Summary
Nous démontrons un procédé de déposition biofilms bactériens d’Escherichia coli dans les patrons spatiaux arbitraires avec une haute résolution utilisant la stimulation optique d’une structure de surface-adhérence codée génétiquement.
Abstract
Structuration et structure spatiale jouent un rôle important dans les biofilms bactériens. Nous démontrons une méthode accessible pour la culture des biofilms d’e. coli dans des configurations spatiales arbitraires à haute résolution spatiale. La technique utilise une construction codé génétiquement optogenetic — pDawn-Ag43 — que les couples la formation de biofilm chez e. coli à la stimulation optique en lumière bleue. Nous détaillons le processus de transformation d’e. coli avec pDawn-Ag43, préparer le montage optique requis et le protocole pour la culture des biofilms à motifs à l’aide de bactéries pDawn-Ag43. Utilisant ce protocole, biofilms avec une résolution spatiale inférieure à 25 μm peut être modelés sur différentes surfaces et environnements, y compris les chambres fermées, sans nécessiter de microfabrication, installations de salle blanche ou traitement de surface préalable. La technique est commode et plus approprié pour une utilisation dans les applications qui étudier l’effet de la structure des biofilms, offrant un contrôle ajustable de structuration du biofilm. Plus largement, il a également des applications potentielles dans les biomatériaux et de l’éducation, bio-art.
Introduction
Les biofilms sont attachés à la surface des communautés de microbes et sont connus pour leur accouplement solide structure-fonction. Géométrie spatiale et structuration des biofilms jouent un rôle important dans la fonction communautaire globale (et vice versa)1. La longueur de petite échelles impliquée dans la structure des biofilms — l’ordre de dizaines de microns2— faire un contrôle accordable et pratique du biofilm, répétition d’un problème difficile. Nous démontrons un protocole qui permet d’être précisément à motifs en géométries arbitraires, fondées sur l’illumination optique des biofilms.
Le protocole présenté ici utilise pDawn-Ag433, une construction d’optogenetic qui allie la formation de biofilm dans la bactérie e. coli à l’illumination optique par la conduite de l’expression de Ag43 (un adhésine gène responsable de l’adhérence de surface et de biofilm formation) sous le contrôle de pDawn4 (un régulateur transcriptionnel contrôlé par illumination optique). La méthode est facile à utiliser et modèle biofilms sur différents environnements, y compris les chambres du Clos de la culture (transparent) de surface. Par rapport à des méthodes de dépôts cellule existantes, par exemple, axée sur les gouttelettes de dépôts5 ou surface prepatterning/traitement6, pDawn-Ag43 ne nécessite pas d’installations de microfabrication ou salle blanche et ne nécessite pas de matières autres que celles disponible à un laboratoire de microbiologie typique. Il est capable de modèle avec une résolution spatiale inférieure à 25 μm, approchant les dimensions spatiales de microcolonies naturellement des biofilms2. Dans l’ensemble, cette technique offre la possibilité de manipuler la structure des biofilms, qui puis ouvre de nombreuses pistes pour l’étude des microecology dans les communautés bactériennes7. En outre, biofilms à motifs peuvent fournir une plate-forme pratique sur lequel à l’ingénieur biomatériaux utile8,9. Dans cet article, nous examiner le protocole de base nécessaire à la structuration des biofilms en utilisant pDawn-Ag43 et de traiter les éventuelles modifications et dépannage liés à la méthode.
Protocol
1. préparation du pDawn-Ag43 souches bactériennes
- PDawn-Ag43 de la transformer en une souche d’e. coli d’intérêt (Figure 1).
- Développer une souche clonage par un plasmide pDawn-Ag43 (disponible à partir d’un référentiel de plasmide) en inoculant la souche dans un bouillon LB additionné de 50 spectinomycine μg/mL (LB + spec) dans un tube à culture (du jour au lendemain dans un incubateur à agitation à ~ 250 tr/mn, 37 ° C). Ensuite, utilisez un kit de miniprep pour récolter le de plasmide purifié pDawn-Ag4310.
- Choisir une souche d’e. coli d’intérêt à être modelé. Jusqu’ici, pDawn-Ag43 a été vérifiée pour travailler dans les MG16553 et BW25113.
- Utiliser un protocole établi pour générer compétentes (p. ex., chimiquement compétent11 ou electrocompetent12) les stocks de l’Elu la souche e. coli (p. ex., MG1655).
- PDawn-Ag43 plasmide à transformer les bactéries compétentes11,12, suivie de 1 h de récupération et la plaque sur LB + plaques de gélose spec. Permettre aux colonies de croître pendant une nuit à 37 ° C.
- Magasin la pDawn-Ag43 transformé des souches.
- Ensemencer une seule colonie de pDawn-Ag43 d’une LB + spec gélose dans LB + spec dans un tube de culture et développez-le dans un incubateur à agitation (à ~ 250 tr/mn, 37 ° C) de la phase exponentielle (DO600 ~0.4 - 0,8).
- Préparer le stock pour stocker la souche pDawn-Ag43 transformé à-80 ° C à long terme en mélangeant 1 mL de culture à 1 mL de glycérol stérile à 50 % dans un tube en cryo pour obtenir un 25 % de glycérol stock congélateur. Stocker dans un congélateur à-80 ° C.
- Si des plasmides supplémentaires (p. ex., journaliste fluorescent plasmides) ont besoin de se transformer, de créer des cellules compétentes11,12 de la pDawn-Ag43 transformé de souche et répétez le processus de transformation11 , 12 pour les plasmides supplémentaires au besoin.
Remarque : Si vous utilisez électroporation8, il est possible de cotransform plusieurs plasmides (y compris les pDawn-Ag43) en même temps ; Toutefois, une transformation simultanée n’est pas recommandée en utilisant des méthodes de transformation chimique, comme la grande taille (> 10 Ko) de pDawn-Ag43 signifie efficacité de transformation est réduites.
2. préparation le montage optique de projecteur pour les bactéries éclairantes
- Obtenir un incubateur bactérien avec murs opaques et un trou pour le passage des câbles, un projecteur portatif capable de montage et de fonctionnement à l’intérieur de l’incubateur bactérienne, et un portable équipé de logiciels pour projection de présentation (voir Table de Matériaux). En choisissant le projecteur et l’incubateur, veiller à ce que la distance minimale de mise au point du projecteur est inférieure à la hauteur intérieure de la couveuse.
- Placer le projecteur à l’intérieur de l’incubateur en bas, avec l’ouverture pointant directement vers le haut, le plafond, où la chambre de culture de biofilm est attaché (Figure 2).
- Fixer le projecteur en place en construisant un set-up avec un montage d’essai à base optique connecté à un poteau vertical, à son tour relié à une horizontale qui se visse dans le projecteur (Figure 2). Notez que cette configuration peut être modifiée selon les pièces projecteur/disponible. En fin de compte, la condition essentielle est que le projecteur est fixé solidement au bas de l’incubateur, avec l’ouverture vers le haut.
- Brancher le portable via le câble de l’écran (p. ex., HDMI) vers le projecteur à l’intérieur de l’incubateur.
- Si les surfaces — surtout le plafond — de l’intérieur de l’incubateur sont réfléchissantes (p. ex., metal surface polie), recouvrez-les de surface mate noire pour minimiser les reflets.
- Ruban adhésif permet de fixer une boîte de Petri « factice » vide sur le plafond de l’incubateur. Notez que, comme avec le projecteur, il y a plusieurs façons acceptables d’attacher une boîte de Petri ; s’assurer que la surface de fond transparent de la chambre de culture, où l’illumination se produit, n’est pas couvert.
- Ajuster la mise au point du projecteur en tournant le bouton de mise au point pour que le plan de mise au point coïncide avec la surface inférieure de la boîte de Petri de biofilm (par exemple, une plaque bien) fixée au plafond de l’incubateur (Figure 2). Le projecteur doit s’allumer une image forte, non floue sur la partie inférieure de la boîte de Pétri. Supprimer la boîte de Petri « factice » une fois que la projection a été optimisée.
- À l’aide du logiciel de l’ordinateur portable, diriger le projecteur pour éclairer le champ de vision complet avec éclairage bleu maximal (par exemple, RVB = [0, 0, 255]) en présentant un glissement complet bleu.
- Mesurer l’intensité lumineuse du projecteur à l’aide d’un wattmètre optique en plaçant la tête photodétecteur au plafond incubateur et en lisant l’intensité sur le correspondant wattmètre étalonné par rapport à la longueur d’onde lumineuse 460 nm. Suivez les instructions sur la connexion et calibrer le photodétecteur pour le wattmètre spécifique utilisé.
- Réduire la lumière ambiante (par exemple, éteindre les lumières de la pièce, ou placez l’incubateur des sources lumineuses) autant que possible avant de faire éclairage mesures d’intensité.
- Ajuster l’intensité de l’éclairage à l’aide d’un filtre de densité neutre réglable placé à l’ouverture du projecteur. Tournez le filtre pour régler l’intensité de l’éclairement mesurée par le compteur de puissance, jusqu'à ce que l’intensité de l’éclairage dans le centre de la région de projection de lumière bleue indique 50 μW/cm2.
Remarque : S’il est possible de régler l’intensité de l’éclairage en utilisant des valeurs RVB bleus plus faibles sur l’extrémité du logiciel, en utilisant un filtre tout en maximisant la valeur RVB bleue a l’avantage de maximiser le contraste optique du système entre lumineux vs. régions sombres. - Dessiner des motifs arbitraires à l’aide du logiciel de présentation/projecteur sur l’ordinateur portable et d’afficher ces modèles sur le plafond de l’incubateur, utilisation du projecteur.
NOTE : Formation de Biofilm régions doivent être dessinées avec éclairage bleu maximal (par exemple, RVB = [0, 0, 255]), les régions non-biofilm-formant avec pas d’éclairage (par exemple, RVB = [0, 0, 0]).
3. mise en culture des Biofilms à motifs
- Avant l’illumination, préparer les bactéries pDawn-Ag43, à partir du stock de congélateur de glycérol, afin qu’ils sont induits avec fiabilité à la dernière phase de croissance exponentielle pour l’éclairage (Figure 3 a).
- Ensemencer une souche pDawn-Ag43 du stock de glycérol sur LB + plaques de gélose spec. Permettre aux colonies de croître pendant la nuit (37 ° C).
NOTE : De là jusqu'à l’étape de la culture d’illumination, s’assurer que les cellules restent dans l’ombre autant que possible — brèves périodes à l’éclairage ambiant (par exemple, pour les subdilution) sont acceptables. - Ensemencer une colonie de bactéries pDawn-Ag43 d’une boîte de gélose lb + spec bouillon et développer la culture du jour au lendemain à la phase stationnaire (dans un incubateur à agitation à ~ 250 tr/mn, 37 ° C, pendant environ 16 h).
- Subdilute de la culture à un ratio de 1 : 1 000 avec LB + spec bouillon (p. ex., ajouter 1 μL de culture nuitée à 1 mL de frais LB + spec).
- Permettre la culture subdiluted de grandir jusqu'à la fin de la phase exponentielle/début stationnaire (OD ~ 1.0, ~ 6 h dans un incubateur à agitation à ~ 250 tr/mn, 37 ° C).
- En attendant que la culture à cultiver, préparer les milieux M63 avec 1 x M63 sels, 1 mM MgSO4, 0,2 % de glucose, acides casamino 0,1 % et spectinomycine 50 μg/mL dans l’eau (s’assurer que les éléments constitutifs sont stériles).
- Subdilute la culture exponentielle-phase tardive à un ratio de 1/100 avec M63 milieux supplémentés avec 50 spectinomycine μg/mL. Ensuite, introduire la dilution dans une boîte de Petri de biofilm (par exemple, déposer l’échantillon dilué dans un puits de la plaque).
Remarque : Les volumes requis pour cette subdilution au 1/100 dépendent de la boîte de Petri utilisé (par exemple, si vous utilisez une plaque polystyrène 6 puits puits [non-culture de tissus traitée], un seul échantillon il faudrait ajouter 20 μL de la culture à 2 mL de M63 + spec, comme le volume standard de puits d’une plaque de 6 puits est de ~ 2 mL).
- Ensemencer une souche pDawn-Ag43 du stock de glycérol sur LB + plaques de gélose spec. Permettre aux colonies de croître pendant la nuit (37 ° C).
- Comme les échantillons sont maintenant prêts pour l’éclairage, bande de la boîte de Pétri au plafond de l’incubateur, veiller à ce que la surface au fond du plat est transparente pour l’illumination par le bas par le projecteur.
Remarque : Il est important de s’assurer que le plafond de l’incubateur n’est pas opaque, pour minimiser l’illumination errant. Illumination errant peut également être réduite en utilisant des plaques de paroi noire comme Pétri, bien que ce ne soit pas strictement nécessaire, si vous utilisez de telles dalles, vérifiez l’intrados est transparent. - Laissez les biofilms à la culture dans l’incubateur du jour au lendemain (16 h avec pas de secousses, à 37 ° C). Notez que certains projecteurs devient moins fiables à des températures élevées. Si tel est le cas, la culture à des températures plus basses (par exemple, 30 ° C), sans oublier que le temps d’incubation peut être nécessaire d’augmenter, selon la souche e. coli .
4. imagerie modelé Biofilms
- Après la croissance durant la nuit des échantillons biofilm, sortir le plat de la culture de l’incubateur. Le plat devra biofilms bactéries attachées à sa surface inférieure où il a été éclairé, ainsi que les bactéries planctoniques dispersés dans les milieux liquides ci-dessus.
- Jeter les cellules planctoniques en enlevant le milieu liquide de la boîte de Petri (p. ex., en aspirant doucement avec une pipette).
- Rincer l’échantillon 2 x avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour enlever le reste des cellules planctoniques (Figure 3 b) par pipetage doucement dans du PBS, suivi par aspiration.
- Si les cellules sont étiquetées fluorescent, l’image directement les échantillons à l’aide de la microscopie de fluorescence13 (p. ex., grand champ13, confocale 3D14, etc.).
NOTE : Biofilms Fluorescent peut également être conservés à l’aide d’un support de montage automatique de durcissement. Appliquer une goutte de montage de médias à un échantillon de biofilm, couvrir avec une lamelle de verre, en prenant soin de ne pas pour capturer les bulles dessous et laissez-le durcir pendant la nuit avant l’imagerie. - Si les cellules bactériennes utilisées ne sont pas étiquetées fluorescent, appliquer le violet de gentiane teinture technique15 (Figure 3 b) pour renforcer le contraste du biofilm avant l’imagerie.
5. Protocole Modifications/Alternatives
- Cultiver les bactéries pDawn-Ag43 sur différentes surfaces.
- Mettre le verre ou des poly-diméthyl-siloxane (PDMS) coupons (p. ex., lamelles ou fines lanières de PDMS) en plaques bien avant l’ajout d’un échantillon/éclairage bactérien et suivre le même protocole que précédemment pour modèle pDawn-ag43 biofilms sur verre et PDMS.
- Croissance pDawn-Ag43 bactéries à l’intérieur d’une chambre de culture transparent, fermé.
- Générer un moule de chambre de culture pour PDMS.
- Pour une chambre de culture de base, générer des moisissures en attachant un prisme dur, rectangulaire sur une surface plane (le prisme deviendra une cavité dans le PDMS qui sert de la chambre de la culture une fois que le moule est casté). Notez que plus complexe culture chambre moules peuvent être fabriqués à l’aide de lithographie douce16.
- Monter une cavité PDMS en versant PDMS dans le moule et en lui permettant de guérir (un protocole détaillé Lithographie douce, voir Science Education de base de données16 de JoVE).
- Après durcissement, couper n’importe quel excès PDMS, perforer des canaux d’entrée/sortie dans la chambre de cavité/culture et coller la cavité sur une surface plane (par exemple, verre/polystyrène) en appuyant fermement le PDMS sur la surface plane, laissant la cavité entre la surface et le plafond de PDMS comme la chambre de culture de biofilm.
NOTE : Collage permanent basé sur plasma traitement16 peut également être utilisé, mais les puces ne sera alors pas réutilisables. - Suivre le protocole de culture comme avant, à l’aide d’une seringue avec aiguilles pointe émoussée (au lieu d’une pipette) pour introduire l’échantillon bactérienne dans la chambre de culture/rinçage avec le tampon PBS (Figure 3).
- Si vous utilisez une cavité temporairement servile, utiliser uniquement de dépression pour tirer liquide dans/hors de la chambre, pour s’assurer que la cavité ne devienne non collée à la surface de verre/polystyrène sous-jacent.
- Générer un moule de chambre de culture pour PDMS.
- Croissance pDawn-Ag43 bactéries utilisant un film photomasque pour éclairage structuré.
- Concevoir un modèle de biofilm à l’aide de logiciels de CAO compatible avec un service d’imprimante/impression film photomasque. La conception du film photomask doit être claires dans les régions où le biofilm est destiné à être imprimé et noir/opaque ailleurs. Lorsque vous avez terminé, envoyer le fichier photomasque au service imprimante/impression et attendent le retour de la physique photomask.
- Instruire le projecteur pour éclairer un champ de vision complet avec éclairage bleu maximal (par exemple, RVB = [0, 0, 255]) à l’aide du logiciel de l’ordinateur portable.
- Découper une zone d’intérêt du plus grand film photomasque et bande directement à la partie inférieure de la culture de biofilm plat avant d’introduire l’échantillon bactérien pour l’éclairage de nuit (Figure 3D). Les biofilms la culture comme avant et retirez le photomasque après mise en culture, avant de l’imagerie.
Representative Results
Comme on le voit dans la Figure 4 a, pDawn-Ag43 bactéries ont servi à produire des biofilms à motifs dans des plaques en polystyrène bien avec éclairage de projecteur (le projecteur a été mis pour illuminer un pois), photographié par microscopie à fond clair avec cristal tache violette comme agent de contraste et la microscopie de fluorescence à l’aide de bactéries rouge fluorescent-protéine-exprimant. Échantillons de biofilm fluorescent peuvent aussi être photographiées à l’aide de la microscopie confocale14 pour obtenir des images du biofilm en 3-d (Figure 4 b). Dans la Figure 4, nous illustrons la structuration haute résolution possible en utilisant un film photomasque pour fournir un éclairage à motifs à l’échantillon de biofilm. Enfin, dans la Figure 4 et 4E, nous démontrons des exemples de motifs sur le verre et les surfaces PDMS, ainsi que chambres de culture clos PDMS — celles-ci illustrent les différents types d’environnements où la structuration pDawn-Ag43 peut être appliquée.
Figure 1 : préparation de bactéries pDawn-Ag43 (protocole section 1). Préparation pDawn-Ag43 bactéries capables de la formation de biofilm de lumière sous réglementation consiste à purifier le plasmide pDawn-Ag43 d’un hôte de clonage de souche, transformant en une souche d’e. coli d’intérêt et la création de stock congélateur bactérienne pour à long terme stockage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : préparation d’un montage optique pour l’éclairage d’exemple de biofilm (protocole, article 2). Le montage optique est logé dans un incubateur bactérien et se compose d’un projecteur connecté à l’ordinateur, éclairer un échantillon de biofilm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Culture de protocole pour la structuration des biofilms (protocole, article 3). (A) avant l’illumination, pDawn-Ag43 bactéries sont préparés avant le patterning tels qu’ils sont fiable induits lors de la phase de croissance appropriée. (B) après une nuit illuminée de croissance, un biofilm à motifs sera présent au bas de la boîte de Petri, ainsi que les cellules planctoniques dans les milieux liquides, et après quelques traitements supplémentaires, le biofilm est prêt pour l’imagerie. (C) comme alternative à bien des plaques, des biofilms peuvent être cultivées dans des chambres de culture clos comme une cavité moulée de PDMS. Dans ce cas, les seringues attachés à aiguilles pointe émoussée peuvent servir à introduire l’échantillon et de vider les liquides hors de la chambre. (D) comme une alternative aux modèles d’éclairage axées sur le projecteur, patrons peuvent également être générées par du ruban adhésif film photomasks directement au fond des chambres de culture de biofilm. Dans ce cas, le projecteur doit être mis en place pour éclairer la lumière bleue à travers le champ complet. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : résultats représentatifs des biofilms à motifs à l’aide de pDawn-Ag43. Tous les résultats ont été obtenus à l’aide d’une souche d’hôte de MG1655 e. coli . (A) pDawn-Ag43 bactéries ont servi à produire des biofilms à motifs dans des plaques en polystyrène bien avec éclairage de projecteur (le projecteur a été mis pour illuminer un pois), photographié par microscopie à fond clair avec la tache violette en cristal comme un agent de contraste et la microscopie de fluorescence à l’aide de bactéries rouge fluorescent-protéine-exprimant. (B) les échantillons de biofilm fluorescents sont imagés avec la microscopie confocale à obtenir des images 3D du biofilm. Biofilms à haute résolution (C) peut être modelés avec un film de photomasque pour fournir un éclairage à motifs à l’échantillon de biofilm. Les Biofilms (D) peut être modelés sur le verre et les surfaces PDMS. Les Biofilms (E) peut être modelés en chambres de culture clos. Ce chiffre a été adapté du précédent travail3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Problème | Causes/solutions possibles |
| PDawn-Ag43 de tranformer en souche hôte - aucune colonie | À faible concentration de plasmide - vérifier la concentration de plasmide sur spectromètre. Un miniprep typique de pDawn-Ag43 devrait produire au moins 100 ng/μl ; utiliser jusqu'à 10-100 ng pour la transformation |
| Cocher/remake cellules compétentes : cellules compétentes devraient avoir l’efficacité de la transformation au moins 10 ^ 6 UFC/µg vérifiée à l’aide d’un plasmide standard tels que pUC19 - si non, remake cellules compétentes | |
| Antibiotique mal (niveau de) sur gélose LB - Assurez-vous d’utiliser 50 spectinomycine μg/mL pour la sélection | |
| Éclairage de projecteur se transforme du jour au lendemain off / incompatible | Désactiver le logiciel de problématique telles que : nuit logiciels/OS mise à jour automatique, filtre à lumière bleue nuit |
| Projecteur peut être une surchauffe - set incubateur à une température plus basse alors que projecteur est allumé (par exemple 30 ° C au lieu de 37 ° C) - projecteur Remarque comme source de chaleur peut surchauffer incubateur au-delà de point de consigne | |
| Enlever inutiles sources d’humidité de l’incubateur, car ceux-ci peuvent affecter électronique projecteur | |
| No/bas niveaux du biofilm forment après l’éclairage pendant la nuit, aucune croissance de cellules planctoniques soit (c'est-à-dire liquide est clair) | Antibiotique mal (niveau de) - Assurez-vous d’utiliser 50 spectinomycine μg/mL |
| Vérifier que tout est ajoutée à la recette M63 correctement | |
| No/bas niveaux du biofilm forment après l’éclairage pendant la nuit, seules les cellules planctoniques (c.-à-d. liquide est trouble) | Vérifiez lumière, projecteur devrait être éclairante lumière bleue à 50 μW/cm ^ 2 à la longueur d’onde de 460 nm |
| Essayez de laisser les bactéries à croître pendant plus courte/longue période après 1 : 1000 LB étape de subdilution avant d’ajouter à M63 | |
| Restreak des bactéries sur plat de livre, le départ de nouvelle colonie pour générer de la culture de phase stationnaire pendant la nuit | |
| S’assurer que le projecteur fonctionne régulièrement pendant la nuit - voir point ci-dessus | |
| Modèles de biofilm floue, des niveaux élevés de bruit de fond | Réduire les reflets des système d’illumination optique, couvrir les surfaces réfléchissantes sur l’intérieur de l’incubateur |
| Envisagez d’utiliser l’éclairage structuré basé sur photomasque (par opposition à projecteur-en fonction) | |
| Vérifier le projecteur est correctement centré à la surface inférieure de la chambre de culture de biofilm |
Tableau 1 : Commune de résolution des problèmes.
Discussion
Compte tenu de la nécessité d’outils de recherche qui permettent pour le contrôle de structure de biofilm, nous avons présenté un protocole facile à utiliser pour les biofilms bactériens à l’aide de la construction d’optogenetic de pDawn-Ag43 le patterning. Avec cette technique, les biofilms d’e. coli peuvent être optiquement calquées sur divers environnements de surface, y compris des chambres fermées, avec une résolution spatiale inférieure à 25 μm.
Dans l’ensemble, ce protocole peut être décomposé en quatre sections principales : (1) la préparation de la bactérie pDawn-Ag43, (2) la préparation de l’optique et matériel de mise en place de la culture, (3) les étapes de l’illumination avant la croissance bactérienne et (4) l’illumination après rinçages et imagerie.
La partie critique de la section 1 est la réussite de la transformation du plasmide pDawn-Ag43 dans la souche e. coli d’intérêt. Cette opération est facilitée en isolant de haute qualité plasmide purifié et générant des cellules capables de haute qualité pour la transformation (tableau 1, dépannage).
La partie critique de l’article 2 est l’optimisation de l’installation du projecteur afin que l’intensité de l’éclairage est ajustée à 50 μW/cm2 à la longueur d’onde de 460 nm, et le projecteur est correctement centré à la hauteur d’exemple de biofilm. Notez que dans ce protocole, nous décrivons une installation d’éclairage inversé où le projecteur diffuse de la lumière par le bas, vers le haut vers l’exemple de biofilm. L’avantage de cette configuration est que la lumière n’a besoin que de voyager à travers le fond de la boîte de Pétri avant d’atteindre la surface de la formation de biofilm. Illumination par dessus signifie que la lumière devait se déplacer à travers les médias de liquides au-dessus de la surface du biofilm, qui, au cours de la croissance, se trouble avec les cellules planctoniques. Outre ces préoccupations, il est aussi important de minimiser les reflets dans la configuration optique autant que possible, par exemple, en dissimulant des surfaces réfléchissantes à l’intérieur de l’incubateur, ce qui permet d’obtenir des biofilms à motifs plus nettes. Une note liée, plus nette biofilm modèles peuvent également être obtenus en utilisant un photomasque pour contrôler la structuration de l’illumination (Figure 3D, Figure 4). Questions d’intérêt communes nécessitant le dépannage comprennent les problèmes de fiabilité de projecteur à des températures plus élevées (p. ex., 37 ° C), qui peuvent être minimisées en incubant la croissance de biofilm à des températures plus basses (par exemple, 30 ° C), ainsi que de logiciels qui provoque des mises à jour du système d’exploitation ou la lumière bleue de filtrage au cours de la croissance durant la nuit (tableau 1). Il est également important de noter que, selon le modèle de projecteur et incubateur utilisé, il est également possible que la chaleur générée par le projecteur se traduira par une température intérieure plus élevée que l’incubateur REGLAGE de temperature qui peut doivent être corrigées.
La partie critique de l’article 3 est l’obtention des échantillons bactériens fiables et répétables avant ils sont induits par l’illumination. Pour cette raison, il est recommandé d’obtenir des colonies de clones de bactéries pDawn-Ag43 par les rayures sur un plat d’agar et puis en suivant les étapes de culture liquide pour que les bactéries soient allumé/induite à la dernière phase de croissance exponentielle dans un répétable manière.
Enfin, la partie critique de l’article 4 est bien, mais aussi doucement, ronger les cellules planctoniques qui reste après le biofilm patterning protocole ; ainsi, il est recommandé d’effectuer plusieurs étapes de rinçage doux avec du PBS.
Par rapport aux techniques existantes pour cellule structuration5,6, biofilm optique basée sur pDawn-Ag43 le patterning a une assez faible barrière d’entrée à utiliser, car il ne nécessite pas de microfabrication, installations de salle blanche, complexe chimie, ou prétraitement de surface encore est encore capable de modèle avec la haute résolution (25 μm) généralement associée à des techniques de microfabrication. La méthode s’étend des travaux antérieurs sur la photolithographie bactérienne pour contrôler l' expression de gène17. Actuellement, pDawn-Ag43 plasmide est limitée à e. coli, comme il utilise une origine pUC-basée de réplication, mais pDawn et Ag43 sont tous deux compatibles chez d’autres espèces de bactéries (Gram négatif). Techniques génétiques sont disponibles pour introduire éventuellement la formation de biofilm lumière régulée à différentes espèces bactériennes et représente une orientation possible pour de futures recherches. Une autre limitation potentielle de la technique, c’est qu’il agit en augmentant la formation de biofilm chez les souches avec la formation de biofilm native faible (p. ex., MG1655 e. coli). Cependant, souches avec la formation de biofilm indigène forte ont forme biofilms indépendamment des conditions d’éclairement, empêchant la formation de biofilm à motifs à l’aide de pDawn-Ag43 tel que décrit ici ; encore optogenetic techniques peuvent encore s’avérer applicables dans la régulation de la formation de biofilm. Nous notons que dans d’autres contextes, les méthodes alternatives de structuration de biofilm peuvent être disponibles, par exemple via la modulation optique de c-di-GMP18.
Dans l’ensemble, pDawn-Ag43 basé structuration sera appropriée pour une utilisation dans les applications qui étudier l’effet de la structure des biofilms sur fonction1 et, par conséquent, pourraient bénéficier de contrôle accordable sur biofilm structuration — un particulièrement pertinent exemple pour mettre en évidence est l’étude de l’écologie microbienne dans les biofilms2. Orientations futures comprennent des biomatériaux à motifs8,9 et/ou des communautés bactériennes structurées. Autres applications du présent protocole accessible également incluent bio-art19, étant donné le potentiel esthétique évident, mais aussi des sciences formelles et informelles de la vie education20,21,22. Du point de vue éducatif, le protocole décrit ici combine plusieurs techniques pertinentes (culture bactérienne, transformation, optique/optogenetics) et est également modulaire extensible (par exemple, inclure la microfluidique).
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient verre D., H. Kim, l’ACEI N., A. Combes, S. Rajan et B. clés pour leurs suggestions utiles et le laboratoire de Spormann pour accéder à leur microscope confocal. En outre, les auteurs reconnaissent l’appui de Stanford Bio-X Bowes et NSERC PGS bourses, le National Institute of Health (R21-AI-139941) et l’American Cancer Society (RSG-14-177-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
| MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center - Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
| RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
| LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
| Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
| Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
| M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
| Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
| Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
| Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
| 6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
| PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
| 1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
| Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
| Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
| Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
| Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
| Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
| Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
| Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
| Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
| 1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
| 1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
| Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
| Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
| Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture |
| Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
| Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |
References
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