Summary
Vi viser en metode for innskudds Escherichia coli bakteriell biofilm i vilkårlig romlige mønstre med høy oppløsning med optisk stimulering av en genetisk kodet overflaten vedheft konstruksjon.
Abstract
Romlig struktur og mønstre spille en viktig rolle i bakteriell biofilm. Her viser vi en tilgjengelig metode for dyrking E. coli biofilm i vilkårlig romlige mønstre med høy romlig oppløsning. Teknikken bruker en genetisk kodet optogenetic konstruksjon-pDawn-Ag43-at par biofilm formasjon i E. coli til optiske stimulering av blått lys. Vi detalj prosessen for å transformere E. coli med pDawn-Ag43, forbereder det nødvendige optisk oppsettet og protokollen dyrking mønstret biofilm bruker pDawn-Ag43 bakterier. Bruker denne protokollen, kan biofilm med en romlig oppløsning under 25 μm være mønstret på forskjellige overflater og miljøer, inkludert vedlagte chambers, uten microfabrication, ren-rom eller overflate forbehandling. Teknikken er praktisk og egnet for bruk på programmer som undersøker effekten av biofilm strukturen, gir tunable kontroll over biofilm mønstre. Videre, den likeledes har potensielle anvendelser i biologisk materiale, utdanning og bio-art.
Introduction
Biofilm er overflaten tilknyttet samfunn av mikrober, og er godt kjent for sine sterk struktur-funksjon kopling. Romlig geometri og mønstre av biofilm spiller en viktig rolle i totale samfunnet funksjonen (og omvendt)1. Hvor liten skalerer involvert i biofilm struktur-på titalls mikrometer2-gjøre tunable og praktisk kontroll over biofilm mønstre et utfordrende problem. Her viser vi en protokoll som tillater biofilm å være nettopp mønstret i vilkårlig geometrier, basert på optiske belysning.
Protokollen presenteres her bruker pDawn-Ag433, en optogenetic konstruksjon som par biofilm formasjon i E. coli bakterier å optisk belysning ved kjøring uttrykk for Ag43 (en adhesin genet er ansvarlig for overflaten vedheft og biofilm formasjon) under kontroll av pDawn4 (en transcriptional regulator kontrollert av optisk belysning). Metoden er praktisk å bruke og kan overflaten mønster biofilm på ulike miljøer, inkludert lukket (gjennomsiktig) kultur kamre. Sammenlignet med eksisterende celle deponering metoder, for eksempel slippverktøy-baserte deponering5 eller overflate prepatterning/behandling6, pDawn-Ag43 krever ikke microfabrication eller ren-rom og krever ikke materialer utover de tilgjengelig til en typisk mikrobiologi. Det er kjøpedyktig mønster med en romlig oppløsning under 25 μm, nærmer de romlige dimensjonene av microcolonies i naturlig eksisterende biofilm2. Total, denne teknikken gir muligheten til å manipulere biofilm struktur, som åpner mange muligheter for å studere microecology i bakteriell samfunn7. I tillegg kan mønstret biofilm gi en praktisk plattform som ingeniør nyttig biologisk materiale8,9. I dette papiret, vi diskutere grunnleggende protokollen kreves for mønstre biofilm bruker pDawn-Ag43 og potensielle endringer og feilsøking knyttet til metoden.
Protocol
1. forberedelse av pDawn-Ag43 bakteriell stammer
- PDawn-Ag43 forvandle en E. coli belastning av interesse (figur 1).
- Vokse en kloning belastning hosting pDawn-Ag43 plasmider (skaffes fra et plasmider Depot) ved vaksinere belastningen i LB buljong med 50 μg/mL spectinomycin (LB + spec) i en kultur tube (overnatter i en risting inkubator på ~ 250 rpm, 37 ° C). Deretter Bruk en miniprep kit for å høste renset pDawn-Ag43 plasmider10.
- Velg en E. coli belastning av interesse å bli mønster. Så langt, er pDawn-Ag43 bekreftet til å arbeide i MG16553 og BW25113.
- Bruk en etablert protokoll til å generere kompetent (f.eks, kjemisk kompetent11 eller electrocompetent12) bestander av utvalgte E. coli belastning (f.eksMG1655).
- PDawn-Ag43 plasmider forvandle den kompetente bakterier11,12, etterfulgt av 1t utvinning og plate på LB + spec agar plater. Tillate kolonier å vokse over natten på 37 ° C.
- Store pDawn-Ag43 forvandlet stammer.
- Vaksinere en enkelt koloni av pDawn-Ag43 fra en LB + spec agar plate i LB + spec kjøttkraft i en kultur rør og vokse i en risting inkubator (på ~ 250 rpm, 37 ° C) til eksponentiell fase (OD600 ~0.4 - 0,8).
- Klargjør lager lagre pDawn-Ag43 forvandlet belastningen ved-80 ° C langsiktige ved å blande 1 mL av kultur med 1 mL av 50% sterilt glyserol i et cryo-rør for å få en 25% glyserol fryser lager. Lagre dette i-80 ° C fryser.
- Hvis flere plasmider (f.eks, fluorescerende reporter plasmider) må bli forvandlet, opprette kompetent celler11,12 fra pDawn-Ag43 forvandlet belastning og gjenta transformasjon prosessen11 , 12 for ekstra plasmider etter behov.
Merk: Hvis bruker electroporation8, er det mulig å cotransform flere plasmider (inkludert pDawn-Ag43) samtidig; men anbefales en samtidige transformasjon ikke med kjemiske transformasjon metoder som den store størrelsen (> 10 kB) på pDawn-Ag43 betyr transformasjon effektiviteten er redusert.
2. utarbeidelse av projektoren optisk oppsettet for belyse bakterier
- Få en bakteriell inkubator med ikke-gjennomsiktige vegger og hull for bestått kabler, prosjektor montering og fungerer i bakteriell inkubator, og en bærbar PC utstyrt med programvare for presentasjon-projeksjon (se tabell av Materialer). Når du velger projektor og inkubator, sikre det minimal fokusavstand projektoren er mindre enn den innvendige takhøyden i inkubator.
- Plass projektoren innenfor inkubator nederst, med aperture peker direkte oppover, på taket, hvor biofilm kultur kammeret er festet (figur 2).
- Fastsette projektoren på plass ved å opprette et oppsett med en optisk brødfjel base koblet til en vertikal stilling, koblet igjen til en horisontal stilling som skruer inn projektoren (figur 2). Merk at dette oppsettet kan endres avhengig av projektoren/tilgjengelig deler. Til slutt, den viktigste betingelsen er at projektoren er solid fast nederst på inkubator, med blenderåpning peker oppover.
- Koble den bærbare datamaskin via skjermkabelen (f.eksHDMI) til projektoren innenfor inkubator.
- Hvis overflater, spesielt taket-i indre av inkubatoren er reflekterende (f.ekspolert metalloverflate), dekke dem med mørk matte flater å minimere refleksjoner.
- Bruke tape for å knytte en tom "dummy" kultur rett til taket i inkubator. Oppmerksom på at, som med projektoren, finnes det flere akseptabel måter å feste en kultur parabol; Kontroller at at gjennomsiktig undersiden av kultur kammer, der belysning oppstår, ikke dekkes.
- Justere fokus på projektoren ved å vri på fokus bryteren slik at fokus flyet sammenfaller med at undersiden av biofilm kultur retten (f.eksen frisk plate) festet til taket av inkubatoren (figur 2). Projektoren skal lyser en skarp, ikke-uskarpe bildet på bunnen av parabolen kultur. Fjern "dummy" kultur parabol når anslaget er optimalisert.
- Bruke bærbare programvare, direkte projektoren til å lyse opp hele synsfeltet med maksimal blå belysning (f.eksRGB = [0, 0, 255]) ved å presentere et full blå lysbilde.
- Måle belysning intensitet projektoren bruker en optisk strømmåleren ved å plassere photodetector hodet i inkubator taket og lese intensiteten på tilsvarende strømmåleren kalibrert til lys bølgelengde 460 nm. Følg instruksjonene på tilkobling og kalibrere photodetector for bestemte strømmåleren brukes.
- Redusere omgivelseslys (f.eksslå rommet lysene eller plassere inkubator borte fra lyskilder) som mulig før belysning intensitet målinger.
- Justere belysning intensitet ved hjelp av en justerbar Nøytralfilter plassert på projektoren blenderåpning. Rotere filteret for å justere belysning intensitet målt ved strømmåleren, helt til belysning intensiteten i midten av blått lys projiserte regionen står 50 μW/cm2.
Merk: Det er mulig å justere belysning intensitet ved hjelp av lavere blå RGB verdier på programvare slutten, bruker et filter mens maksimere blå RGB-verdien har fordelen av maksimere optisk kontrasten av systemet mellom opplyst vs. mørke områder. - Tegne vilkårlig mønstre ved hjelp av presentasjon/projektor programvare på bærbar PC og viser disse mønstrene på taket i inkubator, bruke projektoren.
Merk: Biofilm-forming områder skal tegnes med maksimal blå belysning (f.eksRGB = [0, 0, 255]), ikke-biofilm-forming regioner med ingen belysning (f.eksRGB = [0, 0, 0]).
3. dyrking mønstret biofilm
- Før belysning, forberede pDawn-Ag43 bakterier, fra glyserol fryser aksjen, slik at de er pålitelig indusert på slutten eksponentiell vekst fasen for belysning (figur 3A).
- Strek en pDawn-Ag43-stamme fra glyserol lager på LB + spec agar plater. Tillate kolonier å vokse over natten (37 ° C).
Merk: Herfra til belysning kultur trinnet kontroller cellene bo i mørket så mye som mulig-korte perioder på ambient belysning (f.eksfor subdilution) er akseptable. - Vaksinere en koloni av pDawn-Ag43 bakterier fra en agar plate i LB + spec buljong og vokse kultur over natten til stasjonære fase (i en risting inkubator på ~ 250 rpm, 37 ° C, ~ 16 h).
- Subdilute kulturen i forholdet 1:1,000 med LB + spec kjøttkraft (f.eksTilsett 1 μL av natten kultur 1 mL av fersk LB + spec).
- Tillat subdiluted kulturen å vokse til sent eksponentiell/tidlig stasjonære fase (OD ~ 1.0, ~ 6 h i en risting inkubator ~ 250 RPM, 37 ° C).
- Mens du venter kulturen å vokse, forberede M63 media med 1 x M63 salter, 1 mM MgSO4, 0,2% glukose, 0,1% casamino syrer og 50 μg/mL spectinomycin i vann (at delene er sterile).
- Subdilute sen-eksponentiell-fase kulturen i forholdet 1: 100 med M63 media med 50 μg/mL spectinomycin. Deretter introdusere fortynning i en biofilm kultur parabol (f.eksPipetter utvannet prøven i en frisk plate).
Merknad: Volumer kreves for denne 1: 100 subdilution avhenger kultur parabol brukes (f.ekshvis bruker en 6-vel polystyren godt plate [ikke-vev-kultur behandlet], et enkelt eksempel ville kreve å legge 20 μL kultur til 2 mL M63 + spec, som den standard godt volum av en 6-vel plate er ~ 2 mL).
- Strek en pDawn-Ag43-stamme fra glyserol lager på LB + spec agar plater. Tillate kolonier å vokse over natten (37 ° C).
- Som eksemplene er nå klar for belysning, tape kultur parabolen med taket i inkubator, at overflaten på bunnen av parabolen er gjennomsiktig for belysning nedenfor av projektoren.
Merk: Det er viktig å sikre at taket i inkubatoren ikke er reflekterende, minimere spredt belysning. Spredt belysning kan også reduseres ved hjelp av svart vegger plater som kultur retter, selv om det ikke strengt nødvendig, hvis bruker slike plater, kontrollerer at undersiden er gjennomsiktig. - Tillate biofilm kultur i inkubator natten (16 h med ingen risting, på 37 ° C). Legg merke til at noen projektorer bli færre pålitelig ved høyere temperaturer. Hvis det er tilfelle, holde kultur ved lavere temperaturer (f.eks30 ° C), husk at inkubasjon tiden må økes, avhengig av E. coli belastningen.
4. imaging mønstret biofilm
- Etter natten veksten av biofilm prøvene, fjerne kultur parabol settefiskanlegg. Retten vil ha biofilm bakterier knyttet til bunnen overflaten der det har blitt opplyst, samt planktoniske bakterier spredt i flytende media ovenfor.
- Kast planktoniske cellene ved å fjerne flytende media fra kultur parabol (f.eksved forsiktig aspirating med en pipette).
- Skyll prøven 2 x med en fosfat-bufret saltvann (PBS)-løsning for å fjerne gjenværende planktoniske celler (figur 3B) av forsiktig pipettering i PBS, etterfulgt av aspirasjon.
- Hvis cellene er fluorescently kodet, direkte bilde eksemplene bruker fluorescens mikroskopi13 (f.eks, wide-field13, 3D AC confocal14, etc.).
Merk: Fluorescerende biofilm også bli bevart ved hjelp av en selv herding montering medium. Bruke en dråpe montering media en biofilm utvalg, dekke det med et glass dekkglassvæske, ta vare ikke for å fange bobler under, og la den herdes natten før bildebehandling. - Hvis bakterieceller brukes ikke er fluorescently kodet, kan du bruke crystal violet flekken teknikk15 (figur 3B) å forsterke biofilm kontrast før bildebehandling.
5. protokoll endringer/alternativer
- Vokse pDawn-Ag43 bakterier på ulike overflater.
- Sette glass eller poly-dimethyl-siloxane (PDMS) kuponger (f.eks, coverslips eller tynne strimler av PDMS) i bra plater før tilsetning av en bakteriell utvalg/belysning, og følge den samme protokollen som før til mønster pDawn-ag43 biofilm på glass og PDMS.
- Vokse pDawn-Ag43 bakterier inne en gjennomsiktig, lukket kultur kammer.
- Generere en kultur kammer mold for PDMS.
- For en grunnleggende kultur kammer, generere mold ved å feste en hard, rektangulær prisme til flate (prism vil bli et hull i PDMS som fungerer som kultur kammeret når mold er kastet). Merk at mer intrikate kultur kammer muggsopp kan være fabrikasjon benytter myk litografi16.
- Kastet en PDMS hulrom ved å helle PDMS i mold og la det å kurere (for en detaljert myk litografi protokoll, se Jove's Science utdanning Database16).
- Etter herding, trimme noen overflødig PDMS, slå inn-/ utløp kanaler i hulrom/kultur kammeret og bånd hulrommet til en flat overflate (f.eks, glass/polystyren) ved å trykke fast PDMS på flatt underlag, forlater hulrom mellom overflaten og PDMS taket som biofilm kultur kammeret.
Merk: Mer permanent bånd basert på plasma behandling16 kan også brukes, men brikkene deretter kan ikke gjenbrukes. - Følg kultur protokollen som før, med en sprøyte med butt tupp nåler (i stedet for en pipette) å innføre bakteriell prøven i kultur kammer/skylling med PBS buffer (Figur 3 c).
- Bruk bare negative trykket for å trekke flytende til av kammeret, for å sikre at hulrommet ikke blir unbonded fra underliggende glass/polystyren overflaten hvis bruker et midlertidig limt hulrom.
- Generere en kultur kammer mold for PDMS.
- Vokse pDawn-Ag43 bakterier bruker en film photomask for strukturert belysning.
- Utforme en biofilm mønster CAD-programvare som er kompatibel med filmen photomask skriver/print service. Photomask film design bør være tydelig i regioner der biofilm skal skrives og svart/ugjennomsiktig andre steder. Når fullført, sende filen photomask til skriveren/utskrift tjenesten og venter retur av den fysiske photomask.
- Instruere projektoren til å belyse en full synsfelt med maksimal blå belysning (f.eksRGB = [0, 0, 255]) bruker bærbare programvare.
- Klipp ut et område av interesse fra større film photomask og tape den direkte til bunnen av biofilm kulturen rett før innføre bakteriell prøven for overnatting belysning (figur 3D). Kultur i biofilm som før og fjerne photomask etter dyrking, før bildebehandling.
Representative Results
Som vist i figur 4A, pDawn-Ag43 bakterier ble brukt til å generere biofilm mønster polystyren bra plater med projektoren belysning (projektoren ble satt til å belyse en polka-dot mønster), avbildet gjennom brightfield mikroskopi med krystall fiolett flekk som kontrast agent og fluorescens mikroskopi med rød-fluorescerende-protein-uttrykke bakterier. Fluorescerende biofilm prøver kan også avbildes bruk AC confocal mikroskopi14 å få bilder av biofilm i 3D (figur 4B). I figur 4Cillustrere vi høyoppløselig finske mulig ved hjelp av en film photomask for å gi mønstret lys til biofilm prøven. Til slutt, i Figur 4 d og 4E, vi viser eksempler på mønstre på glass og PDMS flater, samt lukkede PDMS kultur kammer-Dette illustrerer ulike miljøer der pDawn-Ag43 mønstre kan brukes.
Figur 1: Forberedelse av pDawn-Ag43 bakterier (protocol del 1). Forbereder pDawn-Ag43 bakteriene i stand til lys regulert biofilm formasjon innebærer rensing pDawn-Ag43 plasmider fra en vert kloning belastning, forvandle den til en E. coli belastning av interesse og opprette bakteriell fryser lager for langsiktige lagring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: utarbeidelse av en optisk oppsett for biofilm eksempel belysning (protocol inndeling 2). Optisk opplegget ligger inne i en bakteriell inkubator og består av en datamaskin-tilkoblet projektoren belyse en biofilm prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: kultur protokoll for mønstre biofilm (protocol avsnitt 3). (A) før belysning, pDawn-Ag43 bakterier er forberedt før mønstre slik at de er pålitelig indusert på den riktige vekstfase. (B) etter overnatting opplyst vekst, en mønstret biofilm vil finnes på bunnen av kultur fatet, sammen med planktoniske celler i flytende media, og etter noen videre behandling, biofilm er klart til avbilding. (C) som et alternativ til godt plater, kan biofilm kultivert i vedlagte kultur kamre som en støpt PDMS hulrom. I dette tilfellet kan sprøyter knyttet til butt tupp nåler brukes til å introdusere prøven og flush væske ut av kammeret. (D) som et alternativ til projektoren-basert belysning mønstre, mønstre kan også genereres ved taping film photomasks direkte til bunnen av biofilm kultur kamre. I dette tilfellet bør projektoren settes opp til å belyse blått lys over hele feltet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant resultatene av biofilm mønstret med pDawn-Ag43. Alle resultater ble hentet ved hjelp av en MG1655 E. coli vert belastning. (A) pDawn-Ag43 bakterier ble brukt til å generere biofilm mønster polystyren bra plater med projektoren belysning (projektoren ble satt til å belyse en polka-dot mønster), avbildet gjennom brightfield mikroskopi med crystal violet flekken som en kontrast agent, og fluorescens mikroskopi med rød-fluorescerende-protein-uttrykke bakterier. (B) fluorescerende biofilm prøver er avbildet med AC confocal mikroskopi å få 3D-bilder av biofilm. (C) med høy oppløsning biofilm kan være mønstret med en film photomask å gi mønstret lys til biofilm prøven. (D) biofilm kan være mønstret på glass og PDMS flater. (E) biofilm kan være mønstrede i vedlagte kultur kamre. Dette tallet er tilpasset fra tidligere arbeid3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Problem | Potensielle årsaker løsninger |
| Tranforming pDawn-Ag43 til verten belastning - ingen kolonier | Lav plasmider konsentrasjon - sjekk plasmider konsentrasjon på spectrometer. En typisk miniprep av pDawn-Ag43 skal gi minst 100 ng/μL; bruke opp til 10-100 ng for transformasjon |
| Sjekk/remake kompetent celler: kompetent celler skal ha transformasjon effektivitet minst 10 ^ 6 cfu/µg verifisert ved hjelp av en standard plasmider som pUC19 - hvis ikke remake kompetent celler | |
| Feil (nivå av) antibiotika på LB agar plate - pass på å bruke 50 μg/mL spectinomycin for utvalg | |
| Projektoren belysning slår av / inkonsekvent over natten | Deaktiver problematisk programvare som: automatisk overnatting programvare/operativsystem oppdatering, natten blått lys filter |
| Projektoren kan være overoppheting - angi inkubator til lavere temperatur mens projektoren er slått på (f.eks 30 ° C i stedet for 37 ° C) - Merk projektor som varmekilde kan overopphetes inkubator utover settpunkt | |
| Fjern unødvendige kilder av fuktighet fra inkubator, som dette kan påvirke projektoren elektronikk | |
| No/low nivåer av biofilm dannet etter overnatting belysning, ingen planktoniske celler vekst enten (i.e. flytende er klart) | Feil (nivå av) antibiotika - bruk 50 μg/mL spectinomycin |
| Når alt er lagt til M63 oppskrift riktig | |
| No/low nivåer av biofilm dannet etter overnatting belysning, bare planktoniske celler (i.e. væsken er uklar) | Sjekk lys nivå, projektoren skal være lyser blått lys på 50 μW/cm ^ 2 på 460 nm bølgelengde |
| Prøv å la bakterier vokse for kortere/lengre tid etter 1:1000 LB subdilution trinn før du legger til M63 | |
| Restreak bakterier på LB plate, starter fra frisk kolonien generere overnatting stasjonære fase kultur | |
| Sikre projektoren fungerer konsekvent over natten - se punktet ovenfor | |
| Fuzzy biofilm mønstre, høye nivåer av bakgrunnsstøy | Redusere uønsket lys fra optisk belysning systemet, dekke reflekterende overflater på innsiden av inkubator |
| Vurder å bruke photomask-basert (i motsetning til projektoren-basert) strukturert belysning | |
| Når projektoren er riktig fokusert på undersiden av biofilm kultur kammeret |
Tabell 1: Vanlige feilsøking av problemer.
Discussion
I lys av behovet for forskningsverktøy som tillater biofilm struktur kontroll, har vi presentert en lett-å-bruke protokoll for mønstre bakteriell biofilm bruker den pDawn-Ag43 optogenetic konstruksjonen. Med denne teknikken, kan E. coli biofilm være optisk mønstret på ulike overflaten miljøer, inkludert lukket kammer, med en romlig oppløsning under 25 μm.
Samlet denne protokollen kan deles inn i fire hoveddeler: (1) utarbeidelsen av pDawn-Ag43 bakterier, (2) utarbeidelsen av den optiske og kultur sette opp maskinvare, (3) før belysning bakterievekst trinnene og (4) etter belysning skyller og bildebehandling.
Den kritiske delen av avsnittet 1 er vellykket transformasjonen av pDawn-Ag43 plasmider i E. coli belastningen av interesse. Dette muliggjøres ved å isolere høykvalitets renset plasmider og generere høy kvalitet kompetent celler for transformasjon (tabell 1, feilsøking).
Den kritiske delen av inndeling 2 er optimalisering av projektoren oppsettet slik at belysning intensitet justeres til 50 μW/cm2 på 460-nm bølgelengde og projektoren er riktig fokusert på biofilm eksempel høyden. Merk at i denne protokollen, beskriver vi en invertert belysning oppsett der projektoren skinner lys nedenfor, oppover mot biofilm prøven. Fordelen med dette oppsettet er at lyset trenger bare å reise gjennom bunnen av kultur rett før havoverflaten biofilm formasjon. Lys ovenfra betyr at lyset må reise gjennom flytende media over biofilm overflaten, som i løpet av veksten, blir med planktoniske celler. I tillegg til disse bekymringene, det er også viktig å redusere uønsket lys i optisk oppsettet som mulig, for eksempel ved å dekke opp reflekterende overflater på indre av inkubatoren – dette bidrar til å oppnå skarpere mønstret biofilm. På et beslektet notat, kan skarpere biofilm mønstre også oppnås ved hjelp av en photomask til å styre belysning mønstre (figur 3D, figur 4C). Vanlige problemer krever feilsøking inkluderer projektor pålitelighetsproblemer ved høyere temperaturer (f.eks, 37 ° C), som kan reduseres ved rugende biofilm veksten ved lavere temperaturer (f.eks, 30 ° C), samt programvare som forårsaker operativsystemet eller blått lys filtrering under overnatting vekst (tabell 1). Det er også viktig å merke seg at avhengig av projektoren og inkubator modellen som brukes, er det også mulig at varmen som genereres fra projektoren vil resultere i en høyere indre temperatur enn inkubator temperatur, som må rettes.
Den kritiske delen av avsnitt 3 er å få pålitelig og repeterbare bakteriell prøver før de er indusert av belysning. Derfor anbefales det å få klonal kolonier av pDawn-Ag43 bakterier ved striper dem ut på en agar plate og deretter bruke flytende kultur trinnene slik at bakterier er opplyst/indusert på slutten eksponentiell vekstfase i en repeterbar måte.
Endelig, det viktig del av del 4 er å grundig, men også forsiktig vaske vekk planktoniske cellene igjen etter biofilm mønstre protokoll; Derfor er det anbefalt å utføre flere mild skyll trinn med PBS.
Sammenlignet med eksisterende teknikker for cellen mønstre5,har6, optisk biofilm mønstre basert på pDawn-Ag43 en rimelig lav barriere for innreise til å bruke, ved at den ikke krever microfabrication, rene rom, komplekse kjemi, eller overflate forbehandling, men er fremdeles kjøpedyktig mønster med høy oppløsning (25 μm) vanligvis assosiert med microfabrication teknikker. Metoden utvider tidligere arbeid på bakteriell klima og jordsmonn for å kontrollere gene expression17. PDawn-Ag43 plasmider er foreløpig begrenset til E. coli, som den bruker en pUC-baserte opprinnelsen til replikering, men pDawn og Ag43 er begge kompatible i andre (Gram-negative) bakterie-art. Genetisk teknikker tilgjengelig for potensielt innføre lys regulert biofilm formasjonen til ulike bakteriell arter og representerer en mulig retning for fremtidig forskning. En annen potensiell begrensning av teknikken er at det fungerer ved å øke biofilm formasjon i stammer med svak innfødt biofilm dannelse (f.eksMG1655 E. coli). Imidlertid har stammer med sterk innfødt biofilm dannelse biofilm form uansett belysning forhold, slik at mønstret biofilm dannelse med pDawn-Ag43 som beskrevet her; ennå kan optogenetic teknikker fortsatt bli gjeldende i å regulere biofilm formasjon. Vi oppmerksom på at i andre sammenhenger, alternative metoder for biofilm mønstre kan være tilgjengelige, for eksempel via optisk c-di-GMP modulering18.
Samlet pDawn-Ag43 basert mønstre vil være riktig for bruk i programmer som undersøke effekten av biofilm strukturen på funksjonen1 , og derfor kan ha nytte av tunable kontroll over biofilm mønstre-et spesielt relevant eksempel å markere er studiet av microbial ecology i biofilm2. Fremtidige retninger inkluderer gjør mønstret biologisk materiale8,9 og/eller strukturert bakteriell samfunn. Alternative programmer av denne tilgjengelig protokollen også omfatte bio-art19, gitt klare estetiske potensialet, i tillegg til formelle og uformelle livet vitenskap utdanning20,21,22. Fra et pedagogisk perspektiv, protokollen beskrevet her kombinerer mange relevante teknikker (bakteriell kultur, transformation, optikk/optogenetics) og er også modulbasert utvides (f.eksinkluderer microfluidics).
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker D. Glass, H. Kim, N. Cira, A. Choksi, S. Rajan og B. nøkler for sine forslag og Spormann laboratorium for tilgang til deres AC confocal mikroskop. Videre erkjenner forfatterne støtten fra Stanford Bio-X Bowes og NSERC PGS stipend, National Institute of Health (R21-AI-139941) og American Cancer Society (RSG-14-177-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
| MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center - Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
| RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
| LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
| Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
| Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
| M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
| Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
| Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
| Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
| 6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
| PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
| 1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
| Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
| Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
| Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
| Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
| Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
| Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
| Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
| Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
| 1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
| 1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
| Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
| Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
| Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture |
| Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
| Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Christensen, B. B., Haagensen, J. A. J., Heydorn, A., Molin, S. Metabolic commensalism and competition in a two-species microbial consortium. Applied and environmental microbiology. 68 (5), 2495-2502 (2002).
- Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Ohlendorf, R., Vidavski, R. R., Eldar, A., Moffat, K., Möglich, A. From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression. Journal of Molecular Biology. 416 (4), 534-542 (2012).
- Xu, T., et al. Construction of high-density bacterial colony arrays and patterns by the ink-jet method. Biotechnology and Bioengineering. 85 (1), 29-33 (2004).
- Gu, H., Hou, S., Yongyat, C., Detore, S., Ren, D. Patterned Biofilm Formation Reveals A Mechanism for Structural Heterogeneity in Bacterial Biofilms. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 29 (35), 11145-11153 (2013).
- Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 64 (4), 847-867 (2000).
- Nguyen, P. Q., Botyanszki, Z., Tay, P. K. R., Joshi, N. S. Programmable biofilm-based materials from engineered curli nanofibres. Nature Communications. 5, 4945 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13, 515-523 (2014).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. New York, NY. (2010).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experiments. 47, e2437 (2011).
- JoVE Science Education Database. Bioengineering. Soft Lithography. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Huang, Y., Xia, A., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Kac, E. Signs of Life: Bio Art and Beyond. , MIT Press. Cambridge, MA. (2007).
- Lee, S. A., et al. Trap it!: A Playful Human-Biology Interaction for a Museum Installation. Proceedings of the 33rd Annual ACM Conference on Human Factors in Computing Systems. , 2593-2602 (2015).
- Cira, N. J., et al. A Biotic Game Design Project for Integrated Life Science and Engineering Education. PLOS Biology. 13 (3), e1002110 (2015).
- Bybee, R. W. The next generation science standards and the life sciences. Science and Children. 50 (6), 7 (2013).
