Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

مضادات الميكروبات التآزر التجارب التي تدعمها الطابعة النافثة للحبر الصفيف الشطرنج الآلي وقتل الوقت الأسلوب اليدوي

Published: April 18, 2019 doi: 10.3791/58636
Automatic Translation
1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

اختبار التآزر الميكروبات المستخدمة لتقييم تأثير اثنين أو أكثر من المضادات الحيوية المستخدمة في تركيبة وتتم عادة بواحدة من طريقتين: الصفيف رقعة الداما أو المقايسة قتل الوقت. وهنا، نقدم الآلي وتقنية التآزر الصفيف الشطرنج ساعدت الطابعة النافثة للحبر ودراسة كلاسيكية قتل الوقت تآزر.

Abstract

نهج مبتكرة لعلاج بكتيريا المقاوم معدلات المقاوم للأدوية المتعددة (المقاوم) مسببات استمرار ارتفاع، متجاوزا تطوير مضادات جديدة، بشكل متزايد ضرورة. واحد مثل هذا النهج هو الجمع بين العلاج، في أي اثنين أو أكثر من المضادات الحيوية وتستخدم معا لعلاج عدوى ضد أي واحد أو كلا من هذه العقاقير قد تكون عديمة الفاعلية وحدها. عندما المخدرات اثنين، مجتمعة، بذل أكبر من تأثير المواد المضافة، وأنها تعتبر من التآزر. التحقيق في المختبر نشاط تعاوني خطوة أولى هامة في تقييم فعالية ممكنة من تركيبات العقاقير. ووضعت اثنين من طرق الاختبار التآزر في المختبر الرئيسي: الصفيف الشطرنج والدراسة وقت القتل. في هذه الورقة، نقدم أسلوب صفيف شطرنج الآلي الذي يجعل استخدام تكنولوجيا الطباعة النافثة للحبر لزيادة كفاءة ودقة هذه التقنية، فضلا عن طريقة تآزر قتل الوقت يدوية قياسية. يمكن أن تكون الصفيف الشطرنج الآلي مقايسة فرز الفائق، بينما تقدم الدراسة قتل الوقت دليل بيانات إضافية وتكميلية في نشاط تعاوني والقتل.

الصفيف رقعة الداما هو تعديل القياسية المثبطة أدنى تركيز (MIC) الاختبار، الذي المحتضنة مع المضادات الحيوية في تركيبات مختلفة من تركيز البكتيريا وتقييمها لتثبيط النمو بعد الحضانة بين عشية وضحاها. يتطلب الأداء اليدوي الخاص بالصفيف رقعة الداما سلسلة شاقة وعرضه للخطأ في العمليات الحسابية وتخفيف. في الأسلوب الآلي المعروضة هنا، والحساب، والاستغناء عن حل مخزون المضادات الحيوية المطلوبة الآلي وحدات التخزين عن طريق استخدام تكنولوجيا الطابعة النافثة للحبر. في مقايسة التآزر قتل الوقت، البكتيريا المحتضنة مع المضادات الحيوية ذات الاهتمام، سواء معا وعلى حدة، وأخذ عينات منها وعلى فترات متقطعة على مدى 24 ساعة للثقافة الكمية. النتائج يمكن تحديد ما إذا كان الجمع بين التآزر وما إذا كان من جراثيم، وتقديم بيانات عن تثبيط وقتل البكتيريا على مر الزمن.

Introduction

انتشار المقاوم للأدوية المتعددة (المقاوم) البكتيرية المسببة للأمراض، لا سيما المقاوم بكتيريا سلبية الغرام مثل Enterobacteriaceae الكاربابينيمات المقاوم (CRE)، وقد ترك الأطباء مع خيارات محدودة على نحو متزايد للعلاج مدى نجاح 1، مشكلة تتفاقم بتباطؤ وتيرة اكتشاف العقاقير المضادة للبكتيريا رواية2،3. التآزر مضادات الميكروبات، التي تمارس اثنين من الأدوية المستخدمة في الجمع بين تأثير أكبر من المواد المضافة، ويتيح إمكانية إنقاذ المضادات الحيوية الموجودة لاستخدامها في علاج بكتيريا المقاوم للأدوية، وحتى عندما تكون هذه البكتيريا مقاومة لأحد أو كلا المضادات الحيوية على حدة. التقنيات الموضحة في هذه الورقة تقديم طريقتين مكملة للتآزر في المختبر التجارب أنه عندما تستخدم معا، السماح لمحققين بكفاءة الشاشة تركيبات مضادات الميكروبات من الفائدة لدليل على نشاط تعاوني (الآلي أسلوب صفيف الشطرنج) ومن ثم مواصلة تقييم حركية تثبيط وقتل تجلى تركيبات واعدة تم تحديدها في مرحلة الفرز (الطريقة اليدوية قتل الوقت).

إحدى الطرق الأكثر استخداماً لاختبار التآزر في المختبر هو مقايسة الصفيف رقعة الداما، تختبر تعديلاً لاختبار تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) الذي عزل النشاط المثبطة لاثنين من المضادات الحيوية المختلفة ضد البكتيريا أكثر من مجموعة من مجموعات تركيز4،5. إذا كانت المخدرات هما بذل أكبر من النشاط المضافة عند استخدامها معا، يعتبر الجمع بين التآزر6. ومع ذلك، إعداد مجموعة شطرنج يدوياً ينطوي على سلسلة من العمليات الحسابية وخطوات تمييع وبيبيتينج شاقة ومعرضة للخطأ البشري. هذه القيود أدت إلى الحد من استخدام التآزر اختبار أساسا لتقييم أثر رجعي لعدد قليل من مجموعات المضادات الحيوية والبكتيرية المعزولة، والنتائج لم تكن دائماً متسقة بين الدراسات7، 8،9،،من1011. وعلاوة على ذلك، ساهم تعقيد اختبار التآزر لعدم توافر لها في مختبر الميكروبيولوجيا السريرية والغياب الفعلي للبيانات اختبار التآزر في المختبر من الدراسات السريرية للجمع بين العلاج12، 13.

من أجل زيادة الكفاءة والإنتاجية لأسلوب صفيف رقعة الداما، قدمنا استخدام أسلوب الاختبار الآلي هيئة التصنيع العسكري سبق أن وضعت في المختبر يستخدم تكنولوجيا الطباعة النافثة للحبر بدقة واستمرار الاستغناء عن أحجام صغيرة حل مخزون المضادات الحيوية في آبار في لوحة ميكروتيتير14. البرنامج يغني عن الحاجة إلى عمليات حسابية معقدة ومتعددة الخطوات بيبيتينج. البرنامج المقترن بحساب ويوزع كميات مناسبة من المضادات الحيوية لإنشاء صفيف ثنائي الأبعاد شطرنج إذا كان المستخدم ببساطة مدخلات نطاق التركيز المطلوب وتركيز حل مخزون المضادات الحيوية. ونحن في البداية اختبار هذا الأسلوب ضد مجموعة من لجنة المساواة العرقية يعزل15 وبعد ذلك ركزت على اختبار التركيبات المحتوية على كوليستين للنشاط ضد مستفردات كوليستين المقاوم16. كوليستين دواء أخير عادة محجوزة للاستخدام في علاج مقاومة المقاوم للأدوية المتعددة العوامل الممرضة سلبية الغرام17،18، وكوليستين يجعل الفعل المقاوم البكتيريا مقاومة لعموم تقريبا19، يجعلها مثالية المرشحين لوضع استراتيجيات علاجية رواية استخدام العقاقير التي غير حساسة على حدة. لقد وجدنا أنه المزيج من كوليستين والمونوسكلين البروتين التوليف مثبط للمضادات الحيوية بمعدل مرتفع جداً من التآزر، حتى ضد السلالات التي كانت مقاومة لكل من هذه الأدوية كل على حدة، يفترض أن تمارس كوليستين سوبينهيبيتوري بيرميبيليزينج تأثير على البكتيريا المقاومة حتى كوليستين. وقد اخترنا هذا الجمع استخدامه كمثال في هذه الورقة. من المذكرة، اختبار التآزر يمكن أيضا استخدامها لتقييم لفعالية تعزيز اثنين من المخدرات التي على حد سواء فعالة على حدة.

وييسر أسلوب صفيف الشطرنج الآلي اختبار التفاعل السريع والفائق. ومع ذلك، يكون الأسلوب الصفيف رقعة الداما القيود. تعديل مقايسة هيئة التصنيع العسكري، يوفر البيانات فقط على تثبيط النمو البكتيري وليس على القتل، ولا توفر بيانات عن تأثيرات المضادات الحيوية على مر الزمن. على النقيض من ذلك، الأداء اليدوي لفحوصات التآزر قتل الوقت كثيفة العمالة أكثر لكنه يوفر المعلومات على تثبيط وقتل خلال 24 ساعة وقت دورة20،21. استخدمنا تحليل قتل الوقت على عدد أصغر من المستخلصات لتأكيد نتائجنا الصفيف الشطرنج ولتحديد ما إذا كانت مجموعات التآزري حددنا أيضا جراثيم.

كلا الأسلوبين التآزر الصفيف وقتل الوقت رقعة الداما توفر معلومات قيمة عن نشاط تركيبات العقاقير، وهي مفيدة بشكل خاص في تقييم الخيارات العلاجية رواية المحتملة لمسببات الأمراض البكتيرية شديدة المقاومة. كما أن الأساليب والقيود المتأصلة. أسلوب تمييع هيئة التصنيع العسكري ميكروبروث القياسية على نطاق خطأ المتوقع معروفة من 1 تمييع شقين22، التي تزداد عندما يتم اختبار المخدرات اثنين معا في مجموعة شطرنج. المتوقع تعريف موحد للتآزر، التي تعتبر مزيجاً تآزري فقط إذا كانت المخدرات تنشط معا في ربع بهم كل البلدان المتوسطة الدخل6، يأخذ في الاعتبار هذا التباين، ولكن مثل هذا التغير (والذي يعتقد أن يؤدي إلى من مزيج من التقلبات البيولوجية والتقنية23) حتما يولد عدم اليقين حول موثوقية النتائج التآزر. عدم وجود معايير مراقبة الجودة لاختبار التآزر قيد الحالية أيضا. ولعل الحد أهم من جميع طرق الاختبار التآزر هو عدم وجود الارتباطات الثابتة بين النتائج المختبرية والنتائج السريرية عند استخدام تركيبات لعلاج المرضى24. أبسط وأكثر سرعة من التآزر اختبار الأساليب، مثل الشطرنج الآلي صفيف الأسلوب الموصوفة هنا، قد تيسير إدماج التآزر في المختبر التجارب داخل التجارب السريرية أو تقييمات أخرى لنتائج المرضى بغية تحسين يميز العلاقة بين الآثار في المختبر وفي المجراة في المستقبل.

أسلوب صفيف الشطرنج الآلي الذي نحن الحاضرين هنا يقدم خياراً للفرز الفائق لمجموعة متنوعة من تركيبات ويسمح للتقييم السريع لمجموعات "عالية المخاطر عالية مكافأة" غير عادية، ودون استثمار كبير من الوقت و الموارد. يمكن تقديم معلومات داعمة إضافية عن نشاط تعاوني للجمع بين الأسلوب وقت القتل، الذي ندلل فيما بعد، ويمكن أن يساعد على تميز نشاط جراثيم والحركية المضادة للبكتيريا.

Protocol

تنبيه: استخدام إجراءات السلامة المناسبة عند العمل مع البكتيريا. ارتداء القفازات ومعطف مختبر في جميع الأوقات. أداء العمل في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء إذا كان سيتم إنشاء الهباء الجوي أو العمل مع مسببات الأمراض عالية المخاطر.

ملاحظة: العشرين إلى 24 ح قبل بدء التجارب والانتصارات خارج isolate(s) الجرثومي اختبار على طبق أجار الدم (من مخزون تنقية مستعمرة، والحد الأدنى باساجيد المجمدة في-80 درجة مئوية في مرق الصويا تريبتيك مع الأسهم والغليسيرول 50%). احتضان لوحة عند 35 درجة مئوية في الهواء المحيط.

1-الطابعة النافثة للحبر--ساعدت الشطرنج الآلي الصفيف التآزر

  1. جعل الحلول مخزون مضادات الميكروبات (كوليستين والمونوسكلين).
    1. تحديد تركيزات حل مخزون المضادات الحيوية استناداً إلى قابلية الذوبان من المضادات الحيوية والمطلوب التركيزات النهائية في صفيف رقعة الداما. جعل الأرصدة 10 ملغ/مل كوليستين والمينوسكلين في هذا المثال. استخدام المستند M100 كلسي لتحديد المذيبات المناسبة لكل المضادات الحيوية25. كوليستين والمونوسكلين للذوبان في الماء؛ للطابعة النافثة للحبر D300 يتطلب إضافة خافض للتوتر السطحي لسائل مائي سليم المناولة، حل المضادات الحيوية في المياه عالي النقاوة بنسبة 0.3% بوليسوربيت 20.
    2. تزن بمسحوق المضادات الحيوية باستخدام رصيد التحليلية وحساب حجم المذيب اللازم للحصول على تركيز المخزون الهدف.
      1. إذا تم توفير المضادات الحيوية كملح (مثل كبريتات كوليستين، المينوسكلين هيدروكلوريد) أو بشكل رطب (مثل ثلاثي الميروبينيم)، أو إذا أفيد من الشركة المصنعة يكون أقل من 100 ٪ النقاء، أداء حساب فاعلية26 إلى تحديد كمية المذيب المطلوبة.
      2. اتبع هذا المثال المينوسكلين هيدروكلوريد بدرجة نقاء المعلن من مجم 900:
        الاعتداء نقاء: مجم 900
        الماء المحتوى: لا شيء
        جزء نشط: 0.926 (الحصول عليها بقسمة الوزن الجزيئي المينوسكلين (457.48 Da) بالوزن الجزيئي المينوسكلين هيدروكلوريد (493.94 Da)).
        فاعلية = (مقايسة النقاء) * (1-محتوى الماء) * (جزء نشط)
        = (900/مجم) * (1) * (0.926) = مجم 833.4 أو 83.34%
        ثم تحديد حجم المذيب المطلوبة كما يلي:
        الحجم (مل) = [الوزن (mg) * فاعلية (مجم)] ÷ [تركيز (مغ/مل)]
        لذا، على سبيل المثال، إذا يتم وزن 34.7 ملغ المينوسكلين هيدروكلوريد مسحوق، استخدام الحساب التالي لتحديد حجم المذيب المطلوبة لجعل حل 10 ملغ/مل:
        حجم = (34.7 ملغ) * (833.4 مز/mg) = مل 2.89
        10,000 mg/mL
    3. صب مسحوق المضادات الحيوية في أنبوب مخروطي 15 مل وإضافة وحدة التخزين المناسبة للمياه بالإضافة إلى 0.3% بوليسوربيت 20. دوامة حتى يذوب.
    4. الكوة حل مخزون المضادات الحيوية في أنابيب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل ومخزن في-80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
  2. أداء مراقبة الجودة (QC) مخزون مضادات الميكروبات لاستخدامها في التجارب الصفيف رقعة الداما قبل التآزر الاختبار حيث أنه يمكن تقييم نتائج مراقبة الجودة قبل استخدام الأسهم لاختبار التآزر بيوم واحد على الأقل.
    ملاحظة:    QC الأسلوب الموصوفة هنا مطابق لهذه التقنية التي سوف تستخدم لتركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) اختبار العقاقير فردية ويمكن استخدامها على هذا النحو مع أي سلالات من الفائدة للمحقق.
    1. إعداد تعليق البكتيرية.
      1. تأخذ قاسمة كل مخزون المضادات الحيوية خارج الثلاجة-80 درجة مئوية لبدء ذوبان الجليد أثناء إعداد تعليق البكتيرية. دوامة مذاب مرة واحدة للتأكد من أن المضادات الحيوية في الحل.
      2. حدد عبئا مراقبة الجودة مناسبة وتحديد نطاق هيئة التصنيع العسكري المقبول للعقاقير التي يجري اختبارها استناداً إلى الجدول 5 ألف-1 في M100 كلسي25. استخدام للمخدرات هنا، كولاي ATCC 25922؛ نطاقات هيئة التصنيع العسكري لهذه السلالة هي 0.25-1 ملغ/مل المينوسكلين و 0.25-2 مغ/مل كوليستين.
      3. حدد مجموعة من تركيزات المضادات الحيوية لاختبار التي ستشمل مجمل QC. استخدام نطاق 0.0156 مغ/مل إلى 8 ملغ/مل المينوسكلين وكوليستين ل ATCC 25922.
      4. إضافة 1 مل كلوريد الصوديوم 0.9 في المائة 12 مم × 75 مم جولة أسفل الزجاج الثقافة أنبوب. حدد واحد أو اثنين من المستعمرات من صفيحة بين عشية وضحاها ATCC 25922 ودوامه بلطف بتعليق.
      5. التحقق من أن تركيز البكتيريا باستخدام قارئ ماكفارلاند. ضبط حسب الحاجة عن طريق إضافة المزيد من كلوريد الصوديوم 0.9% أو أكثر من البكتيريا لتحقيق 0.5 ماكفارلاند تعكر القراءة.
      6. جعل إضعاف رافعة تعليق 0.5 ماكفارلاند بإضافة 100 مل التعليق إلى 30 مل مرق مولر هينتون المعدلة الموجبة (كامهب) في أنبوب 50 مل مخروطية للوصول إلى كثافة خلية الأخيرة من 5 × 105 مليلتر زيمبابوي، حسبما أوصت به كلسي27.
      7. استخدام حلقة إينوكولاتينج عقيمة، عزلة متواصلة قطره من العدوى الانطلاق على طبق أجار الدم لتأكيد نقاوة العدوى، واحتضان على 35 درجة مئوية في الهواء المحيط.
    2. إضافة مضادات الميكروبات لصفيحة مسطحة القاع، ساحة، حسنا، واضحة، غير المعالجة 384-جيدا باستخدام D300. تنفيذ هذه الخطوة فورا بعد إعداد تعليق البكتيرية بحيث يمكن إضافة تعليق إلى اللوحات خلال 15 دقيقة من إعداد26.
      1. قم بتشغيل الطابعة النافثة للحبر D300 والكمبيوتر المرتبطة بها. قم بفتح البرنامج.
      2. بدء ملف جديد. أعلاه صورة الشبكة لوحة، انقر بالزر الأيمن على لوحة 1 واختر تحرير لوحة. حدد نوع اللوحة المناسبة (384 جيدا) ووحدة تخزين إضافية (50 مل).
      3. إضافة السوائل (أي مخزون المضادات الحيوية) للبروتوكول بواسطة النقر فوق علامة الجمع بجوار السوائل في اللوحة اليسرى. إضافة اثنين من السوائل (كوليستين والمونوسكلين).
        1. تحوم فوق اللوحة التي ظهرت للسوائل 1 وانقر فوق القلم لتحرير. اسم السائل "كوليستين"، تغيير الفئة إلى "المائي + توين 20"، تغيير التركيز إلى 10 آلاف، وتغيير وحدات تركيز بملغ/مل (علما بأن تركيز المخزون 10 ملغ/مل، أي، 10,000 مغ/مل). ترك ص ب Dispense تركيز وترك ما تبقى الحقول في الإعدادات الافتراضية الخاصة بها. انقر فوق "موافق".
        2. تكرار الإجراء أعلاه للسائل 2 (المينوسكلين).
        3. انقر فوق علامة التبويب بروتوكول الحالية في الجزء العلوي من الشاشة، وتغيير تركيز (الشامل) إلى مغ/مل لتحديد الوحدات المستخدمة لتركيزات المضادات الحيوية كذلك النهائي.
      4. حدد 10 آبار في الشبكة بالنقر والسحب، ثم انقر فوق معايرة في الجزء العلوي من الشاشة. لتحديد تحديد المعايرة باستخدام أعلى تركيز، السائل اختيار كوليستين، أعلى تركيز أدخل 8 (تأكد من وحدات مغ/مل)، و التوزيع حدد 1:2 (50%). اترك الافتراضي القيم في مكان لبقية الإطار، ثم انقر فوق موافق.
      5. تكرار الإجراء أعلاه المينوسكلين لتوليد المعايرة مينوسكلين.
      6. حفظ البروتوكول، ومن ثم انقر فوق الزر تشغيل في أعلى يسار.
      7. انقر فوق الزر ابدأ . تحميل لوحة 384-جيدا (مع إزالة الغطاء) إلى صاحب اللوحة واضغط على تحميل تحت "تحميل لوحة 1 – التآزر" فورا.
        ملاحظة: هذه المطالبة يتم اختياره من قبل البرنامج ولا تشير إلى أن يتم إجراء اختبار التآزر. ضع T8 + كاسيت إلى كاسيت فتحه واضغط على تحميل تحت تحميل كاسيت T8 + الفوري.
      8. عند مطالبتك بذلك، إضافة حل مخزون المضادات الحيوية للخزانات المشار إليها في الكاسيت. اتبع الإرشادات على الشاشة لتحميل السليم والاستغناء بعناية لتجنب الحصول على أي فقاعات في الحل. بعد إضافة كل حل، اضغط على زر تعبئة .
      9. مرة واحدة وقد أضيف الطابعة النافثة للحبر يظهر مخزون المضادات الحيوية بكميات مناسبة لكل بئر ومربع تشغيل مكتمل ، انقر فوق إغلاقوإزالة اللوحة، وإيقاف D300.
    3. إضافة تعليق البكتيرية إلى لوحة 384-جيدا واحتضان لوحة.
      1. صب تعليق البكتيرية معدّة مسبقاً في خزان كاشف عقيمة.
      2. استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 مل تعليق البكتيرية على جميع الآبار التي تحتوي على المضادات الحيوية. إضافة 50 مل كامب دون البكتيريا إلى بئر فارغة؛ وستكون هذه الرقابة السلبية جيدا للتأكد من العقم من وسائط الإعلام.
      3. ضع لوحة في حاضنة هواء المحيط 35 درجة مئوية واحتضان 16-20 ح26.
        ملاحظة: مدة حضانة المرض مختلفة قد يكون مطلوباً إذا يجري اختبار الكائنات الحية الأخرى من انتيروباكتيرياسي ؛ راجع M100 كلسي25 للتوصيات الخاصة بالكائن.
    4. قراءة لوحة على قارئ ميكروسكوبية كثافة بصرية من 600 (OD600)، وتحليل النتائج.
      1. باستخدام برنامج جداول بيانات، تظليل الخلايا بقيمة600 OD ≥0.07 الخضراء، التي تشير إلى النمو، والخلايا التي تحتوي على قيمة < 0.07 الأحمر، للإشارة إلى أي نمو.
        ملاحظة: تم تحديد قيم هذه استناداً إلى الفحص البصري للنمو مقابل لا نمو وترابط مع قراءات التطوير التنظيمي لهذه التجارب؛ OD600 قراءات من الآبار التي تحتوي على وسائل الإعلام وحدها كانت دائماً أقل من 0.07. وقد تختلف قطع مناسبة مع القراء لوحة مختلفة والبكتيريا.
      2. تحديد هيئة التصنيع العسكري لكل دواء. هيئة التصنيع العسكري هو أدنى تركيز للمخدرات التي تحول دون النمو الجرثومي. إذا كانت هيئة التصنيع العسكري داخل نطاق مراقبة الجودة المتوقعة وفقا للوثيقة M100 كلسي25، الحل الأسهم المناسبة للاستخدام.
  3. إعداد تعليق البكتيرية للشطرنج الصفيف.
    1. تأخذ قاسمة كل مخزون المضادات الحيوية خارج الثلاجة-80 درجة مئوية لبدء ذوبان الجليد أثناء إعداد تعليق البكتيرية. دوامة مذاب مرة واحدة التأكد من المضادات الحيوية في الحل.
    2. إضافة ~ 1 مل كلوريد الصوديوم 0.9 في المائة 12 مم × 75 مم جولة أسفل الزجاج الثقافة أنبوب. حدد واحد أو اثنين من المستعمرات من صفيحة بين عشية وضحاها من البكتيريا (في هذه السلالة كولاي القضية، 0494 إدارة الأغذية والعقاقير--مركز السيطرة على الأمراض) ودوامه بلطف بتعليق هذه في كلوريد الصوديوم 0.9%.
    3. التحقق من أن تركيز البكتيريا باستخدام قارئ ماكفارلاند. ضبط حسب الحاجة عن طريق إضافة المزيد من كلوريد الصوديوم 0.9% أو أكثر من البكتيريا لتحقيق 0.5 ماكفارلاند تعكر القراءة.
    4. جعل إضعاف رافعة تعليق 0.5 ماكفارلاند بإضافة 100 مل التعليق إلى 30 مل كامب في أنبوب 50 مل مخروطية للوصول إلى كثافة خلية الأخيرة من 5 × 105 مل زيمبابوي/27.
  4. إضافة مضادات الميكروبات لصفيحة مسطحة القاع، ساحة، حسنا، واضحة، غير المعالجة 384-جيدا باستخدام D300.
    ملاحظة:     تنفيذ هذه الخطوة فورا بعد إعداد تعليق البكتيرية بحيث يمكن إضافة تعليق إلى اللوحات خلال 15 دقيقة من إعداد26.
    1. قم بتشغيل الطابعة النافثة للحبر وبدء ملف جديد، وإضافة السوائل إلى البروتوكول كما هو الحال في 1.2.2.1-1.2.2.3 الخطوات.
    2. إنشاء الشبكة التآزر.
      1. انقر فوق رمز التآزر في الجزء العلوي من الشاشة، والمضي قدما من خلال الخطوات. بالنسبة نوع حدد اثنين أو أكثر من السوائل تؤخذ معا. لوحة، فإنه ليس من الضروري استبعاد أي الآبار؛ انقر فوق التالي على هذه الخطوة دون إجراء تغييرات.
      2. في علامة التبويب المعايرة ، أدخل تركيزات المضادات الحيوية والموضع.
        1. من أجل إضافة المينوسكلين في تناقص تخفيف مضاعفة من 32 إلى 0.031 ملغ/مل، بالإضافة إلى بئر سلبية مع لا من المضادات الحيوية، أسفل المحور y ، أدخل 12 مستويات المعايرة في اللوحة اليسرى. تحديد استخدام المعايرة، حدد أعلى تركيز؛ بالنسبة السوائل، حدد [مينوسكلين]؛ أعلى تركيز، أدخل 32 (تأكد من الوحدة هو تعيين في مغ/مل؛ وإذا لم يكن، قم بإغلاق مربع الحوار التآزر وتغيير تحت علامة التبويب البروتوكول الحالي ). تأكد من أن يتم التحقق من المربع القيمة تشمل 0 . تغيير التوزيع إلى 1:2 (50%).
        2. كرر هذه الخطوات كوليستين على اللوحة اليمنى، باستخدام 12 مستويات المعايرة وتركيز أعلى من 16. انقر فوق التالي.
      3. من علامة التبويب " تخطيط "، اختر معايرة مستويات السوائل 2 أولاً تحديد عدد الصفوف والأعمدة في شبكة تخطيط. انقر فوق التالي. إذا كانت تظهر الشبكة كما هو متوقع، انقر فوق إنهاء.
    3. حفظ على البروتوكول، ثم انقر فوق الزر تشغيل في أعلى يسار.
    4. انقر فوق الزر ابدأ . تحميل لوحة 384-جيدا (مع إزالة الغطاء) إلى صاحب اللوحة واضغط على تحميل تحت تحميل لوحة 1 – التآزر الفوري. ضع T8 + كاسيت إلى كاسيت فتحه واضغط على تحميل تحت تحميل كاسيت T8 + الفوري.
    5. عند مطالبتك بذلك، إضافة حل مخزون المضادات الحيوية للخزانات المشار إليها في الكاسيت. اتبع الإرشادات على الشاشة لتحميل السليم والاستغناء بعناية لتجنب الحصول على أي فقاعات في الحل. بعد إضافة كل حل، اضغط على زر تعبئة .
    6. مرة واحدة وقد أضيف موزع D300 يظهر مخزون المضادات الحيوية بكميات مناسبة لكل بئر ومربع تشغيل مكتمل ، انقر فوق إنهاءوإزالة اللوحة، وإيقاف D300.
  5. إضافة تعليق البكتيرية إلى لوحة 384-جيدا واحتضان لوحة.
    1. صب تعليق البكتيرية معدّة مسبقاً في خزان كاشف عقيمة.
    2. استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 مل التعليق لجميع الآبار في الصفيف رقعة الداما. إضافة 50 مل كامب دون البكتيريا إلى بئر فارغة؛ وستكون هذه الرقابة السلبية جيدا للتأكد من العقم من وسائط الإعلام. احتضان في حاضنة هواء المحيط 35 درجة مئوية 16-20 ح26.
  6. قراءة لوحة على قارئ ميكروسكوبية OD600 وتحليل نتائج مصفوفة رقعة الداما.
    1. أولاً، تحقق من لوحة النقاء والتأكد من وجود المستعمرات المعزولة مورفولوجيا واحد يتفق مع مورفولوجية المتوقعة في الحي ويجري اختبار.
    2. باستخدام برنامج جدول بيانات، خلايا للإشارة إلى النمو وليس النمو كما هو الحال في الخطوة 1.2.4.1 الظل.
    3. تحديد هيئة التصنيع العسكري لكل دواء. ويعتبر هيئة التصنيع العسكري للمخدرات التي لا تمنع النمو البكتيري في أعلى تركيز اختبارها، تكون خارج النطاق.
    4. لكل بئر التي تحول دون النمو، تحديد تركيز المثبطة كسرية (FIC) لكل المضادات الحيوية التي تستند إلى هيئة التصنيع العسكري في هذه المضادات الحيوية (انظر الشكل 1B و 2B الشكل).
      ملاحظة: مركز الاستخبارات المالية هي نسبة تركيز المضادات الحيوية في بئر التي تحول دون نمو إلى أن هيئة التصنيع العسكري؛ حتى للمخدرات مع هيئة التصنيع العسكري 8 ملغ/مل، لديه أيضا تحتوي على 8 ملغ/مل هذا المخدر مركز الاستخبارات المالية 1، بينما تحتوي أيضا على 4 ملغ/مل FIC 0.5.
    5. حساب قيمة الفهرس (FICأنا) تركيز المثبطة كسرى لكل بئر التي تحول دون النمو كمجموع FICs كل من المخدرات في ذلك جيدا.
    6. تحديد أدنى FICأنا النمو الذي أعاق (الحد الأدنى FICأنا). إذا كان الحد الأدنى FICأنا جنيه استرليني 0.5، ينظر الجمع بين التآزر؛ إذا كان 0.5-4، النظر في التركيبة غير مبال؛ وإذا كان > 4، النظر في التركيبة معادية. إذا كان الجمع بين التآزر في بعض مجموعات تركيز لكن معادية أخرى، ملاحظة هذه النتيجة ولكن النظر في التركيبة عموما معادية.

2-الاختبار الوقت-قتل التآزر

  1. جعل الحلول مخزون مضادات الميكروبات. إذا كان يتم إجراء هذه الخطوة قبل التجربة، تجميد الأرصدة في-80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
    1. تحديد تركيزات حل مخزون المضادات الحيوية استناداً إلى قابلية الذوبان من المضادات الحيوية والتركيزات النهائية في الدراسات قتل الوقت المطلوب. في هذا المثال، جعل الأرصدة كوليستين والمونوسكلين بتركيز 1 ملغ/مل. استخدام المستند M100 كلسي لتحديد المذيبات المناسبة لكل المضادات الحيوية25. استخدام المياه، كما أوصت، كوليستين ومينوسكلين.
    2. تزن بمسحوق المضادات الحيوية استخدام رصيد التحليلية وحساب حجم المذيب اللازم للحصول على تركيز المخزون الهدف. إذا لزم الأمر، إجراء عمليات حسابية قوتها قبل تحديد كمية المذيب المطلوبة، كما هو موضح في الخطوة 1.1.2.1 أعلاه.
    3. صب مسحوق المضادات الحيوية في 15 مل من أنابيب مخروطية الشكل وإضافة وحدة التخزين الملائمة للمياه. دوامة حتى يذوب.
  2. استخدام الأسلوب ميكروديلوتيون مرق اليدوي الموصوفة في M07 كلسي26، القيام بمراقبة الجودة لمضادات الميكروبات الأرصدة لاستخدامها في وقت قتل تجارب التآزر. تنفيذ هذه الخطوة قبل التآزر الاختبار حيث أنه يمكن أن يعاد النظر في نتائج مراقبة الجودة قبل استخدام الأسهم بيوم واحد على الأقل.
    1. حدد عبئا مراقبة الجودة مناسبة وتحديد نطاق هيئة التصنيع العسكري المقبول للعقاقير التي يجري اختبارها استناداً إلى الجدول 5 ألف-1 في M100 كلسي25. استخدام للمخدرات هنا، كولاي ATCC 25922؛ نطاقات هيئة التصنيع العسكري لهذه السلالة هي 0.25-1 ملغ/مل المينوسكلين و 0.25-2 مغ/مل كوليستين.
    2. إعداد لوحات ميكروديلوشن مرق المحتوية على المضادات الحيوية.
      1. حدد أعلى تركيز للمضادات الحيوية لفحصها حتى كامل نطاق مراقبة الجودة يمكن إدراجها. استخدام نطاق 0.016 إلى 8 ملغ/مل المينوسكلين وكوليستين ل ATCC 25922.
      2. تمييع مخزون المضادات الحيوية لإيجاد حل عملي في كامب في مرتين أعلى تركيز اللازمة (لأنه سيكون المخفف 1:1 مع تعليق البكتيريا). في هذا المثال، يؤدي إلى تمييع كل الأرصدة من 10 ملغ/مل إلى 16 ملغ/مل.
      3. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 100 مل كل من 2 × معلقات المضادات الحيوية إلى بئر في العمود الأول من لوحة 96-جيدا واضحة، والمائدة المستديرة لأسفل، غير المعالجة وإضافة 50 مل مرق عادي (أي، بدون المضادات الحيوية) لكل بئر من أعمدة اللاحقة.
      4. إزالة 50 مل من المضادات الحيوية التي تحتوي على مرق من كل خير في العمود الأول وإضافة إلى الآبار في العمود الثاني. ماصة صعودا وهبوطاً عدة مرات لخلط المحتويات، تولد بتركيز المضادات الحيوية نصف هذا التركز في العمود الأول.
      5. كرر الخطوة 2.2.2.4 مع كل عمود، حتى أنه أعد سلسلة من المسلسل شقين تخفيف، كل منها بحجم 50 مل،. نصائح ماصة التغيير بين كل خطوة إضعاف إذا كان المطلوب للقضاء على إمكانية ترحيل المضادات الحيوية. لاحظ أن تركيزات الناتجة هي 2 لا تزال جميع × التركيزات النهائية، كما أنها ستكون في وقت لاحق المخفف 1:1 مع تعليق البكتيرية.
      6. لا تقم بإضافة أي من المضادات الحيوية للعمودين النهائي، كما ستكون هذه الأعمدة مراقبة النمو وسلبية.
    3. إعداد تعليق البكتيرية.
      1. إعداد تعليق ماكفارلاند 0.5 من صفيحة ATCC كولاي 25922 في 0.9% كلوريد الصوديوم بين عشية وضحاها كما هو موضح في الخطوات 1.2.1.5-1.2.1.6.
      2. جعل إضعاف 1:150 تعليق 0.5 ماكفارلاند بإضافة 50 مل التعليق إلى 7.5 مل كامب.
        ملاحظة: تعليق البكتيرية النهائية ستكون رافعة المخفف بمجرد أنها مختلطة 1:1 مع الحل المضادات الحيوية، التوصل إلى كثافة الخلية أوصى كلسي 5 × 105 مل زيمبابوي/27).
    4. إضافة بكتيريا ميكروسكوبية واحتضانها.
      1. إضافة 50 مل تعليق البكتيرية لكل بئر، ما عدا في العمودال 11. إضافة 50 مل كامب إلى العمودال 11 (العمود مراقبة سلبية).
      2. احتضان لوحة عند 35 درجة مئوية ح 16-20.
        ملاحظة: مدة حضانة المرض مختلفة قد يكون مطلوباً إذا يجري اختبار الكائنات الحية الأخرى من انتيروباكتيرياسي ؛ راجع M100 كلسي25 للتوصيات الخاصة بالكائن.
      3. قراءة لوحة للنمو بصريا باستخدام الضوء المنقولة، لكل المضادات الحيوية، تحديد أدنى تركيز فيه هناك أي نمو؛ وهذا هو هيئة التصنيع العسكري. راجع المستند M07 كلسي للحصول على تفاصيل إضافية حول التفسير البصري لهيئة التصنيع العسكري26. إذا كانت هيئة التصنيع العسكري ضمن نطاق مراقبة الجودة المتوقعة، الحل الأسهم المناسبة للاستخدام.
  3. تبدأ الثقافة الأولية.
    1. تجعل من 0.5 ماكفارلاند تعليق الكائن الاختبار في العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم كالموصوفة أعلاه.
    2. إضافة 100 مل 0.5 ماكفارلاند تعليق إلى 5 مل كامب في زجاج 25 مم × 150 مم جولة الأنبوبة الثقافة السفلي مع الإغلاق الفولاذ المقاوم للصدأ ودوامه بلطف مزيج.
    3. استخدام حلقة إينوكولاتينج عقيمة، عزلة متواصلة قطره تعليق المخفف على طبق أجار الدم للتأكد من النقاء العدوى واحتضان على 35 درجة مئوية في الهواء المحيط.
    4. استبدال إغلاق الأنبوب واحتضان في حامل أنبوبة الاختبار على شاكر على 35 درجة مئوية في الهواء المحيط على الأقل 3 ح، حتى يتم التوصل إلى لوغاريتمي مرحلة النمو (راجع الخطوة 2.6.1). انتقل إلى الخطوة 2، 4 في حين الثقافة في الحاضنة.
  4. إعداد حلول مضادات الميكروبات في 25 مم × 150 مم أنابيب زجاجية الثقافة.
    1. إخراج مختبرين مخزون مضادات الميكروبات من الثلاجة-80 درجة مئوية لذوبان الجليد. دوامة مذاب مرة واحدة التأكد من المضادات الحيوية في الحل.
    2. بينما هو حضانة الثقافة الأولية، بإضافة 10 مل كامب إلى خمسة أنابيب الثقافة الزجاج يعقم 25 × 150 مم وإضافة حلول مخزون مضادات الميكروبات كما يلي.
      ملاحظة: ينبغي أن تكون المخدرات واحد على الأقل لدراسة أوجه تآزر، بتركيز يؤثر على النمو منحنى فردياً28؛ يمكن تحديد هذا بواسطة تقييم آثار تركيزات العقاقير فردية قبل الدراسة التآزر.
      1. أنبوب 1: إضافة كمية مناسبة من المضادات الحيوية #1 للحصول على الهدف النهائي تركيز المضادات الحيوية. في هذه الحالة، أضف 10 مل من 1 ملغ/مل كوليستين الأسهم للحصول على تركيز كوليستين نهائي من 1 ملغ/مل، حيث أن هذا تركيز التي غير فعالة ضد السلالة المستخدمة في هذا المثال.
      2. أنبوب 2: إضافة كمية مناسبة من المضادات الحيوية #2 للحصول على تركيز المضادات الحيوية النهائية لفحصها. وفي هذه الحالة، أضف 10 مل من 1 ملغ/مل المينوسكلين الأسهم للحصول على تركيز 1 ملغ/مل، بتركيز غير فعال ضد السلالة المستخدمة في هذا المثال نهائي.
      3. أنبوب 3: إضافة نفس الكمية من المضادات الحيوية #1 و المضادات الحيوية #2 المستخدمة في أنابيب 1 و 2. وفي هذه الحالة، أضف 10 مل مخزون المينوسكلين 1 ملغ/مل و 10 مل من 1 ملغ/مل كوليستين الأسهم.
      4. أنبوب 4: إضافة لا المضادات الحيوية؛ وسيكون هذا الأنبوب مراقبة النمو.
      5. أنبوب 5: إضافة لا المضادات الحيوية؛ وسيكون هذا الأنبوب مراقبة سلبية.
  5. إعداد لوحات عميقة البولي بروبلين 96 مع الآبار 2 مل لتخفيف المسلسل بإضافة 900 ميليلتر من كلوريد الصوديوم 0.9% العقيمة إلى صفوف ح ب من أعمدة 1-5 مع ماصة متعددة القنوات.
  6. تعد بداية العدوى وإضافة إلى أنابيب.
    1. مجرد ثقافة الأولى وصلت إلى مرحلة النمو لوغاريتمي (~ 3 ح الكلبسيله الرئوية، الكائنات المستخدمة في هذا المثال)، إزالة أنبوب الثقافة دوامة من شاكر، بلطف، نقل ~ 1 مل تعليق إلى أنبوب ثقافة زجاج 12 مم × 75 مم، و فحص الكثافة مع قارئ ماكفارلاند.
      1. إذا كان أقل من 1.0 مكفارلاند، عودة أنبوب لشاكر واحتضان أطول. إذا كان أكبر من 1.0 مكفارلاند، إضافة كامهب إلى الأنبوب، دوامة بلطف، وإعادة عينة، تكرار هذه العملية حتى يتم التعليق في ماكفارلاند 1.0.
    2. إضافة 100 مل تعليق ماكفارلاند 1.0 لأنابيب 1-4 ودوامه بلطف.
  7. عينة مختبرين من كل ثقافة وأداء المسلسل تخفيف عشرة إضعاف.
    1. وقت 0 (مباشرة بعد إضافة البكتيريا للأنابيب)، وفي 1 و 2، 4، 6، و 24 ساعة، إزالة 150 مل الكوة من كل أنبوبة الثقافة عن إمالة الأنبوب حيث أن فقط تلميح ماصة معقمة يدخل الأنبوب ولا رمح بيبيتور غير معقمة أثناء سحب الكوة. إضافة مختبرين، على التوالي، إلى آبار متتالية في الصف الأول من لوحة جيدا عمق 96 المجهز سابقا. العودة أنابيب إلى رف أنبوبة الاختبار شاكر في حاضنة هواء المحيط 35 درجة مئوية فورا بعد إزالة مختبرين في كل نقطة في الوقت.
    2. استخدام ماصة متعددة القنوات، إزالة 100 مل من الصف A، إضافة إلى صف ب (الذي يحتوي على 900 مل كلوريد الصوديوم 0.9%)، و "الماصة؛" 4-5 مرات صعودا ونزولاً إلى المزيج، خلق 01:10 إضعاف. تجاهل نصائح بعد كل خطوة تمييع لمنع ترحيل بكتيريا، والتي يمكن أن تؤدي إلى التهم مستعمرة زورا مرتفعة.
    3. كرر الخطوة 2.7.2 للصفوف ح ب مع نصائح ماصة جديدة لكل صف.
  8. لوحة المخفف عينات للتهم مستعمرة استخدام29،أسلوب لوحة قطره30.
    1. لوحات أجار مولر هينتون التسمية مع ظروف المضادات الحيوية وتمييع يكون مطلي.
    2. استخدام ماصة متعددة القنوات ونصائح خارج طويلة (لضمان أن تصل إلى نصائح إلى تعليق)، إزالة 10 مل من كل بئر في عمود واحد والاستغناء بعناية في صف واحد على لوحة مسماة على نحو ملائم. إذا كان يتم استخدام لوحات صغيرة (بقطر 100 ملم)، الاستغناء عن الصفوف 3 (يتألف كل منهما من قطرات من الصفوف أ-ح من عمود واحد) كل لوح؛ في لوحات (150 مم)، كبيرة والاستغناء عن 8 صفوف للوحة الواحدة.
    3. تسمح قطرات لتجف تماما (~ 15 دقيقة).
    4. في 24 ساعة، ضع قطره 10 مل مأخوذة مباشرة من الأنبوب مراقبة سلبية في منطقة أشارت إحدى اللوحات لاختبار للعقم. عكس لوحات واحتضان بين عشية وضحاها في 35 درجة مئوية في الهواء المحيط.
  9. عد المستعمرات وحساب كثافة الخلية. علامة المستعمرات مع علامة غرامة-نصيحة دائمة على عكس لوحة لتجنب المستعمرات العد المزدوج أو مفقودة.
    1. أولاً، تحقق من لوحة النقاء والتأكد من وجود المستعمرات المعزولة مورفولوجيا واحد يتفق مع مورفولوجية المتوقعة في الحي ويجري اختبار.
    2. لكل سلسلة تمييع، تحديد قطرات مع المستعمرات 3-30 (عادة قطره واحدة كل سلسلة تمييع). عد المستعمرات في هذه القطرات وسجل العد جنبا إلى جنب مع عامل التخفيف.
      1. إذا كان هناك لا قطرات في سلسلة تمييع مع المستعمرات 3-30، عد المستعمرات في آخر قطره مع > مستعمرات 30 وهو أول انخفاض مع < 3 مستعمرات (ينبغي أن تكون هذه القطرات المجاورة).
    3. لكل سلسلة تمييع، حساب عدد من مستعمرة تشكيل وحدات في المليلتر (زيمبابوي/mL) في العينة على أساس العدد المستعمرات في إسقاط باستخدام الصيغة التالية: زيمبابوي/مل = n(1/د) (100) حيث n هو العدد المستعمرات، د هو عامل إضعاف (1 لنموذج غير مخفف (صف أ) أو 0.1 أو 10-1 للأولى 01:10 إضعاف (صف ب)، 0.01 أو 10-2 للثانية 01:10 تمييع (صف ج)، وهلم جرا، وحسابات 100 المستمر للحقيقة أن الحجم الإجمالي للانخفاض أنا s 10 مل، بينما يتم التعبير عن القيمة النهائية في زيمبابوي/مل، أي زيمبابوي/1,000 مل. استخدام جداول بيانات التي تحتوي على الصيغ التي تقوم بحساب زيمبابوي/ملليلتر من العد مستعمرة لتبسيط هذه العملية.
      1. لتمييع سلسلة فيها أكثر من قطره واحدة لعد (أو فيها نقطتين لحسابها لأن لا قطره سقطت في النطاق)، متوسط التهم زيمبابوي/mL النهائي لجميع قطرات الأصوات التي تم فرزها.
      2. لأن الحد الأدنى للكشف (3 مستعمرات في إسقاط غير مخفف)، زيمبابوي/mL 300 سجل وارسم العد مستعمرة كجنية استرليني 300 مليلتر زيمبابوي لتمييع السلسلة التي توجد فيها < 3 مستعمرات في إسقاط غير مخفف.
    4. فحص قطره مكافحة العقم من الوقت 24؛ إذا كان أي النمو الملاحظ في هذا الانخفاض، ينبغي عدم استخدام نتائج التجربة.
  10. الرسم البياني، وتحليل النتائج.
    1. رسم منحنيات النمو من الثقافات الثلاث التي تحتوي على المضادات الحيوية ومراقبة النمو في نفس الرسم البياني. ارسم الوقت على المحور x وزيمبابوي/مل، باستخدام مقياس لوغاريتمي، على المحور ص .
    2. حساب الفرق في زيمبابوي/مل بين أنبوب الجمع بين 24 في الوقت وعامل واحد الأكثر نشاطا في الوقت 24. إذا كان الفرق إيه تو سجل10، النظر في الجمع بين التآزر. ثم حساب الفرق بين أنبوب الجمع بين وقت 24 وفي الساعة 0 في زيمبابوي/مل. إذا كان الفرق إيه ثري سجل10، النظر في الجمع بين جراثيم.

Representative Results

ويعرض الشكل 1A شبكة من تجربة تآزر صفيف رقعة الداما جنبا إلى جنب مع كوليستين تركيزات 0-16 ميكروغرام/مل ميكروغرام/مل الذي المينوسكلين في تركيزات 0-32 واختبارها ضد سلالة كولاي 0494 إدارة الأغذية والعقاقير--مركز السيطرة على الأمراض. وتمثل القيم القراءات سبيكتروفوتوميتريك في الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600). الآبار مع القيم600 OD أدناه 0.07 (والذي يتوافق مع أي نمو بالفحص البصري) هي الأحمر المظلل، بينما الآبار مع القيم600 OD 0.07 (الذي يتوافق مع النمو بالفحص البصري) الأخضر مظللة. لكل دواء، هو تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC؛ الغامق) أدنى تركيز للعقاقير التي تثبط نمو البكتيريا. المينوسكلين، هذا 32 ميكروغرام/مل، وأنها كوليستين، 8 ميكروغرام/مل. يتم الاحتفاظ التظليل في الشكل 1 باء، ولكن يتم استبدال القيم داخل الآبار التي تحول دون النمو بقيم الفهرس (FICأنا) تركيز المثبطة كسرية. وهذه تتحدد على النحو التالي: في كل بئر، يحسب مؤشر التركيز المثبطة كسرية (FIC) كل دواء بقسمة تركيز المضادات الحيوية في هذا البئر بهيئة التصنيع العسكري المخدرات، و FICأنا يتم حسابه بجمع FICs اثنين. ترد الآبار مع FICأنا قيمة 0.5، الذي يعتبر قطع للتآزر، مع كسر خط حدود، وجيدا مع FICأنا القيمة الأدنى (0.094) هو الغامق. لأن الحد الأدنى FICأنا القيمة في النطاق تآزرية، يعتبر الجمع بين التآزر.

الشكل 2 ألف و 2 باء الشكل تظهر شبكات مماثلة لتلك الموجودة في الشكل 1A و 1B الشكل، ولكن في هذه الحالة الجمع بين لا تثبت التآزر ضد عزل اختبار (عزلالرئوية ك. 4 بيدمك)، نظراً الحد الأدنى FICأنا التي تحول دون النمو هو 1، و > 0.5.

ويوضح الشكل 3 قراءات الكثافة البصرية من شبكة تآزر رقعة الداما التي وقع فيها العديد من الآبار تم تخطيها (كلواكاي عن عزل 27 بيدمك المعقدة). تم تخطي الآبار هي الآبار التي تحول دون النمو البكتيري على الرغم من وجود النمو البكتيري في الآبار المجاورة مع تركيزات أعلى من المضادات الحيوية. هذه الظاهرة التي تعرف أن يحدث في معيار هيئة التصنيع العسكري الاختبار كذلك، من المحتمل نظراً للتنوع البيولوجي في خصائص النمو البكتيري من جيدا إلى جيد وإلى حساسية بعض المضادات الحيوية للفروق الصغيرة في العدوى البكتيرية23 , 31 , 32-إذا كان أكثر من واحد تخطي وقع أيضا في مجموعة شطرنج، نحن تجاهل النتائج والمتكررة المقايسة.

الرقم 4 ويعرض أمثلة التآزر قتل الوقت نتائج ثلاث مجموعات اختبار ضد K. الرئوية عزل 32 بيدمك. يتم الإشارة إلى التهم مستعمرة في مقياس لوغاريتمي على y-المحور والوقت، بالساعات، في العاشر-المحور. ويتضح الفرق بين العدوى الانطلاق في أنبوب يحتوي على الجمع بين المخدرات وتركيز البكتيريا في هذا الأنبوب في ح 24 بشريط أحمر والعدد، بينما الفرق بين تركيز البكتيريا في 24 ساعة بين أنبوب تحتوي على التركيبة والانبوب الذي يحتوي على عامل وحيد الأكثر نشاطا وحدها يتجلى في الشريط الأزرق وعدد. ويبين الشكل 4A النتائج من المزيج من كوليستين والمونوسكلين؛ كان هذا المزيج التآزري (الفرق بين تركيزات البكتيريا تتعرض لتركيبة وأنشط عامل إيه تو وحدها سجل10 زيمبابوي/مل في 24 ساعة) وجراثيم (انخفاض من بدء العدوى إلى التركز في سجل إيه ثري ح 2410 CFU/mL). ويبين الشكل 4B النتائج من المزيج من كوليستين والكليندامايسين، وهو مزيج من التآزر ولكنه لم يكن من جراثيم. هذه التركيبة أعاق نمو البكتيريا، التي لا المخدرات وحدها، بل لم يقتل منهم. يبين الشكل 4 النتائج من المزيج من كوليستين والاريثروميسين، التي ليست جراثيم أو التآزر.

Figure 1
الشكل 1: لوح شطرنج صفيف النتائج المتظاهرين التعاضد (المينوسكلين + كوليستين محك كولاي سلالة 0494 إدارة الأغذية والعقاقير--مركز السيطرة على الأمراض). (أ) تفسير قراءات والنمو سبيكتروفوتوميتريك صفيف رقعة الداما. القيم في الخلايا قراءات الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600). الخلايا التي تحتوي على قيم600 OD أدناه 0.07 (المقابلة لأي نمو بالفحص البصري) هي الأحمر المظلل، بينما هي الخلايا التي تحتوي على قيم600 OD 0.07 (المقابلة للنمو بالفحص البصري) الأخضر مظللة. (ب) تركيز المثبطة كسور حساب الرقم القياسي (FICأنا). وقد أبقى التظليل التي تشير إلى النمو أو لا النمو. قيم كوليستين والمونوسكلين على طول xو y-محاور، على التوالي، تمثل الآن تركيز المثبطة كسرية (FIC)، أو نسبة تركيز الدواء في هذا العمود أو الصف إلى (تركيز المثبطة الدنيا هيئة التصنيع العسكري) لأن المخدرات وحدها. هو القيمة في كل خلية FICأنا، أو مجموع FICs الاثنين من المخدرات في ذلك جيدا. ويرفق مربع يحدها خط كسر كبير الآبار مع FICأنا 0.5. الخلية تحدها سميكة يشير إلى البئر مع أدنى FICأنا التي تحول دون النمو، أو الحد الأدنى FICأنا. نظراً للحد الأدنى FICأنا 0.5، يعتبر الجمع بين التآزر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: لوح شطرنج صفيف نتائج مزيجاً لا تثبت التآزر (المينوسكلين + كوليستين محك K. الرئوية عزل 4 بيدمك). قيم الكثافة البصرية (A) في تفسير 600 نانومتر والنمو رقعة الداما مصفوفة النتائج كما هو موضح الشكل 1A. (ب) تركيز المثبطة كسور حساب الرقم القياسي (FICأنا) كما هو موضح على الشكل 1A. نظراً للحد الأدنى FICأنا > 0.5، لا يعتبر الجمع بين التآزر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: لوح شطرنج مصفوفة النتائج التي أونينتيربريتابلي نظراً لتخطي الآبار (المينوسكلين + كوليستين اختبار ضد كلواكاي عن مجمع عزل 27 بيدمك). قيم الكثافة الضوئية في تفسير 600 نانومتر والنمو رقعة الداما مصفوفة النتائج كما هو موضح الشكل 1A. وأظهرت عدة آبار تم تخطيها، التي تحول دون النمو البكتيري على الرغم من وجود نمو في الآبار المجاورة مع تركيزات أعلى من المضادات الحيوية،. النتائج ليست هي التفسير، ويحتاج إلى تكرار التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: نتائج التآزر قتل الوقت ثلاث مجموعات اختبار ضد بيدمك عزل الرئوية ك. 32. وترد التهم مستعمرة في مقياس لوغاريتمي على y-المحور والوقت، بالساعات، في العاشر-المحور. ويتضح الفرق بين تركيز البكتيريا في التركيبة في 24 ساعة، والعدوى الانطلاق في الأنبوب بشريط أحمر وعدد. إذا كان الانخفاض من بدء العدوى إلى التركز في ح 24 إيه ثري سجل10 زيمبابوي/mL، يعتبر الجمع بين جراثيم. ويتضح الفرق بين تركيز البكتيريا في 24 ساعة بين الأنبوبة التي تحتوي على التركيبة والانبوب الذي يحتوي على عامل وحيد أنشط وحدة الشريط الأزرق وعدد؛ إذا كان هناك إيه تو سجل10 الحد من زيمبابوي/mL، يعتبر الجمع بين التآزر. (أ) كوليستين (لجنة العلم والتكنولوجيا) + المينوسكلين (دقيقة)، تركيبة التآزري وجراثيم على حد سواء. (ب) كوليستين + الكليندامايسين (CLI)، مزيج التآزري ولكن ليس جراثيم. (ج) كوليستين + الاريثروميسين (ERY)، مجموعة ليس التآزر أو جراثيم. نشرت هذه النتائج في البداية كجزء من دراسة نشاط تعاوني المحتوية على كوليستين تركيبات ضد مقاومة كوليستين Enterobacteriaceae، الذي أثبتنا أن كوليستين كان التآزر مع عدد من المضادات الحيوية التي تنشط على حدة فقط (مثل الكليندامايسين) أو بالدرجة الأولى (مثل الاريثروميسين) ضد البكتيريا إيجابية16. (ملاحظة أن الاريثروميسين التآزر من الصفيف رقعة الداما ضد سلالة سيظهر، لكنه ليس بالوقت--قتل، حتى تم اختياره هنا كمثال على تركيبة غير تآزرية.) افترضنا أن كوليستين، المعروف بقانون قبل بيرميبيليزيشن الغشاء الخارجي الغرام، تمارس أثرا بيرميبيليزينج سوبينهيبيتوري على كوليستين مقاومة البكتيريا سلبية الغرام، مما يتيح دخول المخدرات مثل الكليندامايسين عادة لا يمكن إدخال الخلية سلبية الغرام. تم تعديل لوحة (ألف) من هذا العدد من برينان-كروهن وبيرونتي 2018 كيربي16، حقوق الطبع والنشر © أمريكا جمعية علم الأحياء المجهرية ومضادات الجراثيم والعلاج الكيميائي، 62(10)، 2018، بيي: e00873-18، دوي: 10.1128/AAC.00873-18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

طريقتين الموصوفة هنا على حد سواء تقديم معلومات حول النشاط مضادات الميكروبات المستخدمة في تركيبة على النشاط الفردي بالمقارنة. الرقمية المدعومة من الطابعة النافثة للحبر الآلي، الاستغناء عن الأسلوب تكييف الطريقة الموضحة في "دليل إجراءات الميكروبيولوجيا السريرية"33، بينما يتبع أسلوب قتل الوقت أوثق البروتوكول المقابلة من نفس الرجوع إلى34.

في أسلوب صفيف الشطرنج الآلي العمليات الحسابية لتحديد حجم المخزون الميكروبات إضافة إلى كل بئر اللازمة فضلا عن الاستغناء عن هذه المجلدات، وبالتالي القضاء على بعض المصادر المحتملة الرئيسية لمصادفة خطأ في دليل لوح شطرنج الصفيف. بيد أنها لا تزال ضرورية، أن يحدد المحقق أن الأرصدة الأصلية مصنوعة في تركيز المقصودة وأن تركيزات الهدف النهائي يتم إدخالها في البرنامج D300 بشكل صحيح. إضافة تعليق مضادات الميكروبات للآبار في صفيحة 384-جيدا يمكن أن تكون صعبة في البداية ويتطلب العناية لضمان أن الماصة أدخل نصائح الآبار المناسبة وأن السائل لا يصل دفقة حواف الآبار. يمكن استخدام معالج سائل الآلي بدلاً من ماصة الأقنية باليد لزيادة السرعة والدقة التي يتم إضافة تعليق البكتيرية للآبار. كما ورد في البروتوكول، D300 يتطلب إضافة الفاعل، بوليسوربيت 20 (P-20)، للتعامل الصحيح مع السائل. وقد لوحظ خافض للتوتر السطحي مختلفة، بولي سوربات 80، بتركيز 0.002 في المائة، انخفاض الدخل كوليستين للكائنات الحية مع البلدان المتوسطة الدخل كوليستين < 2 ميكروغرام/مل في فحوصات ميكروديلوتيون مرق القياسية. 35 , 36 مختبرنا سابقا أظهر أن P-20 بتركيزات تصل إلى 0.0015% قد أي تأثير على نتائج D300-بمساعدة هيئة التصنيع العسكري بالمقارنة مع مرجع BMD14. في المثال المقايسة المقدمة هنا، P-20 الحد الأقصى هو تركيز 0.0014%.

ونحن واجه مشكلة واحدة مع بعض فحوصات الصفيف رقعة الداما كان عدد كبير من الآبار تم تخطيها. وهذا حدث بمعدل غير متناسب مع بعض المضادات الحيوية. على وجه التحديد، في شاشة تركيبات ضد مجموعة من مقاومة الكاربابينيمات Enterobacteriaceae، وجدنا أنه بينما 49 المحاكمات 521 (9.4%) غير صالحة للاستعمال بسبب عدة آبار تم تخطيها، 2 12 المضادات الحيوية اختبار (فوسفوميسين وسيفيبيمي) واستأثرت 46 من هذه المحاكمات (94%). قد تكون هذه زيادة معدلات أكثر احتمالاً في المخدرات التي عرضه بشكل خاص لتأثير العدوى31،،من3237. ملاحظة، لا توصي كلسي اختبار فوسفوميسين في مرق تمييع25 بسبب المخاوف حول موثوقية النتائج مع هذا الأسلوب، مما قد يفسر نتائج يمكن الاعتماد عليها مع هذا الدواء. يمكن إجراء بعض التعديلات للأسلوب الآلي الشطرنج وفقا لتفضيل المحقق. يمكن الاستغناء مضادات الميكروبات في لوحات الفعل الذي يتضمن تعليق البكتيرية، بدلاً من الآبار فارغة، وإذا كان هذا الأفضل لأسباب تتعلق بسير العمل داخل المختبر. بينما استخدمت لوحات 384-جيدا هنا، الطريقة يمكن أيضا تنفذ في فحوصات لوحة 96-جيدا مع التعديل المناسب لحجم جيدا. قد يساعد استخدام شكل لوحة 96-جيدا في الآبار تم تخطي الحد للمضادات الحيوية التي شديدة الحساسية للتغيرات الصغيرة في العدوى. عند حساب FICأنا، قد يكون هناك حالات حيث هيئة التصنيع العسكري خارج النطاق (أي، أعلى من اختبار)، بما في ذلك حالات فيها العقاقير يجري اختبارها بأي نشاط فردي ضد النوع من الكائنات الحية التي يجري اختبارها. في هذه الحالات، FIC يمكن حساب استناداً إلى افتراض واحد إضعاف أعلى من أعلى تركيز اختبار هيئة التصنيع العسكري. هذه هي الاستراتيجية الأكثر محافظة، كما أنه يفترض قيمة FIC القصوى الممكنة لتمييع أي حيث لوحظ تثبيط أثناء اختبار التآزر. على سبيل المثال، إذا كانت هيئة التصنيع العسكري الفعلي بدلاً من تخفيف مضاعفة اثنين أعلاه أعلى تركيز اختبارها، ثم FICs المقابلة سيكون من شقين هما أقل من تعيينات المحافظين، وهلم جرا.

من أجل تقييم نشاط جراثيم المخدرات في مقايسة قتل الوقت دقة، من الضروري أن تكون الثقافات لوغاريتمي مرحلة النمو، لا سيما عند جدار الخلية النشطة المضادات الحيوية التي يجري اختبارها28. للبكتيريا تنمو بسرعة المستخدمة في هذا المثال (K. الرئوية)، 3 ساعات للحضانة مع الهز كان مناسبة للوصول إلى هذه المرحلة من النمو، ولكن كميات مختلفة من الوقت قد يكون ضروريا للكائنات الحية المختلفة. وبصفة عامة، ينبغي أن تظهر الثقافة عكر واضح ولكن ليس بشكل كبير. يمكن تحديد المبلغ المناسب للوقت عن طريق إنشاء منحنى نمو مع مستعمرة التهم اتخذت في وقت المسلسل نقاط (مثلاً كل 30 دقيقة ح 4-6)38. العدوى انطلاق المقصود في الدراسة قتل الوقت مهم أيضا. تركز الهدف من العدوى ابتداء من حوالي 5 × 105 إلى 1 × 106 زيمبابوي/مل. تمييع الموصوفة هنا (100 ميكروليتر من تعليق ماكفارلاند 1.0 في 10 مل من وسائل الإعلام) يولد هذه العدوى الكلبسيله الرئوية وغيرها من الأنواع انتيروباكتيرياسي التي اختبرناها عليه. إذا كانت كثافة لقاح الانطلاق في تجربة استخدام الكائنات المختلفة إلى حد كبير أعلى أو أقل من ذلك، ثم إضعاف مختلفة قد تكون ضرورية. (التخفيف المناسبة المطلوبة لنوع معين يمكن تحديده من خلال إجراء عد لوحة من تعليق ماكفارلاند 0.5 أو 1.0 لتحديد كيفية العديد من الكائنات الحية ويمثل هذا التعكر، ثم حساب المبلغ الذي يجب أن يكون التعليق الأولى المخفف للوصول إلى تركيز النهائية المناسبة). إذا، على استعراض التهم لوحة من الدراسة التآزر، وجد العدوى انطلاق أي من الأنابيب المحتوية على المضادات الحيوية كانت أقل بكثير من العدوى ابتداء من مراقبة النمو، وهذا قد يشير إلى أما ترحيل المضادات الحيوية أو جداً القتل السريع للبكتيريا في أن الوقت القصير بين إضافة البكتيريا للأنبوبة المحتوية على المضادات الحيوية وإزالة قاسمة للطلاء. إذا كان العدد الفعلي للمستعمرات في إسقاط غير مخفف في سلسلة أقل من العدد المستعمرات في تخفيف اللاحقة، وهذا يوحي بأثر ترحيل المضادات الحيوية. وقد وصف خيارات مختلفة لمنع هذا التأثير، بما في ذلك نشر من قاسمة واحد يزيد كامل لوحة38 أو الغزل أسفل النموذج وإزالة المادة طافية، وإعادة تعليق في المحلول الملحي المعقم قبل التصفيحات39. في كل مرة نقطة في طريقة قتل الوقت، كما أنها حاسمة بالنسبة للمحقق لكفاءة ولكن دقة إزالة قاسمة من كل أنبوبة الثقافة وإجراء تخفيف المسلسل. يمكن أن يؤدي التأخير أثناء هذه العملية، لا سيما خلال النقاط الزمنية المبكرة التي تحدث في الخلافة، وإغلاق لفترات طويلة خلالها الثقافات ليست المحتضنة واهتزت، بينما يمكن أن يؤدي الاستغناء عن الإهمال وتخفيف المسلسل إلى لوحة غير دقيقة التهم الموجهة إليه. أسلوب انتشار لوحة لوحة العد، التي تنتشر 100 ميكروليتر من كل تمييع صفيحة أجار كامل، بالمقارنة مع الأسلوب لوحة إسقاط وصف أكثر بكثير من السريعة، يتطلب عدد أقل من لوحات أجار، ويسمح لعد أسرع، كحد أقصى هو عدد معدود من المستعمرات لكل قطره 30، بينما تصل إلى 300 المستعمرات يمكن أن تحسب عادة من لوحة انتشار. ومع ذلك، الأسلوب لوحة انتشار أيضا خياراً إذا كان المحققون أكثر راحة مع هذا الأسلوب. إذا انتشرت قطرات إلى بعضها البعض بعد الاستغناء عن ماصة متعددة القنوات، يمكن إجراء التطبيق الفردية من قطرات متباعدة على نطاق أوسع مع ماصة قناة واحدة بدلاً من ذلك. في تجربتنا، التبريد لوحات عند 4 درجة مئوية قبل الاستغناء عن قطرات فيما يبدو للحد من الانتشار المفرط.

واحد الحد من الأساليب الموصوفة هنا هو أن نتائج هذين النوعين من مقايسة التآزر (صفيف الشطرنج وقتل الوقت) ليست متطابقة دائماً، ومنذ آخر نشرت مقالات التعاضد استخدام طريقة واحدة أو أخرى بدلاً من كليهما معا، فإنه يمكن يكون من الصعب على معرفة كيفية دمج البيانات من هذين النوعين من الاختبارات. لأن أسلوب صفيف الشطرنج الآلي قمنا بتطوير بسيط والفائق، استخدمنا أنها سارية المفعول كنوع من الشاشة لاختبار تركيبات لعدد أكبر من يعزل وتحديد مجموعات التركيز الذي كان التآزر. ثم أجرينا عدد أقل من الدراسات قتل الوقت، تحديد تركيبات والتركيزات التي كانت فعالة في الصفيف رقعة الداما. من المذكرة، لأنه عادة ما يتم تنفيذ المقايسة رقعة الداما على نطاق تمييع ميكروبروث، بينما المقايسة قتل الوقت يستخدم كميات أكبر (مماثلة إلى إضعاف ماكروبروث)، وجدنا أن FICs مختلفان في بعض الأحيان بين الأسلوبين، مع ارتفاع التركيزات المطلوبة عموما في مقايسة قتل الوقت لإثبات النشاط. هذه الظاهرة وقد لوحظ سابقا عند مقارنة نتائج فحص هيئة التصنيع العسكري تمييع ماكروبروث وميكروبروث لعصيات سلبية الغرام26 وعندما لقاح أكبر (كما هو مستخدم في دراسات قتل الوقت) مقارنة مع العدوى القياسية المستخدمة في الصفيف تمييع والشطرنج ميكروبروث assays32. وجود قيود محددة المصفوفة رقعة الداما هو التغير المتأصلة في تمييع ميكروبروث اختبار22هيئة التصنيع العسكري. بينما FICأنا قطع لحساب التآزر لهذا التغير رياضيا6 مثل هذا التغير لا محالة يثير القلق بشأن موثوقية واتساق رقعة الداما مصفوفة النتائج.

يجب تأكيد النتائج التي تم الحصول عليها بهذه الطرق بسبب القيود الملازمة للتآزر في المختبر كل اختبار طرق (بما في ذلك زراعة البكتيريا في وسيط نمو الصناعي، وتركيزات المضادات الحيوية ثابتة ودورة لمدة زمنية محدودة)، و كذلك تقييم استخدام تقنيات تكميلية. هذه الأساليب تشمل الدراسات في المختبر الحرائك الدوائية/ميكروبيولوجية (PK/PD) (مثلاً، الألياف المجوفة العدوى النموذجي40)، نماذج حيوانية، وفي النهاية، الدراسات الإنسانية PK/PD وفعالية. يسمح أسلوب صفيف الشطرنج الآلي الموضحة هنا، بتوفير طريقة سريعة معها إلى تركيبات الشاشة للنشاط التآزر المحتملة، لمزيد من المعلومات تستهدف الاستفادة من هذه التقنيات. زيادة التشغيل الآلي لكل من هذه الأساليب، كالتحقيق جيدا أكثر انتظاما للعلاقة بين المعلمات في المختبر والنتائج السريرية، ستكون هامة في القياس حتى استخدام التآزر التجارب وزيادة قابليته للتطبيق السريري.

Disclosures

وقدمت تيكان (موريسفيل، نورث كارولاينا) "موزع D300 الرقمية" والمواد الاستهلاكية المرتبطة بها. وقد تيكان أي دور في تصميم الدراسة أو جمع/تفسير البيانات، وإعداد مخطوطة أو قرار نشر.

Acknowledgments

Thea برينان-كروهن أيد قبل "يونيس كينيدي شرايفر الوطني معهد صحة الطفل" و "التنمية البشرية" طب الأمراض المعدية الأبحاث منحة التدريب (T32HD055148)، و "المعهد الوطني للحساسية" و "الأمراض المعدية" (منحة التدريب T32AI007061)، زمالة مستشفى المكتب من كلية التنمية كلية التطوير الوظيفي بوسطن للأطفال، والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية جائزة تنمية مهنية (1K08AI132716). J.E.K. أيده بالمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية من "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم جائزة R33 AI119114. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management. Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).
  2. Spellberg, B. The future of antibiotics. Critical Care. 18 (3), (2014).
  3. Spellberg, B., et al. The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).
  4. Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).
  5. Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).
  6. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).
  7. Zusman, O., et al. Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).
  8. Clock, S. A., et al. In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).
  9. Hirsch, E. B., et al. Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae. Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).
  10. Tängdén, T., et al. Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).
  11. Tascini, C., et al. Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).
  12. Paul, M., et al. Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).
  13. Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).
  14. Smith, K. P., Kirby, J. E. Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).
  15. Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology. J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).
  16. Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  17. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections. Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).
  18. Nation, R. L., Li, J. Colistin in the 21st century. Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).
  19. Ah, Y. -M., Kim, A. -J., Lee, J. -Y. Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae. International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).
  20. Bratu, S., et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).
  21. Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).
  22. MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing. Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).
  23. Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance. Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).
  24. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
  25. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  26. CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).
  27. Clinical and Laboratory Standards Institute. M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  28. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. 7 (1999).
  29. Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests. Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).
  30. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
  31. Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology. Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).
  32. Smith, K. P., Kirby, J. E. The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  33. Leber, A. L. Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.16.1-5.16.23 (2016).
  34. Leber, A. L. Time-Kill Assay for Determining Synergy. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.14.3.1-5.14.3.6 (2016).
  35. Hindler, J. A., Humphries, R. M. Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).
  36. Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls. Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).
  37. Fuchs, P. C., Barry, aL., Brown, S. D. Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine. European journal of clinical microbiology & infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).
  38. Leber, A. L. Minimum Bactericidal Concentration Testing. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , 5.14.1.11 (2016).
  39. Cai, Y., et al. In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).
  40. Bulman, Z. P., et al. Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era. mBio. 8 (4), (2017).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 146، مضادات الميكروبات التآزر، المضادات الحيوية التآزر، والتآزر، ومقاومة مضادات الميكروبات، المقاومة كوليستين، Enterobacteriaceae الكاربابينيمات المقاوم، التآزر قتل الوقت، الصفيف رقعة الداما، والتشغيل الآلي للمكاتب، الطباعة النافثة للحبر
مضادات الميكروبات التآزر التجارب التي تدعمها الطابعة النافثة للحبر الصفيف الشطرنج الآلي وقتل الوقت الأسلوب اليدوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E.… More

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter