Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Spatiotemporally מבוקר גרעיני טרנסלוקציה של האורחים בתאים חיים באמצעות דבקים מולקולרית בכלובים כמו Photoactivatable תגיות

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/58631
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, University of Tokyo, 2Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

פרוטוקול זה מתאר מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים בתאים חיים באמצעות תגי דבק מולקולרית בכלובים. שיטה זו היא מבטיחה עבור משלוח סמים פילוח גרעיני האתר סלקטיבית.

Abstract

גרעין התא הוא אחד organelles החשובים ביותר כמטרה סמים subcellular-מסירה, מאז אפנון של שכפול גנטי, הביטוי הוא יעיל לטיפול במחלות שונות. . הנה, נדגים מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים שימוש בכלוב תגיות דבק מולקולרית (בכלובדבק-R), תליונים יון (ג. א.+) מרובות של מי guanidinium מוגנים על-ידי קבוצת anionic photocleavable (butyrate-שהוחלפו nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). האורחים המתויגת כלואהדבק-R נלקחים לתוך החיים תאים באמצעות אנדוציטוזה וישארו endosomes. עם זאת, בעת photoirradiation, כלואהדבק-R מומר שברחה מכלוב מולקולרית דבק (Uncagedדבק-R) תליונים גו+ מרובים, נושאת המאפשרת את הבריחה endosomal ואת רוברטסונית גרעיני עוקבות של האורחים. בשיטה זו הוא מבטיח למסירה אתר סלקטיבית הגרעיני פילוח סמים, מאז מתויג האורחים יכולים להעביר לתוך הציטופלסמה ואחריו גרעין התא רק כאשר photoirradiated. בכלוב דבק-R תגיות יכול לספק לאורחים macromolecular כגון נקודות קוונטיות (QDs) כמו גם האורחים מולקולה קטנה. בכלוב תגיות דבק-R ניתן שברחה מכלוב עם לא רק אור UV, אלא גם שני הפוטונים-סגול (ניר) אור, אשר יכול לחדור עמוק לתוך רקמות.

Introduction

גרעין התא, אשר נושאת מידע גנטי, הוא אחד organelles החשובים ביותר כמטרה סמים subcellular-מסירה, מאז אפנון של שכפול גנטי, הביטוי הוא יעיל לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן ותעשיה והפרעות1,2,3. למסירה הגרעין של סמים, ההטיה של פפטיד תיוג כגון גרעיני לוקליזציה אותות (שקל)4,5,6 נחקר באופן נרחב. אולם, על מנת להפחית תופעות לוואי לא רצויות, ייתכן השליטה רוברטסונית גרעיני הוא הכרחי.

בעבר, מבוססות אור טרנסלוקציה של חלבונים לתוך גרעין התא הושגה באמצעות בכלובים NLS7,8,9. NLS נודד אל תוך גרעין התא על-ידי איגוד התחבורה cytoplasmic חלבונים6. בשיטות שדווחה, חלבונים חוות הנושאת NLS בכלובים ישירות שולבו הציטופלסמה מאת microinjection8 או לידי ביטוי תאי היעד באמצעות טכניקה הרחבה9הקוד הגנטי. לכן, שיטה להשגת ספיגת הסלולר והן צילום-induced רוברטסונית גרעינית היא יתרון עבור יישומים מעשיים.

במסמך זה, אנו מתארים מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים בתאים חיים באמצעות תגי דנדריטים דבק מולקולרית בכלובים (כלואהדבק-R, איור 1). דבקים מולקולרית מסיסים במים10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 הנושאת תליונים גו+ מרובים בעבר פותחו, אשר באופן הדוק לדבוק חלבונים11,12,13,14,15, 16,17, חומצות גרעין18,19,20, פוספוליפיד ממברנות21, ו קליי nanosheets22,23 דרך היווצרות גשרים מלח מרובים בין תליונים גו+ oxyanionic קבוצות על המטרות. ג. א.+ תליונים של כלואהדבק-R מוגנים על-ידי קבוצת anionic photocleavable, nitroveratryloxycarbonyl butyrate שהוחלפו (BANVOC). האורחים המתויגת כלואהדבק-R נלקחים לתוך החיים תאים באמצעות אנדוציטוזה והישאר ב- endosomes (איור 2). על photoirradiation, קבוצות NVOC BA כלואהדבק-R מנותקים להניב תשואה של שברחה מכלוב מולקולרית דבק (Uncagedדבק-R) תליונים גו+ מרובים, נושאת המאפשרת ואז ההעברה של האורח מתויג לתוך הציטופלסמה ואחריו גרעין התא (איור 2). התג דבק-R כלואהניתן שברחה מכלוב על ידי חשיפה UV או שני הפוטונים-סגול (ניר) אור בלי phototoxicity רצינית. נדגים את המשלוח גרעיני מבוקר spatiotemporally של האורחים macromolecular, כמו גם מולקולה קטנה לאורחים תגים דבק-R כלואה, באמצעות נקודות קוונטיות (QDs) של הפלורסנט (nitrobenzoxadiazole; להארכה), בהתאמה, כדוגמאות.

Figure 1
איור 1: מבנה סכמטי של כלואהדבק-R. תליונים יון (ג. א.+) guanidinium 9 של כלואהדבק-R מוגן על ידי קבוצת nitroveratryloxycarbonyl butyrate שהוחלפו (BANVOC). הקבוצות NVOC BAהם ביקע על ידי הקרנה UV או אור ניר שני הפוטונים. ליבת מוקד כלואהדבק-R הוא functionalized עם nitrobenzoxadiazole (להארכה) או dibenzocylooctyne (DBCO). הודפס מחדש באישור הפניה20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: איור סכמטי של מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים מצומדת עם תג דבק-R כלואה. האורח /כלואהדבק-R המספר המשלים הוא נלקח לתוך החיים תאים באמצעות אנדוציטוזה. בעת photoirradiation, התג דבק-R כלואההינם שברחה מכלוב להניב תג דבק-R Uncaged, דבר היכול להקל על הבריחה endosomal של האורח מתויגות. לאחר מכן, האורח מתויג נודד אל תוך גרעין התא. הודפס מחדש באישור הפניה20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת לאורחים עם דבק-R בכלובתגי

  1. להכין פתרון דבק-להארכה כלואה.
    1. לסנתז כלואהדבק-להארכה (איור 1) בעקבות הליכים שתואר לעיל20.
    2. להכין פתרון מניות של כלואהדבק-להארכה (10 מ מ) ביבש דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד).
      הערה: אחסן את הפתרון מניות בחושך. הפתרון יכול להיות מדולל עם מאגרי מימית או תא תרבות המדיה בעת השימוש.
  2. להכין פתרון דבק-QD כלואה.
    1. לסנתז כלואהדבק-dibenzocylooctyne (כלואהדבק-DBCO) (איור 1) ביצוע הפרוצדורות בעבר תיאר20.
    2. להכין פתרון מניות של כלואהדבק-DBCO (10 מ מ) ב דימתיל סולפוקסיד יבש.
    3. עבור הכנת דבק כלואה-QD, להכין תחילה QDs אזיד-functionalized (אזיד-QD; איור 3). להוסיף 100 µL של דימתיל formamide (DMF, 125 µM) פתרון של אזיד-PEG4-NHS אסתר (איור 3) µL 400 של DMF (500 ננומטר) פתרון של נקודות קוונטיות (QDs) מצופה פג functionalized-אמין (Amine-QD; איור 3). מערבבים את התערובת לשעה בטמפרטורת החדר.
    4. Dialyze הפתרון שיתקבל עבור 24 שעות מול 800 מיליליטר DMF באמצעות קרום תאית מחדש עם משקל מולקולרי 3,500 ניתוק (MWCO).
    5. לדלל את הפתרון מניות של כלואהדבק-DBCO 50 מיקרומטר עם DMF. להוסיף 200 µL של הפתרון הפתרון שלאחר דיאליזה (איור 3) ומערבבים את התערובת במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
    6. Dialyze הפתרון שיתקבל עבור 24 שעות מול 800 מיליליטר DMF באמצעות קרום regenerated תאית (25,000 MWCO).
    7. לדלל הפתרון שיתקבל ל-200 nM עם DMF.

Figure 3
איור 3: איור סכמטי של הכנת דבק כלואה-QD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. הכנה של דגימות התאים Hep3B תצפיות מיקרוסקופיות

  1. לשמור על hepatocellular האנושי תאי קרצינומה Hep3B של הנשר מינימלית חיונית בינוני (EMEM) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS) ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.
  2. הזרע התאים יום לפני הניסוי. תאי זרע 5.0 × 103 Hep3B טוב של המצע זכוכית תאיים 8 ב- EMEM (10% FBS, 200 µL), דגירה המדגם תא ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 עבור 24 שעות.
  3. להסיר את המדיום תרבות ולשטוף את דגימת תאים עם 100 µL של Dulbecco של המאגר פוספט תמיסת מלח (D-PBS) פעמיים.

3. תצפית של טרנסלוקציה הגרעין של מולקולה קטנה האורחים מופעלות על ידי אור UV

  1. לספק את הדגימה תא (שלב מוכן ב- 2.3) עם 200 µL של EMEM נטולת FBS המכיל כלואהדבק-להארכה (10 מיקרומטר) דגירה המדגם התא שנוצר ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 ב-3 שעות.
    הערה: דגירה של המדגם תא ב EMEM FBS ללא יותר מ 4 שעות גורמת נזק רציני.
  2. להסיר את המדיום תרבות ולשטוף את דגימת תאים עם 100 µL של D-PBS פעמיים.
  3. עבור ויזואליזציה של endosomes, לספק את דגימת תאים עם 200 µL של EMEM (10% FBS) המכיל צבע אדום-פלורסנט (למשל, LysoTracker אדום, 100 ננומטר), דגירה המדגם התא שנוצר ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 עבור 20 דקות להסיר את התרבות בינוני, ולאחר מכן לשטוף דגימת תאים עם 100 µL של D-PBS פעמיים. לספק את דגימת תאים עם 200 µL של EMEM (10% FBS).
  4. עבור רוברטסונית הגרעין של כלואהדבק-להארכה, לחשוף את דגימת תאים לאור אולטרא סגול במשך 2 דקות דרך סיב אופטי באמצעות מקור אור 100-W קסנון מצויד במסנן bandpass nm 365. עבור מדגם תא הפניה ללא חשיפה UV, לשמור את דגימת תאים בחושך.
    הערה: המכסה של סובסטרטים זכוכית ניתן לקחת חשיפה UV יעיל. ותיק חשיפה לאור UV עלולים לגרום cytotoxicity על התאים.
  5. ויזואליזציה של הגרעינים, להוסיף 1 µL של Hoechst 33342 (1 מ"ג/מ"ל) למדיום תרבות, דגירה המדגם התא שנוצר ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 למשך 10 דקות.
  6. נושא את דגימת תאים סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי ולהקליט את micrographs על עירור-488 ננומטר (λobs = 500-530 ננומטר), 543 nm (λobs = 565-620 nm), ו- 710 nm (שני הפוטונים; Λ obs = 390-465 nm) עבור להארכה, צבע אדום-פלורסנט Hoechst 33342, בהתאמה.

