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Chemistry

Spatio-temporelle contrôlée Translocation nucléaire des invités dans les cellules vivantes à l’aide de colles moléculaires en cage comme des balises Photoactivatable

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/58631
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, University of Tokyo, 2Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Ce protocole décrit la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des clients dans l’utilisation des balises de "cage" colle moléculaire des cellules vivantes. Cette méthode est prometteuse pour administration de médicaments sélectifs site nucléaire de ciblage.

Abstract

Le noyau de la cellule est l’un des principaux organites comme une cible de délivrance de médicaments subcellulaires, depuis la modulation de la réplication des gènes et expression est efficace pour le traitement de diverses maladies. Ici, nous démontrons la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités à l’aide de cage tags colle moléculaire (Cagedcolle-R), dont plusieurs pendentifs ion (Gu+) de guanidinium sont protégés par un groupe de photoclivables anionique (butyrate-substitués nitroveratryloxycarbonyl ; BA CONV). Invités le tag Cagedcolle-R sont absorbées dans la vie des cellules par endocytose et restent dans les endosomes. Toutefois, dès lors, Cagedcolle-R est converti en uncaged moléculaire colle (colle-RUncaged) transportant plusieurs pendentifs Gu+ , qui facilite l’évasion endosomal et translocation nucléaire subséquente des invités. Cette méthode est prometteuse pour site sélectif nucléaire ciblage administration de médicaments, puisque les invités marquées peuvent migrer dans le cytoplasme, suivi par le noyau de la cellule uniquement lorsque photoirradiated. Avec cage Tags de colle-R peuvent livrer macromoléculaires invités tels que boîtes quantiques (QDs) ainsi que de petites molécules hôtes. Avec cage Étiquettes de colle-R peuvent être uncaged avec non seulement les rayons UV, mais aussi les deux photons proche infrarouge (NIR) lumière qui peut pénétrer profondément dans les tissus.

Introduction

Le noyau de la cellule, qui contient des informations génétiques, est l’un des principaux organites comme une cible de délivrance de médicaments subcellulaires, depuis modulation de la réplication des gènes et expression est efficace pour le traitement de diverses maladies dont le cancer et génétique les troubles de1,2,3. Pour nucléaire livraison de médicaments, conjugaison de peptide balises telles que la localisation nucléaire signaux (NLS)4,5,6 a été largement étudiée. Toutefois, afin de réduire les effets secondaires indésirables, contrôle spatio-temporelle de la translocation nucléaire est nécessaire.

Auparavant, lumière déclenchée la translocation des protéines dans le noyau de la cellule a été réalisée à l’aide de "cage" NLS7,8,9. NLS migre dans le noyau de la cellule en se liant aux protéines de transport cytoplasmique6. Dans les méthodes signalées, protéines de commentaires portant "cage" NLS sont directement incorporés dans le cytoplasme par microinjection8 ou exprimées dans les cellules cibles à l’aide d’un code génétique expansion technique9. Par conséquent, une méthode qui peut atteindre l’absorption cellulaire et translocation nucléaire photoinduit est avantageuse pour des applications pratiques.

Ici, nous décrivons la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités dans les cellules vivantes à l’aide de balises dendritiques colle moléculaire en cage (Cagedcolle-R, Figure 1). Les colles moléculaire solubles dans l’eau10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 portant plusieurs pendentifs Gu+ a été développé, qui adhèrent fermement à protéines11,12,13,14,15, 16,17, acides nucléiques18,19,20, de membranes phospholipidiques21et argile nanofeuillets22,23 à la formation de multiples ponts salins entre leurs pendentifs Gu+ et oxyanionic des groupes sur les cibles. Les pendentifs de Gu+ du Cagedcolle-R sont protégés par un groupe de photoclivables anionique, nitroveratryloxycarbonyl substitués butyrate (convBA). Invités le tag Cagedcolle-R sont absorbées dans la vie des cellules par endocytose et séjour dans les endosomes (Figure 2). Dès lors, les groupes de conv BAdu Cagedcolle-R sont détachés pour produire une uncaged moléculaire colle (colle-RUncaged) transportant plusieurs pendentifs Gu+ , qui facilite ensuite la migration de l’invité étiquetée dans le cytoplasme, suivi par le noyau de la cellule (Figure 2). La balise de colle-R Cagedpeut être uncaged par l’exposition aux UV ou deux photons proche infrarouge (NIR) lumière sans phototoxicité grave. Nous démontrons l’administration nucléaire spatio-temporelle controlee de macromoléculaires invités ainsi que des invités de petites molécules avec Cagedtags de colle-R, en utilisant des points quantiques (QDs) et un colorant fluorescent (nitrobenzoxadiazole ; NBD), respectivement, à titre d’exemples.

Figure 1
Figure 1 : Structures schématiques Cagedcolle-r Les 9 pendentifs ion (Gu+) de guanidinium de Cagedcolle-R sont protégés par un groupe de nitroveratryloxycarbonyl substitués butyrate (convBA). Les groupes de conv BAsont clivés par irradiation UV ou lumière NIR deux photons. Le noyau central de Cagedcolle-R est fonctionnalisé avec nitrobenzoxadiazole (NBD) ou dibenzocylooctyne (DBCO). Réimprimé avec la permission de référence20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Illustration schématique de la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités conjugué avec une balise de colle-R Caged. L’invité /Cagedconjugué de colle-R est absorbé dans la vie des cellules par endocytose. Dès lors, la balise de colle-R Cagedest uncaged pour produire une balise de colle-R Uncagedqui peut faciliter l’évasion endosomal de l’invité étiquetée. Par la suite, l’invité tagged migre dans le noyau de la cellule. Réimprimé avec la permission de référence20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Protocol

1. préparation des invités avec cagecolle-R Tags

  1. Préparer la solution de colle-NBD Caged.
    1. Une synthèse suivant les procédures décrites précédemment20 Cagedcolle-NBD (Figure 1).
    2. Préparer une solution de colle Caged-NBD (10 mM) dans le sec diméthylsulfoxyde (DMSO).
      Note : Stocker la solution dans l’obscurité. La solution peut être diluée avec tampons aqueux ou de milieux de culture cellulaire à son utilisation.
  2. Préparer la solution de colle-QD Caged.
    1. Synthétiser le Cagedcolle-dibenzocylooctyne (Cagedcolle-DBCO) (Figure 1) suivant la procédure précédemment décrite20.
    2. Préparer une solution de colle Caged-DBCO (10 mM) dans le DMSO sec.
    3. Pour la préparation du Cagedcolle-QD, préparer d’abord QDs azoture fonctionnalisés (Azide-QD ; La figure 3). Ajouter 100 µL de solution diméthyl formamide (DMF, 125 µM) d’azoture-PEG4-NHS ester (Figure 3) à 400 µL d’une FMM (500 nM) solution des points quantiques (QDs) recouverte de PEG fonctionnalisés amine (Amine-QD ; La figure 3). Agiter le mélange pendant 1 h à température ambiante.
    4. Dialyser la solution obtenue pendant 24 h contre 800 mL de DMF à l’aide d’une membrane de cellulose régénérée avec 3 500 poids moléculaire limite (MWCO).
    5. Diluer la solution mère de Cagedcolle-DBCO à 50 µM avec DMF. Ajouter 200 µL de la solution à la solution de dialyse après (Figure 3) et agiter le mélange pendant 3 h à température ambiante.
    6. Dialyser la solution obtenue pendant 24 h contre 800 mL de DMF à l’aide d’une membrane de cellulose régénérée (25 000 MWCO).
    7. Diluer la solution obtenue à 200 nM avec DMF.

Figure 3
Figure 3 : illustration schématique de la préparation du Cagedcolle-QD. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. préparation de l’échantillon de cellules Hep3B pour l’observation au microscope

  1. Maintenir les cellules de carcinome Hep3B hépatocellulaire humaine en milieu essentiel minimal aigle (EMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF) à 37 ° C de moins de 5 % de CO2.
  2. Les cellules des graines la veille de l’expérience. Semences 5,0 × 103 Hep3B cellules / puits d’un substrat de verre 8-chambré en EMEM (10 % FBS, 200 µL) et incuber l’échantillon de cellules à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 24 h.
  3. Enlever le milieu de culture et rincer l’échantillon cellulaire avec 100 µL de solution saline tampon phosphate de Dulbecco (D-PBS) deux fois.

3. observation de Translocation nucléaire de petites molécules hôtes déclenchée par la lumière UV

  1. Fournir l’échantillon de la cellule (document établi en étape 2.3) avec 200 µL de FBS-free EMEM contenant Cagedcolle-NBD (10 µM) et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 3 h.
    Remarque : L’Incubation de l’échantillon de cellules en EMEM FBS-libre pendant plus de 4 h provoque des dommages cellulaires graves.
  2. Enlever le milieu de culture et rincer l’échantillon cellulaire avec 100 µL de PBS-D deux fois.
  3. Pour visualiser les endosomes, fournir l’échantillon de cellules avec 200 µL de ha ha ha (10 % FBS) contenant un colorant fluorescent rouge (p. ex., LysoTracker rouge, 100 nM) et incuber l’échantillon de cellules qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 20 min. enlever la culture support et rincer l’échantillon cellulaire avec 100 µL de PBS-D deux fois. Fournir l’échantillon de cellules avec 200 µL de ha ha ha (10 % FBS).
  4. Pour la translocation nucléaire du Cagedcolle-NBD, exposer l’échantillon cellulaire aux UV pour 2 min via une fibre optique à l’aide d’une source lumineuse de 100 W xénon équipée de filtre passe-bande 365 nm. Pour un échantillon de cellules de référence sans exposition aux rayons UV, garder l’échantillon cellulaire dans l’obscurité.
    Remarque : Le couvercle les substrats de verre peut être enlevé pour l’exposition UV efficace. Longue exposition aux rayons ultraviolets peut provoquer la cytotoxicité pour les cellules.
  5. Pour la visualisation des noyaux, ajouter 1 µL de Hoechst 33342 (1 mg/mL) au milieu de culture et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 10 min.
  6. Sous réserve de l’échantillon de cellules laser confocal, microscopie à balayage et enregistrer les micrographies sur excitation à 488 nm (λobs = 500-530 nm), 543 nm (λobs = 565-620 nm) et 710 nm (deux photons ; Λ OBS = 390-465 nm) pour le jour ouvrable suivant, colorant rouge fluorescente et Hoechst 33342, respectivement.

4. l’observation de la Translocation nucléaire de petites molécules hôtes déclenchée par la lumière de deux photons NIR

  1. Fournir l’échantillon de la cellule (document établi en étape 2.3) avec 200 µL de FBS-free EMEM contenant Cagedcolle-NBD (10 µM) et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 3 h.
  2. Enlever le milieu de culture et rincer l’échantillon cellulaire avec 100 µL de PBS-D deux fois. Fournir l’échantillon de cellules avec 200 µL de ha ha ha (10 % FBS).
  3. Sous réserve de l’échantillon de cellules laser confocal, microscopie à balayage et enregistrer les micrographies sur excitation à 488 nm (λobs = 500-530 nm).
  4. Pour la translocation nucléaire du Cagedcolle-NBD, irradier la région y compris la cellule d’intérêt avec un laser d’excitation biphotonique (710 nm), installé comme une source de lumière dans le microscope, pendant 2 min (30 s × 4). Observer la translocation comme indiqué au point 4.3.

5. observation de Translocation nucléaire d’invités macromoléculaires déclenchée par la lumière UV

  1. Fournir l’échantillon de la cellule (document établi en étape 2.3) avec 200 µL de FBS-free EMEM contenant Cagedcolle-QD (10 nM) et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 3 h.
  2. Enlever le milieu de culture et rincer l’échantillon cellulaire avec 100 µL de PBS-D deux fois. Fournir l’échantillon de cellules avec 200 µL de ha ha ha (10 % FBS).
  3. Pour la translocation nucléaire du Cagedcolle-QD, exposer l’échantillon cellulaire aux UV pour 2 min via une fibre optique à l’aide d’une source lumineuse de 100 W xénon équipée de filtre passe-bande 365 nm. Pour un échantillon de cellules de référence sans exposition aux rayons UV, garder l’échantillon cellulaire dans l’obscurité.
  4. Pour la visualisation des noyaux, ajouter 1 µL de Hoechst 33342 (1 mg/mL) au milieu de culture et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 10 min.
  5. Sous réserve de l’échantillon de cellules laser confocal, microscopie à balayage et enregistrer les micrographies sur excitation à 405 nm (λobs = 430-520 nm) et 488 nm (λobs = 625-680 nm) pour Hoechst 33342 et QDs, respectivement.

6. analyse de viabilité de cellules

  1. Maintenir les cellules de carcinome Hep3B hépatocellulaire humaine en EMEM (10 % FBS) à 37 ° C moins de 5 % de CO2.
  2. Les cellules des graines la veille de l’expérience. Semences 5,0 × 103 Hep3B cellules / puits d’une plaque 96 puits de culture en EMEM (10 % FBS, 200 µL) et incuber l’échantillon de cellules à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 24 h.
  3. Enlever le milieu de culture et rincer l’échantillon cellulaire avec 100 µL de PBS-D deux fois.
  4. Fournir l’échantillon de cellules avec 200 µL de FBS-free EMEM contenant Cagedcolle-NBD (0,1 à 100 µM) et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 3 h.
  5. Exposer l’échantillon cellulaire à la lumière UV pour 2 min via une fibre optique à l’aide d’une source lumineuse de 100 W xénon équipée de filtre passe-bande 365 nm. Pour un échantillon de cellules analogues sans exposition aux rayons UV, garder l’échantillon cellulaire dans l’obscurité.
  6. Ajouter 10 µL de réactif de cellule comptage Kit-8 (10 µL) dans le milieu de culture et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 2 h.
  7. Sous réserve de l’échantillon de cellules de spectroscopie d’absorption (λ = 450 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques.

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Representative Results

Avant photo-irradiation, cellules Hep3B incubées avec Cagedcolle-NBD exposées émission de fluorescence ponctuée de leur intérieur (λext = 488 nm ; Figures 4 a et 4 C, vert). Une micrographie analogue a été obtenue sur l’excitation 543 nm pour le colorant rouge fluorescente (Figures 4 b et 4C, rouge), indiquant que le Cagedcolle-NBD localisée dans les endosomes. En conséquence, l’émission de fluorescence assignable à Cagedcolle-NBD (Figure 4, verts) a été observée en dehors du noyau de la cellule, qui a été visualisé avec Hoechst 33342 (λext = 710 nm, deux photons ; La figure 4, bleu). Après l’irradiation UV, la fluorescence des cellules émis en raison de NBD (Figure 4E, vert) aussi du noyau (Figure 4E, bleu), suggérant que Cagedcolle-NBD uncaged au rendement Uncagedcolle-NBD, qui migrèrent dans le cytoplasme est suivi par le noyau de la cellule. Cette translocation nucléaire du Cagedcolle-NBD peut être induite site sélectivement par la lumière NIR deux photons (Figure 5 a et 1 film, blanc cercle en pointillés). Comme illustré à la Figure 5 b et 1 film, Cagedcolle-NBD dans les zones non n’a pas échappé depuis les endosomes et est resté comme ponctuée par fluorescence. Aucune cytotoxicité appréciable a été observée pour les cellules traitées avec Cagedcolle-NBD avant et même après l’exposition aux UV (Figure 6).

Les balises de colle-R Cagedpeuvent aussi délivrer des invités macromoléculaires telles que QDs dans le noyau de la cellule. Le QD /Cagedconjugué de colle-R (Cagedcolle-QD, Figure 3) peut être absorbé dans les cellules Hep3B (Figure 7 a). Visualisation du noyau cellulaire avec Hoechst 33342 indique que Cagedcolle-QD reste en dehors du noyau avant photo-irradiation (Figure 7 a). Après exposition aux UV pendant 2 minutes, l’émission de fluorescence des QDs a émergé dans le noyau (Figures 7 b et 7c). Une image transversale des cellules ont démontré que l’émission de fluorescence assignable à QDs est en effet émise par l’intérieur du noyau (Figure 7).

Figure 4
Figure 4 : Évasion Endosomal et translocation nucléaire du Cagedcolle-NBD déclenchée par la lumière UV. Confocale à balayage micrographies de cellules Hep3B après 3 h d’incubation à 37 ° C en EMEM contenant Cagedcolle-NBD laser (10 µM) suivie d’un rinçage avec D-PBS. (A, B) Micrographies ont été enregistrés lors de l’excitation à (A) 488 nm (λobs = 500-530 nm, vert) et (B) 543 nm (λobs = 565-620 nm, rouge) après 20 min d’incubation en EMEM (10 % SBF) contenant un colorant fluorescent rouge (100 nM) . (C) : fusion image de (A) et (B). (D, E) Micrographies enregistrement à excitation à 488 nm (λobs = 500-530 nm, vert) et 710 nm (deux photons ; Λ OBS = 390-465 nm, bleu). Les cellules Hep3B, traités avec Cagedcolle-NBD, sont incubées à 37 ° C en EMEM (10 % SBF) contenant Hoechst 33342 (5 µg/mL) avant (D) et après (E) 2 min UV exposition à 365 nm. Barreaux de l’échelle = 20 µm. reproduit avec la permission de référence20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Translocation nucléaire du Cagedcolle-NBD déclenchée par la lumière de deux photons NIR. Confocale à balayage micrographies de cellules Hep3B après 3 h d’incubation à 37 ° C en EMEM contenant Cagedcolle-NBD laser (10 µM) suivie d’un rinçage avec D-PBS. Micrographies ont été enregistrés lors de l’excitation à 488 nm (λobs = 500-530 nm) avant (A) et après (B) une irradiation biphotonique à 710 nm pendant 2 min (30 s × 4). Le cercle en pointillés blanc ( a) représente la zone irradiée. Barreaux de l’échelle = 20 µm. reproduit avec la permission de référence20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : analyse de viabilité de cellules. Viabilité des cellules Hep3B après incubation en EMEM contenant Cagedcolle-NBD (0,1 à 100 µM) avant (A) et après (B) 2 min UV exposition à 365 nm. Réimprimé avec la permission de référence20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Translocation nucléaire du Cagedcolle-QD déclenchée par la lumière UV. Confocal laser numérisation des photographies au microscope des cellules Hep3B à excitation à 405 nm (λobs = 430-520 nm) et 488 nm (λobs = 625-680 nm). Hep3B cellules ont été incubées à 37 ° C pendant 3 h en EMEM contenant Cagedcolle-QD (10 nM), rincés avec D-PBS et puis incubé à 37 ° C pendant 10 min dans ha ha ha (10 % SBF) contenant Hoechst 33342 (5 µg/mL) avant (A) et après (B, C) 2 min d’exposition aux UV lumière à 365 nm. (D) l’image coupe transversale le long de la ligne jaune en (C). Barreaux de l’échelle = 20 µm. reproduit avec la permission de référence20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Movie
Film de 1. Translocation nucléaire de Cagedcolle-NBD déclenchée par la lumière de deux photons NIR. Time-lapse confocale à balayage laser microscopie des cellules Hep3B après 3 h d’incubation à 37 ° C en EMEM contenant Cagedcolle-NBD (10 µM) suivie d’un rinçage avec D-PBS. Micrographies ont été enregistrés avec des intervalles de 3 s à excitation à 488 nm (λobs = 500-530 nm). Les cellules situées dans le cercle en pointillés blanc ont été irradiés avec deux photons NIR légère à la 710 nm pendant 2 min (30 s × 4). Réimprimé avec la permission de référence20. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

Les enquêtes précédentes de lumière déclenchée la translocation des protéines dans le noyau de la cellule ont été obtenus à l’aide de "cage" NLS7,8,9. Comme mentionné précédemment, ces méthodes nécessitent des techniques supplémentaires pour incorporer les NLS-protéines dans le cytoplasme. En revanche, notre balise de colle-R Cagedpermet non seulement translocation nucléaire induite par la photo, mais aussi l’absorption cellulaire des invités. Cette caractéristique de la balise de colle-R Cagedest avantageuse pour les applications in vivo .

La balise de colle-R Cagedpeut livrer macromoléculaires invités tels que les QDs dans le noyau de la cellule. Les QDs employées ici sont plus grands diamètre (DH = 15 à 20 nm) que les pores nucléaires (~ 5 nm)24, suggérant la possibilité d’offrir d’autres macromolécules qui ne peuvent diffuser passivement dans le noyau. Protocoles de fonctionnalisation de surfaces microenvironmental avec des groupes de l’azoture sont bien établi25; en outre, la synthèse des balises de colle-R Cagedportant des autres groupes fonctionnels tels que maléimides, esters de N- hydroxysuccinimide (NHS) et ainsi de suite comme une unité d’ancrage élargira l’applicabilité du Cagedcolle-R balises à divers biomacromolecules.

Inutile de préciser que l’étape critique de cette méthode est l’incorporation des invités le tag Cagedcolle-R par endocytose. L’efficacité de l’assimilation des invités tags dépend de leur concentration et le temps d’incubation. Si les clients d’intérêt, lorsque le tag Cagedcolle-R, sont mégacaryocyte inefficacement, incuber les cellules plus longtemps avec une concentration plus élevée des invités marquées. Une alternative possible est d’augmenter le nombre de Cagedcolle-R incorporé dans les commentaires.

Les invités utilisées dans le présent protocole sont conjuguées par liaison covalente à la balise de colle-R Caged. Il s’agit d’un désavantage potentiel en particulier pour la livraison des ligands de petites molécules, car leur liaison à la cible de biomolécules peut être inhibée par la balise dendritique encombrante. Incorporation d’un éditeur de liens sensibles aux stimuli26 entre la balise Cagedcolle-R et la molécule invitée peut permettre la sortie des invités après la translocation nucléaire.

En résumé, nous avons démontré la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités, l’utilisation des balises photoactivatable avec cage colle moléculaire (Cagedcolle-R). Les invités le tag Cagedcolle-R sont absorbées dans la vie des cellules par endocytose et restent dans les endosomes. Dès lors, Cagedcolle-R est converti en Uncagedcolle-R, qui facilite l’évasion endosomal et translocation nucléaire subséquente des invités. De plus longue date observations peuvent être importantes pour enquêter sur le sort des invités qui restent dans les endosomes ainsi que celles envoyées dans le noyau de la cellule. Expression du gène spatio-temporelle contrôlé à l’aide de balises colle-R Cagedest un sujet intéressant digne d’une enquête plus approfondie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous reconnaissons le centre pour l’intégration de NanoBio, l’Université de Tokyo. Ce travail a été soutenu par la subvention pour jeunes scientifiques (B) (26810046) à K.O. et partiellement pris en charge par subvention de recherche spécialement favorisé (25000005) à Mr T.A. Merci les bourses de recherche de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS ) pour les jeunes scientifiques et le programme Leading Graduate Schools (GPLLI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azide-PEG4-NHS ester Click Chemistry Tools AZ103
Q-dot 655 ITK Invitrogen Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) NIPPON Genetics TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) Harvard Apparatus 7425-RC25K
Hep3B Cells ATCC HB-8064
8-chambered glass substrate Nunc 155411JP
96-well culture plate Nunc 167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM) Thermo Fisher Scientific 10370-021
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) Wako Pure Chemical Industries 045-29795
LysoTracker Red Lonza Walkersville PA-3015
Hoechst 33342 Dojindo H342
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Confocal laser scanning microscope Carl-Zeiss LSM 510 Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8
Xenon light source Asahi Spectra LAX-102
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax Paradigm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Chimie numéro 143 colles moléculaires photoactivation noyau cellulaire évasion endosomal translocation nucléaire excitation biphotonique points quantiques
Spatio-temporelle contrôlée Translocation nucléaire des invités dans les cellules vivantes à l’aide de colles moléculaires en cage comme des balises Photoactivatable
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Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).

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