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Immunology and Infection

इंकजेट प्रिंटर-सहायता प्राप्त स्वचालित चेकरबोर्ड सरणी और मैन्युअल टाइम-किल विधि द्वारा रोगाणुरोधी सिनर्जी परीक्षण

Published: April 18, 2019 doi: 10.3791/58636
Automatic Translation
1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

इस चेकरबोर्ड सरणी या समय-मार परख: रोगाणुरोधी सिनर्जी परीक्षण संयोजन में इस्तेमाल किया दो या अधिक एंटीबायोटिक दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है और आम तौर पर दो तरीकों में से एक द्वारा किया जाता है । यहाँ, हम एक स्वचालित, इंकजेट प्रिंटर की सहायता वाली चेकरबोर्ड सरणी सिनर्जी तकनीक और एक क्लासिक समय को मारने के तालमेल अध्ययन वर्तमान ।

Abstract

चूंकि मल्टीड्रग-रेसिस्टेंट (एमडीआर) रोगजनकों की दरें लगातार बढ़ रही हैं, नए एंटीमाइक्रोबिल्स के विकास से बाहर निकल रही हैं, एमडीआर बैक्टीरिया के उपचार के लिए उपन्यास दृष्टिकोण तेजी से एक आवश्यकता बनता जा रहा है । ऐसा ही एक तरीका संयोजन थेरेपी है, जिसमें दो या अधिक एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग एक संक्रमण के इलाज के लिए किया जाता है जिसके खिलाफ एक या दोनों दवाएं अकेले अप्रभावी हो सकती हैं । जब दो दवाएं, संयोजन में, एक से अधिक additive प्रभाव डालती है, वे synergistic माना जाता है । सहक्रियाशील गतिविधि की इन विट्रो जांच दवा संयोजनों की संभावित प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है । दो मुख्य इन विट्रो सिनर्जी परीक्षण तरीकों विकसित किया गया है: चेकरबोर्ड सरणी और समय को मार डालो अध्ययन । इस पेपर में, हम एक स्वचालित चेकरबोर्ड सरणी विधि है कि इंकजेट मुद्रण प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए दक्षता और इस तकनीक की सटीकता, साथ ही एक मानक मैनुअल समय मार तालमेल विधि को बढ़ाने के लिए करता है वर्तमान । स्वचालित चेकरबोर्ड सरणी एक उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग परख के रूप में काम कर सकते हैं, जबकि मैनुअल समय को मारने का अध्ययन synergistic गतिविधि और हत्या पर अतिरिक्त, पूरक डेटा प्रदान करता है ।

चेकरबोर्ड सरणी मानक ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) परीक्षण है, जिसमें बैक्टीरिया एंटीबायोटिक दवाओं के साथ अलग एकाग्रता संयोजनों में इंक्यूबेटिड और रातोंरात ऊष्मायन के बाद वृद्धि निषेध के लिए मूल्यांकन किया जाता है का एक संशोधन है । चेकरबोर्ड सरणी के मैनुअल प्रदर्शन की गणना और dilutions की एक श्रमसाध्य और त्रुटि-प्रवण श्रृंखला की आवश्यकता है । यहां प्रस्तुत स्वचालित विधि में, गणना और आवश्यक एंटीबायोटिक स्टॉक समाधान मात्रा का वितरण इंकजेट प्रिंटर प्रौद्योगिकी के उपयोग के माध्यम से स्वचालित हैं । समय में मार तालमेल परख, बैक्टीरिया ब्याज की एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इंक्यूबिटिड हैं, दोनों एक साथ और व्यक्तिगत रूप से, और मात्रात्मक संस्कृति के लिए 24 एच के पाठ्यक्रम पर अंतराल पर जांचा । परिणाम यह निर्धारित कर सकते है कि क्या एक संयोजन synergistic है और क्या यह जीवाणुनाशक है, और निषेध और समय के साथ बैक्टीरिया की हत्या पर डेटा प्रदान करते हैं ।

Introduction

मल्टीड्रग-रेसिस्टेंट (एमडीआर) बैक्टीरियल रोगजनकों का प्रसार, विशेषकर एमडीआर ग्राम-निगेटिव बैक्टीरिया जैसे कार्बापैनेम-रेसिस्टेंट एंट्रोबैक्टेरिएसी (सीआरई), ने सफल एंटी-संक्रामक थेरेपी के लिए तेजी से सीमित विकल्पों के साथ चिकित्सकों को छोड़ दिया है । 1, एक समस्या उपंयास जीवाणुरोधी दवा डिस्कवरी2,3की सुस्त गति से exacerbated । रोगाणुरोधी सिनर्जी, जिसमें संयोजन में प्रयुक्त दो दवाओं एक अधिक से अधिक additive प्रभाव डालती है, एमडीआर बैक्टीरिया के उपचार में उपयोग के लिए मौजूदा एंटीबायोटिक दवाओं की संभावना प्रदान करता है, यहां तक कि जब इन बैक्टीरिया एक या दोनों के लिए प्रतिरोधी रहे हैं एंटीबायोटिक दवाओं व्यक्तिगत । इस पत्र में वर्णित तकनीकों में इन विट्रो सिनर्जी परीक्षण के दो पूरक तरीके प्रदान करते है कि, जब एक साथ प्रयोग किया जाता है, जांचकर्ताओं कुशलतापूर्वक synergistic गतिविधि के सबूत के लिए ब्याज के रोगाणुरोधी संयोजनों स्क्रीन करने की अनुमति (स्वचालित चेकरबोर्ड सरणी विधि) और फिर और अवरोध और हत्या के प्रदर्शन के चरण में पहचान की होनहार संयोजनों द्वारा प्रदर्शित की कैनेटीक्स का मूल्यांकन करने के लिए (मैनुअल समय मार विधि) ।

इन विट्रो सिनर्जी परीक्षण के सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में से एक चेकरबोर्ड सरणी परख, ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता का एक संशोधन (MIC) परीक्षण जिसमें एक जीवाणु को अलग करने के खिलाफ दो अलग एंटीबायोटिक दवाओं की निरोधात्मक गतिविधि का परीक्षण कर रहे है एकाग्रता संयोजन की एक सीमा से अधिक4,5. यदि एक साथ प्रयोग करने पर दो औषधियां योगज क्रियाकलाप से अधिक कार्य करती हैं तो संयोजन को सहक्रियाशील माना जाता है । हालांकि, एक चेकरबोर्ड सरणी मैंयुअल रूप से स्थापित करने की गणना की एक श्रृंखला है और कमजोर और कदम है कि श्रमसाध्य और मानव त्रुटि के लिए असुरक्षित है pipetting शामिल हैं । इन बाधाओं को मुख्य रूप से एंटीबायोटिक संयोजनों और बैक्टीरियल आइसोलेट्स की छोटी संख्या के पूर्वव्यापी मूल्यांकन के लिए तालमेल परीक्षण के उपयोग को सीमित करने का प्रभाव पड़ा है, और परिणाम हमेशा अध्ययन के बीच संगत नहीं किया गया है7, 8,9,10,11. इसके अलावा, सिनर्जी परीक्षण की जटिलता नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला में अपनी अनुपलब्धता के लिए और संयोजन थेरेपी12के नैदानिक अध्ययन से इन विट्रो सिनर्जी परीक्षण डेटा के आभासी अनुपस्थिति में योगदान दिया है, १३।

आदेश में दक्षता और चेकरबोर्ड सरणी विधि का throughput बढ़ाने के लिए, हम एक स्वचालित MIC परीक्षण पहले हमारी प्रयोगशाला में विकसित की है कि इंकजेट मुद्रण प्रौद्योगिकी का उपयोग करता है ठीक है और लगातार छोटी मात्रा बांटना तकनीक का उपयोग किया एक microtiter प्लेट14में कुओं में एंटीबायोटिक स्टॉक समाधान । मंच जटिल गणना और कई pipetting चरणों के लिए की जरूरत को निराकरण करता है । एसोसिएटेड सॉफ्टवेयर की गणना करता है और एंटीबायोटिक दवाओं की उचित मात्रा dispenses एक दो आयामी चेकरबोर्ड सरणी बनाने के लिए अगर उपयोगकर्ता बस वांछित एकाग्रता रेंज और स्टॉक समाधान एंटीबायोटिक दवाओं की एकाग्रता । हम शुरू में CRE आइसोलेट्स के एक संग्रह के खिलाफ इस पद्धति का परीक्षण15 और बाद में colistin के खिलाफ गतिविधि के लिए संयोजन युक्त संयोजनों परीक्षण पर ध्यान केंद्रित किया है-प्रतिरोधी आइसोलेट्स16। Colistin अंतिम रिसॉर्ट की एक दवा आम तौर पर एमडीआर ग्राम-नकारात्मक रोगजनकों के उपचार में उपयोग के लिए आरक्षित है17,18, और colistin प्रतिरोध पहले से ही एमडीआर बैक्टीरिया लगभग पान प्रतिरोधी19renders, उंहें आदर्श बना जिन दवाओं के लिए वे व्यक्तिगत रूप से असंवेदनशील है का उपयोग उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए उंमीदवारों । हमने पाया है कि colistin और प्रोटीन संश्लेषण अवरोध करनेवाला एंटीबायोटिक minocycline के संयोजन तालमेल की एक बहुत उच्च दर था, यहां तक कि उपभेदों के खिलाफ है कि इन दवाओं में से प्रत्येक के लिए व्यक्तिगत रूप से प्रतिरोधी थे, संभवतः क्योंकि colistin एक उपनिरोधात्मक डालती यहां तक कि colistin प्रतिरोधी बैक्टीरिया पर प्रभाव permeabilizing । हमने इस पेपर में एक उदाहरण के रूप में उपयोग करने के लिए इस संयोजन को चुना है । ध्यान दें, सिनर्जी परीक्षण का उपयोग दो दवाओं की बढ़ी हुई प्रभावकारिता के लिए मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है, जो व्यक्तिगत रूप से प्रभावी हैं ।

स्वचालित चेकरबोर्ड सरणी विधि तेजी से, उच्च throughput तालमेल परीक्षण की सुविधा है । हालांकि, चेकरबोर्ड सरणी पद्धति में सीमाएं हैं । एक संशोधित MIC परख के रूप में, यह केवल बैक्टीरियल विकास के निषेध पर डेटा प्रदान करता है और नहीं की हत्या पर, और यह समय के साथ एंटीबायोटिक प्रभाव पर डेटा प्रदान नहीं करता है । इसके विपरीत, समय के मैनुअल प्रदर्शन को मार सिनर्जी assays है और अधिक श्रम गहन है, लेकिन दोनों निषेध और एक 24 एच समय पाठ्यक्रम20,21पर हत्या के बारे में जानकारी प्रदान करता है । हम समय को मार विश्लेषण आइसोलेट्स की एक छोटी संख्या पर हमारे चेकरबोर्ड सरणी परिणामों की पुष्टि करने के लिए और निर्धारित करने के लिए कि क्या synergistic संयोजन हम पहचान भी जीवाणुनाशक थे ।

दोनों चेकरबोर्ड सरणी और समय मार सिनर्जी तरीकों दवा संयोजन की गतिविधि पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं, और उच्च प्रतिरोधी बैक्टीरियल रोगजनकों के लिए संभावित उपंयास चिकित्सीय विकल्पों के मूल्यांकन में विशेष रूप से उपयोगी हैं । तरीकों में भी अंतर्निहित सीमाएं हैं । मानक microbroth तनुजा MIC विधि एक ज्ञात अपेक्षित त्रुटि श्रेणी के १ २-गुना तनुजा22, जो जब दो दवाओं एक चेकरबोर्ड सरणी में एक साथ परीक्षण किया जाता है बढ़ जाती है । सिनर्जी की मानक परिभाषा, जो एक संयोजन को तभी सहक्रियाशील मानती है, जब औषधियां एक-चौथाई अपने-अपने MICs6पर एक साथ सक्रिय होती हैं, इस अपेक्षित परिवर्तनशीलता को ध्यान में रखती है, लेकिन ऐसी परिवर्तनीयता (जिसके फलस्वरूप विचार होता है जैविक और तकनीकी उतार चढ़ाव के एक संयोजन से23) अनिवार्य रूप से तालमेल के परिणामों की विश्वसनीयता के बारे में निश्चित रूप से उत्पंन करता है । सिनर्जी परीक्षण के लिए स्थापित गुणवत्ता नियंत्रण मानकों की कमी भी एक मौजूदा सीमा है । शायद सभी तालमेल परीक्षण के तरीकों का सबसे महत्वपूर्ण सीमा में विट्रो परिणाम और नैदानिक परिणामों के बीच स्थापित correlations की कमी है जब संयोजन के लिए24रोगियों का इलाज किया जाता है । सरल और अधिक तेजी से तालमेल ऐसे स्वचालित चेकरबोर्ड सरणी विधि के रूप में परीक्षण के तरीके, यहां वर्णित, नैदानिक परीक्षणों या रोगी परिणामों के अंय मूल्यांकन के भीतर इन विट्रो सिनर्जी परीक्षण के एकीकरण की सुविधा के लिए बेहतर हो सकता है इन विट्रो और भविष्य में vivo में प्रभाव के बीच रिश्ते की विशेषता ।

हम यहाँ मौजूद स्वचालित चेकरबोर्ड सरणी विधि संयोजनों की एक किस्म के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए एक विकल्प प्रदान करता है और समय की एक बड़ी निवेश के बिना असामान्य, "उच्च जोखिम-उच्च इनाम" संयोजन के त्वरित मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है और संसाधनों. समय मार विधि, जो हम बाद में प्रदर्शित, संयोजन के synergistic गतिविधि पर अतिरिक्त सहायक जानकारी प्रदान कर सकते है और अपने जीवाणुनाशक गतिविधि और जीवाणुरोधी कैनेटीक्स की विशेषता में मदद कर सकते हैं ।

Protocol

चेतावनी: बैक्टीरिया के साथ काम करते समय उपयुक्त सुरक्षा प्रक्रियाओं का उपयोग करें । दस्ताने और हर समय एक प्रयोगशाला कोट पहनते हैं । एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करते हैं, तो एयरोसोल उत्पन्न किया जाएगा या उच्च जोखिम रोगजनकों के साथ काम कर रहे हैं ।

नोट: प्रयोगों को शुरू करने से पहले 24 घंटे के लिए, बैक्टीरियल आइसोलेट (एक कॉलोनी-शुद्ध, न्यूनतम passaged स्टॉक में जमे हुए-८० ° c में ५०% ग्लिसरीन स्टॉक के साथ) एक रक्त आगर थाली इस प्लेट को परिवेशी वायु में ३५ ° सेल्सियस पर सेक्यूबेट करते हैं ।

