Summary
유전자 인코딩된 표면 접착 구조물의 광 자극을 사용 하 여 높은 해상도와 대장균 박테리아 biofilms 임의의 공간 패턴에 입금 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
공간 구조와 패턴 박테리아 biofilms에서 중요 한 역할을 재생합니다. 여기 높은 공간 해상도에서 임의의 공간 패턴으로 대장균 biofilms 경작에 대 한 접근 방법을 설명 합니다. 기술은 유전자 인코딩된 optogenetic 구문을 사용 하 여-pDawn-Ag43-그 푸른 빛에 의해 광 자극에 대장균 에서 biofilm 형성 커플. 우리는 pDawn Ag43 박테리아를 사용 하 여 패턴된 biofilms 경작 필요한 광학 설정 및 프로토콜 준비 pDawn Ag43와 대장균 을 변형 하는 과정 선발. 이 프로토콜을 사용 하 여, 25 μ m 아래 공간 해상도 biofilms 다양 한 표면에 소, 깨끗 한 객실 시설, 또는 표면 전처리 필요 없이 동봉 된 챔버를 포함 하 여 환경 패턴 수 있습니다. 기술은 편리 하 고 가변 제어할 biofilm 패턴화 biofilm 구조의 효과 조사 하는 응용 프로그램에서 사용 하기 위해 적절 한입니다. 더 넓게, 그것은 또한 생체 재료, 교육, 및 바이오-예술에서 잠재적인 응용 프로그램 있다.
Introduction
Biofilms, 미생물의 표면에 부착 된 사회 이며 그들의 강한 구조-기능을 위해 유명 하다. 공간 형상과 biofilms의 패턴화 재생 중요 한 역할 전체 커뮤니티 기능 (와 반대로)1. 작은 길이 조정 biofilm 구조에 참여-수십 미크론2순서-어려운 문제를 패턴화 하는 biofilm의 가변 및 편리한 컨트롤. 여기 우리는 biofilms 광학 조명에 따라 정확 하 게 패턴된에서 임의의 형상 되도록 허용 하는 프로토콜을 보여 줍니다.
여기에 제시 된 프로토콜 사용 하 여 pDawn-Ag433, Ag43의 식 운전 하 여 대장균 박테리아에 biofilm 형성 광학 조명에 커플 optogenetic 구문 (는 adhesin 유전자 표면 접착 biofilm에 대 한 책임 대형) pDawn4 (광학 조명에 의해 제어 transcriptional 규칙)의 통제. 방법은 사용 하기 편리 하 고 다양 한에 패턴 biofilms 환경, 동봉된 (투명 한) 문화 챔버를 포함 하 여 표면 수 있습니다. 드롭릿 기반 증 착5 또는 표면 prepatterning/치료6, 등 기존 세포 증 착 방법에 비해 pDawn Ag43 뒤틀림 또는 클린 룸 시설을 필요 하지 않습니다. 그리고 그 이상의 재료를 필요로 하지 않습니다. 일반적인 미생물학 실험실을 사용할 수 있습니다. 그것은 자연스럽 게 기존에 microcolonies의 공간 크기를 접근 25 μ m 아래 공간 해상도 패턴 수 biofilms2. 전반적으로,이 기술은 biofilm 구조는 다음 세균성 지역 사회7microecology를 공부 하는 많은로 조작 하는 기능을 제공 합니다. 또한, 패턴된 biofilms 유용한 바이오8,9하는 편리한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 이 문서에서 우리 biofilms pDawn Ag43를 사용 하 여 패턴에 필요한 기본적인 프로토콜을 토론 하 고 잠재적인 수정 및 메서드에 관련 문제 해결.
Protocol
1. pDawn-Ag43 세균성 긴장의 준비
- PDawn-Ag43 (그림 1)의 E. 콜라이 긴장에 변환.
- LB 국물 문화 관 (~ 250 rpm, 37 ° C에서 떨고 인큐베이터)에서 1 박의 50 μ g/mL spectinomycin (파운드 + 사양)와 보완에 긴장을 접종 하 여 (플라스 미드 저장소에서 얻을 수) pDawn-Ag43 플라스 미드를 호스팅 복제 스트레인 성장. 그런 다음 miniprep 키트를 사용 하 여 순화 pDawn Ag43 플라스 미드10수확.
- 패턴화 될 관심의 E. 콜라이 긴장을 선택 합니다. 지금까지, pDawn-Ag43 MG16553 , BW25113에서 작동 하도록 검증 되었습니다.
- 만든된 프로토콜을 사용 하 여 유능한 생성 (예를 들어, 화학적으로 유능한11 또는 electrocompetent12) 선택의 E. 콜라이 긴장 (예, MG1655).
- PDawn-Ag43 플라스 미드는 유능한 박테리아11,12, 1 h 회복과 접시 파운드 + 사양 한 천 배지에서 다음 변환. 37 ° c.에 하룻밤 성장 식민지 허용
- 스토어 pDawn Ag43 변형 긴장.
- PDawn-Ag43는 파운드에서의 단일 식민지 예방 + 파운드에 한 천 배지를 사양 + 문화 관에서 국물을 사양 고 지 수 단계 (OD600 ~0.4-0.8) (~ 250 rpm, 37 ° C)에서 떨고 인큐베이터에서 성장.
- 곳을 알아내는-튜브 25% 글리세롤 냉장고 재고를 50% 살 균 글리세롤의 1 mL와 문화의 1 mL를 혼합 하 여 장기-80 ° C에서 pDawn Ag43 변형 긴장을 저장 하는 주식을 준비 합니다. -80 ° C 냉장고에 이것을 저장 합니다.
- 12 pDawn Ag43에서 변형 변형 및 변환 과정11 반복 추가 플라스 미드 (예를 들어, 형광 기자 플라스 미드) 변형 될, 유능한 세포11,를 만들 필요가 있는 경우 , 필요에 따라 추가 플라스 미드에 대 한 12 .
참고: electroporation8를 사용 하는 경우 수는 cotransform 여러 플라스 미드 (를 포함 하 여 pDawn-Ag43) 동시에; 그러나, 동시 변환을 권장 하지 않습니다 화학 변환 방법을 사용 하 여 대형 (> 10 kB) pDawn-Ag43의 변환 효율성은 감소 것을 의미.
2. 조명 박테리아에 대 한 프로젝터 광학 설치의 준비
- 케이블, 휴대용 프로젝터 피팅 하 고 세균 인큐베이터, 내부 작동을 전달 하기 위한 불투명 벽과 구멍 세균 인큐베이터를 가져오고 노트북 프레 젠 테이 션-투영 (참조 테이블의 소프트웨어를 갖춘 재료). 선택할 때 프로젝터 및 인큐베이터는 프로젝터의 최소 초점 거리 보다 작으면 인큐베이터의 내부 높이 확인 합니다.
- 상승, biofilm 문화 챔버가 천장에 연결 (그림 2) 직접 인큐베이터 안에 프로젝터 가리키는 조리개와 함께 아래에 놓습니다.
- 수직 포스트에 연결 된 광학 브레드보드 기본으로 설정을 구성 하 여 장소에 프로젝터 수정 차례로 가로 게시물에 어떤 나사에 연결 프로젝터 (그림 2). 참고가이 설정 프로젝터/사용 가능한 부품에 따라 수정할 수 있습니다. 궁극적으로, 주요 요구 사항이입니다 프로젝터 위쪽으로 가리키는 조리개와 인큐베이터, 아래쪽 단단하게 고정 됩니다.
- 인큐베이터 안에 프로젝터는 노트북을 통해 디스플레이 케이블 (예를들면, HDMI) 연결 합니다.
- 경우는 표면-특히 천장-반사 (예를 들면, 금속 광택된 표면), 인큐베이터의 내부는 어두운 매트 표면 반사를 최소화 하기 위해 함께 그들을 커버.
- 테이프를 사용 하 여 빈 '더미' 문화 접시 인큐베이터의 천장에 연결할. 프로젝터, 문화 접시; 연결할 여러 허용 방법 있다, note 문화 실, 조명 발생의 투명 한 바닥 표면 적용 되지 않습니다 확인 하십시오.
- 초점 비행기 아래쪽 표면에 biofilm 문화 요리 (예를 들어, 잘 플레이트)의 인큐베이터 (그림 2)의 천장에 연결 된 일치 되도록 초점 손잡이 선회 하 여 프로젝터의 초점을 조정 합니다. 프로젝터는 문화 접시의 바닥에 날카로운, 비-모호한 이미지를 밝게 한다. 투영은 최적화 되었습니다 일단 '더미' 문화 접시를 제거 합니다.
- 최대 블루 조명 전체 시야를 밝히는 프로젝터를 직접 노트북 소프트웨어를 사용 하 여 (예를 들어, RGB = [0, 0, 255]) 전체 블루 슬라이드를 제시 하 여.
- 매칭 머리 인큐베이터 천장에 배치 하 고 해당 전원 측정기 빛 파장 460 nm 보정에 강도 읽고 여 광 파워 미터를 사용 하 여 프로젝터 조명 강도 측정 합니다. 연결 하 고 사용 하는 특정 전원 측정기에 대 한 매칭 보정에 지시를 따릅니다.
- 주변광을 줄일 (예를 들어, 방 조명, 해제 하거나 인큐베이터 광원에서) 조명 강도 측정을 하기 전에 가능한 만큼 많이.
- 프로젝터 조리개에 조정 가능한 중립적인 밀도 필터를 사용 하 여 조명 강도 조정 합니다. 블루 빛 예상된 지역 중심의 조명 강도 50 μW/c m2를 읽습니다 때까지 파워 미터에 의해 측정 된 조명 강도 조절 하는 필터를 회전 합니다.
참고: 소프트웨어 끝에 파란색 RGB 값을 사용 하 여 조명 강도 조정할 수 있지만 사용 하 여 필터를 조명된 vs 사이 시스템의 광학 대조를 극대화의 장점이 파란색 RGB 가치를 극대화 하는 동안. 어두운 지역. - 노트북에 프레 젠 테이 션/프로젝터 소프트웨어를 사용 하 여 임의의 패턴을 그릴 하 고 프로젝터를 사용 하 여 보육의 천장에 이러한 패턴을 표시 합니다.
참고: 최대 블루 조명으로 그린 한다 Biofilm 형성 지역 (예를 들어, RGB = [0, 0, 255]), 아무 조명 biofilm 형성 비 지역 (예를 들어, RGB = [0, 0, 0]).
3. 꽃무늬 Biofilms 경작
- 조명, 이전 pDawn Ag43 박테리아, 그들은 안정적으로 조명 (그림 3A)에 대 한 후반 지 수 성장 단계에서 유도 된다 그래야 글리세롤 냉장고 재고에서 시작을 준비 합니다.
- 글리세롤 재고에 파운드 + 사양 한 천 배지에서 pDawn Ag43 긴장을 행진. 성장 하는 식민지를 허용 하룻밤 (37 ° C).
참고: 여기에서 조명 문화 단계까지, 셀에에서 머물 수 있도록 어둠 최대한-주변 조명 (예를 들어, subdilution에 대 한)에서 짧은 기간 동안 사용할 수 있습니다. - 파운드에서 한 천 배지에서 pDawn Ag43 박테리아의 식민지 예방 + 국물 사양 성장 하 고 문화 (~ 16 h ~ 250 rpm, 37 ° C에서 떨고 인큐베이터)에서 고정 단계로 하룻밤.
- Subdilute 파운드와 1:1,000의 비율로 문화 + 국물 사양 (예, 신선한 파운드 + 사양의 1 mL에 1 μ의 숙박 문화를 추가).
- Subdiluted 문화 후반 지 수/초기 고정 단계 (OD ~ 1.0, 떨고 인큐베이터에서 ~ 6 h ~ 250 rpm, 37 ° C)까지 성장 하는 것을 허용 한다.
- 성장 하는 문화를 기다리는 동안 준비와 1 x M63 소금, 1mm MgSO4, 포도 당 0.2%, 0.1 %casamino 산, 물에서 50 μ g/mL spectinomycin M63 미디어 (구성 부품은 멸 균 확인).
- M63 미디어 50 μ g/mL spectinomycin 보충 1: 100의 비율로 후반 지 수 상 문화를 subdilute. 그런 다음, biofilm 문화 접시에 희석 소개 (예를 들어, 잘 격판덮개로 희석된 샘플 플라스틱).
참고:이 1: 100 subdilution에 필요한 볼륨 사용 되 고 문화 요리에 따라 달라 집니다 (예를 들어, 6-잘 폴리스 티 렌 잘 접시 [비-조직-문화 치료], 한 샘플을 사용 하는 경우 필요로 문화의 20 μ M63 + 사양의 2 개 mL를 추가 합니다 6 잘 플레이트의 표준 잘 볼륨은 ~ 2 mL).
- 글리세롤 재고에 파운드 + 사양 한 천 배지에서 pDawn Ag43 긴장을 행진. 성장 하는 식민지를 허용 하룻밤 (37 ° C).
- 샘플은 지금 조명에 대 한 준비, 테이프 표면 접시의 바닥에는 조명을 위한 투명 아래에서 프로젝터에 의해 보장 인큐베이터의 천장에 문화 접시.
참고: 인큐베이터의 천장 반사, 길 잃은 조명을 최소화 하는 보장 하기 위해 중요 하다.입니다. 길 잃은 조명 또한 감소 될 수 있다 문화 찬으로 블랙 벽 격판덮개를 사용 하 여 비록이 엄격 하 게 필요 하지 않습니다-같은 접시를 사용 하는 경우 확인 하단 표면 투명. - 밤새 인큐베이터 (16 h 없이 떨고, 37 ° C에서)에 문화에 biofilms를 허용 합니다. 참고 일부 프로젝터 높은 온도에서 덜 안정 되. 경우, (예를 들어, 30 ° C), 낮은 온도에서 문화 염두에 두고 부 화 시간, E. 콜라이 긴장에 따라 증가 할 수 있습니다 유지.
4. 영상 Biofilms 꽃무늬
- 밤새 성장의 biofilm 샘플 후 인큐베이터에서 문화 접시를 제거 합니다. 접시 위의 액체 매체에서 분산 planktonic 박테리아로 서 어디 그것은 조명 되어, biofilm 박테리아의 하단 표면에 부착 된 있을 것 이다.
- Planktonic 셀 (예를 들어, 부드럽게 한 피 펫과 발음으로) 문화 접시에서 액체 미디어를 제거 하 여 삭제 합니다.
- 샘플 2 린스 부드럽게, PBS에 pipetting으로 나머지 planktonic 세포 (그림 3B)를 제거 하는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션 x 뒤 포부.
- 셀 태그 붙일 경우 직접 형광 현미경 검사 법13 (예, 넓은 필드13, 3 차원 confocal14, 등)를 사용 하 여 샘플 이미지.
참고: 형광 biofilms 수 또한 유지 자경 설치 매체를 사용 하 여. Biofilm 샘플 미디어를 장착 한 방울을 적용, 아래, 모든 거품을 잡으려고 하지 돌보는 유리 coverslip로 그것을 커버 하 고 하룻밤 이미징 하기 전에 강화 있습니다. - 사용 하는 세균성 세포 붙일 태그가 지정 되지 이미징 이전 크리스탈 바이올렛 얼룩 기법15 biofilm 대비 향상을 (그림 3B)를 적용 합니다.
5. 프로토콜 수정/대안
- 다른 표면에 pDawn Ag43 박테리아를 성장.
- 유리 또는 폴 리 디 메 틸 실록 산 (PDMS) 쿠폰 (예, coverslips 또는 PDMS의 얇은 스트립) 세균 샘플/조명의 추가 전에 잘 접시에 놓고 따라 동일한 프로토콜 이전과 패턴 pDawn ag43 biofilms에 유리 하 고 PDMS입니다.
- 투명 하 고, 동봉 된 문화 내부 pDawn Ag43 박테리아를 성장.
- PDMS 위한 문화 챔버 형을 생성 합니다.
- 기본적인 문화 챔버, 하드, 직사각형 프리즘 (프리즘 PDMS 몰드 캐스팅 되 면 문화 챔버 역할에 캐비티를 될 것입니다) 평평한 표면에 부착 하 여 금형을 생성 합니다. Note 더 복잡 한 문화 챔버 형 소프트 리소 그래피16를 사용 하 여 날조 될 수 있다.
- PDMS 몰드에 붓는 고 치료할 수 있도록 PDMS 캐비티 캐스팅 (자세한 소프트 리소 그래피 프로토콜 정돈의 과학 교육 데이터베이스16참조).
- 치료, 후 어떤 초과 PDMS 트림, 구멍/문화 챔버로 입구/출구 채널 펀치 하 고 평평한 표면 위에 PDMS 표면 사이 구멍을 떠나 단단히 눌러 평평한 표면 (예를 들어, 유리/폴리스 티 렌)에 캐비티를 채권 및 biofilm 문화 약 실로 PDMS 천장입니다.
참고: 더 영구적인 결합 플라즈마 치료16 에 따라 사용할 수 있습니다, 하지만 칩 다음 되지 않습니다 재사용. - PBS 버퍼 (그림 3C)와 문화 챔버/린스에 세균 샘플을 소개 (대신 피 펫) 무딘 팁 바늘 주사기를 사용 하 여 앞으로 문화 프로토콜을 따릅니다.
- 일시적으로 보 세 구멍을 사용 하는 경우를 액체 에/아웃 캐비티 내부 유리/폴리스 티 렌 표면에서 unbonded 되지 않습니다 수 있도록 챔버의 유일한 부정적인 압력을 사용 합니다.
- PDMS 위한 문화 챔버 형을 생성 합니다.
- 영화 포토 마스크를 사용 하 여 구조적된 조명에 대 한 pDawn Ag43 박테리아를 성장.
- 영화 포토 마스크 프린터/인쇄 서비스와 호환 CAD 소프트웨어를 사용 하는 biofilm 패턴 디자인. 다른 곳에서 포토 마스크 필름 디자인은 지역에 biofilm 인쇄할 수 의미는 명확 하 고 검정/불투명 이어야 한다입니다. 완료 되 면 프린터/인쇄 서비스에 포토 마스크 파일을 전송 하 고 실제 포토 마스크의 반환을 기다리고 있습니다.
- 최대 블루 조명 전체 시야를 밝히는 프로젝터 지시 (예를 들어, RGB = [0, 0, 255]) 노트북 소프트웨어를 사용 하 여.
- 더 큰 영화 포토 마스크, 테이프 biofilm 문화의 하단에 직접 그것은 야간 조명 (그림 3D)에 대 한 세균 샘플 소개 전에 접시에서 관심 영역을 잘라. 이전과 biofilms 문화 고 이미징 이전 경작 후에 포토 마스크를 제거 합니다.
Representative Results
PDawn Ag43 박테리아 biofilms 프로젝터 조명 (폴카 도트 패턴을 조명 하는 프로젝터 설정), 폴리스 티 렌 잘 판 패턴을 생성 하기 위해 사용 되었다 그림 4A에서 볼, 크리스탈 명시 야 현미경을 통해 몇 군데 대조 대리인, 및 빨간 형광 단백질 표현 박테리아를 사용 하 여 형광 현미경으로 보라색 얼룩. 형광 biofilm 샘플 수 또한 될 몇 군데 confocal 현미경 검사 법14 3 (그림 4B) 차원에서 biofilm의 이미지를 사용 하 여. 그림 4C,에서는 우리 꽃무늬 biofilm 샘플을 제공 하는 영화 포토 마스크를 사용 하 여 가능한 고해상도 패터 닝을 보여줍니다. 마지막으로, 그림 4D 4E에 동봉 된 PDMS 문화 실 뿐만 아니라 유리 및 PDMS 표면에 모방의 예 설명-이 보여주는 다양 한 유형의 환경 pDawn Ag43 패턴을 적용할 수 있습니다.
그림 1: pDawn Ag43 박테리아 (프로토콜 섹션 1)의 준비. 호스트 스트레인 복제, 관심, E. 콜라이 긴장에 변형 및 세균 냉장고 재고 만들기에서 pDawn Ag43 플라스 미드 정화 하는 포함 한다 pDawn Ag43 박테리아 빛 규제 biofilm 형성의 능력을 준비 장기 스토리지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: biofilm 샘플 조명 (프로토콜 섹션 2)에 대 한 광학 설치의 준비. 광학 설정 세균 인큐베이터 안에 지 내게 하며 컴퓨터 연결 프로젝터 조명 biofilm 샘플 구성 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 패턴화 biofilms (프로토콜 섹션 3)에 대 한 프로토콜 문화. (A) 이전 조명에, pDawn-Ag43 박테리아 그들은 안정적으로 적절 한 성장 단계에서 유도 된다 그런 패턴 사전 준비가. (B) 후 하룻밤 조명 성장, 꽃무늬 biofilm 액체 매체에 있는 planktonic 셀 함께 문화 접시의 바닥에 있을 것입니다 그리고 몇 가지 추가 처리 한 후는 biofilm 이미징에 대 한 준비. (C) 접시를 잘 하는 대신, biofilms 성형된 PDMS 구멍 같은 동봉된 문화 실에서 배양 수 있습니다. 이 경우에, 샘플을 소개 하 고 챔버의 액체를 플러시 무딘 팁 바늘에 연결 된 주사기를 사용할 수 있습니다. (D) 프로젝터 기반 조명 패턴을 대신, 패턴 또한 생성할 수 biofilm 문화 챔버의 바닥에 직접 영화 포토를 찍고. 이 경우에, 전체 분야에 걸쳐 파란 빛을 밝히는 프로젝터 설정 되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: pDawn Ag43를 사용 하 여 패턴 biofilms의 대표적인 결과. 모든 결과 MG1655 대장균 호스트 스트레인을 사용 하 여 얻은 했다. (A) pDawn Ag43 박테리아 biofilms 프로젝터 조명 (폴카 도트 패턴을 조명 하는 프로젝터 설정), 폴리스 티 렌 잘 판에 패턴을 생성 하는 데 사용 했다 명시 야 현미경으로 크리스탈 바이올렛 얼룩과 통해 몇 군데는 대비 에이전트, 그리고 레드 형광 단백질 표현 박테리아를 사용 하 여 형광 현미경 검사 법. (B) 형광 biofilm 샘플은 biofilm의 3 차원 이미지를 얻기 위해 confocal 현미경 검사 법으로 몇 군데 있습니다. (C) 고해상도 biofilms 꽃무늬 biofilm 샘플을 제공 하는 영화 포토 마스크와 패턴 수 있습니다. (D) Biofilms 유리 및 PDMS 표면에 모방 될 수 있다. (E) Biofilms 동봉된 문화 실에서 모방 될 수 있습니다. 이 그림은 이전 작업3에서 적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 문제 | 잠재적인 원인/솔루션 |
| 트래버스 호스트 스트레인-아니 식민지에 pDawn-Ag43 | 플라스 미드 농도 낮은-분석기에 플라스 미드 농도 선택 합니다. PDawn-Ag43의 전형적인 miniprep는 적어도 100 ng/μ; 양보 해야 사용 하 여 10-100 ng 변환에 대 한 |
| 체크/리 메이크 유능한 세포: 유능한 셀 변환 효율 10 이상 있어야 ^6 cfu / µ g pUC19-하지 않을 경우, 리 메이크 유능한 세포 같은 표준 플라스 미드를 사용 하 여 확인 | |
| 잘못 (수준) 항생제 파운드 천 배지-에 선택에 대 한 50 μ g/mL spectinomycin를 사용할 수 있는지 확인 | |
| 프로젝터 조명 끄기 / 일관성을 하룻밤 밝혀 졌 | 같은 문제가 있는 소프트웨어를 사용 하지 않도록 설정: 자동 하룻밤 소프트웨어/운영 체제 업데이트, 야간 블루 빛 필터 |
| 프로젝터는 과열 될 수 있습니다.-프로젝터 동안 낮은 온도 설정된 인큐베이터 설정 (예: 30 ° C에 37 ° C 대신)-참고 프로젝터로 열 세트 포인트 넘어 인큐베이터 과열 수 있습니다. | |
| 이러한 프로젝터 전자에 영향을 미칠 수 있습니다 인큐베이터에서 습도의 불필요 한 소스 제거 | |
| 없음/낮은 수준의 biofilm의 야간 조명, 아니 planktonic 세포 성장 후도 형성 (즉 액체 분명 하다) | 잘못 (수준) 항생제-50 μ g/mL spectinomycin를 사용할 수 있는지 확인 |
| 모든 것이 제대로 M63 제조 법에 추가 확인 | |
| 야간 조명, planktonic 셀만 후 형성 된 biofilm의 No/낮은 수준 (즉, 액체는 흐린) | 체크 빛 수준, 프로젝터 해야 될 조명 μW/50cm에 블루 빛 ^460 nm 파장에서 2 |
| 박테리아는 이전에 M63 추가 파운드 subdilution 단계 1:1000 후 짧은/긴 시간에 대 한 성장 시키는 시도 | |
| 파운드 격판덮개에 박테리아를 restreak, 야간 고정 단계 문화를 생성 하는 신선한 식민지에서 시작 | |
| 프로젝터는 하룻밤 지속적으로 노력 하 고 있다-참조 확인 포인트 위 | |
| 퍼지 biofilm 패턴, 배경 잡음의 높은 수준 | 광학 조명 시스템에서 길 잃은 빛을 감소, 인큐베이터의 내부에 반사 표면 커버 |
| (반대로 프로젝터 기반) 포토 마스크 기반 구조적된 조명 사용을 고려합니다 | |
| 프로젝터 제대로 biofilm 문화 챔버의 하단 표면에 초점을 맞춘 확인 |
표 1: 공통 문제 해결입니다.
Discussion
Biofilm 구조 제어를 허용 하는 연구 도구에 대 한 필요성에 비추어 우리는 pDawn-Ag43 optogenetic 구문을 사용 하 여 박테리아 biofilms 패턴화를 위한 사용 하기 쉬운 프로토콜을 제시 했습니다. 이 기술로 대장균 biofilms 광학 25 μ m 아래 공간 해상도 함께 동봉 된 챔버를 포함 하 여 다양 한 표면 환경에 꽃무늬 될 수 있습니다.
전반적으로,이 프로토콜 세분화 될 수 있습니다 4 개의 주요 섹션으로: pDawn Ag43 박테리아의 준비 (1), (2) 광학의 준비 및 문화 설정 하드웨어, (3) 사전 조명 세균성 성장 단계, 및 (4) 후 조명 린스와 영상입니다.
섹션 1의 중요 한 부분은 관심의 E. 콜라이 긴장으로 pDawn Ag43 플라스 미드의 성공적인 변환. 이 높은-품질 순화 된 플라스 미드를 분리 하 고 생성 하는 변환에 대 한 높은-품질 유능한 세포에 의해 촉진 된다 (표 1, 문제 해결).
섹션 2의 중요 한 부분을 조명 강도 50 μW/cm2 460 nm 파장에 조정 되 고 프로젝터 제대로 biofilm 샘플 높이에 초점을 맞춘 프로젝터 설정의 최적화입니다. Note이 프로토콜에서 우리는 거꾸로 조명 설정 어디 프로젝터 빛나는 빛 아래에서, 위쪽으로 향해 biofilm 샘플 설명. 이 설정의 장점은 빛만 해야 한다는 biofilm 형성 표면에 도달 하기 전에 문화 접시의 바닥을 통해 여행. 조명 빛은 성장 과정 중 흐리고 planktonic 셀으로 가져옵니다 biofilm 표면 위에 액체 매체를 통해 여행 하는 의미에서. 이러한 우려 뿐만 아니라 그것은 또한 예를 들어 인큐베이터의 내부에 반사 표면을 취재 하 여 광학 설정 가능한 만큼, 길 잃은 빛을 최소화 하는 것이 중요-이 선명한 꽃무늬 biofilms를 얻을 하는 데 도움이. 관련된 메모에서 선명 biofilm 패턴 또한 조명 패턴 (그림 3D, 그림 4C)를 제어 하는 포토 마스크를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 문제 해결을 요구 하는 일반적인 문제는 컴퓨터 소프트웨어 뿐만 아니라 프로젝터 신뢰성 문제는 biofilm 성장 (예, 30 ° C) 낮은 온도에서 배양 하 여 최소화 될 수 있다, 더 높은 온도 (예, 37 ° C)에서 포함 하는 운영 체제 업데이트 또는 하룻밤 성장 (표 1) 중에 필터링 하는 푸른 빛을 발생 합니다. 그것은 또한 중요 하, 프로젝터 및 인큐베이터 모델 사용, 따라는 것도 가능한 프로젝터에서 생성 된 열 인큐베이터 설정 수정 해야 할 수 있는 온도 보다 높은 실내 온도에서 발생 합니다.
전에 그들은 조명에 의해 유도 된다 제 3의 중요 한 부분 안정적이 고 반복 가능한 세균 샘플을 얻는 이다. 이러한 이유로 것이 좋습니다 한 천 배지에서 그들을 밖으로 줄이 다음 되도록 박테리아 조명/유도 반복에 후반 지 수 성장 단계에서 액체 문화 단계를 사용 하 여 pDawn Ag43 박테리아의 클론 식민지를 방식 으로입니다.
마지막으로, 제 4의 중요 한 부분을 철저 하 게, 하지만 또한 부드럽게 씻어 프로토콜; 패턴화 biofilm 후 남은 planktonic 셀은 따라서, PBS와 여러 부드러운 린스 단계를 수행 하는 것이 좋습니다.
셀 패턴5,에 대 한 기존 기술에 비해6, 패턴에 따라 pDawn Ag43 광학 biofilm를 사용 하려면 항목의 합리적으로 낮은 장벽에가지고 소, 깨끗 한 객실 시설, 복잡 한 필요 하지 않습니다. 화학, 또는 표면 전처리, 패턴 제작 기술로 일반적으로 관련 된 높은 해상도 (25 μ m)와 수은 아직. 메서드를 사용 하면 진 식17을 제어 하기 위한 세균성 사진 평판에 대 한 이전 작업을 확장 합니다. 현재, pDawn-Ag43 플라스 미드 복제, pUC 기반 근원 사용 하지만 pDawn와 Ag43는 둘 다 다른 (그람 음성) 세균성 종에 호환 대장균, 제한 됩니다. 유전자 기술 잠재적으로 소개 하는 다른 세균 종 빛 규제 biofilm 형성에 대 한 사용할 수 있으며, 미래 연구에 대 한 가능한 방향을 나타냅니다. 기술은의 또 다른 잠재적인 한계 그것 약한 네이티브 biofilm 형성 (예, MG1655 대장균) 긴장에 biofilm 형성을 증가 시켜 작품 이다. 그러나, 강력한 네이티브 biofilm 형성 된 종자는 제외 패턴된 biofilm 형성 여기; pDawn-Ag43 설명 된 대로 사용 하 여 조명 조건에 biofilms 양식 아직 optogenetic 기술을 여전히 biofilm 형성 조절에 적용 가능한 증명할 수 있습니다. 우리는 다른 문맥에서 biofilm 패터 닝의 대체 방법을 통해 광 c-디-GMP 변조18등, 사용할 수 있습니다는 주의.
전반적으로, pDawn-Ag43 기반 패터 닝 하는 기능1 에 biofilm 구조의 영향을 조사 하 고, 따라서, biofilm 패턴화 가변 제어에서 혜택을 수 있는 응용 프로그램에서 사용 하기 위해 적절 한 될 것입니다-특히 관련 강조 하기 위해 예 biofilms2미생물 생태학의 연구 이다. 미래 방향 패턴된 바이오8,9 또는 구조적된 세균성 지역 사회를 만드는 포함 됩니다. 대체이 액세스할 수 있는 프로토콜의 또한 애플리케이션으로 바이오 아트19, 공식 및 비공식 생명 과학 교육20,,2122뿐만 아니라 분명히 미적 가능성, 주어진 있다. 교육의 관점에서 여기에 설명 된 프로토콜 많은 관련 기술 (세균성 문화, 변환, 광학/optogenetics)를 결합 한 제품 이며 또한 하였으므로 연장 (예를 들어, 마이크로 포함).
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 그들의 도움이 제안 및 그들의 confocal 현미경에 접근을 위한 Spormann 연구소에 대 한 디, H. 김, N. Cira, A. Choksi, S. 라 잔, 유리와 B. 키를 감사합니다. 또한, 저자는 장학, 건강의 국립 연구소 (R21-인공 지능-139941), 그리고 미국 암 협회 (RSG-14-177-01) 스탠포드 바이오 X Bowes NSERC PGS에서 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
| MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center - Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
| RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
| LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
| Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
| Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
| M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
| Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
| Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
| Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
| 6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
| PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
| 1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
| Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
| Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
| Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
| Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
| Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
| Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
| Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
| Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
| 1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
| 1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
| Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
| Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
| Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture |
| Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
| Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |
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