Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Antimikrobielle synergi Testing av blekkskriver-assistert automatiske sjakkbrett matrise og metoden for manuell tid-kill

Published: April 18, 2019 doi: 10.3791/58636
Automatic Translation
1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Antimikrobielle synergi testing brukes til å evaluere effekten av to eller flere antibiotika som brukes i kombinasjon og utføres vanligvis av en av to metoder: sjakkbrett matrisen eller tid-kill analysen. Her presenterer vi en automatisert, inkjet-skriver-assistert sjakkbrett matrise synergi teknikk og en klassisk tid-kill synergi studie.

Abstract

Som priser multidrug-resistente (MDR) patogener fortsetter å stige, outpacing utviklingen av nye hemmestoffer, blir stadig mer romanen tilnærminger til behandling av MDR bakterier en nødvendighet. En slik tilnærming er Kombinasjonsbehandling, i som to eller flere antibiotika brukes sammen til å behandle en infeksjon mot en eller begge av narkotika kan være ineffektiv alene. Når to stoffer, i kombinasjon, utøve større enn additiv effekt, de anses synergistisk. In vitro undersøkelse av samvirkningen er et viktig første skritt i å vurdere mulige effekten av rusmiddelkombinasjoner. To viktigste i vitro synergi testmetoder er utviklet: sjakkbrett matrisen og tid-kill studien. I dette papiret, vi presentere en automatisert sjakkbrett matrisemetode som gjør bruk av blekk trykking teknologien for å øke effektivitet og nøyaktighet av denne teknikken, i tillegg til standard manuell tid-kill synergi metode. Automatiske sjakkbrett matrisen kan tjene som en høy gjennomstrømming screening analysen, mens manuelle tid-kill studien gir ekstra, utfyllende data om samvirkningen og drap.

Sjakkbrett matrisen er en modifikasjon av standard minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) testing, hvor bakterier inkubert med antibiotika på ulike konsentrasjon kombinasjoner og vurdert for vekst hemming etter overnatting inkubasjon. Manuell ytelse i sjakkbrett matrisen krever en arbeidskrevende og feilutsatte rekke beregninger og fortynninger. I det automatiserte metoden presenteres her, beregning og utlevering av nødvendige antibiotika lagerløsning volumer er automatisert gjennom bruk av inkjet-skriverteknologi. I tid-kill synergi analysen, er bakterier inkubert med antibiotika interesse, både sammen og individuelt og samplet i intervaller i løpet av 24 timer for kvantitative kultur. Resultatene kan avgjøre om en kombinasjon er synergistiske og om det er bakteriedrepende og gi data på hemming og drap av bakterier over tid.

Introduction

Spredning av multidrug-resistente (MDR) bakteriell patogener, spesielt MDR Gram-negative bakterier som carbapenem-resistente Enterobacteriaceae (Grobunn), har forlatt klinikere med stadig mer begrensede muligheter for vellykket anti-infective terapi 1, et problem forverret av treg tempoet roman antibakterielle stoff oppdagelsen2,3. Antimikrobielle synergi, der to stoffene i kombinasjon øve en større-enn-additiv effekt, gir mulighet for hevingen eksisterende antibiotika for bruk i behandling av MDR bakterier, selv når disse bakteriene er motstandsdyktig mot en eller begge av de antibiotika individuelt. Teknikkene som beskrives i denne artikkelen gir utfyllende metodene i vitro synergi tester som, når de brukes sammen, spesialopplæring for etterforskere slik effektivt skjermen antimikrobielle kombinasjoner av interesse for bevis på samvirkningen (den automatiserte Sjakkbrett matrisemetode) og så videre evaluere the kinetics av hemming og drap demonstrert av lovende kombinasjoner i screening scenen (manuell tid-kill-metoden).

En av de mest brukte metodene i vitro synergi testing er sjakkbrett array analysen, en endring av minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) testing som hemmende aktiviteten til to forskjellige antibiotika mot en bakteriell isolere testes over en rekke konsentrasjon kombinasjoner4,5. Hvis de to stoffene utøve større enn additiv aktivitet når de brukes sammen, regnes kombinasjonen synergistisk6. Imidlertid innebærer sette opp et sjakkbrett utvalg manuelt en rekke beregninger og utvannende og pipettering trinnene som er arbeidskrevende og sårbare for menneskelige feil. Disse betingelsene har hatt effekt av å begrense bruken av synergi testing hovedsakelig til retrospektiv evalueringen av liten numrene av antibiotika kombinasjoner og bakteriell isolerer og resultatene har ikke alltid vært konsekvente blant studier7, 8,9,10,11. Videre har kompleksiteten i synergi testing bidratt til sin utilgjengelighet i klinisk mikrobiologi og i fravær av i vitro synergi tester data fra kliniske studier kombinasjon terapi12, 13.

For å øke effektiviteten og gjennomstrømningen av metoden sjakkbrett matrise, gjort vi bruk av et automatisert MIC tester teknikk utviklet i vårt laboratorium som bruker blekk trykking teknologien å nøyaktig og konsekvent dispensere små volumer plate14av antibiotika lagerløsning i brønner i en microtiter. Plattformen obviates behovet for komplekse beregninger og flere pipettering trinn. Den tilknyttede programvaren beregner og dispenses passende mengder antibiotika for å opprette en todimensjonal sjakkbrett matrise hvis brukeren bare innganger området ønsket konsentrasjon og lagerløsning konsentrasjon av antibiotika. Vi testet først denne metoden mot en samling av Grobunn isolerer15 og senere har fokusert på testing colistin inneholder kombinasjoner for aktivitet mot colistin-resistente isolerer16. Colistin er et stoff som siste utvei vanligvis reservert for bruk i behandlingen av MDR Gram-negative patogener17,18, og colistin gjør allerede MDR bakterier nesten pan-resistente19, noe som gjør dem ideelle kandidater til utviklingen av romanen strategier bruker narkotika som de er ufølsomme individuelt. Vi fant at kombinasjonen av colistin og protein syntese hemmer antibiotika minocycline hadde en meget høy rate av synergi, selv mot stammer som var resistente mot hver av disse stoffene, antagelig fordi colistin har en subinhibitory permeabilizing effekt på selv colistin-resistente bakterier. Vi har valgt denne kombinasjonen å bruke som et eksempel i denne artikkelen. Av notatet, kan synergi testing også brukes til å vurdere for forbedret effekten av to stoffene som begge effektiv individuelt.

Automatiske sjakkbrett matrise metoden muliggjør rask, høy gjennomstrømming synergi testing. Men har metoden sjakkbrett matrise begrensninger. Som en modifisert MIC analysen, det gir data bare på hemming av bakterievekst og ikke drepe, og det gir ikke data på antibiotika effekter over tid. Derimot manuell ytelsen til tid-kill synergi analyser er mer arbeidsintensiv, men gir informasjon om både hemming og drap over 24 h klokkeslett kurs20,21. Vi brukte tid-kill analyse på et mindre antall isolerer å bekrefte vår sjakkbrett matrise resultater og å finne ut om synergistisk kombinasjonene vi identifisert var også bakteriedrepende.

Både sjakkbrett matrise og tid-kill synergi metoder gir verdifull informasjon om aktiviteten på rusmiddelkombinasjoner, og er spesielt nyttige i å vurdere potensielle romanen behandlingsalternativer for svært motstandsdyktig bakteriell patogener. Metodene har iboende begrensninger. Standard microbroth fortynning MIC metoden har mange kjente forventet feil 1 todelt fortynning22, som øker når to stoffer er testet sammen i et sjakkbrett array. Standard definisjon av synergi, som vurderer en kombinasjon synergistisk hvis narkotika er aktive sammen på en fjerdedel deres respektive mikrofoner6, tar hensyn til dette forventet variasjon, men slike variasjoner (som antas å resultere fra en kombinasjon av biologiske og tekniske svingninger23) uunngåelig genererer usikkert om påliteligheten til synergi resultater. Mangel på etablerte kvalitetskontroll standarder for synergi testing er også en gjeldende begrensning. Kanskje er den viktigste begrensningen av alle synergi testmetoder mangel på etablerte sammenhenger mellom i vitro resultater og kliniske utfall når kombinasjoner brukes til å behandle pasienter24. Enklere og raskere synergi testing metoder, for eksempel automatisert sjakkbrett matrise metoden beskrevet her, kan lette integrasjon i vitro synergi testing i kliniske studier eller andre vurderinger av pasientens utfall for å bedre beskrive forholdet mellom i vitro og in vivo effekter i fremtiden.

Automatiske sjakkbrett matrise metoden som vi presenterer her tilbyr et alternativ for høy gjennomstrømming screening av en rekke kombinasjoner og gir mulighet for rask vurdering av uvanlig, "høy risiko-høy belønning" kombinasjoner uten en større investering av tid og ressurser. Metoden tid-kill, som vi senere viser, kan gi støttende tilleggsinformasjon om samvirkningen av kombinasjonen og kan bidra til å karakterisere den bakteriedrepende aktivitet og antibakterielle kinetics.

Protocol

Forsiktig: Bruke riktige prosedyrer når du arbeider med bakterier. Bruke hansker og en labfrakk til alle tider. Utfør arbeid i en biosafety CAB hvis aerosoler genereres eller arbeider med høy risiko patogener.

Merk: Tjue til 24 h før eksperimenter, strek ut av bakteriell isolate(s) skal testes (fra en koloni-renset, minimal passaged lager frosset ved-80 ° C i tryptic soya buljong med 50% glyserol lager) på en blod agar tallerken. Inkuber platen ved 35 ° C i luften.

1. blekkskriver-assistert automatiske sjakkbrett matrise synergi

  1. Gjøre antimikrobielle lager løsninger (colistin og minocycline).
    1. Bestemme antibiotika lagerløsning konsentrasjoner basert på Løseligheten av antibiotika og ønsket endelige konsentrasjoner i sjakkbrett matrise. Gjøre 10 mg/mL bestander av colistin og minocycline for eksempel. Bruk CLSI M100 dokumentet for å bestemme riktig løsemidler for hver antibiotika25. Både colistin og minocycline er vannløselige; fordi blekkskriver D300 krever tillegg av surfactant for riktig vandig væske håndtering, løses antibiotika i ultrapure deionisert vann med 0,3% polysorbat 20.
    2. Veie ut antibiotika pulver bruker en analytical balanse og beregne volumet løsemiddel nødvendig for å oppnå målet lager konsentrasjon.
      1. Hvis antibiotikaet angis som salt (f.eks colistin sulfate, minocycline hydroklorid) eller hydrert form (f.eks meropenem trihydrate), eller hvis det rapporteres produsenten har mindre enn 100% renhet, utføre en styrke beregning26 til bestemme mengden av løsemiddel kreves.
      2. Følge dette eksemplet av minocycline hydrochloride med uttalte renhet av 900 mg/mg:
        Analysen renhet: 900 mg/mg
        Vann innhold: ingen
        Aktive brøkdel: 0.926 (fås ved å dele molekylvekt av minocycline (457.48 Da) ved molekylvekt av minocycline hydrochloride (493.94 Da)).
        Styrke = (analysen renhet) * (1. – vanninnhold) * (aktiv brøkdel)
        = (900 mg/mg) * (1) * (0.926) = 833.4 mg/mg eller 83.34%
        Deretter Bestem volumet løsemiddel kreves som følger:
        Volum (mL) = [vekt (mg) * styrke (mg/mg)] ÷ [konsentrasjon (mg/mL)]
        Så, for eksempel hvis 34.7 mg minocycline hydrochloride pulver veies, bruk følgende beregning for å fastslå volumet løsemiddel å en 10 mg/mL løsning:
        Volum = (34.7 mg) * (833.4 mg/mg) = 2.89 mL
        10,000 mg/mL
    3. Hell antibiotika pulver i en 15 mL konisk rør og legge den riktige mengden vann pluss 0,3% polysorbat 20. Vortex til oppløst.
    4. Aliquot antibiotika lagerløsning 0,5 mL microcentrifuge rør og butikk på-80 ° C til du er klar for bruk.
  2. Utføre kvalitetskontroll (QC) antimikrobielle aksjer for bruk i sjakkbrett matrise eksperimenter minst en dag før synergi testing slik at QC resultater kan evalueres før bruk aksjen synergi testing.
    MERK:    QC teknikken beskrevet her er identisk med teknikken som brukes for minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) testing av enkelte stoffer og kan brukes som med noen stammer av interesse for etterforskeren.
    1. Forberede bakteriell suspensjon.
      1. Ta en aliquot av hver antibiotika lager av-80 ° C fryseren starte tining klargjøring bakteriell suspensjon. Vortex når tint for å sikre at antibiotikaet i løsningen.
      2. Velg en passende QC belastning og bestemme gyldig MIC område for narkotika testet basert på tabell 5A-1 i CLSI M10025. For narkotika her, bruke E. coli ATCC 25922; MIC-områder for denne belastningen er 0,25-1 mg/mL for minocycline og 0.25-2 mg/mL for colistin.
      3. Velg en rekke antibiotikumet konsentrasjonene teste som inkluderer QC utvalg. Bruk 0.0156 mg/mL til 8 mg/mL for minocycline og colistin for ATCC 25922.
      4. Legge til 1 mL av 0,9% natriumklorid i en 12 mm x 75 mm runde bunnen glassrør kultur. Velg en eller to kolonier en overnatting plate ATCC 25922 og vortex forsiktig å suspendere.
      5. Sjekk konsentrasjonen av bakterier likner en McFarland. Juster etter behov ved å legge mer 0,9% natriumklorid eller flere bakterier å oppnå en 0,5 McFarland turbiditet lesing.
      6. Gjøre en 1:300 fortynning av 0,5 McFarland suspensjon ved å legge til 100 mL suspensjon 30 mL av cation-justert Mueller-Hinton kjøttkraft (CAMHB) i et 50 mL konisk rør å nå en siste celle tetthet 5 x 105 CFU/mL, som anbefalt av CLSI27.
      7. Bruk en steril inoculating loop, isolasjon strek en dråpe av den første inoculum på en blod agar plate for å bekrefte inoculum renhet og ruge på 35 ° C i luften.
    2. Legge til poesi aksent en flat bunn, square-Vel, klart, ubehandlet 384-vel tallerken med D300. Utføre dette trinnet umiddelbart etter forbereder bakteriell suspensjon slik at suspensjon kan legges til platene innen 15 minutter forberedelse26.
      1. Slå på blekkskriver D300 og tilknyttet datamaskinen. Åpne programmet.
      2. Starte en ny fil. Over bildet av platen rutenettet, høyreklikk på Plate 1 og velg Rediger plate. Velg passende skivetype (384 godt) og ekstra volum (50 mL).
      3. Legge til væsker (dvs. antibiotika aksjer) protokollen ved å klikke plusstegnet ved siden av væsker på panelet til venstre. Legge til to væsker (colistin og minocycline).
        1. Hold over panel som dukket opp for væske 1 og klikk blyant å redigere. Navn væsken "Colistin", endre klassen "Aqueous + mellom 20-, endre konsentrasjon 10 000, og endre konsentrasjonsenheter til mg/mL (Merk at lager konsentrasjonen er 10 mg/mL, dvs, 10,000 mg/mL). La Dispense by på konsentrasjon og la resten av feltene på standardinnstillingene. Klikk på OK.
        2. Gjenta fremgangsmåten ovenfor for væske 2 (minocycline).
        3. Klikk kategorien Gjeldende protokollen øverst på skjermen og endre konsentrasjon (masse) til mg/mL å bestemme enhetene som brukes for siste godt antibiotikumet konsentrasjonene.
      4. Velg 10 brønner i rutenettet ved å klikke og dra, klikk titrering øverst på skjermen. For Angi titrering bruker velger høyest konsentrasjon, væske velger Colistin, Høyeste konsentrasjonen angi 8 (Kontroller at enhetene er mg/mL), og for distribusjon Merk 1:2 (50%). La standard verdier i stedet for resten av vinduet og klikk OK.
      5. Gjenta fremgangsmåten ovenfor for minocycline generere minocycline titrering.
      6. Lagre protokollen, og klikk deretter Kjør -knappen øverst til venstre.
      7. Klikk Start -knappen. Laste inn en 384-vel plate (med lokk fjernet) i plate holderen og trykk inn under "Last Plate 1 – synergi" ledeteksten.
        Merk: Dette spørsmålet er valgt av programvaren og indikerer ikke at synergi tester er utført. Sett kassetteninn T8 + i kassett sporet og trykk inn under belastning kassetteninn T8 + spørsmål.
      8. Når du blir spurt, kan du legge antibiotika lagerløsning til angitte reservoarene på kassetten. Følg instruksjonene på skjermen for riktig lasting og dispensere nøye for å unngå å få bobler i løsningen. Etter hver løsning er lagt, trykk på fylt .
      9. Når blekkskriveren har lagt antibiotika lager i riktig bind til hver brønn og Kjør fullført -boksen vises, klikker du Lukk, fjerne platen og deaktivere D300.
    3. Legg bakteriell suspensjoner 384-vel platen og ruge plate.
      1. Hell tidligere utarbeidet bakteriell suspensjon i et sterilt reagens reservoar.
      2. Bruk en flerkanals pipette til 50 mL av bakteriell suspensjon alle antibiotika inneholder brønner. Legge til 50 mL av CAMHB uten bakterier i en tom bra; Dette blir kontrollen negative godt å bekrefte sterilitet av media.
      3. Plasser platen i en 35 ° C luften inkubator og ruge for 16-20 h26.
        Merk: Inkubasjon ulike varighet kan være nødvendig hvis organismer enn Enterobacteriaceae blir testet; se CLSI M10025 for organisme-spesifikke anbefalinger.
    4. Les plate på en microplate leser på en optisk densitet 600 (OD600) og analysere resultatene.
      1. Bruke regnearkprogrammer, skyggelegge celler med OD600 verdien ≥0.07 green, indikerer vekst og celler med en verdi på < 0,07 rødt, som viser ingen vekst.
        Merk: Disse verdiene ble fastsatt basert på visuell inspeksjon av vekst vs ingen vekst og sammenheng med OD målinger for disse eksperimentene; OD600 målinger fra brønner som inneholder medier alene var konsekvent under 0,07. Konsentrasjon kan variere med ulike plate lesere og bakterier.
      2. Angi MIC for hvert legemiddel. MIC er den laveste konsentrasjonen av narkotika som bakteriell vekst er hemmet. Hvis Mikrofonen er innenfor de forventede QC ifølge CLSI M100 dokumentet25, er lager løsningen egnet for bruk.
  3. Forberede bakteriell suspensjon sjakkbrett matrise.
    1. Ta en aliquot av hver antibiotika lager av-80 ° C fryseren starte tining klargjøring bakteriell suspensjon. Vortex når tint slik antibiotika i løsningen.
    2. Legg ~ 1 mL 0,9% natriumklorid i en 12 mm x 75 mm runde bunnen glassrør kultur. Velg en eller to kolonier en overnatting plate (i dette tilfellet, E. coli belastning FDA-CDC 0494) og vortex forsiktig å suspendere disse i 0,9% natrium klorid.
    3. Sjekk konsentrasjonen av bakterier likner en McFarland. Juster etter behov ved å legge mer 0,9% natriumklorid eller flere bakterier å oppnå en 0,5 McFarland turbiditet lesing.
    4. Gjøre en 1:300 fortynning av 0,5 McFarland suspensjon ved å legge til 100 mL suspensjon 30 mL av CAMHB i et 50 mL konisk rør å nå en siste celle tetthet 5 x 105 CFU/mL27.
  4. Legge til poesi aksent en flat bunn, square-Vel, klart, ubehandlet 384-vel tallerken med D300.
    Merk:     utføre dette trinnet umiddelbart etter forbereder bakteriell suspensjon slik at suspensjon kan legges til platene innen 15 minutter forberedelse26.
    1. Slå på blekkskriveren, starte en ny fil og legge væsker i protokollen som i trinn 1.2.2.1-1.2.2.3.
    2. Generere synergi rutenettet.
      1. Klikk ikonet synergi øverst på skjermen og gå gjennom trinnene. Hvis du merker du to eller flere væsker priset sammen. For Plateer det ikke nødvendig å ekskludere noen brønner; Klikk neste på dette trinnet uten å gjøre endringer.
      2. Angi antibiotikumet konsentrasjonene og plassering i kategorien titrering .
        1. Legge til minocycline i å redusere dobling fortynninger fra 32 til 0.031 mg/mL, i tillegg til en negativ godt med ingen antibiotika, ned y -aksen, skriver du 12 for titrering nivåer på venstre panel. Angi titrering bruker, velger du høyest konsentrasjon. væske, Velg Minocycline; for høyeste konsentrasjonen, angir du 32 (Kontroller at enheten er satt til mg/mL, hvis det ikke er lukke dialogboksen synergi og endre under kategorien Gjeldende Protocol ). Kontroller at det er merket av for boksen inkluderer 0 . Endre distribusjon til 1:2 (50%).
        2. Gjenta disse trinnene for colistin på høyre panel, 12 titrering nivåer og en høyeste konsentrasjonen av 16. Klikk neste.
      3. I kategorien Oppsett velger du titrering nivåer av første 2 væsker bestemme antall rader og kolonner i utformingsrutenett. Klikk neste. Hvis rutenettet vises som forventet, klikker du Fullfør.
    3. Lagre protokollen og deretter på Kjør -knappen øverst til venstre.
    4. Klikk Start -knappen. Laste inn en 384-vel plate (med lokk fjernet) i plate holderen og trykk inn under belastning Plate 1-Synergy ledeteksten. Sett kassetteninn T8 + i kassett sporet og trykk inn under belastning kassetteninn T8 + spørsmål.
    5. Når du blir spurt, kan du legge antibiotika lagerløsning til angitte reservoarene på kassetten. Følg instruksjonene på skjermen for riktig lasting og dispensere nøye for å unngå å få bobler i løsningen. Etter hver løsning er lagt, trykk på fylt .
    6. Når D300 dispenser har lagt antibiotika lager i riktig bind til hver brønn og Kjør fullført -boksen vises, klikker du Avslutt, fjerne platen og deaktivere D300.
  5. Legg bakteriell suspensjoner 384-vel platen og ruge plate.
    1. Hell tidligere utarbeidet bakteriell suspensjon i et sterilt reagens reservoar.
    2. Bruk en flerkanals pipette til 50 mL av suspensjon alle brønner i sjakkbrett matrisen. Legge til 50 mL av CAMHB uten bakterier i en tom bra; Dette blir kontrollen negative godt å bekrefte sterilitet av media. Inkuber i en 35 ° C luften inkubator for 16-20 h26.
  6. Lese plate på en microplate leser på OD600 og analysere sjakkbrett matrise resultater.
    1. Først sjekk renhet platen og sikre at de isolerte koloniene er en enkelt morfologi som samsvarer med forventet morfologi av organismen testes.
    2. Bruke regnearkprogrammer, skyggelegge celler vekst og ingen vekst som i trinn 1.2.4.1.
    3. Angi MIC for hvert legemiddel. For et stoff som ikke hemmer bakterievekst på den høyeste konsentrasjonen testet, anses MIC å være av skala.
    4. For hver brønn som veksten er hemmet, bestemmer den Brøkdelen inhibitoriske konsentrasjonen (FIC) for hver Antibiotikum basert på det antibiotikumet MIC (se figur 1B og figur 2B).
      Merk: FIC er forholdet mellom konsentrasjonen av antibiotika i en brønn som veksten hemmes til sin MIC; så for et legemiddel med en mikrofon på 8 mg/mL, en godt inneholder 8 mg/mL at stoffet har en FIC 1, mens en godt inneholder 4 mg/mL har en FIC på 0,5.
    5. Beregn Brøkdelen inhibitoriske konsentrasjon (FICjeg) indeksverdien for hver brønn som veksten hemmes som summen av FICs av narkotika i at godt.
    6. Angi den laveste FICjeg som veksten er hemmet (minimum FICjeg). Hvis den minste FICjeg £0,5, Vurder kombinasjonen synergistisk; Hvis 0,5-4, vurderer kombinasjonen likegyldig; og hvis > 4, vurderer kombinasjonen antagonistiske. Hvis kombinasjonen synergistisk på noen konsentrasjon kombinasjoner men antagonistiske på andre, Merk dette resultatet, men vurderer kombinasjonen samlet antagonistiske.

2. tid-kill synergi Testing

  1. Gjøre antimikrobielle lager løsninger. Hvis dette trinnet utføres før eksperimentet, fryse aksjer på-80 ° C til klar til bruk.
    1. Bestemme antibiotika lagerløsning konsentrasjoner basert på Løseligheten av antibiotika og ønsket endelige konsentrasjoner i tid-kill studier. I dette eksemplet gjør colistin og minocycline aksjer i en konsentrasjon av 1 mg/mL. Bruk CLSI M100 dokumentet for å bestemme riktig løsemidler for hver antibiotika25. Bruk vann, som anbefales, både colistin og minocycline.
    2. Veie ut antibiotika pulver bruker analytical balanse og beregne volumet løsemiddel nødvendig for å oppnå målet lager konsentrasjon. Eventuelt utføre en styrke beregning før bestemme antall løsemiddel nødvendig, som beskrevet i trinn 1.1.2.1 ovenfor.
    3. Hell antibiotika pulver i 15 mL konisk rør og legge til riktig mengde vann. Vortex til oppløst.
  2. Bruke manuell kjøttkraft microdilution metoden beskrevet i CLSI M0726, utføre QC av antimikrobielle aksjer for bruk i tid drepe synergi eksperimenter. Utføre dette trinnet minst én dag før synergi testing slik at QC resultater kan gjennomgås før aksjen.
    1. Velg en passende QC belastning og bestemme gyldig MIC område for narkotika testet basert på tabell 5A-1 i CLSI M10025. For narkotika her, bruke E. coli ATCC 25922; MIC-områder for denne belastningen er 0,25-1 mg/mL for minocycline og 0.25-2 mg/mL for colistin.
    2. Forberede antibiotika inneholder kjøttkraft microdilution plater.
      1. Velg den høyeste konsentrasjonen av antibiotika å bli testet slik QC utvalg kan inkluderes. Bruk en rekke 0.016 til 8 mg/mL for minocycline og colistin for ATCC 25922.
      2. Fortynne antibiotika aksjer til en fungerende løsning i CAMHB til to ganger den høyeste konsentrasjonen trengs (fordi det vil være fortynnes 1:1 av bakterier). I dette eksemplet fortynne både aksjer fra 10 mg/mL til 16 mg/mL.
      3. Bruker en flerkanals pipette, legge til 100 mL av 2 x antibiotika suspensjoner i en brønn i den første kolonnen i en klar, runde bunn, ubehandlet 96-brønns plate og legge 50 mL av vanlig kjøttkraft (dvs. uten antibiotika) hver brønn av de etterfølgende kolonnene.
      4. Fjerne 50 mL av antibiotika inneholder kjøttkraft fra hver godt i den første kolonnen og legge til brønnene i den andre kolonnen. Pipetter opp og ned flere ganger å blande innholdet, generere en antibiotika konsentrasjon halvparten av konsentrasjonen i den første kolonnen.
      5. Gjenta trinn 2.2.2.4 med hver kolonne, slik at en rekke føljetong todelt fortynninger, hver med et volum på 50 mL, forberedes. Endre pipette tips mellom hvert fortynning trinn hvis ønskelig å eliminere muligheten for antibiotika carryover. Legg merke til at de resulterende konsentrasjonene er alle fortsatt 2 x de endelige konsentrasjonene, som de vil senere bli fortynnes 1:1 med bakteriell suspensjon.
      6. Ikke Legg noen antibiotika til de siste to kolonnene, da disse vil være negativ og vekst kontroll kolonnene.
    3. Forberede bakteriell suspensjon.
      1. Forberede en 0,5 McFarland suspensjon fra en overnatting plate av E. coli ATCC 25922 i 0,9% natriumklorid som beskrevet i trinn 1.2.1.5-1.2.1.6.
      2. Gjøre en 1:150 fortynning av 0,5 McFarland suspensjon ved å legge til 50 mL av suspensjon 7,5 mL av CAMHB.
        Merk: Siste bakteriell suspensjon blir utvannet 1:300 når den er blandet 1:1 med antibiotika løsningen, nå CLSI anbefalte celle tetthet 5 x 105 CFU/mL27).
    4. Legge til bakterier i microplate og ruge.
      1. Legge 50 mL av bakteriell suspensjon i hver brønn, unntatt ide 11 kolonnen . Legge til 50 mL av CAMHBden 11 kolonnen (negativ kontroll kolonne) .
      2. Inkuber plate ved 35 ° C i 16-20 h.
        Merk: Inkubasjon ulike varighet kan være nødvendig hvis organismer enn Enterobacteriaceae blir testet; se CLSI M10025 for organisme-spesifikke anbefalinger.
      3. Leser platen for vekst visuelt ved hjelp av lyset og, for hver antibiotika, bestemme laveste konsentrasjonen der det er ingen vekst; Dette er MIC. Se CLSI M07 dokumentet for flere detaljer om visuelle tolkning av MIC26. Hvis Mikrofonen er innenfor de forventede QC, er lager løsningen egnet for bruk.
  3. Starte første kultur.
    1. Gjøre en 0,5 McFarland suspensjon av testen organismen i sterilt 0,9% NaCl som beskrevet ovenfor.
    2. Legge til 100 mL 0,5 McFarland suspensjon å 5 mL av CAMHB i et 25 mm x 150 mm glass rundt bunnen kultur rør med rustfritt stål nedleggelse og vortex forsiktig å blande.
    3. Bruk en steril inoculating loop, isolasjon strek en dråpe fortynnet suspensjon på en blod agar plate å bekrefte inoculum renhet og ruge på 35 ° C i luften.
    4. Erstatt nedleggelse på tube og ruge i et reagensrør rack på en shaker på 35 ° C i luften for minst 3 h, til logaritmisk-fase vekst (se trinn 2.6.1). Fortsett med trinn 2.4 mens kulturen i inkubator.
  4. Forberede antimikrobielle løsninger i 25 x 150 mm kultur BILLEDRØR.
    1. Ta ut antimikrobielle lager dele fra-80 ° C fryseren å tine. Vortex når tint slik antibiotika i løsningen.
    2. Mens innledende kultur er incubating, Legg 10 mL av CAMHB til fem autoklaveres 25 mm x 150 mm BILLEDRØR kultur og Legg antimikrobielle lager løsninger som følger.
      Merk: En synergi studie, minst ett stoff bør være i en konsentrasjon som ikke påvirker veksten kurve individuelt28; Dette kan bestemmes ved å evaluere effekten av personlige narkotika konsentrasjoner før synergi studien.
      1. Rør 1: Legge til riktig mengde antibiotika #1 å få mål siste antibiotika konsentrasjon. I dette tilfellet legge 10 mL 1 mg/mL colistin lager å få en endelig colistin konsentrasjon av 1 mg/mL, da dette er en konsentrasjon som er ineffektive mot påkjenningen brukes i dette eksemplet.
      2. Rør 2: Legge til riktig mengde antibiotika #2 å få siste antibiotika konsentrasjon skal testes. I dette tilfellet legge 10 mL 1 mg/mL minocycline lager å få en endelig konsentrasjon av 1 mg/mL, en konsentrasjon som er ineffektive mot belastningen som brukes i dette eksemplet.
      3. Rør 3: Legge til samme antall antibiotika #1 og antibiotika #2 i rør 1 og 2. I dette tilfellet legge 10 mL 1 mg/mL minocycline aksjer og 10 mL 1 mg/mL colistin lager.
      4. Tube 4: Legge til ingen antibiotika; Dette vil være vekst kontroll røret.
      5. Rør 5: Legge til ingen antibiotika; Dette blir negativ kontroll røret.
  5. Klargjør 96 dyp brønn polypropylen plater med 2 mL brønner for seriell fortynninger ved å legge til 900 µL av sterile 0,9% natriumklorid rader B-H kolonner 1-5 med en flerkanals pipette.
  6. Forberede starter inoculum og legge til rør.
    1. Når den første kulturen har nådd logaritmisk vekstfase (~ 3 h for Klebsiella pneumoniae, organismen brukes i dette eksemplet), fjerne kultur røret fra shaker, vortex forsiktig, overføre ~ 1 mL av suspensjon til 12 x 75 mm kultur røret, og Sjekk tetthet med en McFarland leser.
      1. Hvis det er mindre enn 1,0 McFarland, retur rør til shaker og ruge lenger. Hvis det er større enn 1,0 McFarland, legge CAMHB røret, vortex forsiktig, og å prøve, gjenta prosessen til suspensjon er 1,0 McFarland.
    2. Legg 100 mL 1.0 McFarland suspensjon til rør 1-4 og vortex forsiktig.
  7. Smak dele fra hver kultur og utføre føljetong tidoble fortynninger.
    1. Når 0 (umiddelbart etter tilføyer bakterier til rør) og på 1, 2, 4, 6 og 24 h, fjerne en 150 mL aliquot fra hver kultur rør ved å vippe røret slik at bare sterile pipette spissen inn røret og ikke unsterile å hindre akselen under aliquot uttak. Legge til dele, henholdsvis rad brønner i den første raden av tidligere forberedt 96 dypt godt plate. Returner rør til en reagensglasset rack på en shaker i en 35 ° C luften inkubator umiddelbart etter fjerning dele på hvert tidspunkt.
    2. Bruker en flerkanals pipette, fjerne 100 mL fra rad A, legge raden B (som inneholder 900 mL 0,9% natriumklorid) og Pipetter opp og ned 4 - 5 ganger til mix, skaper et 1:10 fortynning. Kast tips etter hvert fortynning trinn å hindre carryover av bakterier, som kan føre til feilaktig opphøyet kolonien teller.
    3. Gjenta trinn 2.7.2 for rader B-H med nye pipette-spisser for hver rad.
  8. Plate utvannet prøver for kolonien teller bruker slipp plate metoden29,30.
    1. Etiketten Mueller-Hinton agar plater med antibiotika forhold og fortynning å være belagt.
    2. Bruke en flerkanals pipette og ekstra lange tips (for å sikre at tips nå i suspensjon), fjerne 10 mL i hver brønn i første kolonne og dispensere nøye på rad på riktig merket platen. Hvis små (100 mm diameter) plater, dispensere 3 rader (hver bestående av dråper fra rader A-H med en enkelt kolonne) per plate; på store (150 mm diameter) plater, dispensere 8 rader per plate.
    3. Tillate drops tørke helt (~ 15 min).
    4. På 24 h, plassere en 10 mL slippe tatt direkte fra negativ kontroll røret i et angitt område i en av platene til å teste sterilitet. Invertere plater og ruge over natten ved 35 ° C i luften.
  9. Telle kolonier og beregne celle tetthet. Merke kolonier med en fin-spissen permanent markør på baksiden av platen til unngå telle eller manglende kolonier.
    1. Først sjekk renhet platen og sikre at de isolerte koloniene er en enkelt morfologi som samsvarer med forventet morfologi av organismen testes.
    2. For hver fortynning serien, identifisere dråper med 3-30 kolonier (vanligvis en dråpe per fortynning serie). Telle koloniene i disse dråpene og registrere antallet sammen med fortynningsfaktoren.
      1. Hvis det ikke er noen dråper i en fortynning serie med 3-30 kolonier, telle koloniene i den siste dråpen med > 30 kolonier og i første slipp med < 3 kolonier (dette skal være tilstøtende drops).
    3. For hver fortynning serien, beregne antall kolonien danner enheter per milliliter (CFU/mL) i eksemplet basert på antall koloniene i rullegardinlisten ved hjelp av følgende formel: CFU/mL = n(1 /d) (100) der n er antallet kolonier d er fortynningsfaktoren (1 for ufortynnet prøven (linje A), 0,1 eller 10-1 for den første 1:10 fortynning (linje B), 0,01 eller 10-2 for andre 1:10 fortynning (rad C), og så videre, og konstant 100 regnskapet for faktum at det totale volumet av drop jeg s 10 mL, mens den siste verdien uttrykkes i CFU/mL, dvs. CFU/1000 mL. Bruke et regneark som inneholder formler som beregner CFU/mL fra kolonien greven å forenkle denne prosessen.
      1. For fortynning serien der mer enn en dråpe var countable (eller hvor to dråper måtte telles fordi ingen slippe falt i området), gjennomsnitt siste CFU/mL teller for alle telt drops.
      2. Fordi den laveste grensen for påvisning er 300 CFU/mL (3 koloniene i ufortynnet drop), post og plot kolonien telle som £300 CFU/mL for fortynning serien der det finnes < 3 koloniene i ufortynnet drop.
    4. Inspisere sterilitet kontroll slipp fra tid 24; Hvis noen vekst er observert i denne slipp, bør resultatene av eksperimentet ikke brukes.
  10. Grafen og analysere resultatene.
    1. Tegne vekst kurver fra tre antibiotika inneholder kulturer og kontrollen vekst i samme diagram. Tegne inn gang på x -aksen og CFU/mL, bruker en logaritmisk skala på y -aksen.
    2. Beregne forskjellen i CFU/mL kombinasjon røret gangen 24 og den mest aktive enkelt agenten gangen 24. Hvis forskjellen er ≥2 Logg10, vurdere kombinasjonen synergistisk. Deretter beregne forskjellen i CFU/mL kombinasjon røret på tid 24 og på 0. Hvis forskjellen er ≥3 Logg10, vurdere kombinasjonen bakteriedrepende.

Representative Results

Figur 1A presenterer et rutenett fra et sjakkbrett matrise synergi eksperiment i hvilket minocycline i konsentrasjoner på 0-32 μg/mL kombinert med colistin i konsentrasjoner av 0-16 μg/mL og testet mot E. coli belastning FDA-CDC 0494. Verdiene representerer Spektrofotometri opplesninger ved optisk densitet 600 nm (OD600). Brønner med OD600 verdier under 0,07 (som tilsvarer ingen vekst av visuell inspeksjon) er skyggelagt rød, mens brønner med OD600 verdier 0,07 (som tilsvarer vekst av visuell inspeksjon) er skyggelagt grønn. For hvert legemiddel er på minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC, uthevet) den laveste konsentrasjonen av stoff som hemmer bakterievekst. For minocycline, dette er 32 μg/mL, og colistin, er det 8 μg/mL. Skyggeleggingen beholdes i figur 1B, men verdiene i brønnene som veksten er hemmet, erstattes av brøk inhibitoriske konsentrasjon indeks (FICjeg) verdier. Disse bestemt som følger: i hver brønn, fractional inhibitoriske konsentrasjon indeksen (FIC) av hvert legemiddel beregnes ved konsentrasjonen av antibiotika i det godt med stoffets MIC, og at FICjeg beregnes ved å summere de to FICs. Brønner med FICjeg verdien 0,5, som er ansett som cut-off etter synergi, angis med en delt kantlinje, og brønnen med lavest FICjeg verdi (0.094) er uthevet. FICjeg minimumsverdien er i synergistisk området, anses kombinasjonen synergistisk.

Figur 2A og 2B figur viser rutenett slik som i figur 1A og figur 1B, men i dette tilfellet kombinasjonen har ikke viser synergi mot isolere testet (K. pneumoniae isolere BIDMC 4), fordi den minimum FICjeg som veksten hemmes er 1, som er > 0,5.

Figur 3 viser optisk densitet målinger fra et sjakkbrett synergi rutenett der flere hoppet over brønner oppstod (Enterobacter cloacae komplekse isolere BIDMC 27). Hoppet over brønner er brønner som bakteriell vekst er hemmet tross av tilstedeværelsen av bakterievekst i tilstøtende brønner med høyere konsentrasjoner av antibiotika. Dette fenomenet, som er kjent for å oppstå i standard MIC tester også, skyldes dette sannsynligvis biologisk variasjon i bakterievekst egenskaper fra godt til vel og til følsomheten til noen antibiotika til små forskjeller i bakteriell inoculum23 , 31 , 32. Hvis mer enn én hoppet også skjedde i et sjakkbrett array, vi forkastet resultatene og gjentatt analysen.

Figur 4 presenterer eksempler på tid-kill synergi resultatene av tre kombinasjoner testet mot K. pneumoniae isolere BIDMC 32. Kolonien teller angis i en logaritmisk skala på y-aksen og tid, i timer på x-aksen. Forskjellen mellom den første inoculum i røret som inneholder legemidlet kombinasjonen og konsentrasjonen av bakterier i at tube på 24 h er illustrert av den røde linjen og tall, mens forskjellen mellom konsentrasjonen av bakterier på 24 h mellom røret inneholder kombinasjonen og røret som inneholder den mest aktive enkelt agenten alene er illustrert av den blå linjen og antallet. Figur 4A viser resultater fra kombinasjonen av colistin og minocycline; denne kombinasjonen var synergistisk (forskjell mellom konsentrasjoner av bakterier utsatt kombinasjon og mest aktive agent alene ≥2 Logg10 CFU/mL på 24 h) og bakteriedrepende (nedgang starter inoculum til konsentrasjon på 24 h ≥3 Logg10 CFU/mL). Figur 4B viser resultater fra kombinasjonen av colistin og clindamycin, en kombinasjon som var synergistisk men var ikke bakteriedrepende. Denne kombinasjonen hemmet veksten av bakterier, som verken narkotika gjorde alene, men ikke drepe dem. Figur 4C viser resultater fra kombinasjonen av colistin og erythromycin, som var bakteriedrepende verken synergistisk.

Figure 1
Figur 1: Sjakkbrett array resulterer demonstrere synergi (minocycline + colistin testet E. coli belastning FDA-CDC 0494). (A) Spektrofotometri avlesning og vekst tolkning av et sjakkbrett utvalg. Verdiene i cellene er optisk densitet målinger på 600 nm (OD600). Celler med OD600 verdier under 0,07 (tilsvarende ingen vekst av visuell inspeksjon) er skyggelagt rød, mens celler med OD600 verdier 0,07 (tilsvarende vekst av visuell inspeksjon) er skyggelagt grønn. (B) Fractional inhibitoriske konsentrasjon (FICjeg) indeksberegning. Skyggelegging viser vekst eller ingen vekst har blitt beholdt. Verdier for colistin og minocycline langs x- og y-akser, henholdsvis nå representerer Brøkdelen inhibitoriske konsentrasjon (FIC) eller forholdet mellom konsentrasjonen av stoffet i kolonnen eller raden minimum inhibitoriske konsentrasjon ( MIC) av at stoffet alene. Verdien i hver celle er den FICjegeller summen av FICs av to narkotika i at godt. Den store ødelagte line-grenser boksen omslutter brønner med en FICjeg på 0,5. Tykk-grenser cellen angir brønnen med den laveste FICjeg der veksten er hemmet, eller den minste FICjeg. Den minste FICjeg er 0,5, anses kombinasjonen synergistisk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Sjakkbrett matrise resultater en kombinasjon som ikke viser synergi (minocycline + colistin testet mot K. pneumoniae isolere BIDMC 4). (A) optisk densitet på 600 nm og vekst tolkning av sjakkbrett matrise resultater som figur 1A. (B) Fractional inhibitoriske konsentrasjon (FICjeg) indeksberegning som figur 1A. Fordi den minste FICjeg > 0,5 kombinasjonen er ikke vurdert synergistisk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Sjakkbrett matrise resultater som er uninterpretable grunn utelatt brønner (minocycline + colistin testet mot Enterobacter cloacae komplekse isolere BIDMC 27). Optisk densitet på 600 nm og vekst tolkning av sjakkbrett matrise resultater som figur 1A. Flere hoppet over brønner, som bakteriell vekst er hemmet tross av tilstedeværelsen av vekst i tilstøtende brønner med høyere konsentrasjoner av antibiotika, er vist. Resultatene er ikke interpretable, og eksperimenter må gjentas. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Tid-kill synergi resultatene av tre kombinasjoner testet mot K. pneumoniae isolere BIDMC 32. Koloni teller angis i en logaritmisk skala på y-aksen og tid, i timer på x-aksen. Forskjellen mellom konsentrasjonen av bakterier i kombinasjonen på 24 h og den starter inoculum i røret er illustrert av den røde linjen og antallet. Hvis nedgangen starter inoculum til konsentrasjon på 24 h er ≥3 Logg10 CFU/mL, vil kombinasjonen anses bakteriedrepende. Forskjellen mellom konsentrasjonen av bakterier på 24 h mellom røret som inneholder kombinasjonen og røret som inneholder den mest aktive enkelt agenten alene er illustrert av den blå linjen og tall. Hvis det er ≥2 Logg10 CFU/mL reduksjon, anses kombinasjonen synergistisk. (A) Colistin (CST) + minocycline (MIN), en kombinasjon som er både synergistiske og bakteriedrepende. (B) Colistin + clindamycin (CLI), en kombinasjon som synergistisk men ikke bakteriedrepende. (C) Colistin + erythromycin (ERY), en kombinasjon som verken synergistisk eller bakteriedrepende. Disse resultatene ble opprinnelig utgitt som en del av en studie av samvirkningen av colistin inneholder kombinasjoner mot colistin mot Enterobacteriaceae, der vi viste at colistin var synergistisk med en rekke antibiotika som er aktive individuelt bare (f.eks clindamycin) eller hovedsakelig (f.eks erythromycin) mot Gram-positive bakteriene16. (Merk at erythromycin var synergistisk med sjakkbrett matrisen mot belastningen vises, men ikke av tid-drepe, så det har blitt valgt som et eksempel på en ikke-synergistisk kombinasjon.) Vi hypotesen at colistin, som er kjent til å handle permeabilization av Gram-negative ytre membranen, har en sub-inhibitory permeabilizing effekt på colistin-resistente Gram-negative bakterier, slik at oppføring av stoffer som clindamycin som normalt kan ikke angi Gram-negative cellen. Panel (A) av dette tallet har blitt endret fra Brennan-Krohn, Pironti og Kirby 201816, copyright © American Society for mikrobiologi, antimikrobielle midler og kjemoterapi, 62(10), 2018, pii: e00873 18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

De to metodene beskrevet her gir begge informasjon om aktiviteten av poesi aksent i kombinasjon i forhold til deres individuelle aktivitet. Automatisert inkjet-skriver-assistert digitale dispensing metoden er en tilpasning av metoden beskrevet i klinisk mikrobiologi prosedyrer Handbook33, mens metoden tid-kill følger nærmere tilsvarende protokollen fra samme referere til34.

I metoden sjakkbrett matrise beregninger for å fastslå den nødvendige mengden antimikrobielle lager til hver brønn og utlevering av disse volumene er automatisert, dermed eliminere noen av de store potensielle kildene til feil i en manual Sjakkbrett matrise. Det er fortsatt viktig, men at etterforskeren bestemmer at opprinnelige aksjer er gjort på den tiltenkte konsentrasjonen og at målet siste konsentrasjoner er angitt i D300 programvaren riktig. Legge til antimikrobielle suspensjon brønner i en 384-vel plate kan være utfordrende først og krever omsorg for å sikre at pipette tips angir passende brønnene og at væske splash opp ikke kantene av brønnene. En automatisert flytende behandling kan brukes i stedet for en håndholdt flerkanals pipette for å øke hastigheten og nøyaktigheten som bakteriell suspensjon legges til brønner. Som beskrevet i protokollen, må D300 surfactant, polysorbat 20 (P-20), for riktig flytende håndtering. En annen surfactant, polysorbat 80, i en konsentrasjon av 0,002%, har vært nevnt for å senke colistin mikrofoner for organismer med colistin mikrofoner av < 2 µg/mL i standard kjøttkraft microdilution analyser. 35 , 36 vårt laboratorium tidligere viste at P-20 i konsentrasjoner til 0.0015% hadde ingen effekt på D300-assistert MIC resultater i sammenligning med referanse BMD14. I eksemplet analysen presenteres her, er den maksimale P-20 konsentrasjon er 0.0014%.

Et problem vi møtte med noen sjakkbrett matrise analyser var et stort antall hoppet over brønner. Dette skjedde på en uforholdsmessig hastighet med enkelte antibiotika. Spesielt i skjermen kombinasjoner mot en samling av carbapenem-motstandsdyktig Enterobacteriaceaefant vi at mens 49 521 forsøk (9,4%) ble ødelagt på grunn av flere hoppet over brønner, 2 av 12 antibiotika testet (fosfomycin og cefepime) sto for 46 av disse rettssaker (94%). Slike økte priser kan være mer sannsynlig i medisiner som er spesielt utsatt for inoculum effekt31,32,37. Av notatet anbefaler ikke CLSI testing fosfomycin i kjøttkraft fortynning25 bekymringer om pålitelighet resultatene med denne metoden, som kan forklare upålitelige resultatene sett med dette stoffet. Noen endringer kan gjøres til automatiske sjakkbrett metoden i henhold til etterforsker preferanser. Poesi aksent kan bli utlevert til plater allerede inneholder bakteriell suspensjon, og ikke i tomme brønner, hvis dette er å foretrekke av arbeidsflyten laboratoriet. Mens 384-vel platene ble brukt her, kan metoden også bæres i 96-brønnen plate analyser med riktig endring av godt volum. Bruk av en 96-brønns plate format kan hjelpe redusere hoppet over brønner for antibiotika som er spesielt følsomme for små endringer i inoculum. Når du beregner FICjeg, kan det være situasjoner der MIC av skala (dvs., høyere enn testet), inkludert situasjoner hvor stoffet blir testet har ingen aktivitet individuelt mot av organismen testes. I disse tilfellene kan FIC beregnes basert på antar MIC er en fortynning høyere enn den høyeste konsentrasjonen testet. Dette er den mest konservative strategien, som det antas at maksimal mulig FIC verdien for alle fortynning der hemming er observert under synergi testing. For eksempel hvis faktiske MIC var to dobling fortynninger over den høyeste konsentrasjonen testet, og de tilsvarende FICs ville være to ganger lavere enn konservative tildelinger og så videre.

For å nøyaktig vurdere bakteriedrepende aktiviteten av stoffer i en tid-kill analysen, er det viktig at kulturer være i logaritmisk-fase vekst, spesielt når celleveggen aktive antibiotika blir testet28. For raskt voksende bakterier brukes i dette eksemplet (K. pneumoniae), 3 timers inkubasjon med skjelvende var riktig å nå denne vekstfase, men forskjellige mengder tid kan være nødvendig for ulike organismer. Generelt, skal kultur vises tydelig, men ikke tungt grumset. Riktig mengde tid kan bestemmes ved å opprette en vekstkurve med kolonien teller tatt på seriell tid poeng (f.eks enhver 30 min 4-6 h)38. Den tiltenkte starter inoculum i tid-kill studien er også viktig. Målet konsentrasjonen av den første inoculum er ca 5 x 105 til 1 x 106 CFU/mL. Fortynning beskrevet her (100 μL av en 1,0 McFarland suspensjon i 10 mL av media) genererer denne inoculum for Klebsiella pneumoniae og andre Enterobacteriaceae arter som vi har testet den. Hvis tettheten av de første inocula i et eksperiment ved hjelp av ulike organismer er betydelig høyere eller lavere enn dette, kanskje så en annen fortynning behøves. (Riktig fortynning kreves for artene kan bestemmes ved å utføre plate antall en 0,5 eller 1.0 McFarland suspensjon å bestemme hvor mange organismer denne turbiditet representerer, deretter beløpet som første suspensjon må være utvannet for å nå riktig siste konsentrasjonen.) Hvis, på gjennomgang av platen teller fra synergi studien, den første inoculum av antibiotika inneholder rør er funnet å ha vært betydelig lavere enn de første inoculum i kontrollen vekst, kan det tyde begge antibiotika carryover eller svært rask drepe bakterier i kort tid mellom tillegg bakterier mot antibiotika inneholder røret og fjerning av aliquot for plating. Hvis det faktiske antallet koloniene i ufortynnet fall i en serie er lavere enn koloniene i påfølgende fortynninger, foreslår dette antibiotika carryover effekt. Ulike alternativer er beskrevet for å hindre denne effekten, inkludert sprer en enkelt aliquot over en hel tallerken38 eller spinne ned prøven, fjerne nedbryting og å suspendere i sterilt saltvann før plating39. På hvert punkt i metoden tid-kill er det også avgjørende for etterforsker effektivt men nøyaktig fjerne en aliquot fra hver kultur rør og utføre føljetong fortynninger. Forsinkelser under denne prosessen, spesielt i løpet av tidlig tidspunkt som oppstår i nær hverandre, kan føre til lengre perioder der kulturer ikke er er ruges og ristet, mens uforsiktig dispensing og føljetong fortynninger kan føre til unøyaktige plate teller. Slipp plate metoden beskrevet i forhold til spredning plate metoden for plate teller, der 100 μL av hver fortynning er spredt over en hel agar plate, er langt mer rask, krever en mye mindre antall agar plater, og gir raskere teller, som maksimum countable antall koloniene for hver dråpe er 30, mens opp til 300 kolonier kan vanligvis regnes fra en spredning plate. Men er metoden spredning plate også et alternativ hvis etterforskere er mer komfortabel med denne teknikken. Hvis dråper spredt i hverandre etter dispensing med en flerkanals pipette, utføres personlige anvendelsen av mer avstand dråper med en enkanals pipette i stedet. I vår erfaring syntes kjøling plater på 4 ° C før utlevering drops å redusere overdreven spre.

En begrensning teknikkene som beskrives her er at resultatene av de to typene synergi analysen (sjakkbrett matrise og tid-kill) er ikke alltid overensstemmende, og siden mest publiserte synergi artikler bruker en metode eller andre stedet begge sammen, kan det være vanskelig å vite hvor å integrere data fra to typer analyser. Fordi metoden for automatiske sjakkbrett-matrise vi utviklet er enkel og høy gjennomstrømming, vi har brukt det i praksis som en slags skjermen å teste kombinasjoner mot et større antall isolerer og avgjøre hvilke konsentrasjon kombinasjoner var synergistisk. Vi har utført et mindre antall tid-kill studier, velge kombinasjoner og konsentrasjoner som hadde vært effektiv i sjakkbrett matrisen. Av notatet, fordi sjakkbrett analysen utføres vanligvis i microbroth fortynning skala, mens tid-kill analysen bruker større volumer (ligner på en macrobroth fortynning), fant vi at FICs var noen ganger annerledes mellom de to metodene, med høyere konsentrasjoner vanligvis nødvendig i tid-kill analysen å demonstrere aktivitet. Dette fenomenet har vært nevnt tidligere når macrobroth og microbroth fortynning MIC analyseresultatene sammenlignes for Gram-negative bakterier26 og når større inocula (som brukes i tid-kill studier) sammenlignes med den standard inoculum som brukes i microbroth fortynning og sjakkbrett utvalg søk32. En bestemt begrensning av sjakkbrett matrisen er iboende variasjon i microbroth fortynning MIC tester22. Mens FICjeg konsentrasjon synergi konto for denne variasjonen matematisk6 slik variasjon uunngåelig reiser bekymring pålitelighet og konsekvens av sjakkbrett matrise resultater.

Resultatene av disse metodene må bekreftes på grunn av begrensninger knyttet til alle i vitro synergi testmetoder (inkludert dyrking av bakterier i en kunstig vekst medium, statisk antibiotikumet konsentrasjonene og en begrenset tid selvfølgelig), og Videre evalueres ved hjelp av flere teknikker. Slike metoder omfatter i vitro farmakokinetiske/Farmakodynamiske (PK/PD) studier (f.eks, hul fiber infeksjon modell40), dyr modeller, og til slutt, menneskelige PK/PD og effekt studier. Automatiske sjakkbrett matrise metoden beskrevet her, ved å gi en rask metode som skjermen kombinasjoner for potensielle samvirkningen, gjør det mer målrettet utnyttelse av disse teknikkene. Videre automatisering av alle disse metodene, som vel som mer systematisk undersøkelse av forholdet mellom i vitro parametere og kliniske utfall, vil være viktig å skalere opp bruk av synergi testing og øke brukbarheten klinisk.

Disclosures

D300 Digital Dispenser og tilknyttede forbruksvarer ble levert av Tecan (Morrisville, NC). Tecan ikke hadde noen rolle i studien design, data samling/tolkning, manuskriptet forberedelse eller beslutning om å publisere.

Acknowledgments

Thea Brennan-Krohn ble støttet av en Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health og menneskelig utvikling pediatric smittsomme sykdommer forskning trening grant (T32HD055148), National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer trening grant ( T32AI007061), en Boston Children's Hospital Office av fakultetet utvikling fakultetet karriereutvikling fellesskap, og en National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer karriere development award (1K08AI132716). J.E.K. ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer i National Institutes of Health prisen nummer R33 AI119114. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management. Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).
  2. Spellberg, B. The future of antibiotics. Critical Care. 18 (3), (2014).
  3. Spellberg, B., et al. The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).
  4. Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).
  5. Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).
  6. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).
  7. Zusman, O., et al. Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).
  8. Clock, S. A., et al. In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).
  9. Hirsch, E. B., et al. Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae. Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).
  10. Tängdén, T., et al. Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).
  11. Tascini, C., et al. Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).
  12. Paul, M., et al. Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).
  13. Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).
  14. Smith, K. P., Kirby, J. E. Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).
  15. Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology. J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).
  16. Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  17. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections. Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).
  18. Nation, R. L., Li, J. Colistin in the 21st century. Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).
  19. Ah, Y. -M., Kim, A. -J., Lee, J. -Y. Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae. International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).
  20. Bratu, S., et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).
  21. Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).
  22. MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing. Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).
  23. Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance. Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).
  24. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
  25. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  26. CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).
  27. Clinical and Laboratory Standards Institute. M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  28. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. 7 (1999).
  29. Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests. Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).
  30. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
  31. Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology. Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).
  32. Smith, K. P., Kirby, J. E. The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  33. Leber, A. L. Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.16.1-5.16.23 (2016).
  34. Leber, A. L. Time-Kill Assay for Determining Synergy. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.14.3.1-5.14.3.6 (2016).
  35. Hindler, J. A., Humphries, R. M. Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).
  36. Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls. Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).
  37. Fuchs, P. C., Barry, aL., Brown, S. D. Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine. European journal of clinical microbiology & infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).
  38. Leber, A. L. Minimum Bactericidal Concentration Testing. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , 5.14.1.11 (2016).
  39. Cai, Y., et al. In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).
  40. Bulman, Z. P., et al. Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era. mBio. 8 (4), (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 146 antimikrobielle synergi antibiotika synergi synergi resistensutvikling colistin motstand carbapenem-resistente Enterobacteriaceae tid-kill synergi sjakkbrett array automatisering inkjet utskrift
Antimikrobielle synergi Testing av blekkskriver-assistert automatiske sjakkbrett matrise og metoden for manuell tid-kill
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E.… More

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter