Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Spatiotemporally kontrolleret nuklear translokation af gæster i levende celler ved hjælp af bur molekylære lim som Photoactivatable Tags

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/58631
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, University of Tokyo, 2Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Denne protokol beskriver lys-udløst nukleare translokation af gæster i levende celler ved hjælp af bur molekylære lim tags. Denne metode er lovende for site-selektiv nukleare målrette medicinafgivelse.

Abstract

Cellekernen er en af de vigtigste organeller som subcellulært medicinafgivelse mål, siden graduering af genet replikering og udtryk er effektiv til behandling af forskellige sygdomme. Her, viser vi lys-udløst nukleare translokation af gæster, der benytter bur molekylære lim (burlim-R) tags, hvis flere guanidinium ion (Gu+) vedhæng er beskyttet af en anioniske photocleavable gruppe (butyrat-substituerede nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gæsterne markeret med Cagedlim-R er taget i levende celler via endocytose og forblive i endosomes. Dog ved photoirradiation, er Cagedlim-R omdannet til uncaged molekylære lim (Uncagedlim-R) transporterer flere Gu+ vedhæng, som letter endosomal flugt og efterfølgende nukleare translokation af gæsterne. Denne metode er lovende for site-selektiv nukleare målrette medicinafgivelse, da de mærkede Gæster kan migrere ind i cytoplasmaet efterfulgt af cellekernen kun når photoirradiated. Bur Lim-R tags kan levere makromolekylære gæster såsom quantum dots (QDs) samt små-molekyle gæster. Bur Lim-R tags kan være uncaged med UV-lys, men også to-foton nær-infrarødt (NIR) lys, der kan trænge dybt ind i vævet.

Introduction

Cellekernen, der bærer genetisk information, er en af de vigtigste organeller som subcellulært medicinafgivelse mål, siden graduering af genet replikering og udtryk er effektiv til behandling af forskellige sygdomme herunder kræft og genetiske lidelser1,2,3. For nukleare leveringen af narkotika, konjugation af peptid tags som nukleare lokalisering signaler (NLS)4,5,6 har været bredt undersøgt. Men for at reducere uønskede bivirkninger, spatiotemporelle kontrol af den nukleare translokation er nødvendigt.

Tidligere, lys-udløst translokation af proteiner i cellekernen er opnået ved hjælp af bur NLS7,8,9. NLS vandrer ind i cellekernen ved binding til cytoplasmatisk transport proteiner6. I de rapporterede metoder, er gæst proteiner forsynet med bur NLS direkte indarbejdet i cytoplasma ved mikroinjektion8 eller udtrykt i target-cellerne bruger en genetiske kode ekspansion teknik9. Derfor, en metode, der kan opnå både cellulære optagelse og foto-induceret nukleare translokation er fordelagtige for praktiske anvendelser.

Heri, beskriver vi lys-udløst nukleare translokation af gæster i levende celler ved hjælp af dendritiske bur molekylære lim (Cagedlim-Rasmussen, figur 1) tags. Vandopløselige molekylære lim10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 forsynet med flere Gu+ vedhæng er tidligere udviklet, som overholder stramt proteiner11,12,13,14,15, 16,17, nukleinsyrer18,19,20, phospholipid membraner21og ler nanosheets22,23 gennem den dannelsen af flere salt broer mellem deres Gu+ vedhæng og oxyanionic grupper på målene. Gu+ vedhæng af Cagedlim-R er beskyttet af en anioniske photocleavable gruppe, butyrat-substituerede nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Gæsterne markeret med Cagedlim-R er taget i levende celler via endocytose og ophold i endosomes (figur 2). Ved photoirradiation, er BANVOC grupper af Cagedlim-R adskilt for at give en uncaged molekylære lim (Uncagedlim-R) transporterer flere Gu+ vedhæng, som derefter letter overførslen af mærket gæsten i cytoplasmaet efterfulgt af cellekernen (figur 2). Cagedlim-R tag kan være uncaged ved udsættelse for UV- eller to-foton nær-infrarødt (NIR) lys uden alvorlige fototoksicitet. Vi demonstrere spatiotemporally kontrolleret nuklear levering af makromolekylære gæster samt små-molekyle gæsterne med Cagedlim-R tags, ved hjælp af quantum dots (QDs) og et fluorescerende farvestof (nitrobenzoxadiazole; NBD), henholdsvis som eksempler.

Figure 1
Figur 1: Skematisk strukturer Cagedlim-r. De 9 guanidinium ion (Gu+) vedhæng af Cagedlim-R er beskyttet af en butyrat-substituerede nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) gruppe. BANVOC grupper er kløvet af bestråling med UV- eller to-foton NIR lys. Fokale kernen i Cagedlim-R er functionalized med enten nitrobenzoxadiazole (NBD) eller dibenzocylooctyne (DBCO). Genoptrykt med tilladelse fra reference20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk illustration af lys-udløst nukleare translokation af gæsterne konjugeret med et Cagedlim-R tag. Gæsten /Cagedlim-R konjugat er taget i levende celler via endocytose. Ved photoirradiation er Cagedlim-R tag uncaged at give en Uncagedlim-R tag, som kan lette endosomal flugt af mærket gæsten. Efterfølgende vandrer tagged gæsten ind i cellekernen. Genoptrykt med tilladelse fra reference20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af gæsterne med burlim-R Tags

  1. Forberede Cagedlim-NBD løsning.
    1. Syntetisere Cagedlim-NBD (figur 1) efter de procedurer tidligere beskrevet20.
    2. Forberede en stamopløsning af Cagedlim-NBD (10 mM) i tørre dimethylsulfoxid (DMSO).
      Bemærk: Opbevar stamopløsningen i mørke. Løsningen kan fortyndes med vandig buffere eller celle Kulturmedier efter forbrug.
  2. Forberede Cagedlim-QD løsning.
    1. Syntetisere Cagedlim-dibenzocylooctyne (Cagedlim-DBCO) (figur 1) følge procedurerne, der tidligere beskrevne20.
    2. Forberede en stamopløsning af Cagedlim-DBCO (10 mM) i tørre DMSO.
    3. Forberedelsen af Cagedlim-QD først forberede indeholder-functionalized QDs (indeholder-QD; Figur 3). Tilsæt 100 µL dimethyl formamid (DMF, 125 µM) løsning af indeholder-PEG4-NHS ester (figur 3) til 400 µL af en DMF (500 nM) løsning af quantum dots (QDs) belagt med Amin-functionalized PIND (Amin-QD; Figur 3). Rør blandingen i 1 time ved stuetemperatur.
    4. Dialyze den resulterende løsning for 24 h mod 800 mL DMF ved hjælp af en celluloseregenerater membran med 3.500 molekylvægt cut-off (MWCO).
    5. Fortynd stamopløsningen af Cagedlim-DBCO til 50 µM med DMF. Tilføje 200 µL af opløsningen til efter dialyse løsning (figur 3) og rør blandingen i 3 timer ved stuetemperatur.
    6. Dialyze den resulterende løsning for 24 h mod 800 mL DMF ved hjælp af en celluloseregenerater membran (25.000 MWCO).
    7. Fortynd den resulterende løsning til 200 nM med DMF.

Figure 3
Figur 3: skematisk illustration af forberedelsen af Cagedlim-QD. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

2. forberedelse af Hep3B celle prøve for mikroskopiske observationer

  1. Vedligeholde menneskelige hepatocellulært carcinom Hep3B celler i Eagle's minimal afgørende medium (Maibritt VITH) som indeholder 10% føtal bovint serum (FBS) ved 37 ° C under 5% CO2.
  2. Frø celler dagen før eksperimentet. Frø 5.0 × 103 Hep3B celler pr. brønd af en 8-chambered glas substrat i Maibritt VITH (10% FBS, 200 µL), og der inkuberes celle prøven ved 37 ° C under 5% CO2 i 24 timer.
  3. Fjerne næringssubstratet og skyl den celle prøve med 100 µL af Dulbeccos fosfat buffer saltvand (D-PBS) to gange.

3. observation af nukleare translokation af små-molekyle gæsterne udløst af UV-lys

  1. Levere den celle prøve (forberedt i trin 2.3) med 200 µL af FBS-fri Maibritt VITH indeholdende Cagedlim-NBD (10 µM) og Inkuber den resulterende celle prøve ved 37 ° C under 5% CO2 til 3 h.
    Bemærk: Inkubation af celle prøven i FBS-fri Maibritt VITH i længere tid end 4 h forårsager alvorlige celleskader.
  2. Fjerne næringssubstratet og skyl den celle prøve med 100 µL af D-PBS to gange.
  3. For visualisering af endosomes, levere den celle prøve med 200 µL af Maibritt VITH (10% FBS) indeholdende et rødt-fluorescerende farvestof (f.eks.LysoTracker rød, 100 nM), og Inkuber den resulterende celle prøve ved 37 ° C under 5% CO2 i 20 min. Fjern kultur medium, og skyl den celle prøve med 100 µL af D-PBS to gange. Levere den celle prøve med 200 µL af Maibritt VITH (10% FBS).
  4. Nukleare translokation af Cagedlim-NBD, udsætte celle prøven for UV-lys for 2 min via en optisk fiber ved hjælp af en 100-W xenon lyskilde udstyret med en 365 nm bandpass filter. For en reference celle prøve uden UV-eksponering, skal du holde eksemplet celle i mørke.
    Bemærk: Låget af glasset substrater kan tages ud for effektiv UV-eksponering. Lang tid eksponering for UV-lys kan forårsage cytotoksicitet til cellerne.
  5. For visualisering af kerner, tilsættes 1 µL af Hoechst 33342 (1 mg/mL) til substratet, og der inkuberes resulterende celle prøven ved 37 ° C under 5% CO2 til 10 min.
  6. Underlagt den celle prøve Konfokal laser scanning mikroskopi og optage micrographs ved excitation på 488 nm (λobs = 500-530 nm), 543 nm (λobs = 565-620 nm), og 710 nm (to-foton; Λ OBS = 390-465 nm) for NBD, rødt-fluorescerende farvestof og Hoechst 33342, henholdsvis.

4. iagttagelse af atomare translokation af små-molekyle gæsterne udløst af to-foton NIR lys

  1. Levere den celle prøve (forberedt i trin 2.3) med 200 µL af FBS-fri Maibritt VITH indeholdende Cagedlim-NBD (10 µM) og Inkuber den resulterende celle prøve ved 37 ° C under 5% CO2 til 3 h.
  2. Fjerne næringssubstratet og skyl den celle prøve med 100 µL af D-PBS to gange. Levere den celle prøve med 200 µL af Maibritt VITH (10% FBS).
  3. Underlagt den celle prøve Konfokal laser scanning mikroskopi og optage micrographs ved excitation på 488 nm (λobs = 500-530 nm).
  4. For nukleare translokation af Cagedlim-NBD, bestråle regionen, herunder celle af interesse med en to-foton excitation laser (710 nm), installeret som en lyskilde i mikroskop, for 2 min (30 s × 4). Observere omplantning, som beskrevet i trin 4.3.

5. observation af nukleare translokation af makromolekylære gæsterne udløst af UV-lys

  1. Levere den celle prøve (forberedt i trin 2.3) med 200 µL af FBS-fri Maibritt VITH indeholdende Cagedlim-QD (10 nM), og Inkuber den resulterende celle prøve ved 37 ° C under 5% CO2 til 3 h.
  2. Fjerne næringssubstratet og skyl den celle prøve med 100 µL af D-PBS to gange. Levere den celle prøve med 200 µL af Maibritt VITH (10% FBS).
  3. Nukleare translokation af Cagedlim-QD, udsætte celle prøven for UV-lys for 2 min via en optisk fiber ved hjælp af en 100-W xenon lyskilde udstyret med en 365 nm bandpass filter. For en reference celle prøve uden UV-eksponering, skal du holde eksemplet celle i mørke.
  4. For visualisering af kerner, tilsættes 1 µL af Hoechst 33342 (1 mg/mL) til substratet, og der inkuberes resulterende celle prøven ved 37 ° C under 5% CO2 til 10 min.
  5. Underkaste den celle prøve Konfokal laser scanning mikroskopi og optage micrographs ved excitation ved 405 nm (λobs = 430-520 nm) og 488 nm (λobs = 625-680 nm) for Hoechst 33342 og QDs, henholdsvis.

6. celle levedygtighed Assay

  1. Vedligeholde menneskelige hepatocellulært carcinom Hep3B celler i Maibritt VITH (10% FBS) ved 37 ° C under 5% CO2.
  2. Frø celler dagen før eksperimentet. Frø 5.0 × 103 Hep3B celler pr. brønd af en 96-og kultur plade i Maibritt VITH (10% FBS, 200 µL), og der inkuberes celle prøven ved 37 ° C under 5% CO2 i 24 timer.
  3. Fjerne næringssubstratet og skyl den celle prøve med 100 µL af D-PBS to gange.
  4. Levere den celle prøve med 200 µL af FBS-fri Maibritt VITH indeholdende Cagedlim-NBD (0,1-100 µM) og Inkuber den resulterende celle prøve ved 37 ° C under 5% CO2 til 3 h.
  5. Udsætte celle prøven for UV-lys for 2 min via en optisk fiber ved hjælp af en 100-W xenon lyskilde udstyret med en 365 nm bandpass filter. For en tilsvarende celle prøve uden UV-eksponering, skal du holde eksemplet celle i mørke.
  6. Tilsæt 10 µL celle tælle Kit-8 reagens (10 µL) til substratet og Inkuber den resulterende celle prøve ved 37 ° C under 5% CO2 for 2 h.
  7. Celle prøve med forbehold af absorption spektroskopi (λ = 450 nm) ved hjælp af en mikrotiterplade læser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før photoirradiation, Hep3B cellerne inkuberes med Cagedlim-NBD udstillet punktformet fluorescens emission fra deres indre (λext = 488 nm; Tal 4A og 4 C, grønne). En analog Mikrograf blev fremstillet ved excitation på 543 nm for rødt-fluorescerende farvestof (tal 4B og 4 C, rød), der angiver, at Cagedlim-NBD lokaliseret i endosomes. I overensstemmelse hermed, fluorescens emission kan overdrages til Cagedlim-NBD (figur 4D, grønne) blev observeret cellekerne, hvilket blev visualiseret med Hoechst 33342 (λext = 710 nm, to-foton; Figur 4D, blå). Efter UV-bestråling, celler udsendes fluorescens på grund af NBD (figur 4E, grønne) også fra kernen (figur 4E, blå), hvilket tyder på at Cagedlim-NBD var uncaged til udbytte Uncagedlim-NBD, der overflyttes til cytoplasmaet efterfulgt af cellekernen. Sådanne nukleare translokation af Cagedlim-NBD kan være fremkaldt site-selektivt ved to-foton NIR lys (figur 5A og film 1, hvide stiplede cirkel). Som vist i figur 5B og film 1, Cagedlim-NBD i nonirradiated områder flygte ikke fra endosomes og forblev som punktformet fluorescens. Ingen mærkbar cytotoksicitet blev observeret for de celler, der er behandlet med Cagedlim-NBD før og efter UV-eksponering (figur 6).

Cagedlim-R tags kan også levere makromolekylære gæster såsom QDs i cellekernen. QD /Cagedlim-R konjugat (Cagedlim-QD, figur 3) kan tages i Hep3B celler (figur 7A). Visualisering af cellekernen med Hoechst 33342 angiver, at Cagedlim-QD forbliver uden for nucleus før photoirradiation (figur 7A). Efter UV-eksponering for 2 min opstået fluorescens emission af QDs i kernen (figurer 7B og 7 C). En tværsnits billede af cellerne demonstreret, fluorescens emission kan overdrages til QDs faktisk udledes fra inde i kernen (figur 7 d).

Figure 4
Figur 4: Endosomal flugt og nukleare translokation af Cagedlim-NBD udløst af UV-lys. Konfokal laser scanning micrographs af Hep3B celler efter 3-h inkubation ved 37 ° C i Maibritt VITH indeholdende Cagedlim-NBD (10 µM) efterfulgt af skylning med D-PBS. (A, B) Micrographs blev registreret ved excitation på (A) 488 nm (λobs = 500-530 nm, grønne) og (B) 543 nm (λobs = 565-620 nm, rød) efter 20 min inkubation i Maibritt VITH (10% FBS) indeholdende rødt-fluorescerende farvestof (100 nM) . (C) fusioneret billede af (A) og (B). (D, E) Micrographs indspillet ved excitation på 488 nm (λobs = 500-530 nm, grønne) og 710 nm (to-foton; Λ OBS = 390-465 nm, blå). De Hep3B celler, behandlet med Cagedlim-NBD, blev inkuberet ved 37 ° C i Maibritt VITH (10% FBS) indeholdende Hoechst 33342 (5 µg/mL) før (D) og efter (E) 2-min UV eksponering ved 365 nm. Skalere barer = 20 µm. Reprinted med tilladelse fra reference20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Nukleare translokation af Cagedlim-NBD udløst af to-foton NIR lys. Konfokal laser scanning micrographs af Hep3B celler efter 3-h inkubation ved 37 ° C i Maibritt VITH indeholdende Cagedlim-NBD (10 µM) efterfulgt af skylning med D-PBS. Micrographs blev registreret ved excitation på 488 nm (λobs = 500-530 nm) før (A) og efter (B) to-foton bestråling på 710 nm for 2 min (30 s × 4). Den hvide stiplede cirkel i (A) repræsenterer det bestrålede område. Skalere barer = 20 µm. Reprinted med tilladelse fra reference20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: celle levedygtighed assay. Viabilities af Hep3B celler efter inkubation i Maibritt VITH indeholdende Cagedlim-NBD (0,1-100 µM) før (A) og efter (B) 2-min UV eksponering ved 365 nm. Genoptrykt med tilladelse fra reference20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Nukleare translokation af Cagedlim-QD udløst af UV-lys. Konfokal laser scanning micrographs af Hep3B celler ved excitation ved 405 nm (λobs = 430-520 nm) og 488 nm (λobs = 625-680 nm). Hep3B celler blev inkuberet ved 37 ° C til 3 h i Maibritt VITH indeholdende Cagedlim-QD (10 nM), skylles med D-PBS og derefter inkuberes ved 37 ° C i 10 min i Maibritt VITH (10% FBS) indeholdende Hoechst 33342 (5 µg/mL) før (A) og efter (B, C) 2-min eksponering for UV- lys på 365 nm. (D) tværsnits billede langs den gule linje i (C). Skalere barer = 20 µm. Reprinted med tilladelse fra reference20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Movie
Movie 1. Nukleare omplantning af Cagedlim-NBD udløst af to-foton NIR lys. Time-lapse Konfokal laser scanning mikroskopi af Hep3B celler efter 3-h inkubation ved 37 ° C i Maibritt VITH indeholdende Cagedlim-NBD (10 µM) efterfulgt af skylning med D-PBS. Micrographs blev indspillet med 3-s intervallerne ved excitation på 488 nm (λobs = 500-530 nm). Cellerne ligger i den hvide stiplede cirkel var bestrålet med to-foton NIR lys på 710 nm for 2 min (30 s × 4). Genoptrykt med tilladelse fra reference20. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere undersøgelser af lys-udløst translokation af proteiner i cellekernen er opnået ved hjælp af bur NLS7,8,9. Som tidligere nævnt kræver disse metoder ekstra teknikker til at indarbejde de NLS-tagged proteiner i cytoplasmaet. I modsætning hertil vores Cagedlim-R tag giver mulighed for ikke kun foto-induceret nukleare translokation, men også cellulære optagelse af gæsterne. Denne funktion af Cagedlim-R tag er fordelagtige for i vivo applikationer.

Cagedlim-R tag kan levere makromolekylære gæster såsom QDs i cellekernen. QDs ansat her er større i diameter (DH = 15-20 nm) end de nukleare porer (~ 5 nm)24, hvilket tyder på muligheden for at levere andre makromolekyler, der ikke passivt diffuse ind i kernen. Protokoller for functionalization af biomacromolecular overflader med indeholder grupper er veletableret25; Derudover tags syntese af Cagedlim-R tags forsynet med andre funktionelle grupper som maleimides, N- hydroxysuccinimide (NHS) estere og så videre som en forankring enhed vil udvide anvendeligheden af Cagedlim-R til forskellige biomacromolecules.

Overflødigt at sige, er det vigtige skridt af denne metode indarbejdelse af gæsterne markeret med Cagedlim-R via endocytose. Effektiviteten af den cellulære optagelse af mærket gæsterne afhænger deres koncentration og at inkubationstiden. Hvis gæsterne af interesse, når markeret med Cagedlim-Rasmussen, er endocytosed ineffektivt, Ruger celler længere med højere koncentration af mærket gæster. Et muligt alternativ er at øge antallet af Cagedlim-R indarbejdet i gæsten.

Gæsterne i denne protokol er kovalent konjugeret til Cagedlim-R tag. Dette er en potentiel ulempe især for levering af små-molekyle ligander, da deres binding til target biomolekyler kan hæmmes af en omfangsrig dendritiske tag. Inkorporering af en stimuli-responderende linker26 mellem Cagedlim-R-tag og gæst molekyle kan tillade frigivelse for gæsterne efter nukleare translokation.

I Resumé demonstrerede vi lys-udløst nukleare translokation af gæster, der benytter photoactivatable bur molekylære lim (Cagedlim-R) tags. Gæsterne markeret med Cagedlim-R er taget i levende celler via endocytose og forblive i endosomes. Ved photoirradiation omdannes Cagedlim-R til Uncagedlim-R, som letter endosomal flugt og efterfølgende nukleare translokation af gæsterne. Yderligere mangeårige observationer kan være vigtigt at undersøge skæbnen af de gæster, der forbliver i endosomes samt de leveret i cellekernen. Spatiotemporally kontrolleret genekspression ved hjælp af Cagedlim-R tags er et interessant emne værdig af yderligere undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi anerkender centeret for NanoBio Integration, University of Tokyo. Dette arbejde blev støttet af licensbetaling for unge forskere (B) (26810046) til K.O. og delvist understøttet af licensbetaling for specielt fremmes forskning (25000005) til T.A. R.M. tak Research stipendier af Japan Society for fremme af videnskab (JSP'ER ) for unge videnskabsfolk og programmet for førende kandidat skoler (GPLLI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azide-PEG4-NHS ester Click Chemistry Tools AZ103
Q-dot 655 ITK Invitrogen Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) NIPPON Genetics TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) Harvard Apparatus 7425-RC25K
Hep3B Cells ATCC HB-8064
8-chambered glass substrate Nunc 155411JP
96-well culture plate Nunc 167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM) Thermo Fisher Scientific 10370-021
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) Wako Pure Chemical Industries 045-29795
LysoTracker Red Lonza Walkersville PA-3015
Hoechst 33342 Dojindo H342
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Confocal laser scanning microscope Carl-Zeiss LSM 510 Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8
Xenon light source Asahi Spectra LAX-102
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax Paradigm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
  2. Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
  3. Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
  4. Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
  5. Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
  6. Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
  7. Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
  8. Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
  9. Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
  10. Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
  11. Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
  12. Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
  13. Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
  14. Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
  15. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
  16. Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
  17. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
  18. Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
  19. Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
  20. Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
  21. Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
  22. Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
  23. Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
  24. Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
  25. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Tags

Kemi spørgsmålet 143 Molekylær lim photoactivation cellekernen endosomal flugt nukleare translokation to-foton excitation quantum dots
Spatiotemporally kontrolleret nuklear translokation af gæster i levende celler ved hjælp af bur molekylære lim som Photoactivatable Tags
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A.,… More

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter