Summary
Biz Escherichia coli bakteri biyofilmler rasgele kayma desenleri genetik olarak kodlanmış bir yüzeyin-yapışma yapı optik uyarılması kullanarak yüksek çözünürlük ile yatırmak için bir yöntem göstermek.
Abstract
Kayma yapısı ve desenlendirme bakteriyel biyofilmler içinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada yüksek mekansal çözünürlükte rasgele kayma kalıpları içine E. coli biyofilmler kültür için erişilebilir bir yöntemi göstermektedir. Bir genetik olarak kodlanmış optogenetic Yapı tekniği kullanır — pDawn-Ag43 — bu tarafından mavi ışık optik uyarmaya E. coli biyofilm oluşumu çiftler. E. coli pDawn-Ag43 ile dönüştürme işleminin gerekli optik kurulum ve protokol desenli biyofilmler kullanarak pDawn-Ag43 bakteri kültürü için hazırlanıyor ayrıntı. Bu iletişim kuralını kullanan, biyofilmler 25 mikron altındaki bir uzaysal çözünürlük ile çeşitli yüzeyler ve ortamlar, microfabrication, temiz oda tesis veya yüzey Önarıtma gerek kalmadan kapalı odaları da dahil olmak üzere üzerinde desenli. Uygun ve biyofilm desenlendirme üzerinde ayarlanabilir denetim sağlar biyofilm yapısının etkisi araştırmak uygulamalarda kullanım için uygun tekniktir. Daha geniş, ayrıca Biyomalzeme, eğitim ve bio-sanat potansiyel uygulamalar vardır.
Introduction
Biyofilmler yüzey bağlı topluluklar mikroplar ve onların güçlü yapı-fonksiyon kaplin için iyi bilinen vardır. Mekansal geometri ve biyofilmler desenlendirme1bir genel toplum işlevi (ve tersi) önemli rol oynarlar. Küçük uzunluğu biyofilm yapısında yer ölçekler — mikron2onlarca sırasına — zorlu bir sorun biçimlenme biyofilm ayarlanabilir ve rahat kontrolünü yapmak. Burada biz biyofilmler tam desenli içinde rasgele geometrileri üzerinde optik aydınlatma dayalı, olmak için izin veren bir protokol göstermek.
PDawn-Ag433, E. coli bakteri biyofilm oluşumu için optik aydınlatma Ag43 ifade sürüş tarafından çiftler bir optogenetic inşa burada sunulan protokolü kullanır (bir adhesin gen yüzey adezyon ve biyofilm sorumlu oluşumu) pDawn4 (optik aydınlatma tarafından kontrollü bir transkripsiyon regülatör) kontrolü altında. Yöntem kullanmak uygun olur ve desen biyofilmler çeşitli ortamlarda kapalı (saydam) kültür odaları da dahil olmak üzere, yüzey. Damlacık tabanlı ifade5 veya yüzey prepatterning/tedavi gibi6, varolan hücre ifade yöntemleri göre pDawn-Ag43 microfabrication veya temiz oda imkanları gerektirmez ve does değil istemek malzemeleri olanlar dışında tipik Mikrobiyoloji Laboratuvar için kullanılabilir. 25 mikron microcolonies doğal olarak mevcut içinde mekansal boyutları yaklaşıyor, aşağıda bir uzaysal çözünürlük ile desen yapabiliyor biyofilmler2. Genel olarak, bu tekniğin microecology bakteriyel topluluklar7çalışma için birçok yollar açar biyofilm yapısı işleme yeteneği sağlar. Ayrıca, desenli biyofilmler üzerine yararlı Biyomalzeme8,9mühendis uygun bir platform sağlayabilir. Bu kağıt, pDawn-Ag43 kullanarak biyofilmler desenlendirme için gerekli temel Protokolü tartışmak ve adres olası değişiklikler ve yöntemi ile ilgili sorun giderme.
Protocol
1. pDawn-Ag43 bakteri suşları hazırlanması
- PDawn-Ag43 bir ilgi (Şekil 1) e.coli suşu dönüşümü.
- PDawn-Ag43 plazmid (plazmid depodan elde edilebilecek) 50 μg/mL spektinomisin (LB + spec) (gecede, titreyen bir kuluçka ~ 250 rpm, 37 ° C) bir kültür tüp ile takıma LB suyu zorlanma aşı barındırma bir klonlama yük büyümek. Sonra bir miniprep kit saf pDawn-Ag43 plazmid10hasat için kullanın.
- Bir E. coli zorlanma desenli ilgi seçin. Şimdiye kadar pDawn-Ag43 MG16553 ve BW25113 çalışmak için doğrulandı.
- Yetkili oluşturmak için oluşturulmuş protokol kullanın (Örneğin, kimyasal olarak yetkili11 -electrocompetent12) seçilmiş hisse senetleri e.coli suşu (Örneğin, MG1655).
- PDawn-Ag43 plazmid yetkili bakteri11,121 saat kurtarma ve plaka tarafından takip LB + spec ağar kaplamalar, dönüştürün. Koloniler gecede 37 ° C'de büyümeye izin
- Mağaza pDawn Ag43 suşları dönüştürdü.
- PDawn-Ag43 bir LB üzerinden bir koloni aşılamak + agar plaka LB spec + suyu bir kültür tüp spec ve üssel faz (OD600 ~0.4 - 0.8) için titreyen bir kuluçka (~ 250 rpm, 37 ° C)'de büyür.
- Hisse senedi uzun vadeli-80 ° C'de pDawn-Ag43 dönüştürülmüş zorlanma kültürünün 1 mL 1 mL cryo-tüp dondurucu hisse senedi % 25 gliserol elde etmek içinde % 50 steril Gliserin ile karıştırılarak depolamak için hazırlayın. Bu-80 ° C dondurucuda saklayın.
- Ek plazmid (Örneğin, floresan muhabir plazmid) dönüştürülmesi, yetkili hücreleri11,oluşturmak gerekirse12 pDawn-Ag43 den zorlanma değiştirdi ve dönüştürme işlemi11 tekrar , 12 ek plazmid gerektiği gibi.
Not: Elektroporasyon8kullanıyorsanız, bu cotransform (pDawn-Ag43 dahil) aynı anda birden fazla plazmid mümkündür; Ancak, pDawn-Ag43 büyük boy (> 10 kB) dönüşüm verimliliği azalır aracı olarak eş zamanlı dönüşüm kimyasal dönüştürme yöntemleri kullanarak önerilmez.
2. aydınlatıcı bakteriler için projektör optik Set-up hazırlanması
- Kablolar, taşınabilir projektörüne montaj ve bakteriyel inkübatör içinde işleyen kabil iletilmesi için bakteriyel bir kuluçka makinesi saydam olmayan duvarlar ve bir delik ile elde etmek ve bir dizüstü bilgisayar için sunum-projeksiyon (bakınız tablo, yazılım ile donatılmış Malzemeler). Projektör ve kuluçka makinesi seçerken, bu projektörün minimum odaklama mesafesi kuluçka makinesi iç yüksekliği daha az olduğundan emin olun.
- Biyofilm kültür odası nerede tavan, yukarı doğru (Şekil 2) bağlı doğrudan altındaki diyafram işaret ile projektör kuluçka makinesi içine yerleştirin.
- Projektörün yerde bir set-up optik bir breadboard temel ile inşa tarafından dikey bir mesaja bağlı düzeltme sırayla bağlı yatay bir mesaja hangi vida projektör (Şekil 2). Not Bu kurulum projektör/kullanılabilir bölümleri bağlı olarak değiştirilebilir. Sonuçta, projektör sağlam yukarı işaret diyafram ile kuluçka makinesi, alt yakınlarında sabittir anahtar gereksinimi olduğunu.
- Laptop yolu ile ekran kablosunu (Örneğin, HDMI) kuluçka makinesi içinde projektör bağlanın.
- Eğer yüzeyleri — özellikle tavan — yansıtıcı (Örneğin, metal cilalı yüzey), kuluçka makinesi iç vardır onları yansımaları en aza indirmek için karanlık mat yüzey ile koruyun.
- Teyp bir boş 'aptal' kültür bulaşık kuluçka makinesi tavana bağlamak için kullanın. Unutmayın, tasarı ile olduğu gibi kültür çanak eklemek için birden çok kabul edilebilir yolları; aydınlatma oluştuğu, kültür odası şeffaf alt yüzeyine kapsamında değildir olun.
- Projektörün odaklanmak böylece kuluçka (Şekil 2) tavana bağlı alt yüzeyine biyofilm kültür çanak (Örneğin, iyi bir tabak) ile odaklama uçak denk odaklama düğmeyi çevirerek ayarlayın. Projektörün keskin, bulanık olmayan görüntü alt kültür yemeğin üzerine aydınlatmak. Projeksiyon optimize edilmiş bir kez 'aptal' kültür çanak çıkarın.
- Dizüstü bilgisayar yazılımı kullanarak doğrudan en çok mavi aydınlatmalı tam görüş alanı aydınlatmak için projektör (Örneğin, RGB = [0, 0, 255]) tam mavi bir slayt sunarak.
- Photodetector kafa kuluçka tavana yerleştirip yoğunluğu ışık dalga boyu 460 nm için kalibre karşılık gelen güç metre üzerinde okuma bir optik güç ölçeri kullanmayı projektör aydınlatma yoğunluğunu ölçmek. Bağlanma ve photodetector kullanılan belirli güç metre için ayarlama yönergeleri izleyin.
- Ortam ışığı azaltmak (Örneğin, oda ışıkları kapatın veya kuluçka makinesi ışık kaynaklarından uzak yer) aydınlatma yoğunluğu ölçüm yapmadan önce mümkün olduğu kadar.
- Projektör diyafram açıklığında yerleştirilen bir ayarlanabilir nötr yoğunluk filtresi kullanarak aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın. Mavi ışık öngörülen bölge merkezi Aydınlatma şiddeti 50 μW/cm2okur kadar güç ölçer tarafından ölçülen aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın için filtre döndürün.
Not: yazılım ucunda düşük mavi RGB değerleri kullanarak aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın mümkün iken, mavi RGB değeri maksimize sistem optik kontrast ışıklı vs arasında en üst düzeye çıkarma avantajı varken bir filtre kullanarak. karanlık bölgeler. - Dizüstü bilgisayarda sunum/projektör yazılım kullanarak rasgele desenleri çizmek ve bu desenleri projektör kullanarak da kuluçka tavanda görüntüler.
Not: Biyofilm oluşturan bölgeler ile en fazla mavi aydınlatma çizilmesi (Örneğin, RGB = [0, 0, 255]), biyofilm şekillendirme bölgeleri yok aydınlatma ile (Örneğin, RGB = [0, 0, 0]).
3. desenli biyofilmler kültür
- Aydınlatma önce güvenilir bir şekilde geç üstel büyüme faz aydınlatma (Şekil 3A) için indüklenir gliserol dondurucu stoktan başlatılıyor pDawn-Ag43 bakterileri hazırlayın.
- PDawn-Ag43 zorlanma LB + spec agar levha üzerine gliserol stoktan çizgi. Koloniler büyümeye izin geceleme (37 ° C).
Not: hücreler karanlıkta kalmak mümkün olduğu kadar aydınlatma kültür adım kadar buradan olun — kısa dönemlerde ortam aydınlatma (Örneğin, subdilution için) kabul edilebilir. - LB bir agar tabağına bakterilerden pDawn-Ag43 bir koloni aşılamak + suyu spec ve kültürü (içinde ~ 16 h için sallayarak kuluçka makinesi ~ 250 rpm, 37 ° C) durağan faz gecede büyümeye.
- Kültür 1:1,000 LB ile oranında, subdilute + spec suyu (Örneğin, taze LB + spec için 1 mL 1 μL gecede kültür ekleyin).
- Subdiluted kültür geç üstel/erken durağan faz (OD ~ 1.0, titreyen bir kuluçka ~ 6 h ~ 250 rpm, 37 ° C) kadar büyümeye izin.
- Büyümeye kültür için beklerken, M63 medya 1 x M63 tuzları, 1 mM MgSO4, % 0,2 glikoz, % 0,1 casamino asitler ve 50 μg/mL spektinomisin su hazırlamak (kurucu parçaları steril emin olun).
- 1: 100 oranında geç üstel-fazlı kültür 50 μg/mL spektinomisin ile desteklenmiş M63 medya ile subdilute. Sonra bir biyofilm kültür çanak içine seyreltme tanıtmak (Örneğin, seyreltilmiş örnek iyi bir tabak pipette).
Not: Bu 1: 100 subdilution için gerekli birimler kullanılan kültür çanak üzerinde bağlıdır (Eğer 6-şey polistren iyi tabak [Sigara-doku-tedavi kültürü], tek bir örnek kullanarakÖrneğin, kültür 20 μL M63 + spec, 2 mL olarak ekleyerek gerektirecektir Standart iyi 6-şey plaka ~ 2 mL birimdir).
- PDawn-Ag43 zorlanma LB + spec agar levha üzerine gliserol stoktan çizgi. Koloniler büyümeye izin geceleme (37 ° C).
- Örnekleri şimdi aydınlatma için hazır olduğu gibi kültür tabak çanak alt yüzey aşağıdan tarafından projektör aydınlatma için şeffaf olduğu inkübatör, tavana teyp.
Not: Kuluçka makinesi tavan sokak aydınlatma en aza indirmek için yansıtıcı değil emin olmak önemlidir. Sokak aydınlatma de azaltılmış kültür yemekleri olarak siyah duvarlı plakaları kullanarak ancak bu kesinlikle gerekli değildir — böyle plakaları kullanıyorsanız, alt yüzeyinin şeffaf sağlayın. - Kültürüne biyofilmler kuluçka gecede (16 h sallama yok, 37 ° C'de ile) izin verir. Not Bazı projektörler daha yüksek sıcaklıklarda daha az güvenilir olacaktır. Bu durumda, kuluçka süresi, e.coli suşu bağlı olarak arttırılması gerekebilir unutmayın Kültür (Örneğin, 30 ° C), daha düşük sıcaklıklarda tutmak.
4. görüntüleme biyofilmler desenli
- Biyofilm örnekleri gecede büyüme sonra kültür bulaşık kuluçka makinesi kaldırın. Çanak alt yüzeyi bağlı biyofilm bakteri nerede o ışıklı, hem de yukarıdaki sıvı medyada dağınık planktonik bakteri var.
- Planktonik hücreler kültür çanak (bir pipet ile hafifçe alıyorum tarafındanÖrneğin,) sıvı medya kaldırarak atmak.
- Örnek 2 durulama x yavaşça PBS, pipetting tarafından kalan planktonik hücreleri (Şekil 3B) kaldırmak için bir fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) çözüm ile aspirasyon tarafından takip.
- Hücreleri fluorescently etiketlediyseniz, floresans mikroskobu13 (Örneğin, geniş alanlı13, 3-b confocal14, vb) kullanarak örnekleri doğrudan görüntü.
Not: Floresan biyofilmler bir kendi kendine sağlamlaştırma montaj orta kullanarak da korunabilir. Bir biyofilm örnek medyaya montaj bir damla uygulamak, herhangi bir kabarcıklar altında yakalamak için değil dikkat çekici bir cam coverslip ile kapak ve gecede görüntüleme önce sertleşmesine izin. - Kullanılan bakteri hücreleri fluorescently etiketlenir değil, kristal Mor leke tekniği15 (biyofilm kontrastı artırmak için,Şekil 3B) görüntüleme önce uygulanır.
5. iletişim kuralı değişiklikler/alternatifleri
- PDawn-Ag43 bakteri farklı yüzeylerde büyümek.
- Cam ya da koymak poli-dimetil-siloxane (PDMS) kupon (Örneğin, coverslips veya ince şeritler PDMS) bakteriyel bir örnek/aydınlatma eklenmesi önce iyi tabak içine ve aynı iletişim kuralını daha önce olduğu gibi desen pDawn-ag43 biyofilmler için camın üzerine izleyin. ve PDMS.
- Şeffaf ve kapalı kültür odası içindeki pDawn-Ag43 bakterileri büyümek.
- Bir kültür odası kalıp için PDMS oluşturmak.
- Temel kültür odası için kalıp sert, dikdörtgen prizma (prizma kalıp döküm bir kez kültür odası hizmet veren PDMS bir boşluk olacak) düz bir yüzey ekleyerek oluşturun. Daha karmaşık kültür odası kalıpları kullanarak yumuşak litografi16fabrikasyon unutmayın.
- PDMS kalıp içine dökme ve tedavi izin PDMS kavite döküm (detaylı yumuşak litografi iletişim kuralı için Jüpiter'ın bilim eğitim veritabanı16) bakın.
- Kür sonra herhangi bir aşırı PDMS trim, kavite/kültür odasına giriş/çıkış kanalları yumruk ve düz bir yüzey (Örneğin, cam/Polistiren) için boşluğu sıkıca yüzeyi arasında kalan boşluk bırakarak PDMS düz yüzey üzerine basarak bağ ve biyofilm kültür odası olarak PDMS tavan.
Not: daha kalıcı bağ plazma tedavi16 tarihinde göre de kullanılabilir, ancak fişleri sonra yeniden kullanılabilir olmayacaktır. - Bir şırınga künt ipucu iğneler (yerine bir pipet) ile kültür odası/durulama PBS arabelleği (Şekil 3 c) ile içine bakteriyel örnek tanıtmak için kullanmadan önce kültür protokolü olarak izleyin.
- Geçici olarak bağlanmış bir boşluğu kullanıyorsanız, yalnızca negatif basınç sıvı içine/out kavite temel cam/polistiren yüzeyden gümrüksüz haline gelmediğinden emin olmak için odasının, çekmek için kullanın.
- Bir kültür odası kalıp için PDMS oluşturmak.
- PDawn-Ag43 bakteri bir film photomask için yapılandırılmış aydınlatma kullanarak büyümek.
- Bir film photomask yazıcı/yazıcı hizmeti ile uyumlu yazılım kullanarak bir biyofilm desen tasarım. Photomask film tasarımı başka bir yerde nerede biyofilm yazdırılması gereken bölgelerde açık ve siyah/opak olmalıdır. Tamamlandığında, photomask dosya yazıcı/yazdırma servisine gönderebilir ve fiziksel photomask dönüşü bekliyor.
- Tam bir görüş alanı en fazla mavi aydınlatmalı aydınlatmak için projektör talimat (Örneğin, RGB = [0, 0, 255]) dizüstü bilgisayar yazılımı kullanma.
- Bir bölge daha büyük film photomask ve bu doğrudan biyofilm kültür dibine çanağı gece aydınlatma (şekil 3D) için bakteriyel örnek tanıtan önce teyp dan ilgi kesip. Daha önce olduğu gibi biyofilmler kültür ve photomask kültür sonra görüntüleme önce kaldırın.
Representative Results
Şekil 4Agörüldüğü gibi pDawn-Ag43 bakterileri projektör aydınlatma (projektör benekli desen aydınlatmak için kuruldu), polistiren iyi tabak içinde desenli biyofilmler oluşturmak için kullanılan kristal ile aydınlık alan mikroskobu aracılığıyla yansıma menekşe leke bir kontrast Ajan ve bakteri kırmızı-floresan-protein-ifade kullanarak floresans mikroskobu. Floresan biyofilm örnekleri de 3-b (Şekil 4B) biyofilm görüntüleri elde etmek için confocal mikroskobu14 kullanarak yansıma. Şekil 4 ciçinde biz biyofilm örnek için desenli aydınlatma sağlamak üzere bir film photomask kullanarak mümkün yüksek çözünürlüklü desenlendirme göstermektedir. Son olarak, Şekil 4 d ve 4E, biz desenlendirme cam ve PDMS yüzeylerin yanı sıra kapalı PDMS kültür chambers örnekleri göstermek — bunlar nerede pDawn-Ag43 desenlendirme uygulanabilir ortamlar farklı türleri gösterilmektedir.
Şekil 1: pDawn-Ag43 bakterileri (iletişim kuralı Bölüm 1) hazırlanması. PDawn-Ag43 bakterileri ışık düzenlenir biyofilm oluşumu yetenekli hazırlanıyor içerir pDawn-Ag43 plazmid zorlanma klonlama faiz bir e.coli suşu dönüştürme ve oluşturma için bakteriyel dondurucu stok bir ana bilgisayardan arındırıcı uzun vadeli depolama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: optik bir set-up hazırlanması biyofilm örnek aydınlatma (iletişim kuralı Bölüm 2). Optik Kurulum bakteriyel inkübatör içinde yer alır ve bir biyofilm örnek aydınlatıcı bilgisayar bağlı bir projektör ile oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: kültür biyofilmler (iletişim kuralı Bölüm 3) desenlendirme için protokol. (A)önceki aydınlatma için pDawn-Ag43 bakterileri hazırlanmış güvenilir bir şekilde uygun büyüme aşamasında indüklenen vardır öyle ki biçimlenme önce. (Sonra bir gecede büyüme ışıklıB), desenli bir biyofilm sıvı ortamda planktonik hücreleri ile birlikte kültür yemeğin altındaki mevcut olacak ve biraz daha fazla işledikten sonra biyofilm görüntüleme için hazır. (C) plakalar iyi alternatif olarak biyofilmler kapalı kültür odalarında bir kalıp PDMS boşluğu gibi kültürlü. Bu durumda, künt ipucu iğneler bağlı şırınga örnek tanıtmak ve sıvılar odası dışarı floş için kullanılabilir. (D) alternatif projektör tabanlı aydınlatma desen, desen da film photomasks biyofilm kültür odaları alt için doğrudan kayıt tarafından oluşturulabilir. Bu durumda, projektör mavi ışık tam tarlada aydınlatmak için ayarlanmalıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: pDawn-Ag43 kullanarak desenli biyofilmler temsilcisi sonuçlarını. Tüm sonuçları bir MG1655 E. coli ana bilgisayar zorlanma kullanarak elde edilmiştir. (A)pDawn-Ag43 bakterileri projektör aydınlatma (projektör benekli desen aydınlatmak için kuruldu), polistiren iyi tabak içinde desenli biyofilmler oluşturmak için kullanılan aydınlık alan mikroskobu ile kristal Mor leke aracılığıyla görüntüsü bir kontrast Aracısı ve bakteri kırmızı-floresan-protein-ifade kullanarak floresans mikroskobu. (B) Floresan biyofilm örnekleri confocal mikroskobu ile biyofilm 3 boyutlu görüntü elde görüntüsü. (C) yüksek çözünürlüklü biyofilmler biyofilm örnek için desenli aydınlatma sağlamak için bir film photomask ile desenli. (D) biyofilmler cam ve PDMS yüzeyler üzerinde desenli. (E) biyofilmler kapalı kültür odasında desenli. Bu rakam dan önceki çalışma3adapte edilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Sorun | Olası nedenler/çözümleri |
| Dönüştürme pDawn-Ag43 ev sahibi soy - hiçbir koloniler halinde | Plazmid konsantrasyonu düşük - Spektrometre plazmid konsantrasyonu kontrol edin. PDawn-Ag43 tipik bir miniprep en az 100 ng/μL verim; 10-100 ng için dönüştürme için kullanın |
| Onay/yetkili hücreleri remake: yetkili hücreleri-meli-si olmak dönüşüm verimliliği en az 10 ^ 6 cfu/µg pUC19 - Aksi takdirde, yeniden yetkili hücreleri gibi standart bir plazmid kullanarak doğrulanmadı | |
| Yanlış (seviyesi) antibiyotik LB agar plaka üzerinde - 50 μg/mL spektinomisin seçimi için kullandığınızdan emin olun | |
| Projektör aydınlatma gecede kapalı / tutarsız döner | Gibi sorunlu yazılımı devre dışı bırakın: otomatik gece yazılım/OS güncelleştirme, gece-zaman mavi ışık filtresi |
| Projektör aşırı ısınma - ısı kaynağı kuluçka ayar noktası ötesinde aşırı ısınma gibi projektör ise daha düşük sıcaklık set kuluçka makinesi Not projektör (örneğin 30 ° C üzerinde yerine 37 ° C) - açık | |
| Bunlar tasarı elektronik etkileyebilir gibi nem gereksiz kaynakları kuluçka kaldırmak | |
| Biyofilm No/düşük düzeyde kurulan gece aydınlatma sonra hiçbir planktonik hücreler büyüme de (yani sıvı açıktır) | Yanlış (seviyesi) antibiyotik - 50 μg/mL spektinomisin kullandığınızdan emin olun |
| Her şey düzgün M63 tarifi eklenir kontrol | |
| Biyofilm No/düşük düzeyde kurulan gece aydınlatma sonra yalnızca planktonik hücreleri (yani sıvı hava bulutlu) | Kontrol ışık seviyesi, projektör mavi ışık 50 μW/cm aydınlatıcı ^ 2 adlı 460 nm dalga boyu |
| Bakteri M63 için eklemeden önce LB subdilution adım 1: 1000 sonra daha kısa/uzun süre büyümeye izin deneyin | |
| Bakteri LB plaka üzerinde restreak, gecede durağan faz kültür oluşturmak için taze koloni başlatmak | |
| Projektör sürekli gecede çalışma - bakın emin olun noktası yukarıda | |
| Bulanık biyofilm desenleri, arka plan gürültü düzeyi yüksek | Kaçak ışık optik aydınlatma sistemi azaltmak, yansıtıcı yüzeyler kuluçka makinesi iç kapağı |
| Yapılandırılmış aydınlatma photomask tabanlı (aksine projektör tabanlı) kullanmayı göz önünde bulundurun | |
| Onay projektör düzgün biyofilm kültür odası alt yüzeyde odaklanmıştır |
Tablo 1: ortak sorunlarını giderme.
Discussion
Biyofilm Yapı denetimi için izin araştırma araçlarına gerek ışığında, biz pDawn Ag43 optogenetic yapısı kullanarak bakteriyel biyofilmler desenlendirme için bir kullanımı kolay protokol sundu. Bu teknik ile E. coli biyofilmler optik 25 mikron altındaki bir uzaysal çözünürlük ile kapalı odaları da dahil olmak üzere çeşitli yüzey ortamlarında desenli.
Genel olarak, bu iletişim kuralını dört ana bölümlere ayrılabilir: (1) pDawn-Ag43 bakterileri hazırlanması, optik (2 hazırlanması ve kültür set-up donanım, (3) ön aydınlatma bakteriyel büyüme adımları ve sonrası (4) aydınlatma durular ve görüntüleme.
Kritik bölüm 1 faiz e.coli suşu içine pDawn-Ag43 plazmid başarılı dönüşüm parçasıdır. Bu yüksek kaliteli saf plazmid yalıtma ve dönüştürme için yüksek kaliteli yetkili hücreleri üreten tarafından yönetilir (Tablo 1, sorun giderme).
Kritik bölüm 2 projektör kurulum optimizasyonu böylece Aydınlatma şiddeti 460-nm dalga boyunda, 50 μW/cm2 için ayarlanır ve projektör düzgün biyofilm örnek yükseklikte odaklanmıştır parçasıdır. Bu protokol için biz nerede projektör ışığı aşağıdan, yukarı doğru biyofilm örnek parlar bir ters aydınlatma set-up tanımlamak unutmayın. Bu kurulum avantajı ışık sadece kültür çanak alttan biyofilm oluşumu yüzeye ulaşmadan önce seyahat ihtiyaçları olduğunu. Aydınlatma yukarıda ışık büyüme seyri sırasında planktonik hücrelerle bulutlu alır biyofilm yüzey yukarıda sıvı medya yoluyla seyahat etmek zorunda kalacak anlamına gelir. Bu endişeleri ek olarak, ayrıca kaçak ışık optik kurulum mümkün olduğu kadar örneğin, kuluçka makinesi iç yansıtıcı yüzeyler örtbas en aza indirmek önemlidir-bu keskin desenli biyofilmler elde etmek için yardımcı olur. İlgili bir kayda göre daha keskin biyofilm desenleri de aydınlatma desenlendirme (şekil 3D, Şekil 4 c) kontrol etmek için bir photomask kullanarak elde edilebilir. Yaygın sorunları giderme gerektiren dahil projektör güvenilirlik sorunlarını daha yüksek sıcaklıklarda (Örneğin, 37 ° C), (Örneğin, 30 ° C) daha düşük sıcaklıklarda biyofilm büyüme kuluçka tarafından en aza indirilebilir, bilgisayar yazılımı yanı sıra bu işletim sistemi güncelleştirmeleri veya mavi ışık filtreleme gecede büyüme sırasında (Tablo 1) neden olur. Kullanılan projektör ve kuluçka modeline bağlı olarak, bu da projektörden üretilen ısı kuluçka makinesi düzeltilmesi gerekebilir sıcaklığı ayarlamak daha yüksek bir iç sıcaklığı içinde sonuçlanır mümkün olduğunu, unutmamak önemlidir.
Aydınlatma tarafından indüklenir önce bölüm 3 kritik parçası güvenilir ve tekrarlanabilir bakteriyel örnekleri almaktır. Bu nedenle, bu pDawn-Ag43 bakteri klonal kolonileri onları bir agar plaka üzerinde çizgiler ve sonra bakteri geç üstel büyüme aşamasında bir tekrarlanabilir, ışıklı/bağlı olmasını sağlamak için sıvı kültür adımları kullanarak elde etmek için tavsiye edilir bir şekilde.
Son olarak, Bölüm 4 kritik parçası iyice, ama aynı zamanda yavaşça Protokolü biçimlenme biyofilm sonra kalan planktonik hücreleri silsin etmektir; Böylece, birden çok yumuşak durulama adımları izleyerek PBS ile tavsiye edilir.
O does değil istemek microfabrication, temiz oda imkanları, kompleks hücre desenlendirme5,için varolan teknikleri göre6, optik biyofilm bağlı olarak pDawn-Ag43 biçimlenme giriş kullanmak için oldukça düşük bir engel sahiptir Kimya veya yüzey Önarıtma, henüz genellikle microfabrication teknikleri ile ilgili yüksek çözünürlüklü (25 mikron) desen hala yapabiliyor. Yöntemi önceki çalışmalarına gen ifade17kontrol etmek için bakteriyel fotolitografi uzanır. Şu anda, pDawn-Ag43 plazmid pUC tabanlı çoğaltma kökeni kullanır, ancak pDawn Ag43 hem de diğer (gram-negatif) bakteri türlerinin uyumlu olması için E. coli, sınırlıdır. Genetik teknikleri potansiyel olarak farklı bakteri türleri için ışık düzenlenir biyofilm oluşumu tanıtmak için mevcut ve gelecekteki araştırmalar için olası bir yönünü temsil eder. Başka bir potansiyel tekniği o zayıf yerel biyofilm oluşumu (Örneğin, MG1655 E. coli) ile suşları biyofilm oluşumu artırarak inşaat kısıtlamasıdır. Ancak, güçlü yerel biyofilm oluşumu ile suşları biyofilmler formu kullanarak pDawn-Ag43 açıklandığı gibi burada desenli biyofilm oluşumu iyileştirmelerden aydınlatma koşullarından bağımsız olarak var; henüz optogenetic teknikleri hala biyofilm oluşumu düzenlenmesinde ilgili ispat edebilir. Biz diğer bağlamlarda biyofilm desenlendirme alternatif yöntemler ile optik c-di-GMP modülasyon18gibi mevcut olabilir unutmayın.
Genel olarak, pDawn-Ag43 dayalı desenlendirme biyofilm yapısının etkisi işlevi1 araştırmak ve bu nedenle, biyofilm desenlendirme üzerinde ayarlanabilir kontrol yarar uygulamalarda kullanım için uygun olacaktır — özellikle ilgili vurgulamak için örnek biyofilmler2mikrobiyal ekoloji çalışmadır. Gelecekteki yön desenli Biyomalzeme8,9 ve/veya yapılandırılmış bakteriyel topluluklar yapım içerir. Bu erişilebilir protokol alternatif uygulama da bio-sanat19resmi ve resmi olmayan yaşam bilimleri eğitim20,21,22yanı sıra açık estetik potansiyeli göz önüne alındığında, içerir. Eğitim bir açıdan bakıldığında, burada açıklanan protokol birçok ilgili teknikleri (bakteri kültürü, dönüşüm, optik/optogenetics) birleştiren ve modüler uzatılabilir de (Örneğin, havacilik dahil).
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar ö. cam, H. Kim, N. Cira, A. Choksi, S. Rajan ve d. tuşları onların önerileri ve erişim için confocal onların mikroskop Spormann lab için teşekkür ederiz. Ayrıca, yazarlar Stanford biyo-X Bowes ve NSERC PGS Destek Bursu, Ulusal Sağlık Enstitüsü (R21-AI-139941) ve Amerikan Kanser Derneği (RSG-14-177-01) kabul edersiniz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
| MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center - Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
| RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
| LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
| Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
| Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
| M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
| Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
| Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
| Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
| 6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
| PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
| 1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
| Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
| Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
| Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
| Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
| Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
| Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
| Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
| Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
| 1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
| 1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
| Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
| Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
| Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture |
| Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
| Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Christensen, B. B., Haagensen, J. A. J., Heydorn, A., Molin, S. Metabolic commensalism and competition in a two-species microbial consortium. Applied and environmental microbiology. 68 (5), 2495-2502 (2002).
- Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Ohlendorf, R., Vidavski, R. R., Eldar, A., Moffat, K., Möglich, A. From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression. Journal of Molecular Biology. 416 (4), 534-542 (2012).
- Xu, T., et al. Construction of high-density bacterial colony arrays and patterns by the ink-jet method. Biotechnology and Bioengineering. 85 (1), 29-33 (2004).
- Gu, H., Hou, S., Yongyat, C., Detore, S., Ren, D. Patterned Biofilm Formation Reveals A Mechanism for Structural Heterogeneity in Bacterial Biofilms. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 29 (35), 11145-11153 (2013).
- Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 64 (4), 847-867 (2000).
- Nguyen, P. Q., Botyanszki, Z., Tay, P. K. R., Joshi, N. S. Programmable biofilm-based materials from engineered curli nanofibres. Nature Communications. 5, 4945 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13, 515-523 (2014).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. New York, NY. (2010).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experiments. 47, e2437 (2011).
- JoVE Science Education Database. Bioengineering. Soft Lithography. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Huang, Y., Xia, A., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Kac, E. Signs of Life: Bio Art and Beyond. , MIT Press. Cambridge, MA. (2007).
- Lee, S. A., et al. Trap it!: A Playful Human-Biology Interaction for a Museum Installation. Proceedings of the 33rd Annual ACM Conference on Human Factors in Computing Systems. , 2593-2602 (2015).
- Cira, N. J., et al. A Biotic Game Design Project for Integrated Life Science and Engineering Education. PLOS Biology. 13 (3), e1002110 (2015).
- Bybee, R. W. The next generation science standards and the life sciences. Science and Children. 50 (6), 7 (2013).
