Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

एक व्यापक क्षेत्र के दृश्य ट्रैकिंग मंच का उपयोग कर बड़ी सी एलिगेंस आबादी का स्वचालित व्यवहार विश्लेषण

doi: 10.3791/58643 Published: November 28, 2018

Summary

हम व्यापक क्षेत्र के दृश्य निमेटोड ट्रैकिंग मंच (WF-NTP), जो Caenorhabditis एलिगेंसकी बड़ी आबादी के उच्च प्रवाह phenotypic लक्षण वर्णन करता है सक्षम बनाता है का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । इन प्रोटोकॉल उत्परिवर्ती उपभेदों में या एक उच्च स्केलेबल फैशन में औषधीय उपचार के जवाब में सूक्ष्म व्यवहार परिवर्तन की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

Caenorhabditis एलिगेंस जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक अच्छी तरह से स्थापित पशु मॉडल है, व्यापक रूप कार्यात्मक जीनोमिक्स और उंर बढ़ने के अध्ययन में कार्यरत । अध्ययन के तहत जानवरों के स्वास्थ्य और फिटनेस का आकलन करने के लिए, एक आम तौर पर शरीर झुकता की संख्या या आंदोलन की गति की माप के रूप में गतिशीलता readouts, पर निर्भर करता है । ये माप आमतौर पर मैनुअल गिनती शामिल है, यह अच्छा सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण बना रही है, समय और श्रम की कमी के रूप में अक्सर 25 या उससे कम के लिए प्रत्येक प्रयोग में पशुओं की संख्या सीमित । उच्च सांख्यिकीय शक्ति के बाद से reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है और झूठी सकारात्मक और नकारात्मक परिणाम सीमा जब कमजोर phenotypic प्रभाव की जांच कर रहे हैं, प्रयास हाल ही में स्वचालित प्रोटोकॉल को बढ़ाने पर ध्यान केंद्रित विकसित किया गया है गतिशीलता का पता लगाने और बहु-पैरामीट्रिक व्यवहार profiling की संवेदनशीलता आदेश में छोटे phenotypic परिवर्तन है कि अक्सर आनुवंशिक अध्ययन और दवा की खोज में महत्वपूर्ण है पर कब्जा करने की जरूरत स्तर को पता लगाने की सीमा का विस्तार करने के लिए, हम यहां एक तकनीकी विकास का वर्णन है कि अप करने के लिए ५,००० व्यक्तिगत पशुओं के अध्ययन में सक्षम बनाता है इसके साथ ही, के बारे में १,००० से माप की सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि-मैनुअल परख की तुलना में गुना और के बारे में १०० अंय उपलब्ध स्वचालित तरीकों की तुलना में गुना ।

Introduction

लगभग आधी सदी पहले, सिडनी ब्रेनर एक मॉडल प्रणाली के रूप में Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) की शुरुआत के विकास और तंत्रिका जीव विज्ञान अध्ययन, इस छोटे (लंबाई में 1 मिमी) के रूप में, पारदर्शी निमेटोड कीड़ा हेरफेर करने के लिए आसान है आनुवंशिक रूप से और1प्रयोगशाला में बनाए रखने के लिए । आज, सी एलिगेंस apoptosis, सेल सिग्नलिंग, कोशिका चक्र की प्रकृति, जीन विनियमन, चयापचय, और उंर बढ़ने सहित जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है2। इसके अलावा, सेलुलर और ऊतक जटिलता, प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न और सी एलिगेंस और उच्च जीवों के बीच रोग रास्ते के संरक्षण (कृमि जीन का ८०% एक मानव orthologue है), सादगी के साथ जुड़ा हुआ है और खेती की लागत प्रभावशीलता, यह एक में प्रभावी बनाने के लिए vivo मॉडल जीव उच्च प्रवाह आनुवंशिक3,4,5,6,7के लिए उत्तरदायी, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , १३ आणि औषध१४,१५,१६ स्क्रिनिंग. इन सभी कारणों के लिए, सी एलिगेंस सामांय और रोग से संबंधित आणविक रास्ते के लक्षण वर्णन के लिए नियोजित किया गया है; neurodegeneration के क्षेत्र में, उदाहरण के लिए, यह प्रोटीन एकत्रीकरण3,4,7,15,17पर वृद्धावस्था के प्रभाव की खोज को सक्षम किया गया है, 18, और प्रोटीन एकत्रीकरण के प्रवर्तकों और अवरोधकों के लक्षण वर्णन3,4,5,6,7,14, 18.

कीड़े के समग्र स्वास्थ्य, जो एक महत्वपूर्ण व्यवहार के लिए अध्ययन के इस प्रकार में परिभाषित किया जा पैरामीटर है, मैंयुअल रूप से विभिंन तरीकों से मापा जा सकता है, जैसे शरीर की संख्या की गिनती द्वारा प्रति मिनट झुकता (BPM)4,6, 19, या आंदोलन की गति को मापने20,21,22, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से औसत उंर और पक्षाघात की दर को मापने के द्वारा । हालांकि शरीर झुकता है और आंदोलन की गति के मैनुअल माप आणविक रास्ते और तंत्र की एक किस्म में कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व किया है3,4,14,19, 20,23, मैनुअल परख वर्तमान में कम प्रवाह, उच्च श्रम गहन, और समय लेने whilst त्रुटियों के लिए प्रवण और मानव पूर्वाग्रहों जा रहा है । इन मुद्दों को पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति के साथ डेटा के संग्रह में काफी चुनौतियों वर्तमान सूक्ष्म व्यवहार परिवर्तन भेद । यह सीमा विशेष रूप से संभावित दवा अणुओं के साथ उपचार के रूप में दवा स्क्रीनिंग के लिए प्रासंगिक है अक्सर छोटे phenotypic परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व24, इसलिए पशुओं की बड़ी संख्या के अध्ययन की आवश्यकता के क्रम में reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए. इस बिंदु को समझाने के लिए, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एक उच्च शक्ति का पता लगाने (POD) विश्वास के साथ व्यवहार में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन को परिभाषित करने के लिए और झूठी सकारात्मक परिणामों को सीमित करने के लिए आवश्यक है25। यह सी एलिगेंस समुदाय में एक मजबूत प्रेरणा के परिणामस्वरूप reproducible, स्वचालित, समय और लागत प्रभावी माप के साथ मैनुअल गिनती की जगह है । इस मांग को पूरा करने के लिए, कई प्रयोगशालाओं हाल ही में उच्च संवेदनशीलता माप और कीड़े की बड़ी संख्या के सटीक कीड़ा ट्रैकिंग के लिए तरीके विकसित किया है22,26,27,28 ,29,30,31,३२,३३.

इसके अलावा सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माप के लिए आवश्यक पशुओं के बड़े साथियों को स्वचालन की प्रक्रिया का विस्तार करने के लिए, हम हाल ही में एक विस्तृत क्षेत्र के दृश्य निमेटोड ट्रैकिंग मंच (WF-NTP)15,३४ विकसित किया है ,३५,३६, जो बहुत बड़ी कीड़ा आबादी पर एकाधिक phenotypic readouts की एक साथ जांच सक्षम बनाता है, सांख्यिकीय प्रासंगिक phenotypical पता लगाने में एक महत्वपूर्ण कारक25। न केवल WF-NTP वर्तमान में समानांतर में ५,००० पशुओं के लिए निगरानी कर सकते हैं, लेकिन phenotypic readouts भी कई मापदंडों की दर और शरीर झुकता के आयाम सहित, शामिल हैं, आंदोलन की गति, आबादी है कि झोले के अंश, और जानवरों के आकार । इसलिए यह समानांतर में कीड़े के हजारों स्क्रीन करने के लिए आसानी से संभव है और एक बहुआयामी फिंगरप्रिंट३६बनाने के लिए एक व्यवहार नक्शे में अलग readouts गठबंधन करने के लिए । एसोसिएटेड ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर पायथन में लिखा है, जो भी इसे संचालित करने के लिए आवश्यक है और पूरी तरह से अनुकूलन योग्य है । इस तकनीक को अपनाने के लिए यूजर्स को सक्षम बनाने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (GUI) भी दिया गया है ।

यहां, हम प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला है कि WF-NTP के संभावित अनुप्रयोगों के कुछ वर्णन प्रस्तुत करते हैं । विशेष रूप से, हम यौगिकों के प्रशासन पर चर्चा, छोटे अणुओं से प्रोटीन चिकित्सकीय को लेकर, और वर्णन कैसे कीड़े की बड़ी आबादी पर सीधे उनके प्रभाव स्क्रीन करने के लिए, इस प्रकार प्रभावी रूप से छोटे नमूने की जरूरत को दूर उप आबादी । इस प्रयोजन के लिए WF-NTP का उपयोग पहले से ही अल्जाइमर रोग (AD)15,३४,३५ और पार्किंसंस रोग (पीडी) के ड्रग डिस्कवरी प्रोग्राम डिजाइन करने के उद्देश्य से प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण लाभ लाया है18 चिकित्सकीय उंमीदवारों३५,३७के आकलन के लिए vivo डेटा में प्रयोग ।

Protocol

1. C. एलिगेंस प्रोटोकॉल के लिए सामग्री तैयार करना

  1. एक 10x M9 बफर समाधान तैयार करने के लिए, एक 1 एल autoclavable बोतल के लिए monobasic पोटेशियम फॉस्फेट, dibasic सोडियम फॉस्फेट के ६० ग्राम, और सोडियम क्लोराइड के ५० ग्राम के 30 ग्राम जोड़ें ।
    1. 1 L शुद्ध पानी और आटोक्लेव के ca. १२१ ° c पर 15 मिनट के लिए जोड़ें ।
    2. शुद्ध पानी में 10 बार पतला और ca. १२१ ° c पर आटोक्लेव 15 मिनट के लिए ।
    3. जब ठंडा, 1 एम मैग्नीशियम सल्फेट के एक समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
      नोट: केवल 1x M9 (M9) का उपयोग निंन चरणों में वर्म हैंडलिंग के लिए किया जाना चाहिए ।
  2. निमेटोड विकास मध्यम (रिच-NGM) तैयार करने के लिए, २.७ ग्राम के सोडियम क्लोराइड, आगर के १५.७५ ग्राम, कैसिइन के ५.७५ ग्राम, शुद्ध पानी की ९०० मिलीलीटर, और 15 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव मिलाएं ।
    1. एक वार्मिंग ओवन (ca. ७० ° c) के लिए अमीर-NGM माध्यम स्थानांतरण यदि तुरंत इस्तेमाल नहीं किया; रिच-NGM ca पर पिघला रखा जा सकता है । ७० ° c अनुपयोगी बनने से पहले 12 घंटे तक के लिए ।
    2. अमीर-NGM मिश्रण करने के लिए, 1 एम कैल्शियम क्लोराइड के समाधान के ९०० µ एल जोड़ने के लिए, 1 एम मैग्नीशियम सल्फेट के एक समाधान के ९०० µ एल, और पूर्ण इथेनॉल में 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल के एक समाधान के ९०० µ एल ।
      नोट: कोलेस्ट्रॉल का उपयोग करने के लिए पहले autoclaving की आवश्यकता नहीं है ।
    3. एक आयु तुल्यकालिक जनसंख्या बनाए रखने वाली प्रायोगिक प्लेटों को तैयार करने के लिए, 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR) के ९२ µ l को ८१२ µ मीटर पर रिच-NGM की ९०० मिलीलीटर में जोड़ें ।
      नोट: FUDR दोनों ही विषैले और यलो हैं, इसलिए लैब कोट और सेफ्टी ग्लासेस के अलावा nitrile दस्ताने पहनना जरूरी है । बेकार की अनुमति के लिए सामांय अपशिष्ट स्ट्रीम में प्रवेश और एक afterburner के साथ जलाए द्वारा के निपटान मत करो ।
    4. एक वृद्धि की थाली (रिच NGM प्लेट) उत्पन्न करने के लिए एक 9 सेमी बाँझ पेट्री डिश में autoclaved अमीर-NGM के 20 मिलीलीटर डालो । एक गतिशीलता प्लेट (चुटकुला प्लेट) बनाने के लिए एक 9 सेमी बाँझ पेट्री डिश में autoclaved अमीर-NGM के 15 मिलीलीटर डालो । एक FUDR प्लेट उत्पन्न करने के लिए एक 9 सेमी बाँझ पेट्री डिश में FUDR के साथ अमीर-NGM के 20 मिलीलीटर डालो ।
      नोट: चुटकुला प्लेट की कम आगर मात्रा कैमरा फोकस और कीड़ा ट्रैकिंग की सुविधा (चरण 3.2.5 देखें).
  3. OP50 ई कोलाई तनाव तैयार, autoclaving 1 पौंड शोरबा के १२१ ° c 15 मिनट और स्टार्टर संस्कृति के साथ inoculate जब ठंडा के लिए एल द्वारा ।
    1. बैक्टीरियल संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं और केंद्रापसारक के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए ट्यूब निष्फल ।
    2. के लिए जीवाणुओं स्थानांतरण ट्यूब बाँझ और ४,६०० x g पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    3. supernatant और, बाँझ पानी का उपयोग कर, मूल मात्रा के 10% में निलंबित 10x बनाने के लिए (10 बार केंद्रित) OP50 शेयर ।
    4. १५० मिलीलीटर को 10x OP50 शेयर के 15 मिलीलीटर पतला 1x OP50 उत्पंन करने के लिए, बाँझ पानी का उपयोग कर, अमीर NGM प्लेट बीज के लिए इस्तेमाल किया जा रहा से पहले । FUDR प्लेट्स बीज के लिए शेष 10x समाधान का उपयोग करें ।
      नोट: चुटकुला प्लेटें unseed रहेंगी और केवल छवि अधिग्रहण चरण में इस्तेमाल किया जाएगा ।
  4. बैक्टीरिया के साथ प्लेट बीज, अमीर-NGM और FUDR प्लेटें अलग ।
    1. बाँझ शर्तों के तहत, ३५० µ एल 1x OP50 के रिच-NGM प्लेट्स में जोड़ें और समान रूप से फैले ।
      नोट: थाली के किनारे में फैल नहीं कीड़े के रूप में थाली के पक्षों को क्रॉल और मर जाएगा ।
    2. बाँझ शर्तों के तहत, FUDR प्लेटों के लिए 10x OP50 के ३५० µ एल जोड़ें और समान रूप से फैल गया ।
    3. उपयोग करने से पहले प्लेटें सूखी और 2 डी के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी की अनुमति दें ।

2. WF-NTP के साथ उपयोग के लिए C. एलिगेंस की तैयारी

  1. एलिगेंस अमीर-NGM प्लेटों पर बनाए रखने या कीड़े युक्त आगर की एक छोटी राशि स्थानांतरित करके एक ताजा जीवाणु परत पर नीचे चेहरा । प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की शुरुआत करने से पहले इस तरीके से सी. एलिगेंस उपभेदों बनाए रखें ।
  2. स्थानांतरित तकनीक का उपयोग (२.१ कदम देखें), बीज एक अच्छी तरह से खिलाया, मिश्रित स्टेज कीड़े का उपयोग कर तनाव के 20 प्लेटें और उंहें 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 डी के लिए विकसित करने की अनुमति ।
  3. 5 १ १५ मिलीलीटर ट्यूब में M9 और पूल के 15 मिलीलीटर का उपयोग कर कीड़े युक्त प्लेट धो लें । प्रत्येक तनाव के सभी 20 प्लेटों के लिए दोहराएँ ।
  4. 2 मिनट के लिए २,००० x g पर कीड़े केंद्रापसारक, supernatant हटाने के लिए, और M9 समाधान के 2 मिलीलीटर में निलंबित ।
  5. 3:2 vol/vol के अनुपात में 13% सोडियम हाइपोक्लोराइट और 4 एम सोडियम हीड्राकसीड को मिलाकर ब्लीचिंग सॉल्यूशन की 10 मिलीलीटर तैयार करें ।
    नोट: इस समाधान autoclaving की आवश्यकता नहीं है । दोनों घटकों और परिणामी समाधान संक्षारक कर रहे है और देखभाल के साथ nitrile दस्ताने का उपयोग कर संभाला जाना चाहिए । सोडियम हीड्राकसीड हल्का कांच के लिए संक्षारक है और प्लास्टिक के कंटेनर में संग्रहित किया जाना चाहिए ।
  6. प्रत्येक केंद्रापसारक ट्यूब के लिए ब्लीचिंग समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और लगभग ३.५ मिनट या छल्ली पूरी तरह से भंग कर दिया है जब तक के लिए जोरदार शेक ।
  7. बाँझ शर्तों के तहत, 15 मिलीलीटर M9 करने के लिए नमूनों को पतला और 2 मिनट के लिए २,००० x g पर केंद्रापसारक । supernatant निकालें और M9 समाधान के 15 मिलीलीटर में निलंबित ।
  8. दोहराएं चरण २.७ 6 बार, जब तक केवल कीड़ा अंडे रहते हैं, और समाधान अब क्लोरीन की एक गंध है ।
  9. 2 मिनट के लिए २,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक, supernatant हटाने के लिए, और M9 समाधान के 2 मिलीलीटर में निलंबित ।
  10. बाँझ शर्तों के तहत, एक बाँझ ग्लास पिपेट का उपयोग एक 12-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली के प्रत्येक कुआं में अंडे युक्त M9 के 2 मिलीलीटर हस्तांतरण और 20 डिग्री सेल्सियस पर 16 ज की एक ंयूनतम के लिए गर्मी ।
    नोट: क्रॉस संदूषण को रोकने के लिए प्रत्येक दबाव के लिए अलग प्लेट का प्रयोग करें । बहु कुओं के लिए केंद्रापसारक ट्यूबों से स्थानांतरित कदम कीड़ा घुटन से बचने में मदद करता है ।
  11. 12 से रातोंरात रची कीड़े हस्तांतरण 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में अच्छी तरह से प्लेटें । कृमि समाधान के 5 µ एल के 3 बूंदें लें और पहले लार्वा स्टेज (L1) पर मौजूद कीड़ों की संख्या की गणना करें ।
  12. समाधान के µ एल प्रति कीड़े की संख्या की गणना ।
  13. बीज थाली प्रति ३,००० कीड़े पर अमीर NGM प्लेटों पर L1 कीड़े और उंहें 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए बढ़ने की अनुमति है, जब तक वे अंतिम लार्वा चरण (L4) मंच तक पहुंचने ।

3. जनरल WF-NTP प्रोटोकॉल

  1. उपयुक्त एकाग्रता में प्रत्येक दवा यौगिक के २.२ मिलीलीटर जोड़ें (जैसे squalamine18 और bexarotene15की तरह दवाओं के लिए 25 या 10 मिमी, क्रमशः) 6 FUDR प्लेटों के लिए और प्रत्येक वांछित कीड़ा तनाव के लिए बाँझ शर्तों के तहत शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: इस चरण में प्रत्येक एकाग्रता और प्रत्येक विलायक इस्तेमाल के लिए, परीक्षा के तहत प्रत्येक यौगिक के लिए दोहराया जाता है ।
    1. बंद कीड़े धो 5 रिच-NGM प्लेट्स कदम पर तैयार २.१३ M9 बफर के 15 मिलीलीटर का उपयोग कर और एक केंद्रापसारक ट्यूब के लिए कीड़े हस्तांतरण ।
    2. 2 मिनट के लिए २,००० x g पर केंद्रापसारक, हटाने supernatant, और M9 के 3 मिलीलीटर में निलंबित । कीड़े युक्त M9 समाधान के 5 µ एल के 3 बूंदें ले लो और पिछले लार्वा चरण L4 पर मौजूद कीड़े की संख्या गिनती ।
    3. M9 बफर के µ एल प्रति कीड़े की संख्या की गणना ।
  2. बीज ७०० एक दिया यौगिक युक्त सूखी FUDR प्लेटों में से 6 पर L4 लार्वा, प्रत्येक यौगिक की प्रत्येक एकाग्रता के लिए दोहराने और बाँझ शर्तों के तहत शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    1. उन उपभेदों जहां कीड़ा पक्षाघात केवल तापमान, ऐसे विज्ञापन तनाव३८के रूप में स्थापना के द्वारा प्रेरित किया जाता है के लिए L4 से 24 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े की मशीन । वयस्कता के D0 के रूप में L4 लार्वा चरण के बाद दिन गिनती ।
  3. ट्रैकर के लिए स्टेज लाइट्स चालू करें ।
    1. ७०% इथेनॉल के साथ कांच मंच साफ और सुनिश्चित करें कि कोई दिखाई अवशेषों रहता है, तो लेंस टोपी हटा दें । एक एयर डस्टर का उपयोग इमेजिंग लेंस साफ । सुनिश्चित करें कि कैमरा सही ढंग से और स्थापित है और छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर के साथ रिकॉर्डिंग शुरू में खामियों को दूर किया है ।
    2. मोनो 16 रिकॉर्डिंग पैरामीटर सेटअप के साथ 20 फ्रेम/एस, रिकॉर्ड करने के लिए कैमरा सेटिंग्स समायोजित करें; रिकॉर्ड १,२०० फ्रेम, MJPEG प्रारूप में एक ९५% संपीड़न दर पर सहेजा जा रहा है । एक खाली 9 सेमी पेट्री डिश का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि चरण सही ऊंचाई पर सेट है और यदि आवश्यक हो तो इसे समायोजित ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि प्लेट के किनारों रिकॉर्डिंग में दिखाई दे रहे हैं के रूप में यह ' रखें-मृत एल्गोरिथ्म ' सही ढंग से काम करने के लिए अनुमति देगा (आंकड़ा 1a).
    3. बाँझ शर्तों के तहत, 2 पहले से ही शर्तों और चरण 1.2.4 में तैयार 1 चुटकुला स्क्रीनिंग प्लेट के साथ कदम ३.२ पर तैयार प्लेटें ले लो । चुटकुला प्लेट के लिए M9 समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें । M9 के अंय 2 मिलीलीटर का प्रयोग करें 2 की सतह क्षेत्र के 1/3 धो करने के लिए ३.२ पर चुटकुला प्लेट पर तैयार प्लेटें ।
    4. M9 समाधान के लगभग 5 मिलीलीटर और ट्रैकर मंच पर लगभग ६०० कीड़े युक्त चुटकुला थाली प्लेस । एक व्यक्ति कृमि का उपयोग कर कैमरा ध्यान केंद्रित करने और रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं ।
    5. जब रिकॉर्डिंग पूरा हो गया है, कीड़े के साथ चुटकुला थाली त्यागें; मार्क FUDR प्लेटों के रूप में एक बार इस्तेमाल किया जा रहा है और यह मशीन के लिए वापस ।
    6. प्रत्येक प्रायोगिक शर्त के लिए 3.3.5 करने के लिए चरण 3.3.3 दोहराएँ ।
    7. दोहराएं कदम 3.3.3 वयस्क उंर में हर समय बिंदु के लिए 3.3.6 के लिए ।
      नोट: स्क्रीनिंग प्रक्रियाओं कृमि वयस्क उंर के किसी भी बिंदु पर किया जा सकता है (सीए .3 सप्ताह) । इन प्रोटोकॉल 9 समय अंक को परखने की सुविधा; लेखक हर 2 दिन वयस्कता के 1 दिन से शुरू स्क्रीनिंग की सिफारिश ।

4. असतत खुराक अध्ययन के लिए अनुकूलन

  1. 3.1.3 के लिए कदम 3.1.1 दोहरा द्वारा कीड़े तैयार करते हैं ।
    1. बीज ca. १००० 5 FUDR प्लेटों पर L4 कीड़े । वयस्कता के डी 3 तक 24 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें, विज्ञापन३८ कीड़े शामिल प्रयोगों के लिए मशीन ।
  2. एक बाँझ गिलास पिपेट का उपयोग करना, एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए थाली से बाँझ शर्तों के तहत तैयार कीड़े हस्तांतरण, 2 मिनट के लिए २,००० एक्स जी पर केंद्रापसारक और supernatant को दूर.
    1. M9 बफ़र के 1 मिलीलीटर में कीड़े का समाधान निलंबित । एक microcentrifuge ट्यूब के लिए कीड़े हस्तांतरण, 2 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक, और supernatant हटा दें ।
  3. प्रोटीन transduction के लिए, वांछित एकाग्रता (आमतौर पर ४० µ मीटर) में अभिकर्मक वितरण रिएजेंट और देशी प्रोटीन के 20 µ एल के ४० µ एल जोड़ें, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    1. बाँझ शर्तों के तहत एक बाँझ ग्लास पिपेट का उपयोग एक microcentrifuge ट्यूब में कदम 4.2.1 से कीड़े हस्तांतरण करने के लिए समझाया प्रोटीन युक्त एक कुल मात्रा देने के लिए १०६० µ एल प्लेस ट्यूबों क्षैतिज और शेक ६० rpm में एक 24 डिग्री सेल्सियस मिलाना में 8 घंटे के लिए मशीन
  4. बाँझ शर्तों के तहत, एक चुटकुला प्लेट के लिए M9 समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ने और चुटकुला प्लेट पर कीड़े से अधिक दवा की एक microcentrifuge ट्यूब हस्तांतरण ।
    1. 3.3.2 करने के लिए ३.३ कदम दोहरा कर ट्रैकर सेट करें ।
    2. बाँझ शर्तों के तहत, एक चुटकुला प्लेट के लिए M9 समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ने और चुटकुला प्लेट पर कीड़े से अधिक दवा की एक microcentrifuge ट्यूब हस्तांतरण ।
    3. ट्रैकर मंच पर चुटकुला थाली प्लेस, एक व्यक्ति कीड़ा पर कैमरा ध्यान केंद्रित है, और रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं । जब पूरा, चुटकुला थाली लेबल और एक तरफ सेट ।
    4. सभी नमूनों के लिए चरण निमा और 4.4.3 दोहराएं ।
    5. एक ग्लास पिपेट का उपयोग करना, चुटकुले थाली से बाँझ शर्तों के तहत एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब के लिए कीड़े हस्तांतरण, और 2 मिनट के लिए २,००० x g पर केंद्रापसारक । निकालें supernatant, एक FUDR प्लेट पर गोली हस्तांतरण, और बाँझ शर्तों के तहत सूखे की अनुमति देते हैं ।
    6. सभी नमूनों के लिए चरण 4.4.5 दोहराएँ ।
  5. वयस्कता के D6 तक 24 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े की मशीन ।
    नोट: एकाधिक एंटीबॉडी की मशीन भी संभव है ।
  6. चुटकुला प्लेट के लिए M9 बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें और एक FUDR थाली से चुटकुला प्लेट पर सभी कीड़े धोने के लिए M9 समाधान के 2 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    1. 3.3.2 करने के लिए ३.३ कदम दोहरा कर ट्रैकर सेट करें ।
    2. ट्रैकर मंच पर चुटकुला थाली प्लेस, आवश्यक के रूप में कैमरा ध्यान केंद्रित है, और रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं । जब रिकॉर्डिंग पूरा हो गया है, चुटकुला थाली त्यागें या यदि वांछित आगे स्क्रीनिंग के लिए इसे ठीक ।
    3. सभी नमूनों के लिए 4.6.2 करने के लिए ४.६ चरणों को दोहराएँ ।

5. वीडियो डेटा का विश्लेषण करना

  1. वीडियो प्राप्त करने के बाद, डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर जीयूआई (चित्रा 2) में उपयुक्त मापदंडों का चयन करें ।
    1. एक या एकाधिक वीडियो लोड ब्राउज़िंग समारोह के माध्यम से । किसी आउटपुट गंतव्य फ़ोल्डर का चयन करें । सुनिश्चित करें कि ६०० करने के लिए १,२०० फ्रेम एक 30 एस विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है ।
      नोट: फ़्रेम की किसी भी श्रेणी का विश्लेषण किया जा सकता है ।
    2. एक पिक्सेल डालें मिमी रूपांतरण कारक है, जो इमेजिंग के लिए ०.०२९ होगा पूर्ण संकल्प पर एक 9 सेमी पेट्री व्यंजन । ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म का चयन करें ' मृत रखें ' ।
      नोट: रूपांतरण कारक इस्तेमाल किए गए दृश्य के क्षेत्र पर निर्भर करेगा । Z-रूपांतरण एल्गोरिथ्म भी एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    3. पता लगाने अनुभाग में मापदंडों में भरें (चित्रा 2): जेड का उपयोग करें छवियां = १००, जेड गद्दी = 3, एसटीडी पिक्सल = ५४, थ्रेसहोल्ड = 9, खोलने = 1, बंद = 2 । फ़िल्टरिंग पैरामीटर को न्यूनतम आकार = 20, अधिकतम आकार = १८०, वर्म-की तरह = ०.९४ समायोजित करें ।
    4. धुन बनाने पथ मापदंडों: अधिकतम दूरी कदम = 10; न्यूनतम लंबाई = १५०, स्मृति = 10.
    5. झुकता है और वेग मापदंडों सेट करें । बेंड थ्रेशोल्डके लिए १.८ का उपयोग करें, 0 न्यूनतम झुकताके लिए, और वेग अनुमान लगानेके लिए फ्रेम के लिए १५०.
    6. मृत कीड़ा आंकड़ेट्यून । अधिकतम गतिके लिए प्रति मिनट और १.० अधिकतम हरा के लिए ५.० का उपयोग करें ।
    7. आउटपुट फ़ोल्डर चुनें । ५० करने के लिए आउटपुट फ़्रेम की संख्या सेट करें । फ़ॉंट आकार 10 पर सेट करें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक या अधिक रुचि के क्षेत्रों का चयन करें (ROIs) ।
  2. उदाहरण फ़ंक्शन का उपयोग करके पैरामीटर का परीक्षण । उत्पादन उदाहरण छवियों और जांच करें कि कीड़े 8 थ्रेसहोल्ड कदम (चित्रा 1) भर में दिखाई दे रहे हैं ।
  3. प्रारंभ कार्य फ़ंक्शन का उपयोग करें ।
  4. पूरे डेटासेट के लिए व्यक्तिगत परिणामों को संयोजित करके पाठ परिणाम फ़ाइलों का विश्लेषण करें. GUI में tsv फ़ंक्शन के लिए निर्यात का उपयोग करें ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, कीड़े के व्यक्तिगत मेट्रिक्स भी जनसंख्या अध्ययन के लिए विचार किया जा सकता है ।
    1. एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ डेटा का विश्लेषण ।

Representative Results

संचालन की आसानी, multiparametric विश्लेषण, और सचित्र WF के उच्च प्रवाह-NTP प्रोटोकॉल (आंकड़े 1 और 2) यह एक बहुत ही सटीक तरीके से कृमि व्यवहार में बहुत छोटे परिवर्तन निर्धारित करने के लिए संभव बनाता है. इमेजिंग मंच कस्टम पर आधारित है दृक्-यांत्रिकी बनाया है, और यह एक 6 सांसद मोनोक्रोम 16 मिमी फोकल लंबाई उच्च संकल्प लेंस 1 ' के लिए ' सेंसर के साथ संयुक्त कैमरा का उपयोग कर इकट्ठे किया जा सकता है, एक 8 ' द्वारा ' 8 ' सफेद backlight के साथ प्रबुद्ध ( सामग्री की तालिका देखें और भी अतिरिक्त जानकारी के लिए३६ संदर्भ) । एसोसिएटेड WF-NTP सॉफ्टवेयर पायथन में लिखा है और Windows प्लेटफार्मों पर चलाने के लिए विकसित किया गया था । यह ३.०० GHz octa-कोर प्रोसेसर और ६४ GB रैंडम-एक्सेस मेमोरी (RAM) के साथ एक कस्टम इकट्ठे कंप्यूटर पर चलाता है । कंप्यूटर के रैम और सीपीयू पर आधारित काम और वीडियो एनालिसिस को parallelize करने के लिए सॉफ्टवेयर भी तैयार किया गया था; यानी, कम गणना शक्ति के साथ एक मशीन के समानांतर में कम वीडियो चलाने में परिणाम होगा । सेटअप हम वर्तमान में उपयोग कर रहे है समानांतर में ca. 16 वीडियो को चलाने के लिए अनुकूलित है और ca. १०० वीडियो के एक विश्लेषण रातोंरात पूरा कर सकते हैं । इसके अलावा, WF के जीयूआई में प्रदान की अनुकूलन के विस्तार के उच्च स्तर-NTP इमेजिंग विश्लेषण की गुणवत्ता के महान नियंत्रण की अनुमति देता है । GUI को सीधे समानांतर या वैयक्तिक वीडियो में बड़े डेटासेट अपलोड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; विशिष्ट फ़्रेम को पिक्सेल रूपांतरण फ़ैक्टर के साथ विस्तृत उप-विश्लेषण के लिए भी चुना जा सकता है, जिसका उपयोग व्यवहार मीट्रिक का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है. दो अलग ट्रैकिंग एल्गोरिदम में से एक (मृत रखने के लिए और Z-रूपांतरण) उपयोगकर्ता विश्लेषण में पंगु बना जानवरों पर विचार करना चाहते है या नहीं के आधार पर चुना जा सकता है । थ्रेसहोल्ड पैरामीटर वीडियो और प्रयोगात्मक गुणवत्ता के साथ तदनुसार देखते हो सकता है । खोलने और बंद पैरामीटर शोर को हटाने के लिए और आगे थ्रेसहोल्ड कार्यक्षमता को लागू करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति दें । skeletonizing एल्गोरिथ्म विश्लेषण का एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है । वस्तु आकार कट-नापसंद (फ़िल्टरिंग) पृष्ठभूमि शोर के लिए एक अतिरिक्त फिल्टर प्रदान करते हैं और कीड़ा की तरह पैरामीटर एक ellipsoidal आकार के साथ कीड़े केवल वस्तुओं पर विचार करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है, इसलिए अन्य वस्तुओं है कि एक ही पिक्सेल आकार हो सकता है से भेद कीड़े । इन थ्रेसहोल्ड संचालन के बाद, सभी परिणामी लेबल क्षेत्रों व्यक्तिगत कीड़े के रूप में पहचाना जा सकता है और उन क्षेत्रों की स्थिति तो बाद में विश्लेषण और ट्रैकिंग के लिए प्रत्येक फ्रेम के लिए संग्रहीत कर रहे हैं । प्रत्येक ट्रैक किए गए कीड़ों की सनक का उपयोग कृमि मैट्रिक्स का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है जैसे कि समय के एक समारोह के रूप में कृमि झुकने (बीपीएम) की सीमा. उपयोगकर्ताओं को भी टकराव के बाद सॉफ्टवेयर की स्मृति में एक कीड़ा रखने के लिए इस्तेमाल फ्रेम की संख्या का चयन करने की अनुमति दी जाती है, और एक कीड़ा फ्रेम के बीच स्थानांतरित कर सकते हैं कि पिक्सल की संख्या भी शोर से जानवरों को भेद करने के लिए देखते हो सकता है. न्यूनतम ट्रैक लंबाई विकल्प उपयोगकर्ता केवल कुछ फ्रेम के लिए ट्रैक किया गया है कि कीड़े को त्यागने के लिए अनुमति देता है । ऐसे झुकता है और वेग के रूप में अन्य प्रमुख मापदंडों, उपयोगकर्ता एक शरीर मोड़ के रूप में गिना जा करने के लिए आवश्यक झुकने की डिग्री का चयन करने की अनुमति और जानवरों की गति का अनुमान करने के लिए आवश्यक माना फ्रेम की संख्या. कट-ऑफ मापदंडों आगे झोले के साथ जानवरों के शामिल किए जाने के लिए देखते हो सकता है । आउटपुट स्वचालित रूप से परिणाम फ़ाइलों में दिखाया गया है । इन मूल्यों को पंगु बना जानवरों के अंश के मूल्यांकन के लिए ऊपरी सीमा के रूप में माना जाता है । उपयोगकर्ता भी ब्याज की एक या अधिक क्षेत्रों का चयन कर सकते हैं । यह सुविधा विशेष रूप से कीड़े के उपजनसंख्या का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है और उत्पादन स्वचालित रूप से परिणाम फ़ाइलों में हल है । आउटपुट विकल्प उपयोगकर्ता आउटपुट फ़ोल्डर और इसके लिए उत्पादित किया जाएगा ट्रैकिंग फ़्रेम की संख्या का चयन करने के लिए अनुमति देता है । विभिंन उपकरण सेट भी आगे डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ऐसे भूखंड पथ उपकरण है कि व्यक्तिगत कीड़ा पटरियों और फिंगरप्रिंटिंग उपकरण है कि उपयोगकर्ता फिंगरप्रिंट मैप्स बनाने के लिए अनुमति देता है दिखाता है ।

इस पद्धति को अपनाया जा करने के लिए नए दृष्टिकोण सक्षम बनाता है, न केवल सी के जैविक अध्ययन के लिए एलिगेंस लेकिन यह भी औषधीय और चिकित्सा अनुसंधान प्रयोजनों के लिए, आनुवंशिक संशोधनों और नशीली दवाओं के उपचार के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के रूप में. हम बड़ी जनसंख्या अध्ययन के लिए phenotypes के लक्षण वर्णन द्वारा इस क्षमता सचित्र है (N > १०००) neurodegenerative रोग के विभिंन कीड़ा मॉडल (frontotemporal मनोभ्रंश (FTD)३९, पार्किंसंस रोग (पीडी)7 , अल्जाइमर रोग (AD)16,४०, और पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS)19 (चित्रा 3ए), और पीडी18 और विज्ञापन के कीड़ा मॉडल का उपयोग कर संभावित चिकित्सीय अणुओं के प्रभाव निस्र्पक 15,12 (चित्र 3 बी) । दो छोटे अणुओं, squalamine18 और bexarotene15, की सांद्रता पर प्रशासित किया गया 25 µ m करने के लिए पीडी (चित्र बी1) और 10 µ एम के लिए विज्ञापन३८ (चित्र बी) कीड़े, क्रमशः. दोनों यौगिकों स्पष्ट खुराक पर निर्भर प्रभाव का परीक्षण किया सांद्रता की सीमा से पता चला. हमें पता चला है कि माप की इस उच्च सटीकता कीड़े कि पारंपरिक तरीकों की तुलना में विश्लेषण किया जा सकता है की संख्या में वृद्धि के द्वारा हासिल की है (आंकड़ा 3सी). हम आणविक स्क्रीनिंग में नमूना आकार (आंकड़ा 3सी) के महत्व सचित्र के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उत्परिवर्ती उपभेदों के लक्षण वर्णन में । 20 डिग्री सेल्सियस से तापमान में वृद्धि विज्ञापन कीड़े के लगभग आधे से वयस्कता के 3 दिनों के बाद पंगु बनने की ओर जाता है । कीड़ा आबादी अलग शर्तों के तहत जांच की गई, जैसे, जब कीड़े पर ४२-amyloid के अवशेष फार्म व्यक्त-β पेप्टाइड (Aβ1-42) (विज्ञापन कीड़े) सूक्ष्म तापमान रूपों के संपर्क में थे (आंकड़ा 3सी, वाम पैनल), जब Aβ1-42 सभी न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था (चित्रा 3सी, सेंट्रल पैनल), या जब विज्ञापन कीड़े bexarotene को उजागर किया गया (चित्रा 3सी, सही पैनल). कीड़े भी छोटे ROIs से विश्लेषण किया गया बेतरतीब ढंग से WF-NTP (n < ५०, पीली पट्टियों) के साथ अधिग्रहीत वीडियो के दृश्य के पूर्ण क्षेत्र से चयनित पूरी कृमि जनसंख्या के औसत गतिशीलता के साथ इन कीड़ों के गतिशीलता की तुलना पर प्रकाश डाला (एन < १,०००) । सभी पैनलों में, अंतर पूरे कीड़ा जनसंख्या पर मापा p ≤ ०.०००१ (* * * *) के साथ सांख्यिकीय महत्वपूर्ण प्रतीत होता है ।

WF-NTP प्रोटोकॉल यहां वर्णित भी कई मापदंडों के एक साथ रिकॉर्डिंग (आंकड़ा 1b) एक इष्टतम तरीके से समर्थन करने के लिए, दोनों आंतरिक सत्यापन और शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला के एक व्यापक फिंगरप्रिंट के विकास की अनुमति देता है एक नियंत्रण नमूना के सापेक्ष, कई अध्ययनों में सार्थक तुलना के लिए अनुमति देता है । इस बहु-पैरामीट्रिक दृष्टिकोण कई व्यवहार सुविधाओं का एक साथ विश्लेषण, झुकने आवृत्ति, गति, पक्षाघात दर, आकार, मोड़ आयाम, और मोड़ विस्थापन३६सहित शामिल हैं । यह पशुओं के हजारों की अनुमति देता है महान विस्तार से निगरानी और एक बहुत ही उच्च संवेदनशीलता और सांख्यिकीय महत्व पर और बड़ी आबादी के अध्ययन के लिए अवसर प्रदान करता है । इस ट्रैकिंग प्रक्रिया भी पक्षाघात के अध्ययन के समानांतर में अंय व्यवहार माप, आणविक स्क्रीनिंग अध्ययन में एक महत्वपूर्ण विशेषता के साथ प्रदर्शन करने की अनुमति का लाभ है ।

परिणाम है कि अब तक विज्ञापन15,३४,३५ और पीडी18 दवा डिस्कवरी में प्राप्त किया गया है व्यापक क्षेत्र के महत्व को देखने के डेटा अधिग्रहण के लिए बहुत पशुओं की संख्या में वृद्धि हो सकती है कि एक ही प्रयोग में नजर रखी, काफी प्रयोगात्मक त्रुटियों को कम करने और बहुत अध्ययन के सांख्यिकीय वैधता में सुधार. इन परिणामों के आधार पर, हम आशा है कि WF-NTP प्रोटोकॉल, जो हम समुदाय३६के लिए आसानी से उपलब्ध कराया, काफी सी एलिगेंसके उपयोग का विस्तार होगा ।

Figure 1
चित्र 1: WF-NTP विश्लेषण चरण और फ़िंगरप्रिंट का उदाहरण. (a) 1. मूल वीडियो । 2. पृष्ठभूमि छवि । 3. पृष्ठभूमि घटाई छवि । 4-6. थ्रेशोल्ड चरण । 7-9. कीड़े की एकल लेबलिंग. () कई phenotypes जंगली प्रकार के कीड़े और पीडी और विज्ञापन के कीड़ा मॉडल के लिए एक फिंगरप्रिंट के साथ रिपोर्ट कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस (GUI) WF-NTP । विशिष्ट वीडियो और चयनित फ़्रेम को विश्लेषण के लिए GUI में चुना जा सकता है, और एक पिक्सेल रूपांतरण कारक डाला जा सकता है, जिसके बाद विश्लेषण दो दिए गए ट्रैकिंग एल्गोरिदम में से एक के साथ किया जाता है. यह एक शरीर मोड़ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जानवरों की गति का अनुमान करने की जरूरत फ्रेम की संख्या के रूप में गिनती के लिए आवश्यक झुकने की डिग्री का चयन करने के लिए संभव है । शरीर झुकता है और गति थ्रेसहोल्ड पंगु बना कीड़ा आंकड़े निर्धारित कर सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: WF-NTP विधि द्वारा सक्षम अनुप्रयोगों के उदाहरण। () FTD, पीडी, विज्ञापन, और ALS सहित neurodegenerative रोगों की एक श्रृंखला के सी. एलिगेंस मॉडलों के लिए बीपीएम माप की बड़ी जनसंख्या अध्ययन (एन > १,०००) में WF-NTP का आवेदन. () औषध खोज में WF-NTP का आवेदन. () तापमान संवेदनशीलता, दवा प्रभावकारिता, और उत्परिवर्ती तनाव लक्षण वर्णन में जनसंख्या अध्ययन का महत्व । उपजनसंख्याों का Phenotypes n < ५० (पीली पट्टियां) की तुलना पूरे वर्मी जनसंख्या (n < १,०००) के साथ की जाती है । त्रुटि पट्टियां माध्य (SEM) के मानक त्रुटि इंगित करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

क्योंकि ऑप्टिकल विज्ञान के क्षेत्र में तकनीक के तेजी से विस्तार के कारण, यह अब संभव है एलिगेंस अध्ययन में स्वचालित तरीकों के लिए काफी नए तरीके से पते की आवश्यकता है । नतीजतन, डिजिटल ट्रैकिंग प्लेटफार्मों की एक संख्या20,४१,४२,४३,४४,४५,४६ पर डिजाइन किया गया है और उपलब्ध कराया इस तरह के आंदोलन की गति के रूप में मानकों के मैनुअल गिनती की जगह के लिए पिछले कुछ वर्षों में, आवृत्ति झुकने, पक्षाघात दर, और साथ ही व्यवहार के अधिक जटिल रूपों जैसे ओमेगा बदल जाता है, और उम्र माप. सबसे हाल ही में स्वचालित प्लेटफार्मों बहुत reproducibility और सी एलिगेंस अध्ययन के संवेदनशीलता में सुधार हुआ है४१ और छोटे साथियों या यहां तक कि व्यक्तिगत जानवरों पर उच्च गुणवत्ता डेटा प्रदान की है । हम कृमि व्यवहार के विश्लेषण के स्वचालन का विस्तार करने के लिए यह भी समानांतर में पशुओं के हजारों के साथियों के phenotypes का मूल्यांकन करने के लिए संभव बनाने का फैसला किया । कीड़ा साथियों के अध्ययन के दृष्टिकोण का मुख्य लाभ यह है कि यह कृमि24 व्यवहार के उच्च आंतरिक परिवर्तनशीलता के लिए लेखांकन के लिए अनुमति देता है और तथ्य यह है कि दवा उपचार के अध्ययन अक्सर सूक्ष्म phenotypic रूपांतरों के लिए नेतृत्व के लिए, जो कर रहे है मुश्किल पर्याप्त सांख्यिकीय महत्व के साथ पता लगाने के लिए जब पशुओं के एक छोटे समूह का उपयोग कर । पता लगाने की एक उच्च शक्ति (फली) वास्तव में विश्वास के साथ व्यवहार में किसी भी महत्वपूर्ण भिंनता का पता लगाने के लिए और झूठी सकारात्मक परिणाम25सीमा आवश्यक है ।

यहां, हमने C. एलिगेंसके लिए हाल ही में रिपोर्ट की गई स्वचालित स्क्रीनिंग पद्धति के आधार पर प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला बताई है, जो वाइड फील्ड-ऑफ-व्यू निमेटोड ट्रैकिंग प्लेटफ़ॉर्म (WF-NTP)३६है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल को 5 भागों में विभाजित किया गया है । 1 भागों और 2 बड़े कीड़ा आबादी की तैयारी का वर्णन । महत्वपूर्ण कदम काम की स्थिति और रिएजेंट और आवश्यक प्लेटों की तैयारी के बांझपन के लिए प्रयोग चलाने के लिए कर रहे हैं । हम ध्यान दें कि, वृद्धि हुई अन्य स्क्रीनिंग के तरीके की तुलना में इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रदान की प्रवाह के कारण३६, यह भी रिएजेंट की मात्रा में वृद्धि की आवश्यकता है; इस पहलू को प्रायोगिक डिजाइन में सावधानीपूर्वक विचार करने की जरूरत है । हम यह भी ध्यान दें कि ब्लीचिंग कदम महत्वपूर्ण है और पहले से परीक्षण की जरूरत है के रूप में अंडे की एक बड़ी संख्या और स्वस्थ लार्वा इन प्रयोगों को चलाने के लिए आवश्यक हैं । इस प्रोटोकॉल विवरण के भाग 3 कैसे ठोस मीडिया और स्क्रीन कीड़ा आबादी में ड्रग्स देने के लिए । हम ध्यान दें कि प्रोटोकॉल के इस भाग के समानांतर में उपयोगकर्ता द्वारा परीक्षण किया जा करने के लिए दवाओं और दवा सांद्रता की संख्या पर दृढ़ता से निर्भर है । स्क्रीनिंग प्रक्रिया का पूरा स्वचालन और तेजी से डेटा अधिग्रहण व्यवहार अवलोकन से सीमित कदम को रिएजेंट तैयारी और विकास और बड़े कीड़ा आबादी के तुल्यकालन बदलाव । व्यवहार स्क्रीनिंग के दौरान महत्वपूर्ण कदम रिकॉर्डिंग के समय और किसी भी कृमि हैंडलिंग कदम (जैसे, NGM प्लेटों से ट्रैकिंग मंच के लिए कीड़े के हस्तांतरण) कर रहे हैं । प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक वयस्क उंर के दौरान 9 दिनों तक के लिए कीड़े स्क्रीन डिजाइन उदाहरण है; हालांकि, इस प्रोटोकॉल आसानी से उपयोगकर्ता इच्छाओं के रूप में कई समय अंक के रूप में स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे, 18 लगातार दिन३६। भाग 4 तो प्रोटोकॉल के आवेदन को दिखाता है प्रोटीन अणुओं (जैसे, एंटीबॉडी और आणविक chaperones) सी. एलिगेंसमें उद्धार, और पता चलता है कि कैसे प्रोटोकॉल 1-3 भागों में सचित्र आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, वांछित पर निरभर है अनुप्रयोग. हम प्रदर्शन कैसे इस प्रक्रिया को न केवल दवा की डिलीवरी के अणुओं की तरह है लेकिन यह भी आणविक chaperones या एंटीबॉडी३७के प्रशासन के लिए बढ़ाया जा सकता है । पहले चार कदम (भागों) बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है, जब तक अंयथा उल्लेख किया । सभी तरल घटकों का उपयोग करने से पहले autoclaved होना चाहिए और गर्मी कदम ७०% सापेक्ष आर्द्रता पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए । 5 भाग में, हम कैसे सॉफ्टवेयर ट्रैकिंग मंच के साथ संयोजन में प्रदान की पैकेज का उपयोग करने का वर्णन । यह सॉफ्टवेयर WF-NTP बड़े कीड़ा आबादी के व्यवहार से संबंधित आंकड़ों के विश्लेषण के लिए बनाया गया रिवाज है । हमारा सुझाव है कि उपयोगकर्ता डेटा विश्लेषण के लिए भाग 5 में दिए गए दिशानिर्देशों का पालन करता है; हालांकि, इन मापदंडों रिकॉर्ड वीडियो की विशिष्ट सुविधाओं पर निर्भर कर रहे हैं (यानी, एफपीएस, देखने के क्षेत्र, वीडियो संकल्प, अधिग्रहीत फ्रेम की संख्या). GUI में दिए गए उदाहरण फ़ंक्शन को विश्लेषण से पहले सही मापदंडों के मूल्यांकन की सुविधा देने के लिए डिज़ाइन किया गया है.

प्रोटोकॉल की ये श्रृंखला सी. एलिगेंस की बड़ी आबादी के phenotypes का विश्लेषण करने के लिए संभव बनाने के लिए (वर्तमान में ५,००० व्यक्तिगत कीड़े समानांतर में) प्रभावी ढंग से, कलाकृतियों जानवरों के व्यवहार की आंतरिक परिवर्तनशीलता के कारण को कम करने , एलिगेंस25के अध्ययन के लिए सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए आवश्यक पता लगाने की शक्ति पर प्रारंभिक अध्ययन के साथ समझौते में. मंच उच्च संकल्प कैमरों की एक प्रणाली का उपयोग करता है, एक उच्च गति से पशुओं की बड़ी संख्या की छवियों की रिकॉर्डिंग में सक्षम है, जबकि एक साथ कई बड़े साथियों की रिकॉर्डिंग । उच्च प्रदर्शन और WF-NTP प्रोटोकॉल का उच्च प्रवाह यह एक बहुत ही सटीक तरीके से कृमि व्यवहार में बहुत छोटे परिवर्तन निर्धारित करने के लिए संभव बनाता है । इसलिए, इस पद्धति के नए दृष्टिकोण न केवल एलिगेंस के जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए माना जाता है, लेकिन इसके अलावा औषधीय और चिकित्सा अनुसंधान के लिए, आनुवंशिक संशोधनों और नशीली दवाओं के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के रूप में सक्षम बनाता है उपचार. इस प्रक्रिया को भी पक्षाघात के अध्ययन की अनुमति के अंय व्यवहार मापन, आणविक स्क्रीनिंग अध्ययन में एक महत्वपूर्ण विशेषता के साथ समानांतर में प्रदर्शन करने का लाभ है ।

विज्ञापन15,३४,३५ और पीडी18 की दवा खोज कार्यक्रमों में अब तक हासिल किया गया है कि परिणाम काफी हद तक बढ़ाने में व्यापक क्षेत्र के दृश्य डेटा अधिग्रहण के महत्व का प्रदर्शन जानवरों की संख्या है कि एक ही प्रयोग में नजर रखी जा सकता है, जिससे काफी प्रयोगात्मक त्रुटियों को कम करने और बहुत अध्ययन के सांख्यिकीय वैधता में सुधार । जबकि वर्तमान दृष्टिकोण इस प्रोटोकॉल में वर्णित दवा की खोज के क्षेत्र में चुनौतियों को संबोधित करने पर ध्यान केंद्रित किया है, हमें उंमीद है कि इस पद्धति को व्यापक रूप से समुदाय में अपनाया जाएगा, और है कि अपने आवेदन जटिल आनुवंशिक करने के लिए बढ़ाया जाएगा और व्यवहार अध्ययन और वर्तमान में जासूसी कर रहे हैं कि phenotypes की संख्या का विस्तार.

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं हैं.

Acknowledgments

इस कार्य के लिए केंद्र द्वारा रोगों का खुलासा (सीएमडी) का समर्थन किया गया । FAA अल्जाइमर सोसायटी, ब्रिटेन (अनुदान संख्या ३१७, के रूप में-एस एफ-16-003) से एक वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप पुरस्कार द्वारा समर्थित है । सी. एलिगेंस उपभेदों को Caenorhabditis एलिगेंस जेनेटिक सेंटर (CGC) से प्राप्त किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumable reagents
monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich P0662
dibasic sodium phosphate Sigma Aldrich S3264
sodium chloride Sigma Aldrich 13422
magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Agar Sigma Aldrich A1296
Difco casein digest Scientific Laboratory Supplies 211610
calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C3881
cholesterol Acros 110190250
absolute ethanol Vwr 20821.33
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% Alfa Aesar L16497.ME
LB medium capsules MP biomedicals 3002-031
13% sodium hypochlorite Acros Organics AC219255000
Sodium hydroxide Fisher Chemical S/4880/53
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E. coli strain OP50 Supplied by CGC Op50 E coli strain
C. elegans strain wild type Supplied by CGC N2 C. elegans strain
C. elegans strain AD Supplied by CGC GMC101 C. elegans strain
C. elegans strain PD Supplied by CGC NL5901 C. elegans strain
C. elegans strain ALS Supplied by CGC AM725 C. elegans strain
C. elegans strain Tau Supplied by CGC BR5485 C. elegans strain
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Tactrol 2 Autoclave Priorclave
9 cm sterile Petri dishes Fisher Scientific 11309283
2 L erlenmeyer flasks Scientific Laboratory Supplies FLA4036
Nalgene 1 L Centrifuge pots Fisher Scientific 3120-1000
RC5C plus floor mounted centrifuge Sorvall 9900884
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-12
Heraeus Multifuge X3R Thermofisher scientific 75004515
Inoculating Spreaders Fisher Scientific 11821741
M4 multipette Eppendorf 4982000012
P1000 pipette Eppendorf Research Plus
P200 pipette Eppendorf Research Plus 3123000055
P10 pipette Eppendorf Research Plus 3123000020
1,000 μL low retention tips Sarstedt
300 μL low retention tips Sarstedt 70.765.105
10 μL low retention tips Sarstedt 70.1130.105
pipeteboy 2 VWR 612-0927
50 mL serological pipette Appleton Woods CC117
25 mL serological pipette Appleton Woods CC216
10 mL serological pipette Appleton Woods CC214
glass pipette 270 mm Fisherbrand FB50255 Camera for videos recording
pulsin Polyplus Transfection 501-04 Transduction reagent
Multitron Standard shaking incubator Infors HT INFO28573
air duster Office Depot 1511631
Name Company Catalog Number Comments
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software
8'' by 8'' Backlight Edmond Optics 88-508 Tracker component
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor Edmond Optics 86-571 Tracker component
6 Mpx camera Edmond Optics 33540 Tracker component
FlyCapture Software PointGrey SDK v2.12 Image capture software
WF-NTP Software Cambridge Enterprise v1.0 Image analysis software
Office Package Microsoft Office 365 Statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, (1), 71-94 (1974).
  2. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews Drug Discovery. 5, (5), 387-399 (2006).
  3. Nollen, E. A. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 101, (17), 6403-6408 (2004).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 99, (16), 10417-10422 (2002).
  5. Van der Goot, A. T., et al. Delaying aging and the aging-associated decline in protein homeostasis by inhibition of tryptophan degradation. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA. 109, (37), 14912-14917 (2012).
  6. Van Ham, T. J., et al. Identification of MOAG-4/SERF as a regulator of age-related proteotoxicity. Cell. 142, (4), 601-612 (2010).
  7. Van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of α-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4, (3), e1000027 (2008).
  8. Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes & Development. 19, (13), 1544-1555 (2005).
  9. Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, (10), 865-867 (2008).
  10. Kim, Y., Sun, H. Functional genomic approach to identify novel genes involved in the regulation of oxidative stress resistance and animal lifespan. Aging Cell. 6, (4), 489-503 (2007).
  11. Dillin, A., et al. Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development. Science. 298, (5602), 2398-2401 (2002).
  12. Lee, S. S., Kennedy, S., Tolonen, A. C., Ruvkun, G. DAF-16 target genes that control C. elegans life-span and metabolism. Science. 300, (5619), 644-647 (2003).
  13. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews. Genetics. 3, (5), 356-369 (2002).
  14. Alavez, S., Vantipalli, M. C., Zucker, D. J. S., Klang, I. M., Lithgow, G. J. Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan. Nature. 472, (7342), 226-229 (2012).
  15. Habchi, J., et al. An anticancer drug suppresses the primary nucleation reaction that initiates the production of the toxic A 42 aggregates linked with Alzheimers disease. Science Advances. 2, (2), e1501244 (2016).
  16. Wu, Y., et al. Amyloid- -Induced pathological behaviors are suppressed by ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26, (50), 13102-13113 (2006).
  17. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 92, (20), 9368-9372 (1995).
  18. Perni, M., et al. A natural product inhibits the initiation of a-synuclein aggregation and suppresses its toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA. 114, (6), E1009-E1017 (2017).
  19. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5, (3), e1000399 (2009).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of visualized experiments. (95), 52321 (2015).
  21. Machino, K., Link, C. D., Wang, S., Murakami, H., Murakami, S. A semi-automated motion-tracking analysis of locomotion speed in the C. elegans transgenics overexpressing beta-amyloid in neurons. Frontiers in Genetics. 5, 202 (2014).
  22. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8, (7), 592-598 (2011).
  23. Van der Goot, A. T., Nollen, E. A. A. Tryptophan metabolism: entering the field of aging and age-related pathologies. Trends in Molecular Medicine. 19, (6), 336-344 (2013).
  24. Lublin, A. L., Link, C. D. Alzheimer's disease drug discovery: in vivo screening using Caenorhabditis elegans as a model for β-amyloid peptide-induced toxicity. Drug Discovery Today: Technologies. 10, (1), e115-e119 (2013).
  25. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational analysis of lifespan experiment reproducibility. Frontiers in genetics. 8, (JUN), 92 (2017).
  26. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10, (9), 877-879 (2013).
  27. Wang, S. J., Wang, Z. -W. Track-a-worm, an open-source system for quantitative assessment of C. elegans locomotory and bending behavior. PLoS ONE. 8, (7), e69653 (2013).
  28. Faumont, S., et al. An image-free opto-mechanical system for creating virtual environments and imaging neuronal activity in freely moving Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 6, (9), e24666 (2011).
  29. Tsibidis, G. D., Tavernarakis, N. Nemo: a computational tool for analyzing nematode locomotion. BMC Neuroscience. 8, 86 (2007).
  30. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8, (2), 153-158 (2011).
  31. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8, (2), 147-152 (2011).
  32. Restif, C., et al. CeleST: computer vision software for quantitative analysis of C. elegans swim behavior reveals novel features of locomotion. PLoS Computational Biology. 10, (7), e1003702 (2014).
  33. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS ONE. 3, (5), e2208 (2008).
  34. Habchi, J., et al. Systematic development of small molecules to inhibit specific microscopic steps of Aβ42 aggregation in Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114, (2), E200-E208 (2017).
  35. Aprile, F. A., et al. Selective targeting of primary and secondary nucleation pathways in Aβ42 aggregation using a rational antibody scanning method. Science Advances. 3, (6), e1700488 (2017).
  36. Perni, M., et al. Massively parallel C. elegans tracking provides multi-dimensional fingerprints for phenotypic discovery. Journal of neuroscience. 306, 57-67 (2018).
  37. Perni, M., et al. Delivery of Native Proteins into C. elegans Using a Transduction Protocol Based on Lipid Vesicles. Scientific Reports. 7, (1), 7380 (2017).
  38. McColl, G., et al. Utility of an improved model of amyloid-beta (Aβ₋) toxicity in Caenorhabditis elegans for drug screening for Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 7, (1), 7380 (2012).
  39. Fatouros, C., et al. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21, (16), 3587-3603 (2012).
  40. Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. In vivo aggregation of β-Amyloid peptide variants. Journal of Neurochemistry. 71, (4), 1616-1625 (1998).
  41. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. 1-17 (2012).
  42. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G. T., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurobiology. 49, (4), 303-313 (2001).
  43. Tsechpenakis, G., Bianchi, L., Metaxas, D., Driscoll, M. A novel computational approach for simultaneous tracking and feature extraction of C. elegans populations in fluid environments. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 55, (5), 1539-1549 (2008).
  44. Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neuroscience. 10, 84 (2009).
  45. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H., Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. 5, 115 (2004).
  46. Stroustrup, N., et al. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10, (7), 665-670 (2013).
एक व्यापक क्षेत्र के दृश्य ट्रैकिंग मंच का उपयोग कर बड़ी <em>सी एलिगेंस</em> आबादी का स्वचालित व्यवहार विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perni, M., Casford, S., Aprile, F. A., Nollen, E. A., Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform. J. Vis. Exp. (141), e58643, doi:10.3791/58643 (2018).More

Perni, M., Casford, S., Aprile, F. A., Nollen, E. A., Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform. J. Vis. Exp. (141), e58643, doi:10.3791/58643 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter