Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

سباتيوتيمبورالي الخاضعة لسيطرة النووية إزفاء من الضيوف في الخلايا الحية باستخدام الغراء الجزيئية محبوس كالعلامات فوتواكتيفاتابل

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/58631
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, University of Tokyo, 2Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

ويصف هذا البروتوكول إزفاء النووية آثار خفيفة للضيوف في الخلايا الحية باستخدام العلامات الغراء الجزيئية محبوس. هذا الأسلوب واعدة لإيصال الأدوية النووية الاستهداف الانتقائي الموقع.

Abstract

نواة الخلية واحدة من العضيات الأكثر أهمية كهدف إيصال الأدوية سوبسيلولار، منذ التحوير الجيني النسخ المتماثل والتعبير فعالة لعلاج الأمراض المختلفة. هنا، علينا أن نبرهن إزفاء النووية آثار خفيفة للضيوف استخدام قفص العلامات الجزيئية الغراء (قفصالغراء-R)، الذين المعلقات أيون (قو+) جوانيدينيوم متعددة محمية بواسطة جماعة فوتوكليفابل أنيونى (butyrate محل نيتروفيراتريلوكسيكاربونيل؛ مكتبة الإسكندرية نفوك). يجري تناول الضيوف الموسومة محبوسالغراء-R في المعيشة الخلايا عن طريق الالتقام، وتبقى في اندوسوميس. ومع ذلك، عند فوتويرادييشن، يتم تحويل محبوسالغراء-R في أونكاجيد الجزيئية الغراء (الغراءUncaged-R) تحمل المعلقات قو+ متعددة، مما يسهل الهروب اندوسومال وازفاء النووية اللاحقة للضيوف. هذا الأسلوب واعدة بالنسبة للموقع انتقائية النووية تستهدف إيصال المخدرات، حيث يمكن ترحيل الضيوف كلمات داخل السيتوبلازم متبوعاً بنواة الخلية فقط عندما فوتويرادياتيد. قفص يمكن تسليم العلامات الغراء-R الضيوف الجزيئات مثل نقاط الكم (قدس) فضلا عن الضيوف جزيء صغير. قفص يمكن أن تكون العلامات الغراء-R أونكاجيد مع الأشعة فوق البنفسجية ليس فقط ولكن أيضا الضوء اثنين-فوتون (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء، والتي يمكن اختراق عميق في الأنسجة.

Introduction

نواة الخلية، التي تحمل المعلومات الوراثية، واحدة من العضيات الأكثر أهمية كهدف إيصال الأدوية سوبسيلولار، منذ التحوير الجيني النسخ المتماثل والتعبير فعالة لعلاج الأمراض المختلفة بما في ذلك السرطان والوراثية اضطرابات1،،من23. النووية تسليم المخدرات، وتصريف الببتيد العلامات مثل التعريب النووية إشارات (NLS)4،،من56 تم التحقيق على نطاق واسع. ومع ذلك، بغية الحد من الآثار الجانبية غير المرغوب فيها، مراقبة الزمانية المكانية لنقل جسد النووية ضروري.

سابقا، أحرز إزفاء آثار خفيفة من البروتينات في نواة الخلية باستخدام قفص NLS7،،من89. وترحيل NLS في نواة الخلية بالربط بالنقل هيولى البروتينات6. في أساليب الإبلاغ عنها، هي مباشرة أدمج السيتوبلازم microinjection8 ضيف بروتينات تحمل NLS محبوس أو المعرب عنها في الخلايا المستهدفة باستخدام تقنية توسيع الشفرة الجينية9. ولذلك، أسلوب الذي يمكن أن يحقق الإقبال على الهاتف الخلوي والمستحثه بالصورة النووية إزفاء مفيداً للتطبيقات العملية.

هنا، يمكننا وصف إزفاء النووية آثار خفيفة للضيوف في الخلايا الحية باستخدام العلامات الجذعية الغراء الجزيئية محبوس (محبوسالغراء-R، الشكل 1). الالتصاق الجزيئية للذوبان في الماء10،11،12،13،14،15،16،،من1718 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 واضعة متعددة قو+ المعلقات سابقا ووضعت أحكام التي تلتزم بالبروتينات11،،من1213،،من1415، 16،17والأحماض النووية18،،من1920و الأغشية فسفوليبيد21وطين نانوشيتس22،23 من خلال تشكيل جسور الملح متعددة بين المعلقات قو+ والجماعات أوكسيانيونيك على الأهداف. المعلقات قو+ آر الغراء محبوسمحمية بجماعة فوتوكليفابل أنيونى، الاستعاضة عن بوتيرات نيتروفيراتريلوكسيكاربونيل (بانفوك). يجري تناول الضيوف الموسومة محبوسالغراء-R في المعيشة الخلايا عن طريق الالتقام وإقامتهم في اندوسوميس (الشكل 2). عند فوتويرادييشن، يتم فصل مجموعات نفوك با محبوسالغراء-R العائد أونكاجيد جزيئية غراء (Uncagedالغراء-R) تحمل المعلقات قو+ متعددة، مما يسهل الهجرة الضيف المعلمة ثم في السيتوبلازم متبوعاً بنواة الخلية (الشكل 2). يمكن أن تكون العلامة الغراء-R محبوسأونكاجيد بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية أو اثنين-فوتون الضوء (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء دون لالضيائيه خطيرة. ونحن تثبت تسليم النووية الخاضعة للرقابة سباتيوتيمبورالي الجزيئات الضيوف، فضلا عن الضيوف جزيء صغير محبوسالغراء-R به، مع استخدام نقاط الكم (قدس) وصبغة فلورسنت (نيتروبينزوكساديازولي؛ بنك دبي الوطني)، على التوالي، كأمثلة.

Figure 1
الشكل 1: الهياكل التخطيطي محبوسالغراء-ر. المعلقات أيون (قو+) جوانيدينيوم 9 من الغراء محبوس-R محمية بمجموعة نيتروفيراتريلوكسيكاربونيل محل butyrate (بانفوك). هي مجموعات نفوك باالمشقوق التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية أو اثنين-فوتون ضوء الجرد. هو فونكتيوناليزيد جوهر محبوسالغراء-R التنسيق مع نيتروبينزوكساديازولي (دبي) أو ديبينزوسيلوكتيني (دبكو). طبع بإذن من المرجع20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: توضيح التخطيطي لتشغيل ضوء النووية إزفاء الضيوف مترافق مع علامة غراء-R محبوس. الضيف/هو تناول المتقارن الغراء-Rمحبوسفي المعيشة الخلايا عن طريق الالتقام. عند فوتويرادييشن، علامة الغراء-R محبوسأونكاجيد أن تسفر عن علامة غراء-R Uncaged، التي يمكن أن تسهل هروب اندوسومال الضيف المعلمة. وفي وقت لاحق، ترحيل الضيف المعلمة إلى نواة الخلية. طبع بإذن من المرجع20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد الضيوف مع قفصالغراء-R والعلامات

  1. إعداد حل الغراء-بنك دبي الوطني محبوس.
    1. توليف محبوسالغراء-دبي (الشكل 1) اتباع الإجراءات الموصوفة سابقا20.
    2. إعداد حل أسهم من محبوسالغراء-دبي (10 مم) في الجافة ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]).
      ملاحظة: تخزين حل الأسهم في الظلام. يمكن أن تضعف الحل مع المخازن المؤقتة مائي أو خلية ثقافة الإعلام عند الاستخدام.
  2. إعداد حل الغراء-QD محبوس.
    1. توليف محبوسالغراء-ديبينزوسيلوكتيني (محبوسالغراء-دبكو) (الشكل 1) ووصف الإجراءات التالية قبل20.
    2. إعداد حل أسهم من محبوسالغراء-دبكو (10 مم) في [دمس] جافة.
    3. لإعداد محبوسالغراء-QD، أولاً بإعداد فونكتيوناليزيد أزيد قدس (أزيد-QD؛ الشكل 3). إضافة 100 ميليلتر للتوصل إلى حل ثنائي ميثيل ميثلامين (DMF، 125 ميكرومتر) إستر أزيد--PEG4--دائرة الصحة الوطنية (الشكل 3) إلى 400 ميليلتر من DMF (500 nM) حل نقاط الكم (قدس) مغلفة بشماعة فونكتيوناليزيد أمين (أمين-QD؛ الشكل 3). يقلب الخليط ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    4. دياليزي الحل الناتجة عن ح 24 ضد 800 مل DMF استخدام غشاء السليولوز المجددة مع وقف إنتاج المواد الانشطارية الوزن الجزيئي 3,500 (موكو).
    5. تمييع الحل الأسهم من الغراء محبوس-دبكو إلى 50 ميكرومتر مع DMF. إضافة 200 ميليلتر من الحل إلى الحل بعد انتهاء الغسيل الكلوي (الشكل 3) ويقلب المخلوط ح 3 في درجة حرارة الغرفة.
    6. دياليزي الحل الناتجة عن ح 24 ضد 800 مل DMF استخدام غشاء السليولوز المجددة (موكو 25,000).
    7. تمييع الحل الناتجة إلى 200 نانومتر مع DMF.

Figure 3
الشكل 3: رسم توضيحي التخطيطي لإعداد محبوسالغراء-QD- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2-إعداد نموذج الخلية Hep3B للملاحظات المجهرية

  1. الحفاظ على البشرية سرطانه الخلية الكبدية Hep3B الخلايا في متوسطة النسر الأساسية الحد الأدنى (اللور) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.
  2. بذور الخلايا في اليوم قبل التجربة. بذور 5.0 × 103 Hep3B الخلايا كل بئر الركازة 8 غرف زجاجية في اللور (10% FBS، 200 ميليلتر)، واحتضان العينة الخلية عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 ل 24 ساعة.
  3. إزالة متوسط الثقافة وشطف العينة الخلية مع 100 ميليلتر من الفوسفات المالحة دولبيكو المخزن المؤقت (د-برنامج تلفزيوني) مرتين.

3-المراقبة النووية إزفاء الضيوف الجزيئات الصغيرة الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية

  1. توريد خلية العينة (أعد الخطوة 2.3) مع 200 ميليلتر من اللور مجاناً FBS تتضمن محبوسالغراء، بنك دبي الوطني (10 ميكرون) واحتضان العينة الخلية الناتجة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 لح 3.
    ملاحظة: الحضانة للعينة الخلية في اللور خالية من FBS لمدة أطول من 4 ح يتسبب في أضرار خطيرة خلية.
  2. إزالة متوسط الثقافة وشطف العينة الخلية مع 100 ميليلتر من د-برنامج تلفزيوني مرتين.
  3. للتصور، اندوسوميس وتوريد نموذج الخلية مع 200 ميليلتر من اللور (10% FBS) التي تحتوي على صبغة الفلورسنت الأحمر (مثلاً، ليسوتراكير الأحمر، 100 nM)، واحتضان العينة الخلية الناتجة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 ل 20 دقيقة إزالة الثقافة المتوسطة، وشطف العينة الخلية مع 100 ميليلتر من د-برنامج تلفزيوني مرتين. توفير نموذج الخلية مع 200 ميليلتر من اللور (10% FBS).
  4. للنووية إزفاء من محبوسالغراء، بنك دبي الوطني، تعرض العينة خلية للأشعة فوق البنفسجية الخفيفة ل 2 دقيقة عن طريق ألياف الضوئية باستخدام مصدر ضوء زينون 100-ث مزودة بفلتر ممر الموجه 365 نانومتر. لمرجع خلية عينة دون التعرض للأشعة فوق البنفسجية، تبقى عينة خلية في الظلام.
    ملاحظة: يمكن اتخاذها الغطاء لركائز الزجاج لكفاءة التعرض للأشعة فوق البنفسجية. قد يسبب التعرض طويل الأجل للأشعة فوق البنفسجية سيتوتوكسيسيتي للخلايا.
  5. لتصور الأنوية، إضافة 1 ميليلتر من هويشت 33342 (1 ملغ/مل) إلى متوسط الثقافة، واحتضان العينة الخلية الناتجة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 لمدة 10 دقائق.
  6. رهنا بعينه خلية [كنفوكل] ليزر المسح المجهري وتسجيل ميكروجرافس على الإثارة في 488 نانومتر (λobs = 500-530 نانومتر)، 543 نانومتر (λobs = 565-620 نيوتن متر)، و 710 نانومتر (اثنين-فوتون؛ Λ obs = 390 465 nm) لبنك دبي الوطني والصبغ الأحمر نيون هويشت 33342، على التوالي.

4-المراقبة النووية إزفاء الضيوف الجزيئات الصغيرة الناجمة عن نير اثنين-فوتون الضوء

  1. توريد خلية العينة (أعد الخطوة 2.3) مع 200 ميليلتر من اللور مجاناً FBS تتضمن محبوسالغراء، بنك دبي الوطني (10 ميكرون) واحتضان العينة الخلية الناتجة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 لح 3.
  2. إزالة متوسط الثقافة وشطف العينة الخلية مع 100 ميليلتر من د-برنامج تلفزيوني مرتين. توفير نموذج الخلية مع 200 ميليلتر من اللور (10% FBS).
  3. رهنا بعينه خلية [كنفوكل] ليزر المسح المجهري وتسجيل ميكروجرافس على الإثارة في 488 نانومتر (λobs = 500-530 نانومتر).
  4. للنووية إزفاء من محبوسالغراء، بنك دبي الوطني، يتهددها المنطقة بما في ذلك خلية اهتمام بليزر إثارة اثنين-فوتون (710 nm)، والمثبتة كمصدر ضوء في المجهر، لمدة 2 دقيقة (30 ثانية × 4). مراقبة نقل جسد كما هو موضح في الخطوة 4، 3.

5-المراقبة النووية إزفاء الضيوف الجزيئات الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية

  1. توريد خلية العينة (أعد الخطوة 2.3) مع 200 ميليلتر من اللور مجاناً FBS تتضمن محبوسالغراء-QD (10 نانومتر)، واحتضان العينة الخلية الناتجة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 لح 3.
  2. إزالة متوسط الثقافة وشطف العينة الخلية مع 100 ميليلتر من د-برنامج تلفزيوني مرتين. توفير نموذج الخلية مع 200 ميليلتر من اللور (10% FBS).
  3. للنووية إزفاء من الغراء محبوس-QD، تعرض العينة خلية للأشعة فوق البنفسجية الخفيفة ل 2 دقيقة عن طريق ألياف الضوئية باستخدام مصدر ضوء زينون 100-ث مزودة بفلتر ممر الموجه 365 نانومتر. لمرجع خلية عينة دون التعرض للأشعة فوق البنفسجية، تبقى عينة خلية في الظلام.
  4. لتصور الأنوية، إضافة 1 ميليلتر من هويشت 33342 (1 ملغ/مل) إلى متوسط الثقافة، واحتضان العينة الخلية الناتجة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 لمدة 10 دقائق.
  5. رهنا بعينه خلية [كنفوكل] ليزر المسح المجهري وتسجيل ميكروجرافس على الإثارة في 405 نانومتر (λobs = 430-520 nm) و 488 نانومتر (λobs = 625-680 نانومتر) هويشت 33342 وقدس، على التوالي.

6-خلية جدوى الفحص

  1. الحفاظ على البشرية سرطانه الخلية الكبدية Hep3B الخلايا في اللور (10% FBS) عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.
  2. بذور الخلايا في اليوم قبل التجربة. بذور 5.0 × 103 Hep3B خلايا كل من لوحة الثقافة 96-جيدا في اللور جيدا (10% FBS، 200 ميليلتر)، واحتضان العينة الخلية عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 ل 24 ساعة.
  3. إزالة متوسط الثقافة وشطف العينة الخلية مع 100 ميليلتر من د-برنامج تلفزيوني مرتين.
  4. توفير نموذج الخلية مع 200 ميليلتر من اللور مجاناً FBS تتضمن محبوسالغراء-بنك دبي الوطني (0.1-100 ميكرومتر) واحتضان العينة الخلية الناتجة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 لح 3.
  5. يعرض عينة خلية للأشعة فوق البنفسجية ل 2 دقيقة عن طريق ألياف الضوئية باستخدام مصدر ضوء زينون 100-ث مزودة بفلتر ممر الموجه 365 نانومتر. لنموذج خلية مماثلة دون التعرض للأشعة فوق البنفسجية، تبقى عينة خلية في الظلام.
  6. إضافة 10 ميليلتر لخلية العد كيت-8 كاشف (10 ميليلتر) إلى متوسط الثقافة واحتضان العينة الخلية الناتجة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 لح 2.
  7. رهنا بعينه خلية مطيافية الامتصاص (λ = 450 nm) باستخدام قارئ ميكروسكوبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قبل فوتويرادييشن، Hep3B الخلايا المحتضنة مع محبوسالغراء-بنك دبي الوطني معارضها fluorescence الشروريه الانبعاثات من تلك الداخلية (λext = 488 نانومتر؛ الأرقام 4A ج 4، الخضراء). تم الحصول عليها صورة مجهرية مماثلة عند الإثارة في 543 نانومتر للصبغ الأحمر نيون (الأرقام 4B و ج 4، الأحمر)، مشيراً إلى أنه محبوسالغراء-بنك دبي الوطني مترجمة في اندوسوميس. وبناء على ذلك، لوحظ انبعاث fluorescence الإحالة إلى محبوسالغراء، بنك دبي الوطني (الشكل 4، الأخضر) خارج نواة الخلية، التي كانت تصور مع هويشت 33342 (λext = 710 نانومتر، اثنين-فوتون؛ الرقم 4، الأزرق). بعد إشعاع الأشعة فوق البنفسجية، الأسفار الخلايا تنبعث نظراً لبنك دبي الوطني (4E الشكل، الأخضر) أيضا من النواة (4E الشكل، زرقاء)، مما يوحي بأنه محبوسالغراء-بنك دبي الوطني أونكاجيد الغلة Uncagedالغراء، بنك دبي الوطني، التي هاجرت إلى السيتوبلازم متبوعاً بنواة الخلية. يمكن الناجمة عن نقل النووي مثل جسد محبوسالغراء-بنك دبي الوطني انتقائية الموقع قبل يومين-فوتون الضوء نير (الشكل 5A و 1 الفيلم، دائرة بيضاء متقطع). كما هو موضح في الشكل 5 (ب) و الفيلم 1، محبوسالغراء-بنك دبي الوطني في مجالات نونيرادياتيد لم ينج من اندوسوميس وظلت الأسفار الشروريه. وقد لوحظ لا سيتوتوكسيسيتي ملموس للخلايا تعامل مع محبوسالغراء-بنك دبي الوطني قبل وحتى بعد التعرض الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 6).

يمكن تسليم العلامات الغراء-R محبوسأيضا الضيوف الجزيئات مثل قدس إلى نواة الخلية. QDمحبوسالمتقارن الغراء-R (محبوسالغراء-QD، الشكل 3) يمكن أن يؤخذ إلى خلايا Hep3B (الشكل 7 أ). التصور لنواة الخلية مع هويشت 33342 يبين أنه محبوسالغراء-QD لا تزال خارج النواة قبل فوتويرادييشن (الشكل 7 أ). بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 دقيقة، ظهرت انبعاث الأسفار قدس في النواة (7B الأرقام وج 7). صورة مقطعية للخلايا أظهرت أن انبعاث fluorescence الإحالة إلى قدس بل ينبعث من داخل النواة (الشكل 7).

Figure 4
الشكل 4: الهروب اندوسومال والنووية إزفاء من الغراء محبوس-دبي سببها الأشعة فوق البنفسجية- [كنفوكل] ليزر المسح ميكروجرافس الخلايا Hep3B بعد 3-ح الحضانة عند 37 درجة مئوية في اللور تتضمن محبوسالغراء، بنك دبي الوطني (10 ميكرون) تليها الشطف مع د-برنامج تلفزيوني. (أ) (ب) سجلت ميكروجرافس على الإثارة في (أ) 488 نانومتر (λobs = 500-530 نانومتر، الأخضر) و (ب) 543 نانومتر (λobs = 565-620 نانومتر، أحمر) بعد 20 دقيقة حضانة في اللور (10% FBS) المحتوية على الصبغ الأحمر نيون (100 نانومتر) . (ج) صورة ممزوج من (أ) و (ب). (د، ه) سجلت ميكروجرافس على الإثارة في 488 نانومتر (λobs = 500-530 نانومتر، الأخضر) و 710 نانومتر (اثنين-فوتون؛ Λ obs = 390-465 شمال البحر الأبيض المتوسط، الأزرق). الخلايا Hep3B، تعامل مع محبوسالغراء، بنك دبي الوطني، كانت المحتضنة في 37 درجة مئوية في اللور (10% FBS) التي تتضمن هويشت 33342 (5 ميكروغرام/مل) قبل (د) وبعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية 2-مين (ه) في 365 نانومتر. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. Reprinted بإذن من المرجع20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: النووية إزفاء من محبوسالغراء-دبي سببها ضوء الجرد اثنين-فوتون- [كنفوكل] ليزر المسح ميكروجرافس الخلايا Hep3B بعد 3-ح الحضانة عند 37 درجة مئوية في اللور تتضمن محبوسالغراء، بنك دبي الوطني (10 ميكرون) تليها الشطف مع د-برنامج تلفزيوني. وسجلت ميكروجرافس على الإثارة في 488 نانومتر (λobs = 500-530 نانومتر) قبل (أ) وبعد (ب) اثنين-فوتون الإشعاع في 710 شمال البحر الأبيض المتوسط لمدة 2 دقيقة (30 ثانية × 4). الدائرة البيضاء المتقطعة في (أ) يمثل منطقة المشع. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. Reprinted بإذن من المرجع20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: خلية بقاء المقايسة. فيابيليتيس الخلايا Hep3B بعد حضانة في اللور تتضمن محبوسالغراء، بنك دبي الوطني (0.1-100 ميكرومتر) قبل (أ) وبعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية 2-مين (ب) في 365 نانومتر. طبع بإذن من المرجع20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7: النووية إزفاء من الغراء-QD محبوسسببها الأشعة فوق البنفسجية- [كنفوكل] ليزر المسح ميكروجرافس الخلايا Hep3B على الإثارة في 405 نانومتر (λobs = 430-520 nm) و 488 نانومتر (λobs = 625-680 nm). كانت المحتضنة الخلايا Hep3B في 37 درجة مئوية ح 3 في اللور التي تحتوي على الغراء محبوس-QD (10 نانومتر) وتشطف مع د-برنامج تلفزيوني، وثم المحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في اللور (10% FBS) التي تتضمن هويشت 33342 (5 ميكروغرام/مل) قبل (أ) وبعد (ب، ج) 2-مين التعرض للأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في 365 نانومتر. (د) صورة مقطعية على طول الخط الأصفر في (ج). تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. Reprinted بإذن من المرجع20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Movie
فيلم 1. إزفاء النووية من محبوسالغراء-بنك دبي الوطني سببها ضوء الجرد اثنين-فوتون- ليزر [كنفوكل] الوقت الفاصل بين المسح المجهري للخلايا Hep3B بعد 3-ح الحضانة عند 37 درجة مئوية في اللور تتضمن محبوسالغراء، بنك دبي الوطني (10 ميكرون) تليها الشطف مع د-برنامج تلفزيوني. وسجلت ميكروجرافس مع فواصل 3-s على الإثارة في 488 نانومتر (λobs = 500-530 نانومتر). كانت المشع الخلايا الموجودة في الدائرة البيضاء المتقطعة مع الجرد اثنين-فوتون الضوء على 710 شمال البحر الأبيض المتوسط لمدة 2 دقيقة (30 ثانية × 4). طبع بإذن من المرجع20. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد تحققت التحقيقات السابقة من إزفاء آثار خفيفة من البروتينات في نواة الخلية باستخدام قفص NLS7،،من89. وكما ذكر آنفا، هذه الأساليب تتطلب تقنيات إضافية دمج البروتينات معلم NLS في السيتوبلازم. على النقيض من ذلك، يتيح لنا العلامة الغراء-R محبوسإزفاء النووية المستحثة بالصورة ليس فقط، بل أيضا استيعاب الخلوية للضيوف. هذه الميزة للعلامة الغراء-R محبوسمفيد للتطبيقات في فيفو .

يمكن تقديم العلامة الغراء-R محبوسالضيوف الجزيئات مثل قدس إلى نواة الخلية. قدس المستخدمة هنا أكبر في القطر (دح = 15-20 نانومتر) من المسام النووية (~ 5 نانومتر)24، مما يوحي بإمكانية تسليم الجزيئات الكبيرة الأخرى التي لا يمكن نزع فتيل سلبية إلى النواة. بروتوكولات الروغان سطوح بيوماكروموليكولار مع مجموعات أزيد هي راسخة25؛ وباﻹضافة إلى ذلك، العلامات توليف للعلامات الغراء-R محبوسإذ تضع المجموعات الوظيفية الأخرى مثل ماليميديس، وإسترات N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS)، وهكذا كما سيتم توسيع وحدة لترسيخ انطباق محبوسالغراء-البحث والتطوير في مختلف بيوماكروموليكوليس.

وغني عن القول، أن الخطوة الحاسمة لهذا الأسلوب هو إدراج الضيوف الموسومة محبوسالغراء-البحث والتطوير عن طريق الالتقام. كفاءة امتصاص الخلوية للضيوف المعلمة يعتمد على تركيزهم وفترة حضانة المرض. إذا كان ضيوف اهتمام، عند معلم مع محبوسالغراء-R، المبتلعة غير فعالة، احتضان الخلايا وقتاً أطول مع تركيز أعلى من كلمات الضيوف. بديل محتمل زيادة عدد محبوسالغراء-R أدرجت في الضيف.

تساهمي هي مترافق الضيوف المستخدمة في هذا البروتوكول إلى العلامة الغراء-R محبوس. هذا عيب محتمل خاصة بالنسبة لتسليم يغاندس جزيء صغير، قد أعاق تجليدها للجزيئات الحيوية المستهدفة بالعلامة الجذعية ضخمة. قد يسمح إدماج رابط تستجيب للمنبهات26 بين العلامة محبوسالغراء-R والجزيء الضيف الإفراج عن الضيوف بعد إزفاء النووية.

وباختصار، أثبتنا إزفاء النووية آثار خفيفة للضيوف استخدام العلامات الجزيئية الغراء (محبوسالغراء-R) فوتواكتيفاتابل محبوس. يجري تناول الضيوف الموسومة محبوسالغراء-R في المعيشة الخلايا عن طريق الالتقام والبقاء في اندوسوميس. عند فوتويرادييشن، يتم تحويل محبوسالغراء-R إلى Uncagedالغراء-R، مما يسهل الهروب اندوسومال وازفاء النووية اللاحقة للضيوف. مزيد من الملاحظات منذ فترة طويلة قد تكون هامة للتحقيق في مصير الضيوف التي لا تزال في اندوسوميس فضلا عن تلك التي سلمت إلى نواة الخلية. التعبير الجيني سباتيوتيمبورالي الخاضعة للمراقبة باستخدام العلامات الغراء-R محبوسموضوع اهتمام تستحق مزيدا من التحقيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونعترف المركز "التكامل نانوبيو"، وجامعة طوكيو. هذا العمل كان يدعمها معونات للشباب العلماء (ب) (26810046) إلى كو ودعمها جزئيا من معونات "بحوث الترويج خصيصا" (25000005) إلى "جمهورية مقدونيا يأتون" بفضل "الزمالات البحثية من الجمعية اليابانية" لتعزيز العلوم (JSPS ) للعلماء الشباب وبرنامج المدارس الرائدة في الدراسات العليا (جبلي).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azide-PEG4-NHS ester Click Chemistry Tools AZ103
Q-dot 655 ITK Invitrogen Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) NIPPON Genetics TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) Harvard Apparatus 7425-RC25K
Hep3B Cells ATCC HB-8064
8-chambered glass substrate Nunc 155411JP
96-well culture plate Nunc 167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM) Thermo Fisher Scientific 10370-021
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) Wako Pure Chemical Industries 045-29795
LysoTracker Red Lonza Walkersville PA-3015
Hoechst 33342 Dojindo H342
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Confocal laser scanning microscope Carl-Zeiss LSM 510 Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8
Xenon light source Asahi Spectra LAX-102
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax Paradigm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
  2. Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
  3. Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
  4. Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
  5. Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
  6. Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
  7. Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
  8. Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
  9. Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
  10. Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
  11. Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
  12. Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
  13. Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
  14. Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
  15. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
  16. Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
  17. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
  18. Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
  19. Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
  20. Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
  21. Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
  22. Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
  23. Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
  24. Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
  25. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Tags

الكيمياء، 143 قضية، غراء الجزيئية، فوتواكتيفيشن، ونواة الخلية، الهروب اندوسومال، النووية إزفاء، الإثارة اثنين-فوتون، نقاط الكم
سباتيوتيمبورالي الخاضعة لسيطرة النووية إزفاء من الضيوف في الخلايا الحية باستخدام الغراء الجزيئية محبوس كالعلامات فوتواكتيفاتابل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A.,… More

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter