Summary
Vi visar en metod för insättning Escherichia coli bakteriell biofilm i godtyckliga rumsliga mönster med hög upplösning använder optisk stimulering av en genetiskt kodade yta friktion konstruktion.
Abstract
Rumslig struktur och mallning spela en viktig roll i bakteriell biofilm. Här visar vi en tillgänglig metod för odling av E. coli biofilmer i godtyckliga rumsliga mönster med hög rumslig upplösning. Tekniken använder en genetiskt kodade optogenetic konstruktion — Misterrayban1-Ag43 — som par biofilm bildning i E. coli att optiska stimulering av blått ljus. Vi detalj processen för att omvandla E. coli med Misterrayban1-Ag43, förbereda krävs optiska set-up och protokollet för odling mönstrade biofilmer med Misterrayban1-Ag43 bakterier. Användning av detta protokoll, kan biofilmer med en rumslig upplösning nedan 25 μm vara mönstrade på olika ytor och miljöer, inklusive slutna kamrar, utan att kräva mikrofabrikation, renrum faciliteter eller ytans förbehandling. Tekniken är bekvämt och lämpligt för användning i applikationer som undersöker effekten av biofilm struktur, som tillhandahåller avstämbara kontroll över biofilm mallning. Mer allmänt, den har också potentiella tillämpningar inom biomaterial, utbildning och bio-art.
Introduction
Biofilmer är ytan-anslutna samhällen av mikrober, och är kända för sin starka struktur och funktion-koppling. Rumslig geometri och mallning av biofilmer spela en viktig roll i gemenskapens Totalfunktion (och vice versa)1. De små längden skalor inblandade i biofilm struktur — storleksordningen tiotals µm2— göra avstämbara och bekväm kontroll av biofilm mönstring ett utmanande problem. Här visar vi ett protokoll som möjliggör biofilmer vara just mönstrade i godtyckliga geometrier, baserat på optisk belysning.
Det protokoll som presenteras här använder Misterrayban1-Ag433, en optogenetic konstruktion som par biofilm bildning i E. coli -bakterier till optisk belysning av körning uttrycket av Ag43 (ett adhesin gen som ansvarar för surface vidhäftning och biofilm bildande) under kontroll av Misterrayban14 (en transkriptionell reglering kontrolleras av optisk belysning). Metoden är praktiskt att använda och kan ytan mönster biofilmer på olika miljöer, inklusive bifogade (transparent) kultur chambers. Jämfört med befintliga cell nedfall metoder, såsom droplet-baserade nedfall5 eller yta prepatterning behandlingsrum6, Misterrayban1-Ag43 kräver inte mikrofabrikation eller renrum faciliteter och kräver inte material utöver de tillgängliga för en typisk mikrobiologiska laboratoriet. Det ska kunna mönster med en rumslig upplösning nedan 25 μm, närmar sig microcolonies i naturligt befintliga rumsliga dimensioner biofilmer2. Sammantaget ger denna teknik förmågan att manipulera biofilm struktur som sedan öppnar många vägar för att studera microecology i bakteriesamhällen7. Mönstrad biofilmer kan dessutom ge en bekväm plattform som ingenjör användbar biomaterial8,9. I detta papper, vi diskutera grundläggande protokollet krävs för mönstring biofilmer med Misterrayban1-Ag43 och åtgärda potentiella ändringar och felsökning relaterade till metoden.
Protocol
1. beredning av Misterrayban1-Ag43 bakteriestammar
- Omvandla Misterrayban1-Ag43 till en E. coli -stam av intresse (figur 1).
- Växer en kloning stam hosting Misterrayban1-Ag43 plasmid (kan erhållas från en plasmid repository) genom ympning stammen i LB buljong kompletteras med 50 μg/mL spectinomycin (LB + spec) i en kultur tub (övernattning i en skakande inkubator på ~ 250 rpm, 37 ° C). Använd sedan ett miniprep kit för att skörda de rena Misterrayban1-Ag43 plasmid10.
- Välja en E. coli -stam av intresse att vara mönstrade. Hittills har har Misterrayban1-Ag43 verifierats för att fungera i MG16553 och BW25113.
- Använd ett etablerat protokoll för att generera behöriga (t.ex., kemiskt behöriga11 eller electrocompetent12) lager av valt E. coli stam (t.ex., MG1655).
- Förvandla den behöriga bakterier11,12, följt av 1 h återhämtning, och plattan på LB + spec agarplattor Misterrayban1-Ag43 plasmid. Tillåta kolonier att växa över natten vid 37 ° C.
- Store den Misterrayban1-Ag43 förvandlade stammar.
- Inokulera en enda koloni av Misterrayban1-Ag43 från en LB + spec agarplatta in LB + spec buljong i en kultur tub och växa i en skakande inkubator (på ~ 250 rpm, 37 ° C) till exponentiell fas (OD600 ~0.4 - 0,8).
- Förbereda lager att lagra Misterrayban1-Ag43 omvandlas stammen vid-80 ° C långsiktigt genom att blanda 1 mL kultur med 1 mL 50% steril glycerol i ett cryo-rör för att få en 25% glycerol frys lager. Lagras i-80 ° C frys.
- Om ytterligare plasmider (t.ex., fluorescerande reporter plasmider) behöver omvandlas, skapa behöriga celler11,12 från den Misterrayban1-Ag43 omvandlas stam och upprepa omvandling process11 , 12 för ytterligare plasmider som behövs.
Obs: Om du använder elektroporation8, det är möjligt att cotransform flera plasmider (inklusive Misterrayban1-Ag43) samtidigt. dock rekommenderas en samtidig omvandling inte med kemisk omvandling metoder, eftersom den stora storleken (> 10 kB) på Misterrayban1-Ag43 betyder förvandling effektivitet minskas.
2. beredning av projektor optisk Set-up för lysande bakterier
- Skaffa en bakteriell inkubator med icke-transparenta väggar och ett hål för kablar, en bärbar projektor klarar av montering och funktion inuti bakteriell inkubatorn, och en bärbar dator utrustad med programvara för presentation-projektion (se tabellen Material). När du väljer projektorn och inkubator, säkerställa att minimal fokusavstånd av projektorn blir mindre än den invändiga höjden av inkubator.
- Placera projektorn inuti inkubatorn längst ner, med bländare pekar direkt uppåt, på taket, där biofilm kultur kammaren är ansluten (figur 2).
- Fixa den på plats genom att konstruera en set-up med en optisk bakbord bas ansluten till en vertikal inlägg, i sin tur är ansluten till en horisontell post som skruvar i projektorn (figur 2). Observera att detta upplägg kan ändras beroende på projektor/tillgängliga delar. Ytterst är det centrala kravet att projektorn är stabilt fixerad nära botten av inkubatorn, med bländare pekande uppåt.
- Anslut den bärbara datorn via display kabeln (t.ex., HDMI) till projektorn inuti inkubatorn.
- Om ytorna — särskilt taket — interiör av inkubatorn är reflekterande (t.ex., polerad metallyta), täck dem med mörka matta ytor att minimera reflektioner.
- Använda tejp för att fästa en tom 'dummy' kultur maträtt i taket av inkubator. Observera att, med projektorn, finns det flera godtagbara sätt att fästa en kultur maträtt; säkerställa att transparent bottenyta på kultur avdelningen, där belysningen uppstår, inte är täckt.
- Justera fokus på projektorn genom att vrida fokuseringsknappen så att fokus planet sammanfaller med bottenytan av biofilm kultur skålen (t.ex., en väl platta) fäst till taket av inkubator (figur 2). Projektorn bör belysa en skarp, icke-suddig bild på undersidan av kultur skålen. Ta bort 'dummy' kultur skålen när projektionen har optimerats.
- Med laptop programvara, rikta projektorn för att belysa hela synfältet med maximal blå belysning (t.ex., RGB = [0, 0, 255]) genom att presentera en helt blå bild.
- Mäta belysning intensiteten av projektorn med en optisk wattmetern genom att placera fotodetektor chef inkubator taket och läsa intensiteten på motsvarande power mätaren kalibreras till ljus våglängd 460 nm. Följ instruktionerna på ansluta och kalibrera fotodetektor för specifika wattmetern används.
- Minska omgivande ljus (t.ex., stänga av rummet ljus, eller placera inkubatorn ljuskällor) så mycket som möjligt innan belysning intensitet mätningar.
- Justera belysningen intensiteten med hjälp av en justerbar neutral densitet filter placeras på projektorn bländare. Rotera filtret för att justera belysning intensitet mätt wattmetern, tills belysning intensitet i mitten av regionen blå-ljus projicerade läser 50 μW/cm2.
Obs: Det är möjligt att justera belysning intensitet med lägre blå RGB värden på programvara slutet, använder ett filter samtidigt maximera blå RGB-värdet har fördelen av att maximera systemet optiska kontrast mellan belysta vs. mörkrets rike. - Rita godtyckligt mönster med presentation/projektor programvaran på den bärbara datorn och visa dessa mönster på taket i inkubatorn, användning av projektorn.
Obs: Biofilm-bilda regioner bör göras med maximal blå belysning (t.ex., RGB = [0, 0, 255]), icke-biofilm-bilda regioner med ingen belysning (t.ex., RGB = [0, 0, 0]).
3. odla mönstrade biofilmer
- Innan belysningen, förbereda Misterrayban1-Ag43 bakterier, start från glycerol frys lager, så att de induceras tillförlitligt på sena exponentiella tillväxtfasen för belysning (figur 3A).
- Streak en Misterrayban1-Ag43 stam från glycerol lager på LB + spec agarplattor. Tillåta kolonier att växa över natten (37 ° C).
Obs: Här tills steget belysning kultur, säkerställa cellerna bo i mörkret så mycket som möjligt — korta perioder på omgivande belysning (t.ex., för subdilution) är acceptabla. - Inokulera en koloni av Misterrayban1-Ag43 bakterier från en agarplatta i LB + spec buljong och växa kultur natten till stationära fasen (i en skakande inkubator på ~ 250 rpm, 37 ° C, för ~ 16 h).
- Subdilute kulturen i ett förhållande av 1:1,000 med LB + spec buljong (t.ex., tillsätt 1 μL av övernattning kultur 1 ml färsk LB + spec).
- Låt den subdiluted kulturen att växa tills sena exponentiella och början stationära fasen (OD ~ 1.0, ~ 6 h i en skakande inkubator på ~ 250 rpm, 37 ° C).
- Väntan på kulturen att växa, förbereda M63 media med 1 x M63 salter, 1 mM MgSO4, 0,2% glukos, 0,1% casamino syror, och 50 μg/mL spectinomycin i vatten (se till att de ingående delarna är sterila).
- Subdilute sena-exponential-fas kulturen i förhållandet 1: 100 med M63 media kompletteras med 50 μg/mL spectinomycin. Sedan, införa utspädningen i en biofilm kultur skålen (t.ex.Pipettera utspädda provet i en väl platta).
Observera: De volymer som krävs för detta 1: 100 subdilution beroende av kultur skålen används (t.ex., om du använder en 6-väl polystyren väl platta [icke-vävnad-kultur behandlas], ett enda prov skulle kräva att lägga till 20 μL av kultur i 2 mL M63 + spec, som den standard är väl en 6-well platta ~ 2 mL).
- Streak en Misterrayban1-Ag43 stam från glycerol lager på LB + spec agarplattor. Tillåta kolonier att växa över natten (37 ° C).
- Eftersom proverna är nu redo för belysning, tejpa kultur skålen i taket av inkubator, att säkerställa att ytan på botten av skålen är transparent för belysning underifrån av projektorn.
Obs: Det är viktigt att se till att taket på inkubatorn inte är reflekterande, att minimera herrelösa belysning. Herrelösa belysning kan också minskas genom att använda svart-walled plattor som kultur rätter, även om detta inte är absolut nödvändigt — om använder sådana plattor, säkerställa bottenytan är transparent. - Tillåta biofilmer till kultur i inkubatorn över natten (16 h med inga skakningar, vid 37 ° C). Observera att vissa projektorer blir mindre tillförlitlig vid högre temperaturer. Om så är fallet, att kultur vid lägre temperaturer (t.ex., 30 ° C), hålla i åtanke att inkubationstiden kan behöva ökas, beroende på den E. coli -stammen.
4. imaging mönstrad biofilmer
- Efter övernattning tillväxten av biofilm proverna, ta bort kultur skålen från inkubatorn. Skålen har biofilm bakterier bifogas dess bottenyta där det har varit upplyst, samt plankton bakterier dispergerade i flytande media ovan.
- Kassera plankton cellerna genom att ta bort flytande media från kultur skålen (t.ex., av aspirera försiktigt med en pipett).
- Skölj provet 2 x med en fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning ta bort återstående plankton cellerna (figur 3B) genom att försiktigt pipettering i PBS, följt av aspiration.
- Om cellerna är fluorescently Taggad, direkt image proverna använda fluorescence mikroskopi13 (t.ex., wide-fältet13, 3-D confocal14, etc.).
Obs: Fluorescerande biofilmer kan också bevaras med hjälp av en egen härdning monteringsmedium. Applicera en droppe montering media till en biofilm prov, täck med ett täckglas, noga med att inte fånga några bubblor under, och låt det härda över natten innan imaging. - Om bakteriecellerna används inte är fluorescently taggade, tillämpa de kristallviolet fläcken teknik15 (figur 3B) för att förbättra biofilm kontrast innan imaging.
5. protokoll ändringar/alternativ
- Odla Misterrayban1-Ag43 bakterier på olika ytor.
- Fram glas eller poly-dimetyl-siloxan (PDMS) kuponger (t.ex., coverslips eller tunna remsor av PDMS) till plattor före tillsats av en bakteriell prov/belysning, och följa samma protokoll som tidigare till mönster Misterrayban1-ag43 biofilmer på glas och PDMS.
- Odla Misterrayban1-Ag43 bakterier inuti en genomskinlig, slutna kultur kammare.
- Generera en kultur avdelningen mögel för PDMS.
- För en grundläggande kultur kammare, generera mögel genom att fästa en hård, rektangulär Prisma till en plan yta (prism blir ett hålrum i den PDMS som fungerar som kultur kammaren när mögel är kastad). Observera att mer intrikata kultur avdelningen formar kan fabriceras med mjuk litografi16.
- Kasta en PDMS hålighet genom att hälla PDMS i formen och gör det möjligt att bota (för en detaljerad mjuk litografi-protokollet, se Jove's Science Education Database16).
- Efter härdning, trimma någon överflödig PDMS, punsch inlopp/utlopp kanaler in i hålrum och kultur kammaren och bond hålrummet till en plan yta (t.ex., glas/polystyren) genom att trycka ordentligt på den PDMS på platt yta, lämnar hålrummet mellan ytan och PDMS taket som biofilm kultur kammaren.
Obs: Mer permanent bindning baserat på plasma behandling16 kan också användas, men markerna kommer då inte kunna återanvändas. - Följ protokollet kultur som innan, med en spruta med trubbig spets nålar (i stället för en pipett) att införa bakteriell provet i den kultur avdelningen/skölj med PBS-bufferten (figur 3 c).
- Om ett tillfälligt bundna hålrum Använd endast undertrycket dra vätska in/ut på avdelningen, att se till att hålet inte blir unbonded från underliggande glas/polystyren ytan.
- Generera en kultur avdelningen mögel för PDMS.
- Odla Misterrayban1-Ag43 bakterier med en film photomasken för strukturerade belysningen.
- Designa en biofilm mönster med hjälp av CAD-programvara som är kompatibel med en film photomasken skrivare självbetj. Photomasken film design bör vara tydlig i regioner där biofilmen är tänkt att skrivas ut och svart/ogenomskinlig någon annanstans. När du är klar, skicka photomasken filen till skrivaren/utskrift tjänsten och väntar återlämnande av den fysiska fotomask.
- Instruera projektorn att belysa ett fullt synfält med maximal blå belysning (t.ex., RGB = [0, 0, 255]) med laptop programvara.
- Klipp ut en region av intresse från större film photomasken och tejp det direkt till botten av biofilm kulturen skålen innan införa bakteriell provet för övernattning belysning (figur 3D). Kultur biofilmer som tidigare och ta bort photomasken efter odling, före imaging.
Representative Results
Som kan ses i figur 4A, Misterrayban1-Ag43 bakterier användes för att generera biofilmer mönstrade i polystyren plattor med projektorn belysning (projektorn sattes att belysa en polka-dot mönster), avbildas genom brightfield mikroskopi med kristall violett fläcken som kontrastmedel och fluorescensmikroskopi använder röd-fluorescerande-protein-uttryckande bakterier. Fluorescerande biofilm prover kan också avbildas med konfokalmikroskopi14 att få bilder av biofilmen i 3-D (figur 4B). I figur 4 cillustrera vi det högupplösta mönstringen som möjligt genom att använda en film photomasken som ger mönstrade belysning till biofilm provet. Slutligen, i figur 4 d och 4E, visar vi exempel på mönster på glas och PDMS ytor, samt medföljande PDMS kultur chambers — dessa visar olika typer av miljöer där Misterrayban1-Ag43 mallning kan tillämpas.
Figur 1: förberedelse av Misterrayban1-Ag43 bakterier (protokoll avsnitt 1). Förbereda Misterrayban1-Ag43 bakterier kan ljus-reglerade biofilm bildning innebär renande Misterrayban1-Ag43 plasmid från en värd kloning stam, förvandla den till en E. coli -stam av intresse och skapa bakteriell frys lager för långsiktiga lagring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: beredning av en optisk set-up för biofilm provet belysning (protokoll avsnitt 2). Optiska set-up ligger inne en bakteriell inkubator och består av en dator-ansluten projektor upplysande en biofilm provet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kultur protokoll för mönstring biofilmer (protokoll avsnitt 3). (A) före belysning, Misterrayban1-Ag43 bakterier förbereds innan mönstring sådan att de induceras tillförlitligt på ordentlig tillväxtfasen. (B) efter natten upplyst tillväxt, en mönstrad biofilm kommer närvara på botten av kultur skålen, tillsammans med plankton celler i flytande media, och efter några ytterligare bearbetning, biofilmen är redo för avbildning. (C) som ett alternativ till väl plattor, biofilmer kan vara odlade i slutna kultur avdelningar såsom en gjuten PDMS hålighet. I detta fall kan sprutor kopplade till trubbig spets nålar användas för att införa provet och spola vätskor ur kammaren. (D) som ett alternativ till projektor-baserad belysning mönster, mönster kan också genereras genom att tejpa film fotomasker direkt till botten av biofilm kultur chambers. I det här fallet bör projektorn ställas in att lysa blått ljus över hela fältet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat av biofilmer mönstrad använder Misterrayban1-Ag43. Alla resultat erhölls med hjälp av en MG1655 E. coli värd stam. (A) Misterrayban1-Ag43 bakterier användes för att generera biofilmer mönstrade i polystyren plattor med projektorn belysning (projektorn sattes att belysa en polka-dot mönster), avbildas genom brightfield mikroskopi med kristallviolett fläck som en kontrastmedel och fluorescensmikroskopi använder röd-fluorescerande-protein-uttryckande bakterier. (B) fluorescerande biofilm prover är avbildade med konfokalmikroskopi att få 3D-bilder av biofilmen. (C) högupplösta biofilmer kan vara mönstrade med en film photomasken som ger mönstrade belysning till biofilm provet. (D) biofilmer kan vara mönstrade på glas och PDMS ytor. (E) biofilmer kan vara mönstrade i slutna kultur chambers. Denna siffra har anpassats från tidigare arbete3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Problemet | Möjliga orsaker/lösningar |
| Tranforming Misterrayban1-Ag43 till värd stam - inga kolonier | Låg plasmid koncentration - kontrollera plasmid koncentration på spektrometer. En typisk miniprep av Misterrayban1-Ag43 bör ge minst 100 ng/μl; Använd upp till 10-100 ng för omvandling |
| Kontrollera/remake behöriga celler: behöriga celler bör ha förvandling effektivitet minst 10 ^ 6 cfu/µg verifieras med en standard plasmid såsom pUC19 - om inte, remake behöriga celler | |
| Fel (nivå) antibiotikum på LB agar tallrik - se till att använda 50 μg/mL spectinomycin för urval | |
| Projektor belysningen stängs av / inkonsekvent över natten | Inaktivera problematisk programvara såsom: automatisk övernattning programvara/OS uppdatering, natten blå-ljus filter |
| Projektorn kan vara överhettning - set inkubator till lägre temperatur medan projektorn slås på (t.ex. 30 ° C i stället för 37 ° C) - OBS projektorn som värmekälla kan överhettas inkubator utöver börvärde | |
| Ta bort onödiga källor till fukt från inkubator, eftersom dessa kan påverka projektorn elektronik | |
| Nr/låga nivåer av biofilm bildas efter övernattning belysning, ingen plankton celler tillväxt antingen (dvs flytande är klart) | Fel (nivå) antibiotika - se till att använda 50 μg/mL spectinomycin |
| Kontrollera allt läggs till M63 receptet ordentligt | |
| Nr/låga nivåer av biofilm bildas efter övernattning belysning, endast plankton celler (dvs flytande är grumlig) | Kolla ljus nivå, projektorn bör lysande blått ljus på 50 μW/cm ^ 2 460 nm våglängd |
| Prova att låta bakterier växa kortare/längre tid efter 1: 1000 LB subdilution steg innan du lägger till M63 | |
| Restreak bakterier på LB skylt, start från färsk koloni att generera övernattning stationära fasen kultur | |
| Se till att projektorn arbetar konsekvent över natten - se punkt ovan | |
| Fuzzy biofilm mönster, höga nivåer av bakgrundsljud | Minska ströljus från optisk belysning system, täcka reflekterande ytor på insidan av inkubator |
| Överväg att använda photomasken-baserade (i motsats till projektor-baserade) strukturerade belysning | |
| Kontrollera att projektorn är korrekt inriktad på bottenytan på biofilm kultur avdelningen |
Tabell 1: Gemensamma felsökning.
Discussion
Mot bakgrund av behovet av forskningsverktyg som möjliggör en biofilm struktur kontroll, har vi presenterat en lätt-till-använda protokoll för mönstring bakteriell biofilm med den Misterrayban1-Ag43 optogenetic konstruktion. Med denna teknik, kan E. coli biofilmer vara optiskt mönstrade på olika surface miljöer, inklusive sluten kammare, med en rumslig upplösning nedan 25 μm.
Övergripande, detta protokoll kan delas upp i fyra huvudavsnitt: (1) utarbetandet av Misterrayban1-Ag43 bakterier, (2) utarbetandet av den optiska och kultur set-up maskinvara, (3) stegen före belysning bakterietillväxt och (4) efter belysning sköljningar och imaging.
Den kritiska delen av avsnitt 1 är framgångsrika omvandlingen av Misterrayban1-Ag43 plasmid i E. coli stam av intresse. Detta underlättas av isolera högkvalitativ renad plasmid och generera hög kvalitet behöriga celler för omvandling (tabell 1, felsökning).
Den kritiska delen av avsnitt 2 är optimering av projektorn upplägget så att belysning intensitet justeras till 50 μW/cm2 på 460-nm våglängd och projektorn är korrekt inriktad på biofilm prov höjden. Observera att i detta protokoll, beskriver vi en inverterad belysning set-up som där projektorn lyser ljus underifrån, uppåt mot biofilm provet. Fördelen med detta upplägg är att ljuset bara behöver resa genom botten av kultur skålen innan den når biofilm bildning ytan. Belysning ovanifrån innebär att ljuset måste färdas genom flytande media över biofilm ytan, som, under tillväxten, blir grumlig med plankton celler. Förutom dessa farhågor, är det också viktigt att minimera ströljus i optiska set-up som möjligt, exempelvis genom att täcka upp reflekterande ytor på insidan av inkubatorn — detta hjälper till att få skarpare mönstrade biofilmer. I en liknande anteckning, kan skarpare biofilm mönster också erhållas med hjälp av en photomasken för att styra belysning mönster (figur 3D, figur 4 c). Vanliga problem som kräver felsökning omfatta projektorn tillförlitlighetsproblem vid högre temperaturer (t.ex., 37 ° C), som kan minimeras genom ruvning biofilm tillväxten vid lägre temperaturer (t.ex., 30 ° C), samt datorprogram som orsakar uppdateringar av operativsystemet eller blått ljus filtrering under natten tillväxt (tabell 1). Det är också viktigt att notera att, beroende på projektorn och inkubatorn modell används, det är också möjligt att värme som alstras från projektorn kommer att resultera i en högre invändig temperatur än inkubatorn inställd temperatur, som kan behöva korrigeras.
Den kritiska delen av avsnitt 3 är att erhålla pålitliga och repeterbara bakteriell prover innan de induceras av belysning. Av denna anledning rekommenderas att erhålla klonal kolonier av Misterrayban1-Ag43 bakterier genom strimmor ut dem på en agarplatta och sedan använda flytande kultur stegen så att bakterierna är upplyst/inducerad på sena exponentiella tillväxtfasen i en repeterbar sätt.
Slutligen, den kritiska delen av avsnitt 4 är att grundligt, men också försiktigt, tvätta bort de plankton cellerna som återstår efter den biofilm som mönstring av protokollet. Således, det rekommenderas att utföra flera steg i milda skölj med PBS.
Jämfört med befintliga tekniker för cell mönster5,har6, optisk biofilm mönstring utifrån Misterrayban1-Ag43 en rimligt låg barriär av posten att använda, eftersom det inte kräver mikrofabrikation, renrum faciliteter, komplex kemi, eller ytans förbehandling, ännu är fortfarande kunna mönster med hög upplösning (25 μm) vanligtvis förknippas med mikrofabrikation tekniker. Metoden omfattar tidigare arbete på bakteriell photolithography för att styra gen uttryck17. För närvarande är Misterrayban1-Ag43 plasmid begränsad till E. coli, som den använder en pUC-baserade ursprunget för replikering, men Misterrayban1 och Ag43 är båda kompatibla i andra (gramnegativa) bakteriearter. Genetiska tekniker finns tillgängliga för att eventuellt införa ljus-reglerade biofilm bildning till olika bakteriearter och representerar en möjlig riktning för framtida forskning. En annan potentiell begränsning av tekniken är att det fungerar genom att öka biofilm bildning i stammar med svag infödda biofilm bildning (t.ex., MG1655 E. coli). Stammar med starka inhemska biofilm bildning har dock biofilmer form oavsett belysning villkor, utgör hinder för mönstrade biofilm bildning med Misterrayban1-Ag43 som beskrivs här; optogenetic tekniker kan ändå fortfarande bevisa tillämpliga reglera biofilm bildning. Vi noterar att alternativa metoder för biofilm mönstring i andra sammanhang, kan vara tillgängliga, till exempel via optisk c-di-GMP modulering18.
Sammantaget Misterrayban1-Ag43 baserat mönster kommer att vara lämpliga för användning i applikationer som undersöka effekten av biofilm struktur på funktion1 , och därför kunde dra nytta avstämbara kontroll över biofilm mallning — en särskilt relevant exempel för att belysa är studiet av mikrobiell ekologi i biofilmer2. Framtida inriktningar inkluderar att göra mönstrade biomaterial8,9 eller strukturerad bakteriesamhällen. Alternativa tillämpningar av detta tillgängligt protokoll inkluderar även bio-art19, med tanke på den tydliga estetiska potential, samt formella och informella life science utbildning20,21,22. Ur ett pedagogiskt perspektiv, protokollet beskrivs här kombinerar många relevanta tekniker (bakterieodling, transformation, optik/optogenetik) och är också modulärt utdragbara (t.ex., inkluderar mikrofluidik).
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar D. glas, H. Kim, N. Cira, A. Choksi, S. Rajan och B. nycklar för deras användbara förslag och Spormann lab för tillgång till deras confocal mikroskopet. Dessutom erkänner författarna stöd från Stanford Bio-X Bowes och NSERC PGS stipendier, National Institute of Health (R21-AI-139941), och American Cancer Society (RSG-14-177-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
| MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center - Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
| RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
| LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
| Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
| Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
| M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
| Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
| Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
| Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
| 6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
| PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
| 1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
| Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
| Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
| Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
| Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
| Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
| Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
| Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
| Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
| 1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
| 1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
| Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
| Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
| Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture |
| Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
| Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Christensen, B. B., Haagensen, J. A. J., Heydorn, A., Molin, S. Metabolic commensalism and competition in a two-species microbial consortium. Applied and environmental microbiology. 68 (5), 2495-2502 (2002).
- Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Ohlendorf, R., Vidavski, R. R., Eldar, A., Moffat, K., Möglich, A. From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression. Journal of Molecular Biology. 416 (4), 534-542 (2012).
- Xu, T., et al. Construction of high-density bacterial colony arrays and patterns by the ink-jet method. Biotechnology and Bioengineering. 85 (1), 29-33 (2004).
- Gu, H., Hou, S., Yongyat, C., Detore, S., Ren, D. Patterned Biofilm Formation Reveals A Mechanism for Structural Heterogeneity in Bacterial Biofilms. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 29 (35), 11145-11153 (2013).
- Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 64 (4), 847-867 (2000).
- Nguyen, P. Q., Botyanszki, Z., Tay, P. K. R., Joshi, N. S. Programmable biofilm-based materials from engineered curli nanofibres. Nature Communications. 5, 4945 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13, 515-523 (2014).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. New York, NY. (2010).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experiments. 47, e2437 (2011).
- JoVE Science Education Database. Bioengineering. Soft Lithography. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Huang, Y., Xia, A., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Kac, E. Signs of Life: Bio Art and Beyond. , MIT Press. Cambridge, MA. (2007).
- Lee, S. A., et al. Trap it!: A Playful Human-Biology Interaction for a Museum Installation. Proceedings of the 33rd Annual ACM Conference on Human Factors in Computing Systems. , 2593-2602 (2015).
- Cira, N. J., et al. A Biotic Game Design Project for Integrated Life Science and Engineering Education. PLOS Biology. 13 (3), e1002110 (2015).
- Bybee, R. W. The next generation science standards and the life sciences. Science and Children. 50 (6), 7 (2013).
