Summary
Dieses Protokoll beschreibt Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit Käfig molekularen Klebstoff-Tags. Diese Methode ist viel versprechend für Website-selektiv-targeting Drug-Delivery.
Abstract
Der Zellkern ist eines der wichtigsten Organellen als subzelluläre Drug Delivery-Ziel seit Modulation der gen-Replikation und Ausdruck ist wirksam zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten. Hier zeigen wir, dass Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste mit molekularen Klebstoff (CagedKleber-R) Tags, sperrte deren mehrere Guanidinium Ion (Gu+) Anhänger von einer anionischen Photocleavable Gruppe (Butyrat-substituierten geschützt sind Nitroveratryloxycarbonyl; BA SVOC). Gäste, die mit dem Stichwort CagedKleber-R sind berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose und bleiben in Endosomen. Allerdings wird auf Photoirradiation, CagedKleber-R in uncaged molekularen Klebstoff (UncagedKleber-R) tragen mehrere Gu+ Anhänger umgewandelt, die Endosomal entweichen und anschließenden nuklearen Translokation der Gäste erleichtert. Diese Methode ist vielversprechend für Website-selektiv-targeting Drug-Delivery, da tagged Gäste in das Zytoplasma, gefolgt von den Zellkern übergehen können nur dann, wenn Photoirradiated. Im Käfig Kleber-R Tags können makromolekularen Gäste wie Quantenpunkte (QDs) sowie kleine Molekül Gäste liefern. Im Käfig Kleber-R Tags sind uncaged mit nicht nur UV-Licht, sondern auch zwei-Photon Nah-Infrarot (NIR) Licht, das tief in das Gewebe eindringen kann.
Introduction
Der Zellkern, der genetischen Information trägt, ist eines der wichtigsten Organellen als subzelluläre Drug Delivery-Ziel seit Modulation der gen-Replikation und Ausdruck ist wirksam zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs und genetische 1,2,3-Störungen. Für nukleare Lieferung von Medikamenten Konjugation von Peptid Stichwörter wie nukleare Lokalisierung Signale (NLS)4,5,6 allgemein untersucht worden ist. Um unerwünschte Nebenwirkungen zu reduzieren, ist jedoch räumlich-zeitliche Kontrolle der nuklearen Translokation notwendig.
Zuvor wurde Licht ausgelöst Translokation von Proteinen in den Zellkern mit Käfig NLS7,8,9erreicht. NLS wandert in den Zellkern durch die Bindung an zytoplasmatischen Transport Proteine6. In den gemeldeten Methoden sind Gast Proteine mit Käfig NLS direkt in das Zytoplasma durch Mikroinjektion8 integriert oder in den Zielzellen mit einem genetischen Code Ausbau Technik9ausgedrückt. Daher ist eine Methode, die zelluläre Aufnahme und Foto-induzierte nuklearen Translokation erreichen kann vorteilhaft für praktische Anwendungen.
Hier beschreiben wir Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit dendritischen eingesperrte molekularen Klebstoff (CagedKleber-R, Abb. 1) Tags. Wasserlösliche Leime molekulare10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 mit mehreren Gu+ -Anhänger sind bereits entwickelt worden, die halten uns fest an Proteine11,12,13,14,15, 16,17, Nukleinsäuren18,19,20, Phospholipid-Membranen-21und Ton Nanosheets22,23 durch die Bildung von zahlreichen Salz Brücken zwischen ihren Gu+ -Anhänger und Oxyanionic Gruppen auf die Ziele. Die Gu+ -Anhänger CagedKleber-r sind durch einen anionischen Photocleavable Gruppe, Butyrat ersetzt Nitroveratryloxycarbonyl (BASVOC) geschützt. Gäste, die mit dem Stichwort CagedKleber-R sind berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose und Aufenthalt in Endosomen (Abbildung 2). Auf Photoirradiation sind die BASVOC Gruppen von CagedKleber-R freistehend ein uncaged molekularen Klebstoff (UncagedKleber-R) tragen mehrere Gu+ Anhänger nachzugeben, dann die Migration von tagged Gast erleichtert in das Zytoplasma, gefolgt von den Zellkern (Abbildung 2). Caged-Kleber-R-Tag kann durch die Einwirkung von UV- oder zwei-Photon Nah-Infrarot (NIR) Licht ohne schwere Phototoxizität uncaged. Wir demonstrieren die raumzeitlich kontrollierte nukleare Lieferung von makromolekularen Gäste sowie kleine Molekül Gäste mit CagedKleber-R Tags Quantenpunkte (QDs) mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Nitrobenzoxadiazole; NBD), bzw. als Beispiele.
Abbildung 1: Schematische Strukturen der CagedKleber-R. Die 9 Guanidinium Ion (Gu+) Anhänger CagedKleber-r sind von einer Gruppe von Butyrat ersetzt Nitroveratryloxycarbonyl (BASVOC) geschützt. Die BA-SVOC-Gruppen sind durch Bestrahlung mit UV- oder zwei-Photon NIR Licht gespalten. Die fokale Kern CagedKleber-R ist mit Nitrobenzoxadiazole (NBD) oder Dibenzocylooctyne (DBCO) funktionalisiert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-20. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Licht-ausgelösten nuklearen Translokation Gäste konjugiert mit einem CagedKleber-R Tag. Der Gast /CagedKleber-R Konjugat berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose. Auf Photoirradiation ist das CagedKleber-R Tag uncaged die Bezeichnung für einen Uncaged-Kleber-R, weichen, der Endosomal Entweichen von der tagged Gast erleichtern kann. Anschließend wandert der tagged Gast in den Zellkern. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-20. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Protocol
1. Vorbereitung der Gäste mit KäfigKleber-R Stichwörter
- CagedKleber-NBD Lösung ansetzen.
- CagedKleber-NBD (Abbildung 1) nach dem Verfahren beschriebenen20zu synthetisieren.
- Bereiten Sie eine Stammlösung CagedKleber-NBD (10 mM) in trockenen Dimethyl Sulfoxid (DMSO).
Hinweis: Bewahren Sie die Stammlösung in Dunkelheit. Die Lösung kann mit wässrigen Puffer oder Zellkulturmedien nach Gebrauch verdünnt werden.
- CagedKleber-QD Lösung ansetzen.
- Synthetisieren CagedKleber-Dibenzocylooctyne (CagedKleber-DBCO) (Abbildung 1) nach den Verfahren zuvor20beschrieben.
- Bereiten Sie eine Stammlösung CagedKleber-DBCO (10 mM) in trockenen DMSO.
- Für die Vorbereitung von CagedKleber-QD zuerst vorbereiten-Azid funktionalisiert QDs (Azid-QD; ( Abbildung 3). 400 µL einer DMF 100 µL einer Dimethyl Formamid (DMF, 125 µM) Lösung von Azid-PEG4-NHS Ester (Abbildung 3) hinzufügen (500 nM) Lösung von Quantenpunkten (QDs) beschichtet mit Amin funktionalisiert PEG (Amin-QD; ( Abbildung 3). Rühren Sie die Mischung für 1 h bei Raumtemperatur.
- Die resultierende Lösung für 24 h gegen 800 mL DMF 3.500 Molekulargewicht Cut-Off (MWCO) eine regenerierte Zellulose-Membran mit Dialyse.
- CagedKleber-DBCO bis 50 µM mit DMF-Stammlösung zu verdünnen. Die Post-Dialyse-Lösung (Abbildung 3) 200 µL der Lösung hinzu und rühren Sie die Mischung für 3 h bei Raumtemperatur.
- Die resultierende Lösung für 24 h gegen 800 mL DMF eine regenerierte Zellulose-Membran (25.000 MWCO) mit Dialyse.
- Verdünnen Sie die resultierende Lösung bis 200 nM mit DMF.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Zubereitung von CagedKleber-QD. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
2. Vorbereitung des Hep3B Zellprobe für mikroskopische Beobachtungen
- Halten menschliche hepatozellulären Karzinom Hep3B Zellen in Adlers minimal wesentliche Medium (EMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) bei 37 ° C weniger als 5 % CO2.
- Samen der Zellen am Vortag das Experiment. 5.0 × 103 Hep3B Samenzellen pro Bohrloch eine 8 Kammern Glassubstrat in EMEM (10 % FBS, 200 µL), und inkubieren Sie die Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 für 24 h.
- Entfernen Sie das Kulturmedium zu und spülen Sie die Zellprobe mit 100 µL Dulbeccos Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (D-PBS) zweimal.
3. Beobachtung der nuklearen Translokation von Small-Molecule Gäste ausgelöst durch UV-Licht
- Liefern die Zellprobe (vorbereitet in Schritt 2.3) mit 200 µL der FBS-freie EMEM mit CagedKleber-NBD (10 µM) und inkubieren Sie die daraus resultierenden Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 für 3 h.
Hinweis: Die Zellprobe in FBS-freie EMEM länger als 4 h Inkubation verursacht schwere Zellschäden. - Entfernen Sie das Kulturmedium zu und spülen Sie die Zellprobe mit 100 µL D-PBS zweimal.
- Für die Visualisierung von den Endosomen, liefern die Zellprobe mit 200 µL EMEM (10 % FBS), einen rot-fluoreszierenden Farbstoff enthält (z. B.LysoTracker rot, 100 nM), und die daraus resultierende Zellprobe bei 37 ° C inkubieren unter 5 % CO2 für 20 min. entfernen die Kultur Medium und spülen die Zellprobe mit 100 µL der D-PBS zweimal. Liefern die Zellprobe mit 200 µL EMEM (10 % FBS).
- Setzen Sie für nukleare Translokation von CagedKleber-NBD die Zellprobe mit UV-Licht für 2 min. über eine optische Faser mit einer 100-W Xenon-Lichtquelle mit einem 365 nm Bandpass-Filter ausgestattet. Halten Sie für eine Referenzprobe Zelle ohne UV-Exposition die Zellprobe in Dunkelheit.
Hinweis: Der Deckel der Glassubstrate kann für effiziente UV-Exposition abgenommen werden. Langjähriger Exposition gegenüber UV-Licht kann dazu führen, dass Zytotoxizität zu den Zellen. - Für die Visualisierung der Kerne, dem Kulturmedium 1 µL Hoechst 33342 (1 mg/mL) hinzu, und inkubieren Sie die daraus resultierenden Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 10 min. lang.
- Unterliegt die Zellprobe konfokale Laser-scanning-Mikroskopie und erfassen die Mikrographen auf Anregung bei 488 nm (λObs = 500-530 nm), 543 nm (λObs = 565-620 nm), und 710 nm (zwei-Photon; Λ OBS = 390-465 nm) für NBD, rot fluoreszierenden Farbstoff und Hoechst 33342, beziehungsweise.
4. Beobachtung des nuklearen Translokation von Small-Molecule Gäste durch zwei-Photonen-NIR Licht ausgelöst
- Liefern die Zellprobe (vorbereitet in Schritt 2.3) mit 200 µL der FBS-freie EMEM mit CagedKleber-NBD (10 µM) und inkubieren Sie die daraus resultierenden Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 für 3 h.
- Entfernen Sie das Kulturmedium zu und spülen Sie die Zellprobe mit 100 µL D-PBS zweimal. Liefern die Zellprobe mit 200 µL EMEM (10 % FBS).
- Unterliegt die Zellprobe konfokale Laser-scanning-Mikroskopie und erfassen die Mikrographen auf Anregung bei 488 nm (λObs = 500-530 nm).
- Für nukleare Translokation von CagedKleber-NBD, die Region, einschließlich der Zelle von Interesse mit einem zwei-Photon Erregung Laser zu bestrahlen (710 nm), als eine Lichtquelle in das Mikroskop für 2 min (30 s × 4) installiert. Beobachten Sie die Translokation, wie unter Punkt 4.3 beschrieben.
5. Beobachtung der nuklearen Translokation der makromolekularen Gäste ausgelöst durch UV-Licht
- Liefern die Zellprobe (vorbereitet in Schritt 2.3) mit 200 µL der FBS-freie EMEM mit CagedKleber-QD (10 nM), und die daraus resultierende Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % inkubieren CO2 für 3 h.
- Entfernen Sie das Kulturmedium zu und spülen Sie die Zellprobe mit 100 µL D-PBS zweimal. Liefern die Zellprobe mit 200 µL EMEM (10 % FBS).
- Setzen Sie für nukleare Translokation von CagedKleber-QD die Zellprobe mit UV-Licht für 2 min. über eine optische Faser mit einer 100-W Xenon-Lichtquelle mit einem 365 nm Bandpass-Filter ausgestattet. Halten Sie für eine Referenzprobe Zelle ohne UV-Exposition die Zellprobe in Dunkelheit.
- Für die Visualisierung der Kerne, dem Kulturmedium 1 µL Hoechst 33342 (1 mg/mL) hinzu, und inkubieren Sie die daraus resultierenden Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 10 min. lang.
- Unterliegt die Zellprobe konfokale Laser-scanning-Mikroskopie und Aufzeichnen der Mikrographen auf Anregung bei 405 nm (λObs = 430-520 nm) und 488 nm (λObs = 625-680 nm) für Hoechst 33342 und QDs, beziehungsweise.
6. Zelle Lebensfähigkeit Assay
- Menschlichen hepatozellulären Karzinom Hep3B Zellen in EMEM pflegen (10 % FBS) bei 37 ° C weniger als 5 % CO2.
- Samen der Zellen am Vortag das Experiment. 5.0 × 103 Hep3B Samenzellen pro Bohrloch einer 96-Well-Kultur-Platte in EMEM (10 % FBS, 200 µL), und inkubieren Sie die Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 für 24 h.
- Entfernen Sie das Kulturmedium zu und spülen Sie die Zellprobe mit 100 µL D-PBS zweimal.
- Liefern die Zellprobe mit 200 µL der FBS-freie EMEM mit CagedKleber-NBD (0,1-100 µM) und inkubieren Sie die daraus resultierenden Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 für 3 h.
- Setzen Sie die Zellprobe mit UV-Licht für 2 min über eine optische Faser mit einer 100-W Xenon-Lichtquelle mit einem 365 nm Bandpass-Filter ausgestattet. Halten Sie für eine analoge Zellprobe ohne UV-Exposition die Zellprobe in Dunkelheit.
- Das Kulturmedium 10 µL des Reagenz Zelle zählen Kit-8 (10 µL) hinzu und inkubieren Sie die daraus resultierenden Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 für 2 h.
- Unterliegen die Zellprobe Absorption Spektroskopie (λ = 450 nm) mit einer Mikrotestplatte Reader.
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Representative Results
Vor Photoirradiation, Hep3B Zellen inkubiert mit CagedKleber-NBD ausgestellt punctata Fluoreszenzemission von ihrem inneren (λExt = 488 nm; Abbildungen 4A und 4 C, grün). Eine analoge Schliffbild erhielt nach Anregung bei 543 nm für rot fluoreszierenden Farbstoff (Zahlen 4 b und 4 C, rot), darauf hinweist, dass CagedKleber-NBD in den Endosomen lokalisiert. Dementsprechend wurde die Fluoreszenzemission belegbar, CagedKleber-NBD (Abbildung 4, grüne) außerhalb der Zellkern, die mit Hoechst 33342 visualisiert wurde beobachtet (λExt = 710 nm, zwei-Photon; Abbildung 4, blau). Nach UV-Bestrahlung die Zellen emittiert Fluoreszenz durch NBD (Abbildung 4E, grüne) auch aus dem Zellkern (Abbildung 4E, blau), darauf hindeutet, dass CagedKleber-NBD uncaged Rendite UncagedKleber-NBD, die war in migriert Das Zytoplasma, gefolgt von den Zellkern. Diese nukleare Translokation von CagedKleber-NBD kann Website selektiv durch zwei-Photonen-NIR-Licht (Abbildung 5A und Film 1, weiß gestrichelter Kreis) induziert werden. Wie in Abbildung 5 b und Film 1gezeigt, CagedKleber-NBD in nonirradiated Gebieten blieb nicht verschont von den Endosomen und blieb als punktförmige Fluoreszenz. Keine nennenswerten Zytotoxizität wurde für die Zellen behandelt mit CagedKleber-NBD vor und auch nach der UV-Exposition (Abbildung 6) beobachtet.
Die CagedKleber-R Tags liefern auch makromolekularen Gäste wie QDs in den Zellkern. Die QD /Caged-Kleber-R-Konjugat (CagedKleber-QD, Abbildung 3) kann in Hep3B Zellen (Abb. 7A) aufgenommen werden. Visualisierung des Zellkerns mit Hoechst 33342 zeigt, dass CagedKleber-QD außerhalb der Kern vor Photoirradiation (Abbildung 7A) bleibt. Nach UV-Exposition für 2 min entstand die Fluoreszenzemission von QDs im Zellkern (Zahlen 7 b und 7 C). Ein Cross-sectional Bild der Zellen nachgewiesen, dass belegbar, QDs Fluoreszenzemission in der Tat aus im Kern (Abbildung 7) emittiert wird.
Abbildung 4: Endosomal entweichen und nukleare Translokation von CagedKleber-NBD ausgelöst durch UV-Licht. Konfokale Laser-scanning-Aufnahmen von Hep3B Zellen nach 3 h Inkubation bei 37 ° C in EMEM mit CagedKleber-NBD (10 µM) gefolgt von Spülen mit D-PBS. (A, B) Mikrographen verzeichneten auf Anregung bei (A) 488 nm (λObs = 500-530 nm, grün) und (B) 543 nm (λObs = 565-620 nm, rot) nach 20 min Inkubation in EMEM (10 % FBS) mit rot fluoreszierenden Farbstoff (100 nM) . (C) zusammengeführten Bild (A) und (B). (D, E) Mikrographen aufgezeichnet auf Anregung bei 488 nm (λObs = 500-530 nm, grün) und 710 nm (zwei-Photon; Λ OBS = 390-465 nm, blau). Die Hep3B Zellen, mit CagedKleber-NBD, behandelt wurden bei 37 ° C in EMEM inkubiert (10 % FBS) mit Hoechst 33342 (5 µg/mL) vor (D) und nach (E) 2 min UV-Exposition bei 365 nm. Skalieren von Balken = 20 µm. Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-20. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Nukleare Translokation von CagedKleber-NBD ausgelöst durch zwei-Photon NIR Licht. Konfokale Laser-scanning-Aufnahmen von Hep3B Zellen nach 3 h Inkubation bei 37 ° C in EMEM mit CagedKleber-NBD (10 µM) gefolgt von Spülen mit D-PBS. Mikrographen verzeichneten auf Anregung bei 488 nm (λObs = 500-530 nm) vor (A) und nach (B) zwei-Photonen-Bestrahlung bei 710 nm für 2 min (30 s × 4). Der weiße gestrichelte Kreis in (A) stellt der bestrahlten Fläche. Skalieren von Balken = 20 µm. Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-20. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Zelle Lebensfähigkeit Assay. Künstliche Hep3B Zellen nach Inkubation in EMEM mit CagedKleber-NBD (0,1-100 µM) vor (A) und nach (B) 2 min UV-Exposition bei 365 nm. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-20. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Nukleare Translokation von CagedKleber-QD durch UV-Licht ausgelöst werden. Konfokale Laser-scanning-Aufnahmen von Hep3B Zellen bei Erregung bei 405 nm (λObs = 430-520 nm) und 488 nm (λObs = 625-680 nm). Hep3B Zellen wurden bei 37 ° C für 3 h in EMEM mit CagedKleber-QD inkubiert (10 nM), mit D-PBS gespült und dann bei 37 ° C für 10 min in EMEM inkubiert (10 % FBS) mit Hoechst 33342 (5 µg/mL) vor (A) und nach (B, C) 2 min UV-Exposition Licht bei 365 nm. (D) Cross-sectional Bild entlang der gelben Linie (C). Skalieren von Balken = 20 µm. Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-20. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Film 1. Nukleare Translokation von CagedKleber-NBD ausgelöst durch zwei-Photon NIR Licht. Time-Lapse konfokale Laser-scanning-Mikroskopie der Hep3B Zellen nach 3 h Inkubation bei 37 ° C in EMEM mit CagedKleber-NBD (10 µM) gefolgt von Spülen mit D-PBS. Mikrographen verzeichneten mit 3-s-Takt auf Anregung bei 488 nm (λObs = 500-530 nm). Die Zellen in der weiße gestrichelte Kreis wurden bestrahlt mit zwei-Photonen-NIR Licht am 710 nm für 2 min (30 s × 4). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-20. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
Vorausgegangenen Untersuchungen Licht ausgelöst Translokation von Proteinen in den Zellkern sind mit Käfig NLS7,8,9erreicht worden. Wie bereits erwähnt, erfordern diese Methoden zusätzliche Techniken, die NLS-markierten Proteine in das Zytoplasma zu integrieren. Im Gegensatz dazu ermöglicht unser Caged-Kleber-R-Tag nicht nur Foto-induzierte nuklearen Translokation, sondern auch zelluläre Aufnahme der Gäste. Diese Funktion des CagedKleber-R Tags ist für in-Vivo Anwendungen vorteilhaft.
CagedKleber-R Tag liefern makromolekularen Gäste wie QDs in den Zellkern. Die hier eingesetzte QDs sind im Durchmesser größer (DH = 15-20 nm) als die Kernporen (~ 5 nm)24, die Möglichkeit zu anderen Makromolekülen, die passiv in den Zellkern diffundieren kann nicht liefern. Protokolle für die Funktionalisierung von Biomacromolecular Oberflächen mit Natriumazid Gruppen sind gut etablierte25; Darüber hinaus Stichwörter Synthese von CagedKleber-R Tags mit anderen funktionellen Gruppen wie Maleimides, N- Hydroxysuccinimide (NHS) Ester und So weiter, wie eine Verankerung Einheit wird die Anwendbarkeit der CagedKleber-R erweitern zu verschiedenen Biomakromoleküle.
Unnötig zu sagen, ist der entscheidende Schritt dieses Verfahrens die Einbeziehung der Gäste mit dem Stichwort CagedKleber-R per Endozytose. Die Effizienz der zellulären Aufnahme von tagged Gäste hängt von ihrer Konzentration und die Inkubationszeit. Wenn die Gäste von Interesse, wenn mit CagedKleber-R, getaggt Endocytosed ineffizient sind, brüten Sie die Zellen länger mit höheren Konzentration der tagged Gäste. Eine mögliche Alternative ist die Zahl der CagedKleber-R in der Gast aufgenommen.
Die Gäste, die in diesem Protokoll verwendeten sind kovalent an das CagedKleber-R Tag konjugiert. Dies ist ein potentieller Nachteil vor allem für die Lieferung von kleinen Molekül-Liganden, da deren Bindung an das Ziel Biomoleküle durch das sperrige dendritischen Tag gehemmt werden kann. Einbau von einem Reize reagierende Linker26 zwischen dem CagedKleber-R Tag und Gastmolekül kann Freigabe der Gäste nach nuklearen Translokation ermöglichen.
Zusammenfassend haben wir Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste mit Photoactivatable Käfig molekularen Klebstoff (CagedKleber-R) Tags. Die Gäste, die mit dem Stichwort CagedKleber-R sind berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose und bleiben in den Endosomen. Auf Photoirradiation ist CagedKleber-R in UncagedKleber-R, konvertiert, die erleichtert die Endosomal entweichen und anschließenden nuklearen Translokation der Gäste. Weitere langjährige Beobachtungen können wichtig sein, das Schicksal der Gäste zu untersuchen, die in den Endosomen sowie die bleiben in den Zellkern geliefert. Raumzeitlich kontrollierte Genexpression mit CagedKleber-R Tags ist ein interessantes Thema würdig der weiteren Untersuchung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir anerkennen das Zentrum für NanoBio Integration, der University of Tokyo. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Beihilfe für junge Wissenschaftler (B) (26810046), K.O. und teilweise unterstützt von Beihilfe für speziell gefördert Forschung (25000005), t.a. r.m. Dank der Research Fellowships der Japan Society für die Förderung der Wissenschaft (JSPS ) für junge Wissenschaftler und das Programm für die führenden Graduate Schools (GPLLI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azide-PEG4-NHS ester | Click Chemistry Tools | AZ103 | |
| Q-dot 655 ITK | Invitrogen | Q21521MP | |
| Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) | NIPPON Genetics | TOR-3K | |
| Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) | Harvard Apparatus | 7425-RC25K | |
| Hep3B Cells | ATCC | HB-8064 | |
| 8-chambered glass substrate | Nunc | 155411JP | |
| 96-well culture plate | Nunc | 167008 | |
| Eagle's minimal essential medium (EMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10370-021 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare | SH30406.02 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) | Wako Pure Chemical Industries | 045-29795 | |
| LysoTracker Red | Lonza Walkersville | PA-3015 | |
| Hoechst 33342 | Dojindo | H342 | |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo | CK04 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl-Zeiss | LSM 510 | Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Xenon light source | Asahi Spectra | LAX-102 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax Paradigm |
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