1. inkjet प्रिंटर-सहायता स्वचालित Checkerboard सरणी सिनर्जी

  1. रोगाणुरोधी स्टॉक समाधान (colistin और minocycline) बनाओ ।
    1. एंटीबायोटिक दवाओं की घुलनशीलता और चेकरबोर्ड सरणी में वांछित अंतिम सांद्रता के आधार पर प्रतिजैविक स्टॉक समाधान सांद्रता निर्धारित करें । इस उदाहरण के लिए colistin और minocycline के 10 मिलीग्राम/ प्रत्येक एंटीबायोटिक25के लिए उपयुक्त सॉल्वैंट्स निर्धारित करने के लिए Clsi M100 दस्तावेज़ का उपयोग करें । दोनों colistin और minocycline पानी में घुलनशील हैं; क्योंकि D300 इंकजेट प्रिंटर उचित जलीय द्रव हैंडलिंग के लिए surfactant के अलावा की आवश्यकता है, ०.३% polysorbate 20 के साथ ultrapure विआयनीकृत पानी में एंटीबायोटिक भंग ।
    2. एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर एंटीबायोटिक पाउडर बाहर वजन और लक्ष्य स्टॉक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक विलायक की मात्रा की गणना ।
      1. यदि एंटीबायोटिक एक नमक के रूप में आपूर्ति की है (जैसे colistin सल्फेट, minocycline हाइड्रोक्लोराइड) या हाइड्रेटेड रूप में (जैसे meropenem trihydrate), या यदि यह १००% शुद्धता से कम है करने के लिए निर्माता द्वारा रिपोर्ट की गई है, एक शक्ति गणना26 करने के लिए प्रदर्शन आवश्यक विलायक की मात्रा निर्धारित करते हैं ।
      2. ९०० मिलीग्राम/एमजी की एक कथित शुद्धता के साथ minocycline हाइड्रोक्लोराइड के इस उदाहरण का पालन करें:
        परख शुद्धता: ९०० मिलीग्राम/
        पानी की सामग्री: कोई नहीं
        सक्रिय अंश: ०.९२६ (minocycline के आणविक वजन (४९३.९४ Da)) के आण्विक वजन (४५७.४८ Da) से विभाजित करके प्राप्त की ।
        शक्ति = (परख शुद्धता) * (1-पानी की सामग्री) * (सक्रिय अंश)
        = (९०० मिलीग्राम/मिलीग्राम) * (1) * (०.९२६) = ८३३.४ मिलीग्राम/मिलीग्राम या ८३.३४%
        तो इस प्रकार के रूप में आवश्यक विलायक की मात्रा निर्धारित:
        मात्रा (एमएल) = [वजन (मिलीग्राम) * शक्ति (मिलीग्राम/एमजी)] ÷ (मिलीग्राम/एमएल)
        तो, उदाहरण के लिए, यदि ३४.७ मिलीग्राम minocycline हाइड्रोक्लोराइड पाउडर बाहर तौला है, एक 10 मिलीग्राम/एमएल समाधान बनाने के लिए आवश्यक विलायक की मात्रा का निर्धारण करने के लिए निम्न परिकलन का उपयोग करें:
        मात्रा = (३४.७ मिलीग्राम) * (८३३.४ मीटरजी/mg) = २.८९ मिलीलीटर
        १०,००० मिलीग्राम/एमएल
    3. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एंटीबायोटिक पाउडर डालो और पानी की उचित मात्रा प्लस ०.३% polysorbate 20 जोड़ें । भंवर जब तक भंग ।
    4. ०.५ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूबों और स्टोर में aliquot एंटीबायोटिक स्टॉक समाधान-८० ° c जब तक उपयोग के लिए तैयार है ।
  2. सिनर्जी परीक्षण के लिए कम से कम एक दिन पहले चेकरबोर्ड सरणी प्रयोगों में उपयोग के लिए रोगाणुरोधी शेयरों की गुणवत्ता नियंत्रण (QC) प्रदर्शन, ताकि QC परिणामों को सिनर्जी परीक्षण के लिए स्टॉक का उपयोग करने से पहले मूल्यांकन किया जा सके ।
    नोट:    QC तकनीक यहां वर्णित तकनीक है कि ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) व्यक्तिगत दवाओं के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के समान है और इस तरह के हित के किसी भी उपभेदों के साथ के रूप में अन्वेषक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. बैक्टीरियल सस्पेंशन तैयार करते हैं ।
      1. -८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर प्रत्येक एंटीबायोटिक स्टॉक का एक aliquot ले लो, जबकि बैक्टीरिया निलंबन की तैयारी विगलन शुरू करने के लिए । भंवर एक बार यह सुनिश्चित करने के लिए कि एंटीबायोटिक समाधान में है thawed ।
      2. एक उपयुक्त QC तनाव का चयन करें और दवाओं के लिए स्वीकार्य MIC सीमा निर्धारित तालिका 5a-1 में Clsi M10025के आधार पर परीक्षण किया जा रहा है । यहां दवाओं के लिए, ई. कोलाई atcc २५९२२ का उपयोग करें; इस स्ट्रेन के लिए एमआईसी रेंजों में 025-1 मिलीग्राम/एमएल मीनोसाइक्लिन के लिए और कोलिस्टिन के लिए 025-2 मिलीग्राम/एमएल है ।
      3. परीक्षण करने के लिए एंटीबायोटिक सांद्रता की एक सीमा का चयन करें कि पूरे QC रेंज शामिल होंगे । ०.०१५६ मिलीग्राम/एमएल की रेंज का प्रयोग करें 8 मिलीग्राम/एमएल के लिए minocycline और colistin के लिए ATCC २५९२२ ।
      4. एक 12 मिमी x ७५ मिमी गोल नीचे ग्लास संस्कृति ट्यूब के लिए ०.९% सोडियम क्लोराइड के 1 मिलीलीटर जोड़ें । ATCC २५९२२ और भंवर धीरे से निलंबित करने के लिए एक रात की थाली से एक या दो कालोनियों का चयन करें ।
      5. एक McFarland पाठक का उपयोग कर बैक्टीरिया की एकाग्रता की जांच करें । समायोजित करें के रूप में और अधिक ०.९% सोडियम क्लोराइड या अधिक बैक्टीरिया जोड़ने के लिए एक ०.५ McFarland आविलता पढ़ने प्राप्त करने के द्वारा की जरूरत है ।
      6. ०.५ McFarland निलंबन की एक 1:300 कमजोर करना करने के निलंबन के १०० मिलीलीटर से जोड़ने के लिए धनायन के 30 मिलीलीटर समायोजित म्यूलर-हिटन ब्रोथ (CAMHB) एक ५० एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 5x105 cfu/एमएल के अंतिम सेल घनत्व तक पहुँचने के लिए, के रूप में clsi द्वारा सिफारिश की27.
      7. एक बाँझ inoculating लूप का उपयोग करना, आइसोलेशन एक बूंद रक्त ऐगार प्लेट पर शुरू inoculating की एक बूँद inoculating शुद्धता की पुष्टि करने के लिए, और परिवेशी वायु में ३५ डिग्री सेल्सियस पर सेबेट.
    2. एक फ्लैट-नीचे, स्क्वायर-well, स्पष्ट, अनुपचारित ३८४-खैर प्लेट D300 का उपयोग करने के लिए रोगाणुबिलों जोड़ें । बैक्टीरियल सस्पेंशन तैयार करने के तुरंत बाद इस स्टेप को करें ताकि 15 मिनट की तैयारी26के अंदर ही सस्पेंशन को प्लेट्स में जोड़ा जा सके ।
      1. D300 इंकजेट प्रिंटर और संबंधित कंप्यूटर पर चालू करें । सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम खोलें ।
      2. कोई नई फ़ाइल प्रारंभ करें । प्लेट ग्रिड की छवि के ऊपर, प्लेट 1 पर राइट-क्लिक करें और संपादित करें प्लेटचुनें । उपयुक्त प्लेट प्रकार (३८४ अच्छी तरहसे) और अतिरिक्त मात्रा (५० मिलीलीटर) का चयन करें ।
      3. बाएं हाथ के पैनल पर तरल पदार्थ के बगल में धन चिह्न पर क्लिक करके प्रोटोकॉल के लिए तरल पदार्थ (यानी, एंटीबायोटिक स्टॉक) जोड़ें । दो तरल पदार्थ (colistin और minocycline) जोड़ें ।
        1. उस पैनल पर होवर करें जो फ्लूइड 1 के लिए दिखाई दे और संपादित करने के लिए पेंसिल पर क्लिक करे । द्रव "Colistin" नाम, वर्ग परिवर्तन करने के लिए "जलीय + बीच 20", परिवर्तन एकाग्रता १०,००० करने के लिए, और परिवर्तन एकाग्रता इकाइयों को मिलीग्राम/एमएल (ध्यान दें कि स्टॉक एकाग्रता है 10 मिलीग्राम/एमएल, यानी, १०,००० मिलीग्राम/एमएल). एकाग्रता पर b y बांटनाछोड़ें और शेष फ़ील्ड्स को उनकी डिफ़ॉल्ट सेटिंग पर छोड़ दें । क्लिक करें, ok।
        2. द्रव 2 (minocycline) के लिए ऊपर की प्रक्रिया को दोहराएं ।
        3. अंतिम अच्छी तरह से एंटीबायोटिक सांद्रता के लिए इस्तेमाल इकाइयों का निर्धारण करने के लिए स्क्रीन के शीर्ष पर वर्तमान प्रोटोकॉल टैब पर क्लिक करें और एमजी/एमएल के लिए एकाग्रता (मास) बदलें ।
      4. ग्रिड में 10 कुओं को क्लिक करके और खींचकर चुनें, फिर स्क्रीन के शीर्ष पर अनुमापन क्लिक करें । के लिए निर्दिष्ट अनुमापन का उपयोग कर उच्च एकाग्रताका चयन करें, तरल पदार्थ के लिए colistinचुनते हैं, उच्चतम एकाग्रता के लिए दर्ज करें 8 (सुनिश्चित करें कि इकाइयों मिलीग्राम/ 1:2 (५०%)का चयन करें । शेष विंडो के लिए डिफ़ॉल्ट मानों को स्थान पर छोड़ दें और ठीकक्लिककरें ।
      5. Minocycline के लिए ऊपर की प्रक्रिया को दोहराएं मिनोसाइक्लिन अनुमापन उत्पंन करते हैं ।
      6. प्रोटोकॉल सहेजें, और तब शीर्ष बाईं ओर रन बटन क्लिक करें ।
      7. प्रारंभ बटन क्लिक करें । लोड एक ३८४-अच्छी तरह से थाली (ढक्कन के साथ हटा दिया) थाली धारक और प्रेस में लोड प्लेट 1 के तहत लोड-सिनर्जी "शीघ्र ।
        नोट: यह संकेत सॉफ़्टवेयर द्वारा चुना गया है और यह संकेत नहीं है कि सिनर्जी परीक्षण किया जा रहा है । एक t8 कैसेट स्लॉट और प्रेस लोड के तहत भरी हुई में एक t8 + कैसेट जगह + कैसेट शीघ्र ।
      8. जब संकेत दिया, एंटीबायोटिक शेयर समाधान कैसेट पर संकेत जलाशयों में जोड़ें । उचित लदान के लिए स्क्रीन पर निर्देशों का पालन करें और ध्यान से वितरण समाधान में किसी भी बुलबुले हो रही से बचने के लिए । प्रत्येक समाधान जोड़ने के बाद, भरा हुआ बटन दबाएँ ।
      9. एक बार इंकजेट प्रिंटर उचित मात्रा में एंटीबायोटिक स्टॉक प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा गया है और पूरा भागो बॉक्स प्रकट होता है, बंदक्लिक करें, थाली को हटा दें, और D300 बंद कर दें ।
    3. ३८४ के लिए बैक्टीरियल सस्पेंशन जोड़ें-अच्छी तरह से थाली और सेने थाली ।
      1. एक बाँझ अभिकर्मक जलाशय में पहले से तैयार बैक्टीरियल निलंबन डालो ।
      2. सभी एंटीबायोटिक युक्त कुओं के लिए बैक्टीरियल निलंबन के ५० मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें । एक खाली अच्छी तरह से बैक्टीरिया के बिना CAMHB के ५० मिलीलीटर जोड़ें; यह नकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से मीडिया की बांझपन की पुष्टि करने के लिए किया जाएगा ।
      3. ३५ डिग्री सेल्सियस में प्लेस प्लेट 16-20 एच26के लिए परिवेशी वायु इनक्यूबेटर और सेबेट ।
        नोट: यदि एन्टेनोबैटेरिएसी के अलावा अन्य जीवों का परीक्षण किया जा रहा है, तो ऊष्मायन की एक भिन्न अवधि की आवश्यकता हो सकती है; जीव विशेष सिफारिशों के लिए CLSI M10025 से परामर्श करें ।
    4. ६०० (आयुध डिपो६००) के एक ऑप्टिकल घनत्व पर एक microplate रीडर पर प्लेट पढ़ें और परिणाम का विश्लेषण ।
      1. एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम, ≥ ०.०७ हरे रंग की एक आयुध डिपो६०० मूल्य के साथ छाया कोशिकाओं का उपयोग, विकास का संकेत है, और < 0.07 लाल के एक मूल्य के साथ कोशिकाओं, कोई वृद्धि का संकेत है ।
        नोट: इन मूल्यों के विकास के दृश्य निरीक्षण के आधार पर निर्धारित किया गया बनाम कोई वृद्धि और इन प्रयोगों के लिए OD रीडिंग के साथ सहसंबंध; अकेले मीडिया वाले कुओं से आयुध डिपो६०० रीडिंग लगातार ०.०७ नीचे थे । उपयुक्त कटऑफ अलग प्लेट पाठकों और बैक्टीरिया के साथ अलग हो सकता है ।
      2. प्रत्येक दवा के लिए MIC निर्धारित करते हैं. MIC दवा है, जिस पर बैक्टीरियल विकास हिचकते है की सबसे कम एकाग्रता है । यदि MIC CLSI M100 दस्तावेज़25के अनुसार अपेक्षित QC श्रेणी के भीतर है, स्टॉक समाधान उपयोग के लिए उपयुक्त है ।
  3. चेकरबोर्ड सरणी के लिए बैक्टीरियल निलंबन तैयार करें ।
    1. -८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर प्रत्येक एंटीबायोटिक स्टॉक का एक aliquot ले लो, जबकि बैक्टीरिया निलंबन की तैयारी विगलन शुरू करने के लिए । भंवर एक बार एंटीबायोटिक समाधान में है यह सुनिश्चित करने के लिए thawed ।
    2. एक 12 मिमी x ७५ मिमी गोल नीचे ग्लास संस्कृति ट्यूब के लिए ०.९% सोडियम क्लोराइड के ~ 1 मिलीलीटर जोड़ें । बैक्टीरिया की एक रात थाली से एक या दो कालोनियों का चयन करें (इस मामले में, ई. कोलाई तनाव एफडीए-सीडीसी ०४९४) और भंवर धीरे से इन को निलंबित करने के लिए ०.९% सोडियम क्लोराइड ।
    3. एक McFarland पाठक का उपयोग कर बैक्टीरिया की एकाग्रता की जांच करें । समायोजित करें के रूप में और अधिक ०.९% सोडियम क्लोराइड या अधिक बैक्टीरिया जोड़ने के लिए एक ०.५ McFarland आविलता पढ़ने प्राप्त करने के द्वारा की जरूरत है ।
    4. ०.५ McFarland निलंबन के १०० मिलीलीटर एक ५० मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में CAMHB के 30 मिलीलीटर को जोड़कर 5 x 105 cfu/एमएल27के एक अंतिम कोशिका घनत्व तक पहुंचने 1:300
  4. एक फ्लैट-नीचे, स्क्वायर-well, स्पष्ट, अनुपचारित ३८४-खैर प्लेट D300 का उपयोग करने के लिए रोगाणुबिलों जोड़ें ।
    नोट:     बैक्टीरियल निलंबन की तैयारी के बाद तुरंत इस कदम को पूरा करने के लिए कि निलंबन की तैयारी की 15 मिनट के भीतर प्लेटों में जोड़ा जा सकता है26.
    1. इंकजेट प्रिंटर चालू करें, एक नई फ़ाइल शुरू, और कदम 1.2.2.1-1.2.2.3 में के रूप में प्रोटोकॉल के लिए तरल पदार्थ जोड़ें ।
    2. सिनर्जी ग्रिड उत्पंन करते हैं ।
      1. स्क्रीन के शीर्ष पर सिनर्जी आइकन पर क्लिक करें और चरणों के माध्यम से आगे बढ़ें । प्रकार के लिए चुनें दो या अधिक तरल पदार्थ एक साथ सकारात्मक असर। थालीके लिए, यह किसी भी कुओं को बाहर करने के लिए आवश्यक नहीं है; परिवर्तन किए बिना इस चरण पर अगला क्लिक करें ।
      2. अनुमापन टैब पर, एंटीबायोटिक सांद्रता और प्लेसमेंट दर्ज करें ।
        1. आदेश में minocycline ३२ से ०.०३१ मिलीग्राम/एमएल कम दोहरीकरण dilutions में जोड़ने के लिए, कोई एंटीबायोटिक के साथ एक नकारात्मक अच्छी तरह के अलावा, वाई अक्ष नीचे, बाईं पैनल पर अनुमापन के स्तर के लिए 12 दर्ज करें । का उपयोग कर अनुमापन निर्दिष्टकरने के लिए, उच्चतम एकाग्रता का चयन करें; तरल पदार्थ के लिए, Minocycline का चयन करें; उच्चतम सांद्रताके लिए, ३२ दर्ज करें (सुनिश्चित करें कि इकाई Mg/mL पर सेट है; यदि ऐसा नहीं है, तो सिनर्जी संवाद बॉक्स को बंद करें और वर्तमान प्रोटोकॉल टैब के अंतर्गत बदलें) । सुनिश्चित करें कि शामिल 0 मान बॉक्स चेक किया गया है । 1:2 (५०%) में वितरण परिवर्तित करें ।
        2. 12 टाइट्रेट करने का स्तर और 16 की एक उच्चतम एकाग्रता का उपयोग कर, दाहिने हाथ पैनल पर colistin के लिए इन चरणों को दोहराएं । अगलाक्लिककरें ।
      3. लेआउट टैब पर, पहले 2 तरल पदार्थ का अनुमापन स्तर चुनें एक लेआउट ग्रिड में पंक्तियों और स्तंभों की संख्या निर्धारितकरें । अगलाक्लिककरें । ग्रिड अपेक्षा के अनुरूप प्रकट होता है, तो समाप्तक्लिक करें ।
    3. प्रोटोकॉल सहेजें, फिर ऊपर बाईं ओर रन बटन पर क्लिक करें ।
    4. प्रारंभ बटन क्लिक करें । लोड प्लेट धारक में एक ३८४-अच्छी तरह से (ढक्कन के साथ हटा) प्लेट और प्रेस लोड थाली 1-सिनर्जी संकेत के तहत भरी हुई । एक t8 कैसेट स्लॉट और प्रेस लोड के तहत भरी हुई में एक t8 + कैसेट जगह + कैसेट शीघ्र ।
    5. जब संकेत दिया, एंटीबायोटिक शेयर समाधान कैसेट पर संकेत जलाशयों में जोड़ें । उचित लदान के लिए स्क्रीन पर निर्देशों का पालन करें और ध्यान से वितरण समाधान में किसी भी बुलबुले हो रही से बचने के लिए । प्रत्येक समाधान जोड़ने के बाद, भरा हुआ बटन दबाएँ ।
    6. एक बार D300 मशीन उचित मात्रा में एंटीबायोटिक स्टॉक प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा गया है और पूरा भागो बॉक्स प्रकट होता है, बाहर निकलेंक्लिक करें, थाली को हटा दें, और d300 बंद कर देते हैं ।
  5. ३८४ के लिए बैक्टीरियल सस्पेंशन जोड़ें-अच्छी तरह से थाली और सेने थाली ।
    1. एक बाँझ अभिकर्मक जलाशय में पहले से तैयार बैक्टीरियल निलंबन डालो ।
    2. चेकबोर्ड सरणी में सभी कुओं के लिए निलंबन की ५० मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें । एक खाली अच्छी तरह से बैक्टीरिया के बिना CAMHB के ५० मिलीलीटर जोड़ें; यह नकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से मीडिया की बांझपन की पुष्टि करने के लिए किया जाएगा । 16-20 एच26के लिए एक ३५ ° c परिवेशी वायु इनक्यूबेटर में सेबेट ।
  6. ६०० आयुध डिपो पर एक microplate रीडर पर प्लेट पढ़ें और चेकरबोर्ड सरणी परिणामों का विश्लेषण ।
    1. सबसे पहले, शुद्धता की थाली की जांच करें और सुनिश्चित करें कि अलग कालोनियों एक एकल आकृति विज्ञान है कि जीव परीक्षण किया जा रहा की उंमीद आकारिकी के अनुरूप है की हैं ।
    2. एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम, शेड कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए वृद्धि और कदम 1.2.4.1 में के रूप में कोई विकास का संकेत है ।
    3. प्रत्येक दवा के लिए MIC निर्धारित करते हैं. एक दवा है कि सबसे अधिक जांच की एकाग्रता में बैक्टीरिया की वृद्धि को बाधित नहीं करता है के लिए, MIC के लिए बंद पैमाने पर माना जाता है.
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से जिसमें विकास हिचकते है के लिए, कि एंटीबायोटिक MIC के आधार पर प्रत्येक एंटीबायोटिक के लिए आंशिक निरोधात्मक एकाग्रता (FIC) निर्धारित ( चित्र 1b और चित्रा 2bदेखें) ।
      नोट: यह एक कुएं में एंटीबायोटिक के सांद्रण का अनुपात है, जिसमें विकास अपने MIC से हिचकते हैं; इसलिए एक दवा के लिए 8 मिलीग्राम/एमएल के साथ एक अच्छी तरह से युक्त 8 मिलीग्राम/एमएल के एक FIC है 1, जबकि एक अच्छी तरह से युक्त 4 मिलीग्राम/एमएल ०.५ की एक FIC है ।
    5. प्रत्येक कूप के लिए भिन्नात्मक निरोधात्मक सांद्रण सूचकांक (FIC-I) की गणना कीजिए जिसमें वृद्धि उस कूप में प्रत्येक औषधि के एफएफआई के योग के रूप में अवरुद्ध है ।
    6. निम्नतम fic का निर्धारण करें जिस पर वृद्धि रोकी जाती है (न्यूनतम fic) । यदि न्यूनतम FICमैं £०.५ है, संयोजन synergistic पर विचार; यदि 0.5-4, उदासीन संयोजन पर विचार; और अगर > 4, संयोजन विरोधी पर विचार करें । यदि संयोजन कुछ एकाग्रता संयोजनों पर synergistic है, लेकिन दूसरों पर विरोधी, इस परिणाम नोट लेकिन समग्र विरोधी संयोजन पर विचार करें ।

2. समय को मार सिनर्जी परीक्षण

  1. रोगाणुरोधी स्टॉक समाधान करें । अगर यह चरण प्रयोग के आगे किया जाता है, तो उपयोग के लिए तैयार होने तक स्टॉक को-८० ° c पर फ़्रीज़ करें ।
    1. एंटीबायोटिक दवाओं और समय में वांछित अंतिम सांद्रता की घुलनशीलता के आधार पर स्टॉक समाधान सांद्रता का निर्धारण अध्ययन को मार डालो । इस उदाहरण में, 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर की एकाग्रता पर colistin और minocycline स्टॉक्स बनाओ । प्रत्येक एंटीबायोटिक25के लिए उपयुक्त सॉल्वैंट्स निर्धारित करने के लिए Clsi M100 दस्तावेज़ का उपयोग करें । पानी का प्रयोग करें, के रूप में की सिफारिश की, दोनों colistin और minocycline के लिए ।
    2. विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर एंटीबायोटिक पाउडर बाहर वजन और लक्ष्य स्टॉक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक विलायक की मात्रा की गणना । यदि आवश्यक हो, तो आवश्यक विलायक की मात्रा निर्धारित करने से पहले एक शक्ति गणना करने के लिए, ऊपर चरण 1.1.2.1 में वर्णित के रूप में ।
    3. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में एंटीबायोटिक पाउडर डालो और पानी की उचित मात्रा में जोड़ें । भंवर जब तक भंग ।
  2. M0726clsi में वर्णित मैनुअल शोरबा microdilution विधि का प्रयोग, समय को मारने के तालमेल के प्रयोगों में उपयोग के लिए रोगाणुरोधी शेयरों की QC प्रदर्शन. सिनर्जी परीक्षण करने से पहले कि QC परिणाम स्टॉक का उपयोग करने से पहले की समीक्षा की जा सकती है तो यह चरण कम से कम एक दिन में निष्पादित करें ।
    1. एक उपयुक्त QC तनाव का चयन करें और दवाओं के लिए स्वीकार्य MIC सीमा निर्धारित तालिका 5a-1 में Clsi M10025के आधार पर परीक्षण किया जा रहा है । यहां दवाओं के लिए, ई. कोलाई atcc २५९२२ का उपयोग करें; इस स्ट्रेन के लिए एमआईसी रेंजों में 025-1 मिलीग्राम/एमएल मीनोसाइक्लिन के लिए और कोलिस्टिन के लिए 025-2 मिलीग्राम/एमएल है ।
    2. एंटीबायोटिक युक्त शोरबा microdilution प्लेटें तैयार करते हैं ।
      1. पूरे QC रेंज शामिल किया जा सकता है तो परीक्षण किया जा करने के लिए एंटीबायोटिक की उच्चतम एकाग्रता का चयन करें । ०.०१६ की एक सीमा का उपयोग करें 8 मिलीग्राम/मिलीलीटर के लिए minocycline और colistin के लिए ATCC २५९२२ ।
      2. CAMHB में एक काम कर समाधान के लिए दो बार उच्चतम एकाग्रता की जरूरत पर एंटीबायोटिक शेयरों पतला (क्योंकि यह बैक्टीरिया के निलंबन के साथ 1:1 पतला हो जाएगा) । इस उदाहरण में, दोनों स्टॉक 10 मिलीग्राम/एमएल से 16 मिलीग्राम/एमएल को पतला ।
      3. एक बहु चैनल pipette का प्रयोग, एक स्पष्ट, गोल नीचे, अनुपचारित ९६-अच्छी तरह से थाली के पहले कॉलम में एक अच्छी तरह से 2x एंटीबायोटिक निलंबन में से प्रत्येक के १०० मिलीलीटर जोड़ और सादे शोरबा (यानी, एंटीबायोटिक के बिना) के ५० मिलीलीटर जोड़ने के बाद कॉलम के प्रत्येक अच्छी तरह से ।
      4. पहले कॉलम में प्रत्येक कुएं से एंटीबायोटिक युक्त शोरबा के ५० मिलीलीटर निकालें और दूसरे स्तंभ में कुओं में जोड़ें । Pipette ऊपर और नीचे कई बार सामग्री मिश्रण करने के लिए, एक एंटीबायोटिक एकाग्रता छमाही पैदा करने के पहले कॉलम में एकाग्रता की ।
      5. प्रत्येक स्तंभ के साथ चरण 2.2.2.4 दोहराएँ, ताकि सीरियल दो गुना dilutions की एक श्रृंखला, प्रत्येक ५० मिलीलीटर की एक मात्रा के साथ, तैयार किया जाता है । एंटीबायोटिक carryover की संभावना को खत्म करने के लिए वांछित अगर प्रत्येक तनुता कदम के बीच पिपेट युक्तियाँ बदलें. ध्यान दें कि परिणामी सांद्रता सभी अभी भी अंतिम सांद्रता 2x कर रहे हैं, के रूप में वे बाद में बैक्टीरियल निलंबन के साथ 1:1 पतला हो जाएगा ।
      6. अंतिम दो स्तंभों में कोई एंटीबायोटिक न जोड़ें, क्योंकि ये नकारात्मक और वृद्धि नियंत्रण स्तंभ होंगे ।
    3. बैक्टीरियल सस्पेंशन तैयार करते हैं ।
      1. ई. कोलाई atcc की एक रात की थाली से एक ०.५ McFarland निलंबन ०.९% सोडियम क्लोराइड में २५९२२ कदम 1.2.1.5-1.2.1.6 में वर्णित के रूप में तैयार करते हैं ।
      2. ०.५ McFarland निलंबन की एक 1:150 कमजोर बनाने के निलंबन के ५० मिलीलीटर को जोड़ने के लिए CAMHB के ७.५ मिलीलीटर ।
        नोट: अंतिम बैक्टीरियल निलंबन 1:300 पतला हो जाएगा एक बार यह एंटीबायोटिक समाधान के साथ 1:1 मिलाया जाता है, CLSI तक पहुँचने की सिफारिश की सेल घनत्व 5 x 105 cfu/एमएल27).
    4. माइक्रोप्लेट और इनक्यूबेट में बैक्टीरिया को जोड़ें ।
      1. एक अच्छी तरह से करने के लिए बैक्टीरियल निलंबन के ५० मिलीलीटर जोड़ें, 11वें स्तंभ में छोड़कर । 11वें स्तंभ (नकारात्मक नियंत्रण स्तंभ) के लिए camhb के ५० मिलीलीटर जोड़ें ।
      2. 16-20 एच के लिए ३५
        नोट: यदि एन्टेनोबैटेरिएसी के अलावा अन्य जीवों का परीक्षण किया जा रहा है, तो ऊष्मायन की एक भिन्न अवधि की आवश्यकता हो सकती है; जीव विशेष सिफारिशों के लिए CLSI M10025 से परामर्श करें ।
      3. विकास के लिए थाली पढ़ें नेत्रहीन संचारित प्रकाश का उपयोग कर और, प्रत्येक एंटीबायोटिक के लिए, सबसे कम एकाग्रता जिसमें कोई वृद्धि नहीं है निर्धारित; यह माइक है । MIC26के दृश्य व्याख्या पर अतिरिक्त विवरण के लिए Clsi M07 दस्तावेज़ से परामर्श करें । यदि MIC अपेक्षित QC श्रेणी के भीतर है, तो स्टॉक समाधान उपयोग के लिए उपयुक्त है ।
  3. प्रारंभिक संस्कृति प्रारंभ करें ।
    1. ऊपर वर्णित के रूप में बाँझ ०.९% NaCl में परीक्षण जीव के एक ०.५ McFarland निलंबन करें ।
    2. एक 25 मिमी x १५० मिमी ग्लास दौर में CAMHB के 5 मिलीलीटर के लिए ०.५ McFarland निलंबन के १०० मिलीलीटर जोड़ें स्टेनलेस स्टील बंद करने और भंवर धीरे मिश्रण करने के लिए नीचे संस्कृति ट्यूब ।
    3. एक बाँझ inoculating लूप का उपयोग करना, अलगाव की लकीर एक रक्त ऐगार थाली पर पतला निलंबन की एक बूंद के लिए inoculating शुद्धता की पुष्टि और परिवेशी वायु में ३५ डिग्री सेल्सियस पर सेबेट ।
    4. ट्यूब पर बंद करने की जगह और एक परीक्षण ट्यूब रैक में एक शेखर पर एक शेखर में ३५ ° c के लिए परिवेशी वायु में, जब तक कि लघुगणकीय-चरण विकास तक पहुंच जाता है (2.6.1 कदम देखें) । २.४ कदम के लिए आगे बढ़ें, जबकि संस्कृति इनक्यूबेटर में है ।
  4. 25 मिमी x १५० मिमी ग्लास संस्कृति ट्यूबों में रोगाणुरोधी समाधान तैयार करें ।
    1. रोगाणुरोधी स्टॉक aliquots से बाहर ले-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर गल करने के लिए । भंवर एक बार एंटीबायोटिक समाधान में है यह सुनिश्चित करने के लिए thawed ।
    2. जबकि प्रारंभिक संस्कृति इंक्यूबैटिंग है, पांच autoclaved 25 मिमी x १५० मिमी ग्लास संस्कृति ट्यूब के लिए CAMHB के 10 मिलीलीटर जोड़ने और रोगाणुरोधी स्टॉक समाधान इस प्रकार जोड़ें ।
      नोट: एक तालमेल अध्ययन के लिए, कम से एक दवा एकाग्रता है कि विकास वक्र व्यक्तिगत रूप से प्रभावित नहीं करता है पर होना चाहिए28; यह सिनर्जी अध्ययन करने से पहले व्यक्तिगत दवा सांद्रता के प्रभाव का मूल्यांकन करके निर्धारित किया जा सकता है ।
      1. ट्यूब 1: लक्ष्य अंतिम एंटीबायोटिक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एंटीबायोटिक #1 की उचित मात्रा में जोड़ें । इस मामले में, 1 मिलीग्राम/एमएल colistin स्टॉक के 10 मिलीलीटर 1 मिलीग्राम/एमएल के एक अंतिम colistin एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, के रूप में यह एक एकाग्रता है कि इस उदाहरण में इस्तेमाल किया तनाव के खिलाफ अप्रभावी है जोड़ें ।
      2. ट्यूब 2: अंतिम एंटीबायोटिक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए एंटीबायोटिक #2 की उचित मात्रा में जोड़ें । इस मामले में, 1 मिलीग्राम/एमएल minocycline स्टॉक के 10 मिलीलीटर 1 मिलीग्राम/एमएल, एक एकाग्रता है कि इस उदाहरण में इस्तेमाल किया जा रहा तनाव के खिलाफ अप्रभावी है की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ें ।
      3. ट्यूब 3: ट्यूब 1 और 2 में इस्तेमाल के रूप में एंटीबायोटिक #1 और एंटीबायोटिक #2 की एक ही मात्रा में जोड़ें । इस मामले में, 1 मिलीग्राम/एमएल minocycline स्टॉक के 10 मिलीलीटर और 1 मिलीग्राम/एमएल colistin स्टॉक के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
      4. ट्यूब 4: कोई एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ें; यह ग्रोथ कंट्रोल ट्यूब होगी ।
      5. ट्यूब 5: कोई एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ें; यह निगेटिव कंट्रोल ट्यूब होगी ।
  5. ९६ गहरे कूप polypropylene के साथ 2 मिलीलीटर प्लेटों के साथ धारावाहिक dilutions के लिए ९००-एल बाँझ ०.९% सोडियम क्लोराइड की पंक्तियों के लिए B-H स्तंभों 1-5 एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ जोड़कर तैयार करते हैं ।
  6. संरोप शुरू करने और ट्यूबों को जोड़ने के लिए तैयार ।
    1. एक बार प्रारंभिक संस्कृति लघुगणक विकास के चरण तक पहुंच गया है (~ Klebsiella निमोनियाके लिए 3 एच, इस उदाहरण में इस्तेमाल किया जीव), shaker से संस्कृति ट्यूब हटाने, भंवर धीरे से, स्थानांतरण ~ एक 12 मिमी x ७५ mm ग्लास के निलंबन के 1 मिलीलीटर एक McFarland पाठक के साथ घनत्व की जांच करें ।
      1. यदि यह १.० मैकफार्लैंड से कम है, वापस करने के लिए शेखर और सेते लंबे समय ट्यूब । यह १.० McFarland से अधिक है, तो ट्यूब, भंवर धीरे, और फिर से नमूना, प्रक्रिया दोहरा जब तक निलंबन १.० McFarland पर है CAMHB जोड़ें ।
    2. 1-4 और भंवर धीरे से ट्यूबों के लिए १.० McFarland निलंबन के १०० मिलीलीटर जोड़ें ।
  7. प्रत्येक संस्कृति से नमूना aliquots और धारावाहिक दस गुना dilutions प्रदर्शन करते हैं ।
    1. 0 समय (तुरंत ट्यूबों के लिए बैक्टीरिया को जोड़ने के बाद) और 1, 2, 4, 6, और 24 ज पर, ट्यूब झुकाव द्वारा प्रत्येक संस्कृति ट्यूब से एक १५० मिलीलीटर aliquot इतना है कि केवल बाँझ पिपेट टिप ट्यूब में प्रवेश करती है और aliquot वापसी के दौरान unबाँझ पिपेट शाफ्ट नहीं । पहले से तैयार ९६ गहरी अच्छी तरह से थाली की पहली पंक्ति में लगातार कुओं के लिए, क्रमशः aliquots जोड़ें । वापसी ट्यूबों के लिए एक परीक्षण ट्यूब रैक में एक शेखर पर एक ३५ ° c हर समय aliquots हटाने के बाद तुरंत परिवेश एयर इनक्यूबेटर ।
    2. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, १०० मिलीलीटर पंक्ति a से निकालें, पंक्ति B में जोड़ें (जिसमें ०.९% सोडियम क्लोराइड का ९०० मिलीलीटर होता है), और पिपेट ऊपर और नीचे 4-5 बार मिक्स करने के लिए, एक 1:10 कमजोर बनाने । हर कमजोर पड़ने के उपाय के बाद युक्तियां छोड़ें बैक्टीरिया है, जो झूठा ऊंचा कॉलोनी गिनती करने के लिए नेतृत्व कर सकते है के आवक को रोकने के लिए ।
    3. प्रत्येक पंक्ति के लिए नए पिपेट युक्तियों के साथ B-H पंक्तियों के लिए चरण 2.7.2 दोहराएं ।
  8. प्लेट पतला नमूने के लिए कॉलोनी की गिनती ड्रॉप प्लेट विधि29,30का उपयोग कर ।
    1. लेबल म्यूलर-हिटन ऐगार प्लेट्स के साथ एंटीबायोटिक की स्थिति और तनुकरण चढ़ाया जाएगा ।
    2. एक मल्टीचैनल पिपेट और अतिरिक्त लंबी युक्तियों का उपयोग (यह सुनिश्चित करने के लिए कि युक्तियां निलंबन में पहुंच), एक स्तंभ में एक अच्छी तरह से 10 मिलीलीटर निकालें और ध्यान से एक पंक्ति में उचित लेबल प्लेट पर बांटना । यदि छोटे (१०० मिमी व्यास) प्लेटों का उपयोग किया जाता है, 3 पंक्तियों (प्रत्येक पंक्तियों से एक एकल स्तंभ की एक-एच) प्लेट प्रति मिलकर बांटना; बड़े (१५० मिमी व्यास) प्लेटों पर, थाली प्रति 8 पंक्तियों बांटना ।
    3. बूंदों को पूरी तरह से शुष्क करने की अनुमति दें (~ 15 मिनट).
    4. 24 घंटे में, एक 10 मिलीलीटर ड्रॉप को एक प्लेट के संकेत क्षेत्र में नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब से सीधे लिया जाता है ताकि बाँझपन के लिए परीक्षण किया जा सके । परिवेशी वायु में ३५ डिग्री सेल्सियस पर रात को पलटें और इनक्यूबेट करें ।
  9. कालोनियों की गणना और सेल घनत्व की गणना । डबल काउंटिंग या गुम कॉलोनियों से बचने के लिए प्लेट के रिवर्स पर फाइन-टिप परमानेंट मार्कर वाली कॉलोनियों को मार्क करें ।
    1. सबसे पहले, शुद्धता की थाली की जांच करें और सुनिश्चित करें कि अलग कालोनियों एक एकल आकृति विज्ञान है कि जीव परीक्षण किया जा रहा की उंमीद आकारिकी के अनुरूप है की हैं ।
    2. प्रत्येक कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए, 3-30 कालोनियों के साथ बूंदों की पहचान (आमतौर पर तनुता श्रृंखला प्रति एक बूंद) । इन बूंदों में कालोनियों गिनती और कमजोर पड़ने कारक के साथ गिनती रिकॉर्ड ।
      1. अगर वहां 3-30 कालोनियों के साथ एक कमजोर पड़ने श्रृंखला में कोई बूंदें, > 30 कालोनियों और < 3 कालोनियों के साथ पहली बूंद के साथ पिछले ड्रॉप में कालोनियों गिनती (ये आसन्न बूंदें होना चाहिए) ।
    3. प्रत्येक तनुता श्रृंखला के लिए, निम्न सूत्र का उपयोग करते हुए ड्रॉप में कालोनियों की संख्या के आधार पर नमूना में (CFU/एमएल) मिलीलीटर इकाइयों बनाने कॉलोनी की संख्या की गणना: CFU/एमएल = n(1/डी) (१००) जहां एन कालोनियों की संख्या है, डी तनुकरण फैक्टर है (1 undiluted नमूना (पंक्ति एक), ०.१ या 10-1 के लिए पहले 1:10 कमजोर पड़ने के लिए (पंक्ति बी), ०.०१ या 10-2 दूसरे 1:10 कमजोर पड़ने के लिए (पंक्ति सी), और इतने पर, और इस तथ्य के लिए निरंतर १०० खातों कि ड्रॉप की कुल मात्रा मैं एस 10 मिलीलीटर, जबकि अंतिम मान CFU/एमएल में व्यक्त किया जाता है, यानी, CFU/1000 मिलीलीटर । इस प्रक्रिया को सरल बनाने के लिए कॉलोनी संख्या से CFU/mL की गणना करने वाले सूत्रों वाले स्प्रेडशीट का उपयोग करें ।
      1. तनुता श्रृंखला के लिए जहां एक से अधिक बूंद गणनीय था (या जहां दो बूंदें था क्योंकि कोई बूंद श्रेणी में गिर गया गिना जाना था), औसत अंतिम CFU/
      2. क्योंकि पता लगाने की कम सीमा है ३०० CFU/एमएल (undiluted ड्रॉप में 3 कालोनियों), रिकॉर्ड और प्लॉट कॉलोनी < के रूप में गिनती £३०० CFU/
    4. समय 24 से बंध्यता नियंत्रण ड्रॉप निरीक्षण; यदि इस बूंद में कोई वृद्धि देखी जाए तो प्रयोग के परिणामों का प्रयोग नहीं करना चाहिए ।
  10. ग्राफ और परिणामों का विश्लेषण ।
    1. एक ही ग्राफ पर तीन एंटीबायोटिक युक्त संस्कृतियों और विकास नियंत्रण से विकास घटता प्लॉट । X अक्ष और Cfu/एमएल पर प्लॉट समय, एक लघुगणकीय पैमाने पर, वाई अक्ष पर का उपयोग कर ।
    2. समय 24 पर संयोजन ट्यूब और 24 समय में सबसे सक्रिय एकल एजेंट के बीच CFU/एमएल में अंतर की गणना । अगर ≥ 2 लॉग10अंतर है, संयोजन synergistic पर विचार करें. फिर समय पर 24 और समय 0 पर संयोजन ट्यूब के बीच CFU/एमएल में अंतर की गणना । यदि अंतर ≥ 3 लॉग10है, संयोजन जीवाणुनाशक पर विचार करें ।

Representative Results

चित्र 1a एक चेकरबोर्ड सरणी सिनर्जी प्रयोग से एक ग्रिड प्रस्तुत करता है जिसमें 0-32 μg/ml की सांद्रता में minocycline 0-16 Μg/ml के सांद्रता पर colistin के साथ संयुक्त था और ई. कोलाई स्ट्रेन एफडीए-सीडीसी ०४९४ के खिलाफ परीक्षण किया गया । मान ऑप्टिकल घनत्व ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) पर स्पेक्ट्रोफोटोमीट्रिक रीडिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं । ०.०७ नीचे आयुध डिपो६०० मूल्यों के साथ वेल्स (जो दृश्य निरीक्षण द्वारा कोई विकास से मेल खाती है) लाल छायांकित हैं, जबकि आयुध डिपो६०० मूल्यों ०.०७ के साथ (जो दृश्य निरीक्षण द्वारा विकास के लिए मेल खाती है) हरे छायांकित हैं । प्रत्येक दवा के लिए, न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC; bolded) दवा है कि बैक्टीरिया के विकास को रोकता है की सबसे कम एकाग्रता है । Minocycline के लिए, यह ३२ μg/mL है, और colistin के लिए, यह 8 μg/mL है । छायाप्रभाव चित्र 1bमें बना रहता है, परंतु कुओं के भीतर के मान, जिनमें वृद्धि रोकी जाती है, आंशिक निरोधात्मक सांद्रण सूचकांक (FIC-I) मानों द्वारा प्रतिस्थापित कर दिए जाते हैं । इन के रूप में निर्धारित कर रहे हैं: प्रत्येक अच्छी तरह से, प्रत्येक दवा के आंशिक निरोधात्मक एकाग्रता सूचकांक (FIC) है कि अच्छी तरह से दवा MIC द्वारा एंटीबायोटिक की एकाग्रता विभाजित द्वारा गणना की है, और FICमैं दो fics संक्षेप द्वारा गणना की है. ०.५, जो तालमेल के लिए cutoff माना जाता है की एक FICi मूल्य के साथ वेल्स, एक टूटी हुई लाइन सीमा के साथ संकेत कर रहे हैं, और सबसे कम ficमैं मान (०.०९४) के साथ अच्छी तरह से bolded है. क्योंकि न्यूनतम FIC मान सहक्रियाशील श्रेणी में होता है, अतः संयोजन को सहक्रियाशील माना जाता है ।

चित्रा 2a और चित्रा 2B शो ग्रिड चित्र 1a और चित्र 1bमें उन लोगों के अनुरूप, लेकिन इस मामले में संयोजन को अलग परीक्षण के खिलाफ तालमेल प्रदर्शित नहीं करता है (K. निमोनिया बीडीएमसी 4 को अलग), क्योंकि न्यूनतम FICमैं जिस पर वृद्धि रोकी जाती है 1 है, जो > 0.5 है ।

चित्रा 3 एक चेकरबोर्ड सिनर्जी ग्रिड है जिसमें कई छोड़े कुओं (enterobacter cloacae जटिल अलग bidmc 27) में हुई से ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग दिखाता है । छोड़े गए कुएं ऐसे कुँए हैं जिनमें जीवाणु की वृद्धि एंटीबायोटिक के उच्च सांद्रता वाले कुओं में बैक्टीरिया की वृद्धि के बावजूद अवरुद्ध होती है । यह घटना है, जो मानक MIC परीक्षण में होने के लिए जाना जाता है के रूप में अच्छी तरह से बैक्टीरियल विकास विशेषताओं में जैविक परिवर्तनशीलता के लिए अच्छी तरह से और बैक्टीरियल संरोप में छोटे मतभेदों को कुछ एंटीबायोटिक दवाओं की संवेदनशीलता के कारण होने की संभावना है23 , 31 , ३२. यदि एक से अधिक छोड़ दिया अच्छी तरह से एक चेकरबोर्ड सरणी में हुई, हम परिणाम खारिज और परख दोहराया ।

चित्रा 4 कश्मीर के खिलाफ परीक्षण किया तीन संयोजनों के समय को मारने के तालमेल के परिणाम के उदाहरण प्रस्तुत करता है निमोनिया ३२ कॉलोनी गिनती y-अक्ष और समय पर एक लघुगणकीय पैमाने में संकेत कर रहे हैं, घंटे में, एक्स-अक्ष पर. दवा संयोजन और 24 घंटे में उस ट्यूब में बैक्टीरिया की एकाग्रता युक्त ट्यूब में शुरू संरोप के बीच अंतर लाल पट्टी और संख्या से सचित्र है, जबकि ट्यूब के बीच 24 घंटे में बैक्टीरिया की एकाग्रता के बीच अंतर संयोजन और अकेले सबसे सक्रिय एकल एजेंट युक्त ट्यूब नीले रंग की पट्टी और संख्या से सचित्र है युक्त । चित्रा 4a colistin और minocycline के संयोजन से परिणाम दिखाता है; इस संयोजन (संयोजन को उजागर बैक्टीरिया की सांद्रता के बीच अंतर और सबसे सक्रिय अकेले एजेंट ≥ 2 लॉग10 cfu/24 ज पर एमएल/ सीएफयू/एमएल) । चित्रा 4b colistin और clindamycin, एक संयोजन है कि synergistic था, लेकिन जीवाणुनाशक नहीं था के संयोजन से परिणाम से पता चलता है । इस संयोजन बैक्टीरिया है, जो न तो दवा अकेले किया के विकास में हिचकते हैं, लेकिन उंहें मार नहीं किया । चित्रा 4C colistin और इरिथ्रोमाइसिन के संयोजन से परिणाम से पता चलता है, जो न तो जीवाणुनाशक था और न ही synergistic.

Figure 1
चित्रा 1: चेकरबोर्ड सरणी सिनर्जी का प्रदर्शन परिणाम (minocycline + colistin ई. कोलाई तनाव एफडीए के खिलाफ परीक्षण-सीडीसी ०४९४) । (क) किसी चेकरबोर्ड सरणी का स्पेक्ट्रमी प्रकाशमितीय पठन और वृद्धि व्याख्या । कोशिकाओं में मान ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) में ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग कर रहे हैं । ०.०७ नीचे आयुध डिपो६०० मूल्यों के साथ कोशिकाओं (दृश्य निरीक्षण द्वारा कोई विकास के लिए इसी) लाल छायांकित हैं, जबकि आयुध डिपो६०० मूल्यों ०.०७ के साथ कोशिकाओं (दृश्य निरीक्षण द्वारा विकास के लिए इसी) हरे रंग छायांकित हैं । (ख) आंशिक निरोधात्मक सांद्रण सूचकांक (एफआईसी I) परिकलन । विकास को दर्शाने वाला छायाप्रभाव बनाए रखा गया है । X-और y-अक्ष, क्रमशः के साथ colistin और minocycline के लिए मान, अब आंशिक निरोधात्मक एकाग्रता (FIC), या उस स्तंभ या पंक्ति में दवा की एकाग्रता का अनुपात न्यूनतम निरोधक एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं ( केवल उस दवा के MIC) । प्रत्येक कोशिका में मूल्य FICमैं, या कि अच्छी तरह से में दो दवाओं के fics का योग है । बड़ी टूटी हुई लाइन-bordered बॉक्स ०.५ की एक FICI के साथ कुओं encloses । स्थूल-परिवेशित कोशिका, निम्नतम FIC के साथ कूप को इंगित करती है, जिसमें वृद्धि रोकी जाती है, या न्यूनतम fic। क्योंकि न्यूनतम FICमैं ०.५ है, संयोजन synergistic माना जाता है. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: चेकरबोर्ड एक संयोजन है कि सिनर्जी (minocycline + colistin कश्मीर के खिलाफ परीक्षण का प्रदर्शन नहीं की सरणी परिणाम . फुफ्फुसी 4 bidmc को अलग) । (क) ६०० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व मान और चेकरबोर्ड सरणी परिणामों की वृद्धि व्याख्या जैसा कि चित्र 1क में बताया गया है । (ख) भिन्नात्मक निरोधात्मक सांद्रण सूचकांक (एफआईसी I) परिकलन जैसा कि चित्र 1क में बताया गया है । क्योंकि ंयूनतम FICI > 0.5 है, संयोजन synergistic नहीं माना जाता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: चेकरबोर्ड सरणी परिणाम है कि छोड़ कुओं के कारण unव्याख्यात्मक कर रहे हैं (minocycline + Enterobacter cloacae परिसर के खिलाफ परीक्षण किया colistin के लिए अलग bidmc 27). ६०० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों और चेकरबोर्ड सरणी परिणाम के विकास की व्याख्या के रूप में चित्र 1aके लिए वर्णित है । कई कुओं को छोड़ दिया, जिसमें एंटीबायोटिक के उच्च सांद्रता के साथ आसन्न कुओं में वृद्धि की उपस्थिति के बावजूद बैक्टीरियल विकास हिचकते है, प्रदर्शन कर रहे हैं । परिणाम interpretable नहीं हैं, और प्रयोग दोहराया जाना चाहिए । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: समय को मारने के तीन संयोजनों के खिलाफ परीक्षण के तालमेल के परिणाम के साथ निमोनिया को अलग bidmc ३२ । कॉलोनी गिनती y-अक्ष और समय पर एक लघुगणकीय पैमाने में संकेत कर रहे हैं, घंटे में, एक्स-अक्ष पर. 24 ज पर संयोजन में बैक्टीरिया की एकाग्रता और ट्यूब में शुरू संरोप के बीच अंतर लाल पट्टी और संख्या से सचित्र है । यदि संरोप शुरू करने से गिरावट पर एकाग्रता को 24 ज ≥ 3 लॉग10 cfu/एमएल, संयोजन जीवाणुनाशक माना जाता है. संयोजन और अकेले सबसे सक्रिय एकल एजेंट युक्त ट्यूब के बीच 24 घंटे में बैक्टीरिया की एकाग्रता के बीच अंतर नीले रंग की पट्टी और संख्या से सचित्र है; यदि ≥ 2 लॉग10 Cfu/एमएल कमी है, संयोजन synergistic माना जाता है. (क) कोलिस्टिन (सीएसटी) + minocycline (MIN), एक संयोजन है कि दोनों सहक्रियाशील और जीवाणुनाशक है । (ख) colistin + क्लीनडैमाइसिन (सीएलआई) एक ऐसा संयोजन है जो जीवाणुनाशक नहीं बल्कि सहक्रियाशील है । (ग) colistin + एरिथ्रोमाइसिन (ERY), एक संयोजन है कि न तो synergistic और न ही जीवाणुनाशक है । इन परिणामों को शुरू में colistin प्रतिरोधी Enterobacteriaceae, जिसमें हम का प्रदर्शन किया है कि colistin एक संख्या एंटीबायोटिक है कि व्यक्तिगत रूप से सक्रिय कर रहे है केवल (जैसे clindamycin) या मुख्य रूप से ग्राम-सकारात्मक जीवाणु के खिलाफ (जैसे इरिथ्रोमाइसिन)16। (ध्यान दें कि erythromycin दिखाया तनाव के खिलाफ चेकरबोर्ड सरणी द्वारा synergistic था, लेकिन समय से नहीं मार, तो यह यहां एक गैर synergistic संयोजन का एक उदाहरण के रूप में चुना गया है.) हम hypothesized है कि colistin, जो ग्राम-नकारात्मक बाहरी झिल्ली के permeabilization द्वारा कार्य करने के लिए जाना जाता है, colistin प्रतिरोधी ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया पर एक उप निरोधात्मक permeabilization प्रभाव डालती, की अनुमति के रूप में दवाओं के प्रवेश सामान्यत: ग्राम-ऋणात्मक कोशिका में प्रवेश नहीं कर सकता । इस आंकड़े के पैनल (क) Brennan से संशोधित किया गया है-Krohn, पीरोंटी, और किर्ने २०१८16, कॉपीराइट © अमेरिकन सोसायटी माइक्रोबायोलॉजी के लिए, रोगाणुरोधी एजेंटों और कीमोथेरेपी, 62 (10), २०१८, pii: e00873-18, doi: 10.1128/00873-18 । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां बताई गई दो विधियां दोनों अपनी व्यक्तिगत गतिविधि की तुलना में संयोजन में प्रयुक्त रोगाणुरोधी की गतिविधि के बारे में जानकारी प्रदान करती हैं । स्वचालित, इंकजेट प्रिंटर की मदद से डिजिटल वितरण विधि नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रक्रियाओं पुस्तिका३३में वर्णित विधि का एक adaption है, जबकि समय मार विधि और अधिक बारीकी से इसी प्रोटोकॉल के बाद से ही संदर्भ३४।

चेकरबोर्ड सरणी विधि में, गणना रोगाणुरोधी स्टॉक के लिए आवश्यक मात्रा का निर्धारण करने के लिए एक अच्छी तरह के रूप में अच्छी तरह से इन संस्करणों के वितरण को जोड़ने के लिए स्वचालित है, इस प्रकार एक मैनुअल में सामना करना पड़ा त्रुटि के प्रमुख संभावित स्रोतों में से कुछ को नष्ट करने चेकरबोर्ड सरणी । यह अभी भी आवश्यक है, तथापि, कि जांचकर्ता निर्धारित करता है कि मूल स्टॉक इरादा एकाग्रता पर बना रहे है और लक्ष्य अंतिम सांद्रता D300 सॉफ्टवेयर में सही ढंग से प्रवेश कर रहे हैं । एक ३८४-कूप प्लेट में कुओं के लिए रोगाणुरोधी निलंबन जोड़ने पहली बार में चुनौतीपूर्ण हो सकता है और यह सुनिश्चित करें कि पिपेट सुझावों उपयुक्त कुओं में प्रवेश और तरल ऊपर कुओं के किनारों छप नहीं है कि देखभाल की आवश्यकता है । एक स्वचालित तरल हेंडलर एक हाथ से आयोजित मल्टीचैनल पिपेट के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है गति और सटीकता, जिसके साथ जीवाणु निलंबन कुओं को जोड़ा जाता है बढ़ाने के लिए । प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में, D300 surfactant के अलावा की आवश्यकता है, polysorbate 20 (पी-20), उचित तरल से निपटने के लिए । एक अलग surfactant, polysorbate ८०, ०.००२% की एकाग्रता में, के साथ जीवों के लिए कम colistin MICs के लिए उल्लेख किया गया है < 2 μg/ ३५ , ३६ हमारी प्रयोगशाला पहले का प्रदर्शन किया है कि पी-20 सांद्रता पर ०.००१५% करने के लिए संदर्भ bmd14के साथ तुलना में D300-सहायतापूर्ण MIC परिणामों पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा । परख यहां प्रस्तुत उदाहरण में, अधिकतम पी 20 एकाग्रता है ०.००१४% ।

एक समस्या हम कुछ चेकरबोर्ड सरणी के साथ सामना करना पड़ा assays है छोड़ा कुओं की एक बड़ी संख्या थी । यह कुछ एंटीबायोटिक दवाओं के साथ आय से अधिक दर पर हुई । विशेष रूप से, carbapenem प्रतिरोधी Enterobacteriaceaeके एक संग्रह के खिलाफ संयोजन की एक स्क्रीन में, हमने पाया है कि जबकि ४९ ५२१ परीक्षण (९.४%) एक से अधिक छोड़े गए कुओं के कारण अनुपयोगी थे, 12 एंटीबायोटिक्स परीक्षण (fosfomycin और cefepime) के 2 इन परीक्षणों के ४६ के लिए जिंमेदार (९४%) । ऐसी बढ़ी हुई दरें उन दवाओं में अधिक होने की संभावना हो सकती है जो विशेष रूप से इननोकुलम प्रभाव31,३२,३७के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं । नोट की, clsi इस विधि के साथ परिणामों की विश्वसनीयता के बारे में चिंताओं के कारण, जो इस दवा के साथ देखा अविश्वसनीय परिणामों की व्याख्या कर सकते हैं शोरबा तनुजा में fosfomycin परीक्षण की सिफारिश नहीं करता है । अन्वेषक वरीयता के अनुसार स्वचालित चेकरबोर्ड विधि में कुछ संशोधन किए जा सकते हैं । रोगाणुरोधी प्लेटों में पहले से ही जीवाणु निलंबन से युक्त, बजाय खाली कुओं में तिरस्कृत किया जा सकता है, अगर यह प्रयोगशाला के भीतर कार्यप्रवाह के कारणों के लिए बेहतर है । जबकि ३८४-कूप प्लेटों का उपयोग यहां किया गया था, विधि भी ९६ में बाहर किया जा सकता है-अच्छी तरह से मात्रा के उचित संशोधन के साथ प्लेट assays हैं । एक ९६-कूप प्लेट प्रारूप का उपयोग एंटीबायोटिक दवाओं के लिए छोड़ दिया कुओं को कम करने में मदद कर सकता है कि विशेष रूप से inoculum में छोटे परिवर्तन के लिए संवेदनशील हैं । जब FIC कापरिकलन कर रहा है, वहाँ स्थितियों जहां MIC बंद पैमाने पर हो सकता है (यानी, परीक्षण से अधिक), जहां दवा परीक्षण किया जा रहा जीव के प्रकार के खिलाफ व्यक्तिगत रूप से कोई गतिविधि नहीं है सहित स्थितियों, परीक्षण किया जा रहा. इन मामलों में, FIC MIC संभालने के आधार पर गणना की जा सकती है एक कमजोर पड़ने उच्चतम एकाग्रता परीक्षण से अधिक है. यह सबसे रूढ़िवादी रणनीति है, क्योंकि यह किसी भी कमजोर पड़ने के लिए अधिक से अधिक संभव फिक वैल्यू को मानता है, जहां तालमेल परीक्षण के दौरान निषेध देखा जाता है । उदाहरण के लिए, यदि वास्तविक MIC के बजाय दो दोहरीकरण dilutions उच्चतम एकाग्रता परीक्षण से ऊपर थे, तो इसी FICs दो रूढ़िवादी कार्य से कम गुना होगा, और इतने पर ।

आदेश में सही समय में दवाओं की जीवाणुनाशक गतिविधि का आकलन करने के लिए मार परख, यह आवश्यक है कि संस्कृतियों लघुगणकीय चरण वृद्धि में हो, खासकर जब सेल दीवार सक्रिय एंटीबायोटिक दवाओं का परीक्षण किया जा रहा है28। इस उदाहरण में इस्तेमाल तेजी से बढ़ते बैक्टीरिया के लिए (के. फुफ्फुसनिआ), झटकों के साथ 3 घंटे के इस विकास के चरण तक पहुँचने के लिए उपयुक्त था, लेकिन विभिन्न जीवों के लिए समय की विभिन्न मात्रा आवश्यक हो सकता है. आम तौर पर, संस्कृति दिखाई देना चाहिए, लेकिन भारी नहीं turbid । समय की उचित राशि कॉलोनी धारावाहिक समय अंक (जैसे, 4-6 एच के लिए हर 30 मिनट)३८में लिया गिनती के साथ एक विकास वक्र के निर्माण के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । समय की मार अध्ययन में संरोप शुरू करने का इरादा भी महत्वपूर्ण है । शुरू संरोप के लक्ष्य एकाग्रता लगभग 5 x 105 से 1 एक्स 106 cfu/एमएल है । यहां वर्णित तनुकरण (१०० μl का १.० mcfarland निलंबन मीडिया के 10 मिलीलीटर में) klebsiella निमोनिया और अन्य enterobacteriaceae प्रजातियों के लिए इस संरोप उत्पन्न करता है जिस पर हम यह परीक्षण किया है. यदि विभिन्न जीवों का प्रयोग करते हुए प्रयोग में प्रारंभ होने वाले इनाकोकुला का घनत्व इस से काफी अधिक या कम है, तो एक अलग तनुकरण की आवश्यकता हो सकती है । (किसी दी गई प्रजाति के लिए आवश्यक उचित तनुकरण का निर्धारण ०.५ या १.० मैकफर्लैंड निलंबन की प्लेट काउंट करके यह पता लगाने के लिए किया जा सकता है कि यह आविलता कितने जीवों का प्रतिनिधित्व करती है, फिर उस राशि की गणना जिसके द्वारा आरंभिक निलंबन होना चाहिए उचित अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए पतला.) यदि, सिनर्जी अध्ययन से प्लेट गणना की समीक्षा पर, एंटीबायोटिक युक्त ट्यूबों के किसी भी शुरू संरोप विकास नियंत्रण के शुरू संरोप से काफी कम है पाया जाता है, यह या तो एंटीबायोटिक आवक या बहुत से संकेत मिल सकता है एंटीबायोटिक युक्त ट्यूब और चढ़ाना के लिए aliquot को हटाने के लिए बैक्टीरिया के अलावा संक्षिप्त समय में बैक्टीरिया की तेजी से हत्या । यदि एक श्रृंखला में undiluted ड्रॉप में कालोनियों की वास्तविक संख्या बाद dilutions में कालोनियों की संख्या से कम है, यह एंटीबायोटिक आवक प्रभाव का सुझाव । विभिंन विकल्पों के इस प्रभाव को रोकने के लिए वर्णित किया गया है, एक पूरी थाली३८ पर एक एकल aliquot प्रसार या नीचे नमूना कताई, supernatant हटाने, और फिर बाँझ नमकीन में३९चढ़ाना से पहले सस्पैंड शामिल है । समय मार विधि में हर समय बिंदु पर, यह भी अन्वेषक के लिए कुशलता से महत्वपूर्ण है, लेकिन सही ढंग से प्रत्येक संस्कृति ट्यूब से एक aliquot हटाने और धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करते हैं । इस प्रक्रिया के दौरान देरी, विशेष रूप से जल्दी समय के दौरान है कि निकट उत्तराधिकार में पाए जाते हैं, लंबी अवधि के लिए नेतृत्व कर सकते है जिसके दौरान संस्कृतियों और न ही हिला कर रख दिया गया है, जबकि लापरवाह वितरण और धारावाहिक dilutions गलत थाली के लिए नेतृत्व कर सकते है मायने रखता. प्लेट की गिनती के प्रसार प्लेट विधि की तुलना में, जिसमें एक कमजोर पड़ने के १०० μL एक पूरे आगर थाली में फैला हुआ है, ड्रॉप प्लेट विधि वर्णित कहीं अधिक तेजी से है, और अधिक तेज की आवश्यकता है, और तेजी से गिनती के लिए अनुमति देता है, के रूप में अधिकतम प्रत्येक बूंद के लिए कालोनियों की गणनीय संख्या 30 है, जबकि अप करने के लिए ३०० कालोनियों आम तौर पर एक फैल थाली से गिना जा सकता है । हालांकि, फैलाओ प्लेट विधि भी एक विकल्प है अगर जांचकर्ताओं इस तकनीक के साथ और अधिक आरामदायक हैं । एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ वितरण के बाद एक दूसरे में फैल जाता है, तो एक एकल चैनल पिपेट के साथ अधिक व्यापक रूप से दूरी की बूंदों के व्यक्तिगत आवेदन के बजाय प्रदर्शन किया जा सकता है । हमारे अनुभव में, 4 डिग्री सेल्सियस से पहले बूंदों वितरण करने के लिए अत्यधिक प्रसार को कम करने के लिए लग रहा था पर ठंडा प्लेटें ।

तकनीकों की एक सीमा यहां वर्णित है कि तालमेल परख के दो प्रकार के परिणाम (checkerboard सरणी और समय को मारने) हमेशा के लिए नहीं हैं, और के बाद से सबसे प्रकाशित सिनर्जी लेख एक विधि का उपयोग करें या अंय के बजाय दोनों एक साथ, यह कर सकते है assays के दो प्रकार से डेटा एकीकृत करने के लिए पता करने के लिए मुश्किल हो सकता है । क्योंकि हम स्वचालित चेकरबोर्ड सरणी विधि विकसित सरल और उच्च throughput है, हम इसे प्रभाव में एक तरह की स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया है आइसोलेट्स की एक बड़ी संख्या के खिलाफ संयोजन का परीक्षण करने के लिए और निर्धारित करने के लिए जो एकाग्रता संयोजन synergistic थे । हम तो समय की एक छोटी संख्या को मारने के अध्ययन, संयोजन और सांद्रता है कि चेकरबोर्ड सरणी में प्रभावी किया गया था का चयन । ध्यान दें, क्योंकि चेकरबोर्ड परख आम तौर पर एक microbroth तनुकरण पैमाने पर किया जाता है, जबकि समय को मारने परख बड़ी मात्रा का उपयोग करता है (एक macrobroth कमजोर पड़ने के समान), हमने पाया है कि fics दो तरीकों के बीच कई बार अलग थे, उच्च के साथ सांद्रता में आम तौर पर समय की आवश्यकता को मार परख गतिविधि प्रदर्शन । यह घटना पहले उल्लेख किया गया है जब macrobroth और microbroth तनुकरण MIC परख परिणाम ग्राम के लिए तुलना कर रहे हैं-नकारात्मक बेसिली26 और जब बड़ा inocula (के रूप में समय में इस्तेमाल किया अध्ययन को मारने) में इस्तेमाल किया मानक inocula के साथ तुलना कर रहे हैं माइक्रोब्रोथ तनुकरण और चेकरबोर्ड सरणी३२assays हैं । चेकरबोर्ड सरणी की एक विशिष्ट सीमा microbroth तनुकरण MIC परीक्षण22में निहित परिवर्तनशीलता है । जबकि FIC इस परिवर्तनीयता के लिए खाते के लिएमैं कटऑफ गणितीय6 ऐसी परिवर्तनशीलता अनिवार्य रूप से विश्वसनीयता और चेकरबोर्ड सरणी परिणामों की निरंतरता के बारे में चिंता को जंम देती है ।

क्योंकि सभी के लिए निहित सीमाओं के विट्रो सिनर्जी परीक्षण तरीकों (एक कृत्रिम विकास के माध्यम में बैक्टीरिया की खेती सहित, स्थैतिक एंटीबायोटिक सांद्रता, और एक सीमित समय पाठ्यक्रम), इन तरीकों से प्राप्त परिणाम की पुष्टि की जानी चाहिए और इसके अलावा पूरक तकनीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया । इस तरह के तरीकों में इन विट्रो फार्माकोकानैटिक/भेषज-गतिक (पीके/पीडी) अध्ययनों (जैसे, खोखले फाइबर संक्रमण मॉडल४०), पशु मॉडलों और अंतत मानव पीके/पीडी और प्रभावकारिता अध्ययन शामिल हैं । स्वचालित चेकरबोर्ड सरणी विधि यहां वर्णित है, एक तेजी से विधि के साथ जो संभावित synergistic गतिविधि के लिए स्क्रीन संयोजन प्रदान करके, इन तकनीकों का अधिक लक्षित उपयोग के लिए अनुमति देता है । इन सभी पद्धतियों का और अधिक स्वचालन, साथ ही इन विट्रो मापदंडों और नैदानिक परिणामों के बीच संबंधों का अधिक व्यवस्थित अन्वेषण, सिनर्जी परीक्षण के उपयोग को बढ़ाने और इसकी नैदानिक प्रयोज्यता में वृद्धि करने में महत्वपूर्ण होगा ।

Disclosures

D300 डिजिटल मशीन और संबद्ध उपभोग्य सामग्रियों Tecan द्वारा प्रदान की गई (Morrisville, नेकां) थे । Tecan अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह/व्याख्या, पांडुलिपि तैयार करने, या प्रकाशित करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी ।

Acknowledgments

Thea Brennan-Krohn एक Eunice कैनेडी Shriver राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास बाल चिकित्सा संक्रामक रोग अनुसंधान प्रशिक्षण अनुदान (T32HD055148), एक राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग प्रशिक्षण अनुदान के संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था ( T32AI007061), एक बोस्टन बच्चों के संकाय विकास संकाय कैरियर विकास फैलोशिप के अस्पताल कार्यालय, और एलर्जी और संक्रामक रोगों कैरियर विकास पुरस्कार (1K08AI132716) के एक राष्ट्रीय संस्थान । J.E.K. पुरस्कार संख्या R33 AI119114 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों की एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था । सामग्री केवल लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण समस्या १४६ रोगाणुरोधी तालमेल एंटीबायोटिक तालमेल सिनर्जी रोगाणुरोधी प्रतिरोध colistin प्रतिरोध carbapenem-प्रतिरोधी enterobacteriaceae समय-मार तालमेल चेकरबोर्ड सरणी स्वचालन इंकजेट मुद्रण
इंकजेट प्रिंटर-सहायता प्राप्त स्वचालित चेकरबोर्ड सरणी और मैन्युअल टाइम-किल विधि द्वारा रोगाणुरोधी सिनर्जी परीक्षण
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Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E.… More

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).

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