4. התבוננות רוברטסונית הגרעין של מולקולה קטנה האורחים המופעלות על-ידי שני הפוטונים ניר אור

  1. לספק את הדגימה תא (שלב מוכן ב- 2.3) עם 200 µL של EMEM נטולת FBS המכיל כלואהדבק-להארכה (10 מיקרומטר) דגירה המדגם התא שנוצר ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 ב-3 שעות.
  2. להסיר את המדיום תרבות ולשטוף את דגימת תאים עם 100 µL של D-PBS פעמיים. לספק את דגימת תאים עם 200 µL של EMEM (10% FBS).
  3. נושא לדוגמה תא סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי ולהקליט את micrographs על עירור-488 ננומטר (λobs = 500-530 ננומטר).
  4. עבור רוברטסונית הגרעין של כלואהדבק-להארכה, להאיר את האזור כולל את התא של עניין עם לייזר שני הפוטונים עירור (710 nm), שהותקנו כמקור אור במיקרוסקופ, למשך 2 דקות (30 s × 4). להתבונן רוברטסונית כפי שמתואר בשלב 4.3.

5. תצפיות של טרנסלוקציה הגרעין של האורחים Macromolecular מופעלות על ידי אור UV

  1. לספק את הדגימה תא (שלב מוכן ב- 2.3) עם 200 µL של EMEM נטולת FBS המכיל כלואהדבק-QD (10 ננומטר), דגירה המדגם התא שנוצר ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 ב-3 שעות.
  2. להסיר את המדיום תרבות ולשטוף את דגימת תאים עם 100 µL של D-PBS פעמיים. לספק את דגימת תאים עם 200 µL של EMEM (10% FBS).
  3. עבור רוברטסונית הגרעין של כלואהדבק-QD, לחשוף את דגימת תאים לאור אולטרא סגול במשך 2 דקות דרך סיב אופטי באמצעות מקור אור 100-W קסנון מצויד במסנן bandpass nm 365. עבור מדגם תא הפניה ללא חשיפה UV, לשמור את דגימת תאים בחושך.
  4. ויזואליזציה של הגרעינים, להוסיף 1 µL של Hoechst 33342 (1 מ"ג/מ"ל) למדיום תרבות, דגירה המדגם התא שנוצר ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 למשך 10 דקות.
  5. נושא את דגימת תאים סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי ולהקליט את micrographs על עירור-405 ננומטר (λobs = 430-520 nm), 488 ננומטר (λobs = nm 625-680) ועבור Hoechst 33342 QDs, בהתאמה.

6. תא הכדאיות Assay

  1. לשמור על hepatocellular האנושי קרצינומה Hep3B תאים EMEM (10% FBS) ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.
  2. הזרע התאים יום לפני הניסוי. תאי זרע 5.0 × 103 Hep3B טוב של צלחת 96-ובכן התרבות ב- EMEM (10% FBS, 200 µL), דגירה המדגם תא ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 עבור 24 שעות.
  3. להסיר את המדיום תרבות ולשטוף את דגימת תאים עם 100 µL של D-PBS פעמיים.
  4. לספק את דגימת תאים עם 200 µL של EMEM נטולת FBS המכיל כלואהדבק-להארכה (0.1-100 מיקרומטר) דגירה המדגם התא שנוצר ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 ב-3 שעות.
  5. לחשוף את הדגימה תא לאור UV במשך 2 דקות דרך סיב אופטי באמצעות מקור אור 100-W קסנון מצויד במסנן bandpass nm 365. לקבלת דוגמה מקבילה לתא ללא חשיפה UV, השאר את דגימת תאים בחושך.
  6. להוסיף 10 µL של ריאגנט תא סופר קיט-8 (10 µL) המדיום תרבות, דגירה המדגם התא שנוצר ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 כבר שעתיים.
  7. נושא לדוגמה תא בליעה (λ = 450 ננומטר) באמצעות קורא microplate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לפני photoirradiation, תאים Hep3B מודגרות עם דבק כלואה-להארכה הציג פליטת קרינה פלואורסצנטית punctate מן הפנים שלהם (λext = 488 ננומטר; דמויות 4A ו- 4 Cירוק). Micrograph מקביל הושג על עירור-543 nm לצבע אדום-פלורסנט (דמויות 4B ו- 4 C, אדום), המציין כי כלואהדבק-להארכה מקומית endosomes. בהתאם לכך, פליטת קרינה פלואורסצנטית שניתן להקצות כלואהדבק-להארכה (איור 4D, ירוק) נצפתה מחוץ לגרעין התא, אשר היה דמיינו Hoechst 33342 (λext = 710 nm, שני הפוטונים; איור 4D, כחול). לאחר הקרנת UV, קרינה פלואורסצנטית התאים הנפלטים עקב להארכה (איור 4E, ירוק) גם מהגרעין (איור 4E, כחול), טוען שהיתה כלואהדבק-להארכה שברחה מכלוב כדי התשואה Uncagedדבק-להארכה, אשר היגרו לתוך הציטופלסמה ואחריו גרעין התא. כזה רוברטסונית הגרעין של כלואהדבק-להארכה יכולה להיגרם האתר באופן סלקטיבי על ידי אור ניר שני הפוטונים (איור 5A ו- סרט 1, עיגול מקווקו לבן). כפי שמוצג באיור 5B וסרט 1, כלואהדבק-להארכה באזורים nonirradiated לא נמלט מן endosomes ונשארו כמו זריחה punctate. אין cytotoxicity ניכר נצפתה עבור התאים שטופלו כלואהדבק-להארכה לפני ואחרי אפילו את החשיפה UV (איור 6).

התגים דבק-R כלואהיכול גם לספק לאורחים macromolecular כגון QDs לתוך גרעין התא. QD /כלואהדבק-R המספר המשלים (כלואהדבק-QD, איור 3) שאפשר לקחת לתוך תאים Hep3B (איור 7 א). ויזואליזציה של גרעין התא עם Hoechst 33342 מציין כי כלואהדבק-QD נשאר מחוץ לגרעין לפני photoirradiation (איור 7 א). לאחר חשיפה UV למשך 2 דקות, פליטת קרינה פלואורסצנטית QDs צמחו בגרעין (איורים 7 ב וג 7). תמונת חתך של התאים הוכיח כי פליטת קרינה פלואורסצנטית שניתן להקצות QDs אכן נפלטת מכל בתוך הגרעין (איור 7D).

Figure 4
איור 4: הבריחה Endosomal, רוברטסונית הגרעין של דבק כלואה-מופעלות על ידי אור UV להארכה. לייזר קונפוקלי סורק micrographs של תאים Hep3B לאחר דגירה 3-h ב- 37 מעלות צלזיוס ב EMEM המכיל כלואהדבק-להארכה (10 מיקרומטר) ואחריו שטיפה עם D-PBS. (A, B) Micrographs נרשמו על עירור (א) 488 ננומטר (λobs = 500-530 ננומטר, ירוק) ו- (B) 543 nm (λobs = 565-620 nm, אדום) לאחר הדגירה 20 דקות ב- EMEM (10% FBS) המכילים צבען אדום-פלורסנט (100 ננומטר) . (ג) ממוזג תמונה של (א) ו- (B). (יח, E) Micrographs שהוקלטו בעת עירור-488 ננומטר (λobs = 500-530 ננומטר, ירוק), 710 nm (שני הפוטונים; Λ obs = 390-465 nm, כחול). תאי Hep3B, שטופלו כלואהדבק-להארכה, היו מודגרות ב 37 ° C ב- EMEM (10% FBS) המכיל Hoechst 33342 (5 µg/mL) לפני (D) ואחרי (E) 2-מין חשיפה UV-365 ננומטר. גודל ברים = 20 מיקרומטר. Reprinted באישור הפניה20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: טרנסלוקציה הגרעין של דבק כלואה-המופעלות על-ידי אור ניר שני הפוטונים להארכה. לייזר קונפוקלי סורק micrographs של תאים Hep3B לאחר דגירה 3-h ב- 37 מעלות צלזיוס ב EMEM המכיל כלואהדבק-להארכה (10 מיקרומטר) ואחריו שטיפה עם D-PBS. Micrographs נרשמו על עירור-488 ננומטר (λobs = 500-530 ננומטר) לפני (א) ואחרי (B) שני הפוטונים הקרנה-710 nm למשך 2 דקות (30 s × 4). העיגול מקווקו הלבן ב- (א) מייצג את האזור לקרינה. גודל ברים = 20 מיקרומטר. Reprinted באישור הפניה20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: assay הכדאיות תא. Viabilities של תאים Hep3B לאחר דגירה של EMEM המכילה כלואהדבק-להארכה (0.1-100 מיקרומטר) לפני (א) ואחרי (B) 2-מין חשיפה UV-365 ננומטר. הודפס מחדש באישור הפניה20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: טרנסלוקציה הגרעין של דבק כלואה-מופעלות על ידי אור UV QD. לייזר קונפוקלי סורק micrographs של תאים Hep3B על עירור-405 ננומטר (λobs = 430-520 nm), 488 ננומטר (λobs = nm 625-680). Hep3B התאים היו מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ב- EMEM המכיל כלואהדבק-QD (10 ננומטר), שטפה עם D-PBS ולאחר מכן מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב- EMEM (10% FBS) המכיל Hoechst 33342 (5 µg/mL) לפני (א) ואחרי (B, C) 2-מין חשיפה UV אור-365 ננומטר. (ד) תמונת חתך לאורך הקו הצהוב ב (ג). גודל ברים = 20 מיקרומטר. Reprinted באישור הפניה20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Movie
סרט 1. טרנסלוקציה הגרעין של כלואהדבק-להארכה המופעלות על-ידי אור ניר שני הפוטונים. סריקת מיקרוסקופיה של תאים Hep3B לאחר דגירה 3-h ב- 37 מעלות צלזיוס ב EMEM המכיל כלואהדבק-להארכה לייזר קונפוקלי בצילום מואץ (10 מיקרומטר) ואחריו שטיפה עם D-PBS. Micrographs נרשמו עם 3-s במרווחים על עירור-488 ננומטר (λobs = 500-530 ננומטר). התאים הממוקמים בעיגול מקווקו הלבן היו מוקרן עם שני הפוטונים ניר אור 710 nm למשך 2 דקות (30 s × 4). הודפס מחדש באישור הפניה20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חקירות קודמות מבוססות אור טרנסלוקציה של חלבונים לתוך גרעין התא הושגו באמצעות בכלובים NLS7,8,9. כאמור, שיטות אלה דורשים שיטות נוספות כדי לשלב את החלבונים מתויג NLS בתוך הציטופלסמה. לעומת זאת, התגים דבק-R שלנו כלואהמאפשרת לא רק תמונה-induced רוברטסונית גרעינית, אלא גם ספיגת הסלולר של האורחים. תכונה זו של התג דבק-R כלואההיא יתרון עבור יישומים ויוו .

התג דבק-R כלואהיכול לספק לאורחים macromolecular כגון QDs לתוך גרעין התא. QDs המועסקים כאן הם קוטר גדול (DH = 15-20 ננומטר) מאשר נקבוביות הגרעין (~ 5 ננומטר)24, מציעה את האפשרות לספק מקרומולקולות אחרות פסיבי לא יכול להתפזר לתוך הגרעין. פרוטוקולים עבור functionalization של משטחים biomacromolecular עם קבוצות אזיד הם וותיקה25; בנוסף, סינתזה של תגיות דבק-R כלואההנושאת קבוצות פונקציונליות אחרות כגון maleimides, N- hydroxysuccinimide (NHS) אסטרים וכן הלאה כמו יחידת עגינת ירחיב את הישימות של כלואהדבק-R תגיות שונות ובמקרו-מולקולות ביולוגיות.

מיותר לציין השלב הקריטי של שיטה זו הוא שילוב של האורחים המתויגת כלואהדבק-R ויה אנדוציטוזה. יעילות ספיגת הסלולר של האורחים מתויג תלוי הריכוז שלהם זמן הדגירה. אם האורחים של עניין, כאשר המתויגת כלואהדבק-R, endocytosed לא יעיל, דגירה התאים יותר עם ריכוז גבוה יותר של האורחים מתויגות. חלופה אפשרית היא להגדיל את מספר דבק כלואה-שולבו האורח R.

האורחים בשימוש פרוטוקול זה הם covalently מצומדת לתגית דבק-R כלואה. זהו חיסרון אפשרי במיוחד עבור משלוח של ליגנדים מולקולה קטנה, שכן שלהם מחייב מולקולות היעד עשוי להיות מעוכבים על ידי התג דנדריטים מגושם. תיאגוד מקשר מגיב לגירויים26 בין התג כלואהדבק-R המולקולה חוות עשוי לאפשר שחרור של האורחים לאחר רוברטסונית גרעינית.

לסיכום, הפגנו מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים באמצעות תגי דבק מולקולרית (כלואהדבק-R) photoactivatable בכלוב. האורחים המתויגת כלואהדבק-R נלקחים לתוך החיים תאים באמצעות אנדוציטוזה ולהישאר בו endosomes. על photoirradiation, כלואהדבק-R מומר Uncagedדבק-R, אשר מאפשר את endosomal לברוח, רוברטסונית גרעיני עוקבות של האורחים. תצפיות ותיק נוסף עשוי להיות חשוב לחקור את גורלו של האורחים שנותרו את endosomes, כמו גם אלה מועברים אל תוך גרעין התא. ביטוי גנים spatiotemporally מבוקרת באמצעות תגי דבק-R כלואההוא נושא מעניין ראוי לחקירה נוספת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו להכיר את המרכז לשילוב NanoBio, באוניברסיטת טוקיו. עבודה זו היה נתמך על ידי מענק הסיוע עבור צעירים מדענים (B) (26810046) כדי לעלף ו חלקית נתמך על ידי מענק הסיוע למחקר מיוחד קידום (25000005) חומרי גלם עוזר ההוראה תודה מלגות של יפן אגודת המחקר עבור קידום המדע (JSPS ) עבור מדענים צעירים ואת התוכנית עבור המובילים בוגרת בתי ספר (GPLLI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azide-PEG4-NHS ester Click Chemistry Tools AZ103
Q-dot 655 ITK Invitrogen Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) NIPPON Genetics TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) Harvard Apparatus 7425-RC25K
Hep3B Cells ATCC HB-8064
8-chambered glass substrate Nunc 155411JP
96-well culture plate Nunc 167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM) Thermo Fisher Scientific 10370-021
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) Wako Pure Chemical Industries 045-29795
LysoTracker Red Lonza Walkersville PA-3015
Hoechst 33342 Dojindo H342
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Confocal laser scanning microscope Carl-Zeiss LSM 510 Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8
Xenon light source Asahi Spectra LAX-102
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax Paradigm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
  2. Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
  3. Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
  4. Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
  5. Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
  6. Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
  7. Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
  8. Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
  9. Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
  10. Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
  11. Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
  12. Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
  13. Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
  14. Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
  15. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
  16. Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
  17. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
  18. Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
  19. Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
  20. Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
  21. Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
  22. Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
  23. Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
  24. Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
  25. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Tags

כימיה גיליון 143 דבקים מולקולרית photoactivation גרעין התא endosomal לברוח רוברטסונית גרעינית עירור שני הפוטונים נקודות קוונטיות
Spatiotemporally מבוקר גרעיני טרנסלוקציה של האורחים בתאים חיים באמצעות דבקים מולקולרית בכלובים כמו Photoactivatable תגיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A.,… More

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter