawn-Ag43 बैक्टीरिया बढे ।
    1. ग्लास या पाली-dimethyl-siloxane (PDMS) कूपन रखो (जैसे, coverslips या PDMS की पतली स्ट्रिप्स) में अच्छी तरह से पहले एक जीवाणु नमूना/रोशनी के अलावा प्लेटें, और पैटर्न pDawn से पहले के रूप में एक ही प्रोटोकॉल का पालन करें-कांच पर ag43 और PDMS ।
  2. एक पारदर्शी, संलग्न संस्कृति कक्ष के अंदर pDawn-Ag43 बैक्टीरिया बढ़ें ।
    1. PDMS के लिए एक संस्कृति चैंबर मोल्ड उत्पंन करते हैं ।
      1. एक बुनियादी संस्कृति चैंबर के लिए, एक सपाट सतह के लिए एक कठिन, आयताकार चश्मे संलग्न द्वारा मोल्ड उत्पंन (चश्मे PDMS है कि संस्कृति चैंबर के रूप में कार्य करता है एक बार मोल्ड डाली है में एक गुहा हो जाएगा) । ध्यान दें कि अधिक जटिल संस्कृति चैंबर molds नरम लिथोग्राफी16का उपयोग कर गढ़े जा सकता है ।
    2. सांचे में PDMS डालने से एक PDMS गुहा कास्ट और यह इलाज करने की अनुमति (एक विस्तृत नरम लिथोग्राफी प्रोटोकॉल के लिए, है जौव विज्ञान शिक्षा16डाटाबेस देखें) ।
    3. इलाज के बाद, गुहा/संस्कृति चैंबर और बंधन गुहा में किसी भी अतिरिक्त PDMS, पंच प्रवेश/आउटलेट चैनल एक सपाट सतह (जैसे, कांच/polystyrene) मजबूती से सपाट सतह पर PDMS दबाने से, सतह के बीच गुहा छोड़ने और PDMS छत के रूप में फिल्म संस्कृति चैंबर ।
      नोट: अधिक स्थाई संबंध प्लाज्मा उपचार के आधार पर16 भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन चिप्स फिर पुन: प्रयोज्य नहीं होगा ।
    4. पहले के रूप में संस्कृति प्रोटोकॉल का पालन करें, कुंद टिप सुइयों के साथ एक सिरिंज का उपयोग (बजाय एक पिपेट के) के लिए संस्कृति चैंबर में जीवाणु का नमूना परिचय/
      1. यदि एक अस्थाई रूप से बंधुआ गुहा का प्रयोग, केवल नकारात्मक दबाव का उपयोग करने में तरल पुल/बाहर कक्ष के, यह सुनिश्चित करने के लिए कि गुहा अंतर्निहित ग्लास/polystyrene सतह से बंधुआ नहीं हो ।
  3. विकसित pDawn-Ag43 संरचित दीप्ति के लिए एक फिल्म photomask का उपयोग बैक्टीरिया ।
    1. एक फिल्म photomask प्रिंटर/प्रिंट सेवा के साथ संगत सीएडी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक फिल्म पैटर्न डिजाइन । photomask फिल्म डिजाइन क्षेत्रों में स्पष्ट किया जाना चाहिए, जहां फिल्म के लिए मुद्रित होने का मतलब है, और काला/ पूर्ण होने पर, photomask फ़ाइल को प्रिंटर/मुद्रण सेवा को भेजें और भौतिक photomask की वापसी का इंतजार करें ।
    2. निर्देश प्रोजेक्टर अधिकतम नीले रोशनी (जैसे, आरजीबी = [0, 0, २५५]) लैपटॉप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के साथ देखने का एक पूरा क्षेत्र रोशन करने के लिए ।
    3. बाहर बड़ी फिल्म photomask से ब्याज की एक क्षेत्र में कटौती, और यह टेप सीधे पहले से फिल्म संस्कृति डिश के नीचे करने के लिए रातोंरात रोशनी (चित्रा 3 डी) के लिए बैक्टीरियल नमूना शुरू करने के लिए । संस्कृति पहले के रूप में और photomask संवर्धन के बाद, इमेजिंग से पहले के रूप में इस फिल्म को हटा दें ।

Representative Results

के रूप में चित्रा 4aमें देखा, pDawn-Ag43 बैक्टीरिया के लिए प्रोजेक्टर रोशनी के साथ polystyrene अच्छी तरह से प्लेटों में नमूनों को उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया (प्रोजेक्टर एक पोल्का डॉट पैटर्न रोशन सेट) था, क्रिस्टल के साथ brightfield माइक्रोस्कोपी के माध्यम से imaged बैंगनी एक विपरीत एजेंट के रूप में दाग, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लाल-फ्लोरोसेंट-प्रोटीन-व्यक्त बैक्टीरिया का उपयोग कर । फ्लोरोसेंट फिल्म के नमूने भी फोकल माइक्रोस्कोपी14 का उपयोग करने के लिए 3-डी (चित्रा 4B) में इस फिल्म की छवियों को प्राप्त करने के लिए imaged जा सकता है । चित्र 4cमें, हम एक फिल्म photomask का उपयोग करके उच्च संकल्प पैटर्न संभव वर्णन करने के लिए फिल्म के नमूने के लिए नमूनों रोशनी प्रदान करते हैं । अंत में, चित्रा 4d और 4Eमें, हम कांच और PDMS सतहों पर पैटर्न के उदाहरण प्रदर्शित करते हैं, साथ ही साथ संलग्न PDMS संस्कृति मंडलों-इन वातावरण के विभिंन प्रकार जहां pDawn-Ag43 patterning लागू किया जा सकता है वर्णन ।

Figure 1
चित्रा 1: pDawn-Ag43 बैक्टीरिया (प्रोटोकॉल खंड 1) की तैयारी । तैयारी pDawn-Ag43 प्रकाश में सक्षम-विनियमित-फिल्म निर्माण के जीवाणुओं को शुद्ध pDawn एक मेजबान क्लोनिंग तनाव से Ag43 प्लाज्मिड शामिल है, यह एक ई. ब्याज की कोलाई तनाव में बदलने, और लंबे समय के लिए बैक्टीरियल फ्रीजर स्टॉक बनाने भंडारण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एक ऑप्टिकल सेट-अप के लिए फिल्म नमूना रोशनी (प्रोटोकॉल खंड 2) की तैयारी । ऑप्टिकल सेट अप एक बैक्टीरियल मशीन के अंदर स्थित है और एक कंप्यूटर से जुड़े प्रोजेक्टर एक फिल्म का नमूना रोशन कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: पैटर्न के लिए कल्चरल प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल अनुभाग 3) । (क) रोशनी से पहले, pDawn-Ag43 बैक्टीरिया पैटर्न से पहले ऐसी है कि वे मज़बूती से उचित विकास के चरण में प्रेरित कर रहे है तैयार हैं । (ख) रातोंरात प्रबुद्ध विकास के बाद, एक पैटर्न वाली फिल्म संस्कृति डिश के तल पर मौजूद होगी, तरल मीडिया में planktonic कोशिकाओं के साथ, और कुछ आगे प्रसंस्करण के बाद, इस फिल्म इमेजिंग के लिए तैयार है । (ग) अच्छी तरह से प्लेटों के लिए एक विकल्प के रूप में, एक molded PDMS गुहा के रूप में इस तरह के संलग्न संस्कृति चैंबर में संस्कृतिया जा सकता है । इस मामले में, कुंद टिप सुइयों से जुड़ी सीरिंज नमूना और फ्लश तरल पदार्थ कक्ष से बाहर लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । (घ) प्रोजेक्टर आधारित दीप्ति पैटर्न के लिए एक विकल्प के रूप में, पैटर्न भी टेप फिल्म photomasks द्वारा सीधे फिल्म संस्कृति मंडलों के नीचे से उत्पंन किया जा सकता है । इस मामले में, प्रोजेक्टर को पूरा क्षेत्र भर में नीली बत्ती को रोशन करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: pDawn-Ag43 का उपयोग करते हुए नमूनों के प्रतिनिधि परिणाम । सभी परिणाम एक MG1655 ई. कोलाई मेजबान तनाव का उपयोग कर प्राप्त किया गया । (क) pDawn-Ag43 जीवाणु प्रोजेक्टर रोशनी के साथ polystyrene अच्छी तरह से प्लेटों में नमूनों को उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया (प्रोजेक्टर एक पोल्का डॉट पैटर्न रोशन करने के लिए सेट किया गया था), एक के रूप में क्रिस्टल वायलेट दाग के साथ brightfield माइक्रोस्कोपी के माध्यम से imaged इसके विपरीत एजेंट, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लाल-फ्लोरोसेंट-प्रोटीन-एक्सप्रेस बैक्टीरिया का उपयोग कर । (ख) फ्लोरोसेंट फिल्म के नमूने के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ छवि को प्राप्त करने के लिए कर रहे है 3-फिल्म के डी छवियां । (ग) उच्च संकल्प वाली फिल्म photomask को फिल्म के नमूने के नमूनों की दीप्ति प्रदान करने के लिए एक फ़िल्म के साथ पैटर्न दिया जा सकता है । (घ) कांच और PDMS सतहों पर फिल्मी पैटर्न हो सकते हैं । (ङ) संलग्न संस्कृति मंडलों में विचित्रता को प्रतिरूपित किया जा सकता है. यह आंकड़ा पिछले3काम से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समस्या संभावित कारणों/
Tranforming pDawn-मेजबान तनाव में Ag43-नहीं कालोनियों कम प्लाज्मिड एकाग्रता-स्पेक्ट्रोमीटर पर प्लाज्मिड एकाग्रता की जाँच करें । pDawn-Ag43 के एक ठेठ miniprep कम से १०० एनजी/μL उपज चाहिए; परिवर्तन के लिए 10-100 एनजी करने के लिए उपयोग
/सक्षम कोशिकाओं की जांच करें: सक्षम कोशिकाओं में परिवर्तन दक्षता होनी चाहिए 10 ^ 6 cfu/µ जी एक मानक प्लाज्मिड जैसे pUC19 का उपयोग कर सत्यापित-यदि नहीं, तो सक्षम कोशिकाओं का रीमेक
गलत (level of) एलबी पर एंटीबायोटिक प्लेट-का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें ५० μg/एमएल spectinomycin चयन के लिए
प्रोजेक्टर प्रदीप्ति बदल जाता है रात भर असंगत/ इस तरह के रूप में समस्याग्रस्त सॉफ्टवेयर अक्षम करें: स्वचालित रात भर सॉफ्टवेयर/
प्रोजेक्टर भडक सकता है-सेट मशीन के तापमान को कम करने के लिए जबकि प्रोजेक्टर चालू है (उदा. 30 ° c ३७ ° c के बजाय)-हीट सोर्स के रूप में नोट प्रोजेक्टर से ज्यादा गरम करना मशीन सेट बिंदु से परे कर सकते है
मशीन से नमी के अनावश्यक स्रोतों निकालें, के रूप में इन प्रोजेक्टर इलेक्ट्रॉनिक्स को प्रभावित कर सकते है
नहीं/रातोंरात रोशनी के बाद गठित फिल्म के कम स्तर, कोई planktonic कोशिकाओं के विकास या तो (यानी तरल स्पष्ट है) गलत (level of) एंटीबायोटिक-का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें ५० μg/एमएल spectinomycin
जांच सब कुछ M63 नुस्खा ठीक से जोड़ा जाता है
नहीं/रातोंरात रोशनी के बाद गठित फिल्म के कम स्तर, केवल planktonic कोशिकाओं (यानी तरल बादल छाए हुए है) प्रकाश स्तर की जांच करें, प्रोजेक्टर ५० μW/cm ^ 2 पर ४६० एनएम तरंग दैर्ध्य में नीले प्रकाश रोशन किया जाना चाहिए
देने की कोशिश करो बैक्टीरिया कम के लिए बढ़ने/1:1000 पौंड उपकमजोरियां कदम M63 को जोड़ने से पहले के बाद लंबे समय
पौंड प्लेट पर restreak बैक्टीरिया, ताजा कॉलोनी से शुरू रातोंरात स्थिर चरण संस्कृति उत्पन्न करने के लिए
सुनिश्चित करें कि प्रोजेक्टर लगातार रातोंरात काम कर रहा है-ऊपर बिंदु देखें
फजी फिल्म पैटर्न, पृष्ठभूमि शोर के उच्च स्तर ऑप्टिकल रोशनी प्रणाली से आवारा प्रकाश को कम करने, मशीन के इंटीरियर पर चिंतनशील सतहों को कवर
photomask आधारित का उपयोग करने पर विचार (के रूप में प्रोजेक्टर के खिलाफ आधारित) संरचित रोशनी
जांच प्रोजेक्टर ठीक से फिल्म संस्कृति चैंबर के नीचे की सतह पर ध्यान केंद्रित है

तालिका 1: सामांय समस्या निवारण समस्याएं ।

Discussion

अनुसंधान उपकरण है कि फिल्म संरचना नियंत्रण के लिए अनुमति देने के लिए की जरूरत के प्रकाश में, हम एक आसान करने के लिए उपयोग के लिए pDawn-Ag43 optogenetic निर्माण का उपयोग बैक्टीरियल फिल्म पैटर्न के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । इस तकनीक के साथ, ई. कोलाई के साथ एक विशेष प्रस्ताव के नीचे के साथ संलग्न कक्षों, सहित विभिंन सतह के वातावरण पर ऑप्टिकली पैटर्न किया जा सकता है माइक्रोन ।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल नीचे चार मुख्य वर्गों में तोड़ा जा सकता है: (1) pDawn-Ag43 बैक्टीरिया की तैयारी, (2) ऑप्टिकल और संस्कृति सेट अप हार्डवेयर की तैयारी, (3) पूर्व दीप्ति बैक्टीरियल विकास कदम, और (4) के बाद रोशनी कुल्ला और इमेजिंग ।

खंड 1 के महत्वपूर्ण भाग pDawn के सफल परिवर्तन-Ag43 प्लाज्मिड हित के ई. कोलाई तनाव में है । यह उच्च गुणवत्ता शुद्ध प्लाज्मिड अलग और परिवर्तन (तालिका 1, समस्या निवारण) के लिए उच्च गुणवत्ता सक्षम कोशिकाओं को पैदा करने से सुविधा है ।

खंड 2 के महत्वपूर्ण भाग के प्रोजेक्टर सेट का अनुकूलन है, ताकि रोशनी की तीव्रता ४६०-एनएम तरंग दैर्ध्य पर ५० μW/cm2 में समायोजित किया जाता है, और प्रोजेक्टर ठीक से फिल्म नमूना ऊंचाई पर ध्यान केंद्रित है । ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल में, हम एक औंधा रोशनी सेट-अप का वर्णन जहां प्रोजेक्टर नीचे से प्रकाश चमकता है, ऊपर की ओर फिल्म नमूना । इस सेट का लाभ यह है कि प्रकाश केवल संस्कृति डिश के नीचे के माध्यम से फिल्म निर्माण की सतह तक पहुंचने से पहले यात्रा की जरूरत है । ऊपर से रोशनी का मतलब है कि प्रकाश के लिए है, जो विकास के दौरान, planktonic कोशिकाओं के साथ बादल हो जाता है के दौरान फिल्म सतह, जो, के ऊपर तरल मीडिया के माध्यम से यात्रा करनी होगी । इन चिंताओं के अलावा, यह भी करने के लिए ऑप्टिकल सेट में आवारा रोशनी को कम करने के रूप में संभव के रूप में ज्यादा महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, मशीन के इंटीरियर पर चिंतनशील सतहों को कवर करके-इस तेज नमूनों को प्राप्त करने में मदद करता है । एक संबंधित नोट पर, तेज फिल्म पैटर्न भी रोशनी पैटर्न (चित्रा 3d, चित्रा 4c) को नियंत्रित करने के लिए एक photomask का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है । समस्या निवारण की आवश्यकता वाले सामान्य समस्याओं में उच्च तापमान (उदा., ३७ ° c) पर प्रोजेक्टर विश्वसनीयता समस्याएँ शामिल होती हैं, जिन्हें कम तापमान पर (उदा., 30 डिग्री सेल्सियस), साथ ही कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर की मशीनिंग से कम किया जा सकता है । ऑपरेटिंग सिस्टम अद्यतन या रात भर विकास (तालिका 1) के दौरान नीले प्रकाश फ़िल्टरिंग के कारण होता है । यह भी ध्यान दें कि, प्रोजेक्टर और मशीन के आधार पर इस्तेमाल किया मॉडल पर निर्भर करता है, यह भी संभव है कि गर्मी प्रोजेक्टर से उत्पंन एक उच्च इंटीरियर तापमान में परिणाम होगा की तुलना में मशीन सेट तापमान है, जो सही करने की आवश्यकता हो सकती है ।

अनुभाग 3 के महत्वपूर्ण हिस्सा विश्वसनीय और दोहराने बैक्टीरियल नमूने प्राप्त करने से पहले वे रोशनी से प्रेरित कर रहे हैं । इस कारण से, यह pDawn-Ag43 बैक्टीरिया की क्लोनिंग उंहें एक आगर प्लेट पर बाहर लकीर से प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है और फिर तरल संस्कृति कदम का उपयोग करने के लिए यह सुनिश्चित करें कि बैक्टीरिया प्रबुद्ध/देर घातीय विकास चरण में एक दोहराने में प्रेरित कर रहे है तरीके.

अंत में, धारा 4 के महत्वपूर्ण भाग के लिए अच्छी तरह से है, लेकिन यह भी धीरे, दूर planktonic के बाद शेष कोशिकाओं धो फिल्म पैटर्न प्रोटोकॉल; इस प्रकार, यह पंजाब के साथ कई कोमल कुल्ला कदम प्रदर्शन करने की सिफारिश की है ।

सेल5,6पैटर्न के लिए मौजूदा तकनीक की तुलना में, ऑप्टिकल pDawn के आधार पर फिल्म पैटर्न-Ag43 प्रवेश के एक काफी कम बाधा का उपयोग किया है, में है कि यह microfabrication की आवश्यकता नहीं है, साफ कमरे की सुविधा, परिसर रसायन विज्ञान, या सतह के उपचार, अभी भी उच्च संकल्प (25 माइक्रोन) आमतौर पर microfabrication तकनीक के साथ जुड़े के साथ पैटर्न के लिए सक्षम है । विधि जीन अभिव्यक्ति17को नियंत्रित करने के लिए बैक्टीरियल photolithography पर पिछले काम फैली हुई है । वर्तमान में, pDawn-Ag43 प्लाज्मिड ई. कोलाईतक ही सीमित है, के रूप में यह एक पीयूसी-प्रतिकृति के मूल आधार का उपयोग करता है, लेकिन pDawn और Ag43 दोनों अंय (ग्राम नकारात्मक) बैक्टीरियल प्रजातियों में संगत कर रहे हैं । आनुवंशिक तकनीक संभावित विभिंन बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए प्रकाश विनियमित फिल्म गठन को शुरू करने के लिए उपलब्ध है और भविष्य के अनुसंधान के लिए एक संभव दिशा का प्रतिनिधित्व करता है । तकनीक की एक और संभावित सीमा यह है कि यह कमजोर देशी फिल्म गठन (जैसे, MG1655 ई. कोलाई) के साथ उपभेदों में बढ़ती फिल्म निर्माण द्वारा काम करता है । हालांकि, मजबूत देशी फिल्म निर्माण के साथ उपभेदों रोशनी की स्थिति की परवाह किए बिना, precluding patterned pDawn-Ag43 के रूप में यहां वर्णित के रूप में प्रयोग किया जाता है । अभी तक optogenetic तकनीक अभी भी फिल्म निर्माण को विनियमित करने में लागू साबित हो सकता है । हम ध्यान दें कि अन्य संदर्भों में, इस तरह के माध्यम से ऑप्टिकल सी-di-जीएमपी मॉडुलन18के माध्यम के रूप में, फिल्म पैटर्न के वैकल्पिक तरीकों उपलब्ध हो सकता है.

कुल मिलाकर, pDawn-Ag43 आधारित पैटर्न अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए उपयुक्त होगा कि1 समारोह पर फिल्म संरचना के प्रभाव की जांच और, इसलिए, स्वरित्र नियंत्रण से फिल्म पैटर्न पर लाभ-एक विशेष रूप से प्रासंगिक हो सकता है उदाहरण के हाइलाइट करने के लिए2फिल्म में माइक्रोबियल पारिस्थितिकी का अध्ययन है । भविष्य के निर्देशों नमूनों को बनाने में शामिल है8,9 और/या संरचित जीवाणु समुदायों । इस सुलभ प्रोटोकॉल के वैकल्पिक आवेदनों में भी जैव कला19, स्पष्ट सौंदर्य क्षमता को देखते हुए, साथ ही औपचारिक और अनौपचारिक जीवन विज्ञान शिक्षा20,21,22शामिल है । एक शैक्षिक परिप्रेक्ष्य से, प्रोटोकॉल यहां वर्णित कई प्रासंगिक तकनीकों को जोड़ती है (बैक्टीरियल संस्कृति, परिवर्तन, प्रकाशिकी/optogenetics) और भी है मॉड्यूलर विस्तार (जैसे, microfluidics शामिल हैं) ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने डी ग्लास, एच किम, एन Cira, ए Choksi, एस राजन, और उनके सहायक सुझावों के लिए बी चाबियां और उनके फोकल माइक्रोस्कोप के लिए उपयोग के लिए Spormann लैब धंयवाद । इसके अलावा, लेखकों स्टैनफोर्ड जैव से समर्थन स्वीकार एक्स Bowes और NSERC PGS फैलोशिप, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R21-AI-१३९९४१), और अमेरिकन कैंसर सोसायटी (RSG-14-177-01) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DH5alpha/pDawn-Ag43 Addgene 107742 DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use
MG1655 E. coli Coli Genetic Stock Center - Yale University CGSC #6300 MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results
RFP expression plasmid iGEM biobricks J04450-pSB4K5bb Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43
Plasmid miniprep kit Qiagen 27104
LB broth powder Affymetrix 75852 Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec
LB agar powder Affymetrix 75851 Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates
Petri dishes Fisherbrand 431760
Spectinomycin hydrochloride pentahydrate abcam ab141968 Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol
M63 media salts 5X solution Bio-world 705729 Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water
Casamino acids Amresco J851 Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%)
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%)
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM)
Crystal violet  Acros organics 212120250 Dilute to 0.1% in water prior to use
Self-hardening mounting media (Shandon immumount) Thermo Scientific 9990402 Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging
Phosphate buffered saline (PBS) solution  Gibco 10010023 Can also use PBS prepared from powder / tablets
6 well plate Fisherbrand 351146 Used as biofilm culture dish for representative results
PDMS kit Dow SYLGARD 184 Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography
1 mL syringe BD syringe 309659 For use with liquid handling with enclosed microchambers
Blunt tip needle CML supply 901-23-050 Attaches to 1 mL syringe
Lab tape Fisherbrand 15-901 Use to attach culture chamber to incubator ceiling
Bacterial incubator Sheldon Manufacturing SMI6 Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling
Portable projector Ivation IV-PJ-PRO-4-1 Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength
Optical breadboard base ThorLabs MSB6 Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards
Optical post ThorLabs TR8 2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp
Optical post right-angle clamp ThorLabs RA90 Connects vertical and horizontal posts
Mounting base ThorLabs BA1S Connects optical breadboard base and vertical post
1/4"-20 screw ThorLabs SH25S050 Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base
1/4"-20 set-screw ThorLabs SS25E63D Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole
Optical power meter Newport 840 Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement
Optical power meter detector Newport 818-UV Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range
Adjustable ND filter K&F Concept SKU0689 Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture
Presentation-projector software Microsoft Powerpoint Any software that allows drawing / presentation will suffice
CAD software Autodesk  AutoCAD Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files
Film photomask Fineline Imaging n/a Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक १४० जैव फिल्म पैटर्न optogenetics सिंथेटिक जीव विज्ञान ई. कोलाई लिथोग्राफी
pDawn-Ag43 का उपयोग करते हुए उच्च-रिज़ॉल्यूशन नमूनों वाली फिल्मी साठा
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Jin, X., Riedel-Kruse, I. H.… More

Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43. J. Vis. Exp. (140), e58625, doi:10.3791/58625 (2018).

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