Summary
该协议提供了一种可靠的方法，建立人类免疫系统和肝细胞的人性化小鼠。通过注射人肝细胞和CD34实现的双重组免疫缺陷小鼠–造血干细胞易受人体免疫缺陷病毒-1感染和重述肝损伤的影响，如艾滋病毒感染者。
Abstract
尽管感染人体免疫机能丧失病毒-1（HIV-1）的患者预期寿命延长，但肝病已成为其发病的常见原因。HIV-1引起的肝脏免疫病理学仍然难以捉摸。具有人类肝细胞和人类免疫系统的小型异种移植动物模型可以概括人类生物学的发病机制。本文描述了一个方案，通过人类肝细胞和CD34——造血干细胞/祖细胞（HSPCs）移植建立双重人化小鼠模型，以研究HIV感染者观察到的肝脏免疫病理学。为了实现双重重组，男性TK-NOG（NOD）。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg（Alb-TK）7-2/ShiJic）小鼠在腹内注射甘西洛韦（GCV）剂量，以消除小鼠转基因肝细胞，并结合三硫丹进行非骨髓性调理，这两种促进人类肝细胞 （HEP） 移植和人类免疫系统 （HIS） 发育。人白蛋白 （ALB） 水平用于肝脏移植，流式细胞测定检测的血液中存在人体免疫细胞，证实了人类免疫系统的建立。使用此处所述的协议开发的模型类似于HIV-1感染造成的肝脏损伤的多个组成部分。其建立对于肝炎病毒合并感染的研究以及抗病毒和抗逆转录病毒药物的评估可能至关重要。
Introduction
自抗逆转录病毒疗法问世以来，与艾滋病毒-1单一感染有关的死亡人数已大大减少。然而，肝病已成为艾滋病病毒感染者发病的常见原因1，2。肝炎病毒感染与HIV-1感染比较常见，占美国艾滋病病毒感染者的10%-30%，3、4、5。
HIV-1和肝炎病毒的宿主特异性限制了小动物模型研究人类特定传染病或研究HIV-1相关肝脏发病机制的多个方面的效用。免疫缺陷小鼠，允许移植人体细胞和/或组织（称为人化小鼠模型）是可以接受的动物模型为临床前研究6，7，8。自21世纪初引入人化小鼠以来，多次对胆囊静物人类肝毒性、人类特异性病原体（包括HIV-1和HIV相关神经认知障碍、爱泼斯坦巴尔病毒、肝炎等）进行临床前研究传染病，已对这些小鼠进行了6、9、10、11的调查。CD34+ HSPCs和/或人类肝细胞移植的多种小鼠模型早已开发出来，并随着时间的推移得到了改进，以研究乙型肝炎病毒（HBV）相关肝病的疾病发病机制12，13,14.HSPC和人肝细胞移植的几个模型基于菌株，称为NOG（NOD）。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac）8，13， NSG （NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）15， 巴尔布/C-拉格2-/- -----（拉格2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J）12，和fah-/- NOD rag1--il2ré_null鼠标16。但是，每个模型都有自己的优点和局限性;例如，AFC8 在 Balb/C-Rag2-/- ---c -/-背景上为 HEP 和人类干细胞 （HSCs） 提供双人机小鼠，使免疫细胞和 HSC 能够成功移植，但不存在抗原特异性 T 细胞和 B 细胞在此模型12中响应 。在重组双人性小鼠时，主要关切包括次优移植、缺乏支持不同组织的合适模型、不匹配的条件、免疫排斥或移植-宿主疾病（GVHD）和技术困难，如与新生儿的风险操纵和高死亡率由于代谢异常13。
虽然人类化小鼠已用于艾滋病研究多年17、18、19，但使用人化小鼠研究HIV-1对肝脏的损害已经有限20。我们之前曾报道建立了双重人性化的TK-NOG小鼠模型，并将其应用于与艾滋病毒相关的肝病8。该模型显示了肝脏和免疫细胞的强健移植，并重述了HIV感染的发病机制。本讨论提出了详细的方案，包括人类肝细胞移植中最关键的步骤。还介绍了成功移植HEP和在TK-NOG小鼠中建立功能免疫系统所需的HSPCs。详细介绍了这些小鼠研究HIV相关肝脏免疫机原机制。使用TK-NOG雄性小鼠携带肝脏特异性疱疹单纯疱疹病毒类型1胸腺激酶（HSV-TK）转基因。表达这种转基因的小鼠肝细胞在短暂接触无毒剂量的GCV后，很容易被消融。移植的人类肝细胞在小鼠肝脏内保持稳定，没有外源性药物21。小鼠还预置了非骨髓剂量的三硫丹，为人类细胞8在小鼠骨髓中创造一个利基。免疫缺陷的TK-NOG小鼠在脾脏注射了HEP和多能的HSPCs。然后，通过血液免疫造影和分别测量血清人-白蛋白水平，定期监测小鼠的血液和肝脏重组。成功重组超过15%的小鼠为人体免疫细胞和HEP注射HIV-1。艾滋病毒对肝脏的影响最早可在感染后4-5周内评估。必须指出，由于使用了HIV-1，在处理病毒并将其注射到小鼠体内时，必须采取一切必要的预防措施。
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Protocol
该协议已获得内布拉斯加大学医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注：在动物实验前，先获得当地IACUC的批准。
1. 脐带血的处理与人体HSPC的分离
- 在层流柜的无菌条件下执行协议的所有步骤。
- 取在肝化管中收集的脐带血（CB），通过添加磷酸盐缓冲盐水（PBS）使体积达到35 mL。如图 1所示，将样品分层淋巴细胞分离介质 （LSM） 顶部，并在 4°C 下将 LSM 与分层 CB 在 400 x g下离心 35 分钟，无需制动器。
注：小心并轻轻稀释血液，以避免在界面处混合。 - 小心地拆下顶部 LSM 和等离子层，并使用转移移液器将白色布漆界面转移到新管中。
- 在30-40 mL的冷缓冲液中重新悬浮布皮涂层（PBS = 0.5% 牛血清白蛋白 [BSA] = 2 mM 乙烯二甲酸 [EDTA]）。使用移液器，将细胞悬浮液的20μL与20μL的0.4%锥蓝色和移液器10μL的混合物结合到计数滑块的两个腔室的外开口中，然后将幻灯片插入自动细胞计数器以计数细胞。
注：在所有步骤中使用冰冷的缓冲液，因为它有助于保持细胞的存活。 - 在300 x g下将细胞在4°C下离心10分钟，并小心吸气上清液。然后，加入300μL的冷缓冲液。
- 加入100 μL的人类Fc受体阻断试剂和100μL的单克隆小鼠抗人CD34抗体结合微珠，最多1 x 108细胞（见材料表）。在4°C下孵育30分钟，加入10mL的冰冷缓冲液清洗细胞，在300 x g下在4°C下离心10分钟。
注：如果存在超过 1 x 108个单元格，则根据单元格数向上缩放。 - 小心地去除上清液，将颗粒重新悬浮在500μL的缓冲液中，然后继续磁分离步骤以丰富HSPCs。
- 在磁激活细胞分拣场中放置正选择LS列（见材料表），并通过3 mL的缓冲液。
- 将样品加载到 LS 柱中，该柱可以捕获附着在样品中的人体 CD34+ 微珠，并允许它在重力影响入收集管。
- 用缓冲液清洗柱3x，并在CD34的同一收集管中收集洗管-细胞的一小部分。
- 将柱状柱与 5 mL 的缓冲液，以将 CD34+细胞放入新的收集管中。重复此过程，实现纯度 >90%。
- 在血细胞计中使用锥蓝色染料计算洗脱的CD34+细胞。计数后，将CD34+细胞在300 x g下离心5分钟，然后丢弃上清液。
- 将CD34+细胞悬浮在25°L的PBS中，用于注射，立即用于移植或冷冻，在冷冻培养基中以1-2百万/mL的浓度冷冻细胞（罗斯威尔公园纪念研究所培养基[RPMI 1640介质]=50%胎儿牛血清（FBS）= 10%二甲基亚硫酸盐[DMSO]），用于移植的进一步使用。
注：在移植中使用活细胞之前，务必重新叙述这些细胞。 - 要检查CD34+洗芯的纯度，请服用50μL的悬浮液，并在4°C下用10μL的PE结合抗人CD34抗体孵育30分钟。抗体孵育后，用PBS清洗染色细胞，将其重新悬浮在100μL的PBS中，然后继续进行流动细胞测定。添加一个没有抗体的附加细胞管，以设计流式细胞仪中的门。
- 采集后，通过选择正向散点 （FSC） 和侧散射 （SSC） 图上的感兴趣区域来分析数据，然后对 FSC 区域和 FSC 高度图上的单个单元进行门控。PE 通道和 SSC 区域图中单个细胞上的门 CD34 阳性细胞。
2. 用于移植的人类肝细胞制剂
- 从液氮中取出冷冻肝细胞，迅速将小瓶浸入水浴中，解冻约90-120s。
- 取出小瓶盖，将解冻的肝细胞倒入加热解冻介质的50 mL锥形管中。
- 用手摇动 50 mL 管，暂停细胞几秒钟。
注：请勿涡旋管。 - 在室温下，在100 x g下将细胞颗粒8分钟。用0.1%BSA清洗PBS中的颗粒细胞，并将其与新鲜或解冻的HSPC（比10：1）在PBS中以80μL/鼠标的最终体积集中。
3. 动物处理、筛查、基因分型和人类HSPC和肝细胞移植治疗
- 动物处理
- 由于严重的免疫缺陷，繁殖，饲养和处理TK-NOG小鼠在无菌条件下。
- 务必佩戴实验室外套、手套、鞋套和面罩，以防止感染可能致病微生物。
- 使用无菌手套和仪器进行手术，并在手术过程中无菌处理动物。
- 为实验选择TK-NOG小鼠
- 通过培育具有雄性非TK-NOG幼虫的雌性TK-NOG小鼠，并通过基因分型选择转基因后代，维持TK-NOG菌株群。
注：执行基因分型（参见步骤 3.3），以确定在产下时新生雄性小鼠和雌性小鼠是否存在转基因。 - 选择6-8周年龄的男性进行移植，因为他们对HSV-TK转基因表达肝细胞21的GCV介导耗度高。
- 在性耳或手术时给小鼠贴上耳标，以方便识别。记下动物的体重和健康状况。
- 通过培育具有雄性非TK-NOG幼虫的雌性TK-NOG小鼠，并通过基因分型选择转基因后代，维持TK-NOG菌株群。
- 使用定量实时聚合酶链反应对HSV-TK转基因存在进行基因分型
- 在发外时（通常在3-4周的年龄）进行基因分型。对于基因分型，在层流生物安全柜中切一块小鼠耳朵，以保持无菌状态，并使用基因组DNA分离试剂盒提取基因组DNA。
- 通过添加1μL的正向引物5'-CCATGCTCTTCTCTCTTTCT-3'，1μL的反向引物5'TAAGGCAGAGCGCGTC-3'，将从耳片中提取的基因组DNA在人类白蛋白促进剂的控制下，以检测HSV-TK转基因FAM探针5+-FAM-AATCGCCCCCCCGC-MGB-3'，以及10μL的母体混合物，在实时聚合酶链反应（PCR）仪器22。
- 设置实时 PCR 设置如下：30 秒（预读阶段）为 60°C，95°C 为 10 分钟（保持阶段），40 个 95°C 周期为 15 秒，60°C 为 1 分钟（PCR 级），60°C 用于 30 秒（后读取阶段）。
注：对于HSV-TK转基因来说，低于22的阈值周期（Ct）被认为是积极的。
- 使用甘西洛韦和三硫丹治疗
- 使用27G针，注射TK-NOG小鼠与腹内GCV注射（6毫克/千克）每天2次，每天2倍，在手术前的100μL的盐水，以耗尽小鼠的转基因腹肌细胞（如图2的实验策略所示）23.
- 在手术前的第3天、第2天和第1天，使用27G针头，在100μL的盐水中，用非骨髓性腹内剂量的胆碱小鼠（1.5克/千克/天）先兆小鼠。
- 手术前一天，用5毫米柳叶刀刺破亚木底静脉，从下颌静脉抽取两至三滴（±100 μL）血液，并通过离心（1，500 x g在4°C下10分钟）分离血清，用于丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定，以评估脱粒肝脏损伤。
- 手术准备
- 在手术前，使用剪子在切口部位（在围肠壁左侧）周围切割鼠标的毛皮。
- 使用鼠标麻醉机将诱导室中的氧气流量调节到 1 L/min，将异常气流调节到 3% - 5%。将一只鼠标一次放入感应室进行麻醉。
- 将无菌延长管的一端（保持容量为 550 μL 的悬架;参见规格材料表）连接到 30 G 针头，另一端连接到 1 mL 注射器。
- 向注射器中填充池内 HEP 和 HSPC 的悬浮液（80 μL/鼠标），将注射器安装在重复点胶的凹槽中，并调整分配器以在每个压榨机中分配 10 μL。
- 一旦小鼠被麻醉（通常在3-4分钟后），将胶然流切换到鼻锥，并将胶然流率降低至2%-3%。
- 小鼠HSPCs和肝细胞的内静脉移植
- 在无菌条件下，在层流柜中执行所有手术步骤。
- 在工作表面放置一个干净的无菌窗帘，用10%的波维酮碘擦洗每只小鼠的左侧，然后先用70%的等丙醇，然后进行切口。
- 用Vanna的类型剪刀在围膜壁左侧的皮肤、肌肉和围肠进行一个小切口（长约1 -1.5厘米，深5毫米），进入肋骨笼下边缘下方约5毫米的围肠腔。
- 找到脾脏，用钳子稍微将其拉到操作区域以方便检修，然后将 30 G 针头插入脾脏的下杆。
- 解锁点胶移液器的柱塞，一次分配 10 μL 的音量，每脾的极限为 60 - 80 μL。慢慢缩回针头，并使用连接贴合器夹住脾脏。
- 用棉布施用器将脾脏推回体腔，用无菌PBS润湿。
- 使用可吸收缝合线中断缝合模式（不是连续的）关闭腹壁的肌肉层。使用不可吸收缝合线，使用中断缝合模式完成皮肤闭合。
- 使用温水循环垫保护小鼠在手术后体温过低。
- 手术后10-14天去除不可吸收的缝合线。
- 术后护理
- 当移植的动物醒来时，在腹内注射镇痛丁丙诺啡（0.1毫克/千克），连续3天每天2次。
- 每天至少观察动物1次，直到它们恢复正常的身体状况。
注：检查每只动物的体重，因为有些老鼠在手术后可能会减轻体重。老鼠通常在1到2周内恢复原来的体重。
4. ELISA对人肝的移植验证，通过流动细胞测定对人体免疫系统进行验证
注：每月评估人类肝脏和免疫系统的重组，分别通过酶相关免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞测定开始1个月后移植。
- 使用 EDTA 管中的柳叶刀从亚木血管收集血液样本，在 4°C 下以 1，500 x g进行 10 分钟的离心机。分离血清以检查人类白蛋白水平，通过遵循制造商的指示。
注：不要丢弃颗粒，并使用颗粒细胞进行流式细胞测定分析，以评估人体免疫系统的重组。 - 在 35 μL 的 FACS 缓冲液 （PBS = 2% FBS） 中重新悬浮无血清的细胞颗粒，并沾染 5 μL 的小鼠特异性 CD45（浓度 0.5 mg/mL）、5 μL 每个人类特异性抗体 CD45 （0.1 mg/mL）、CD3（0.2 mg/mL）、CD8 （0.1 mg/mL） 和 CD19 （0.5 mg/mL）和20 μL的CD4（0.25毫克/升/升）和CD14（0.25毫克/mL）各30分钟在4°C，以检查从CD34+ HSPCs的功能免疫系统的发展。
注：考虑添加一个额外的未染色细胞管，以确定染色细胞的浇注。 - 孵育后，在聚苯乙烯圆底流细胞测定管中转移染色悬浮液（±100μL），并使用2 mL的1x利沙缓冲液（见材料表），用蒸馏水的9部分稀释10x利沙缓冲液的1部分，孵育10 -15分钟，以乳白血球。
注：观察浊度以评估红细胞分型。一旦样品变得清晰，莱沙就完成。 - 变毒后，在管中加入3 mL的FACS缓冲液，在4°C下以300 x g离心5分钟，获得颗粒。在4°C下向颗粒和离心机中加入3mL的FACS缓冲液，重复洗涤5分钟。
- 将细胞固定在新生产的1%甲醛（PFA）中，并在流式细胞仪上获取染色细胞，用流动软件进行分析。
- 对于分析，选择 FSC/SSC 图上的淋巴细胞门控，然后选择 FSC 区域/FSC 高度上的单细胞门控。
- 此外，单细胞群上人类特异性CD45（hCD45）的门，包括小鼠特异性CD45（mCD45），用于排除鼠原细胞。根据未染色细胞的门控对染色种群的门控进行策略。
- 门hCD45+细胞确定CD3+T细胞的频率和CD19+B细胞的频率。门 T 单元，用于确定 CD4 和 CD8 子集。要评估单核细胞，请门在hCD45上确定CD14+单核细胞。
5. TK-NOG小鼠的艾滋病毒感染及其对人类肝脏和免疫系统的影响
- 在指定的生物安全2级设施中处理HIV-1病毒和所有受感染的小鼠。
警告：高压灭菌，并丢弃所有感染艾滋病毒的废物在双重生物危害袋。出于安全考虑，在将感染艾滋病毒的小鼠交给时，请戴上防割手套。 - 在使用病毒时，请随时佩戴个人防护设备 （PPE），包括一次性防护服、鞋套、面罩和双手套。
- 选择重组超过15%的人类CD45+细胞（在步骤4.7中测试），血清中存在人类白蛋白的小鼠，以进行HIV-1感染（在步骤4.1中测试）。
- 给小鼠注射1 x 103至1 x 104组织培养感染剂量50 （TCID50）HIV-1ADA，每只小鼠的容量为100 -200 μL，腹内。
- 使用非曲伦（其中一种子气蒸气浓度为>5%）在感染后5周内对感染艾滋病毒的小鼠实施安乐死。
- 对小鼠实施安乐死后，通过心脏穿刺在EDTA管中采集血液，以分离血清，通过ELISA评估人类特异性白蛋白水平（参见步骤4.1）和血细胞，检查人体免疫的变化，从而了解HIV-1对肝脏的影响使用流细胞测定的细胞（参见步骤4.2 - 4.8）。
注：在生物分析仪上评估感染后5周的外围病毒载量，以确认小鼠是否被感染。 - 抽血后，从安乐死小鼠身上切除肝脏。
- 对于肝脏切除，通过从木质在皮肤、肌肉和腹膜上切开1.5-2厘米长和0.5厘米深的切口来暴露腹腔。使切口垂直于肝脏和隔膜之间的脊柱。提起肝脏，切断任何膜连接到胃和肠道。
- 收集并修复肝脏在4%的甲醛过夜，并遵循标准的免疫组织化学方案，以评估HIV对CK18-肝细胞使用人特异性CK18抗体8的影响。
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Representative Results
通过非常简单的ELISA和流式细胞测定，在每一步都可以轻松监测与人类肝脏和免疫细胞的双重人性化小鼠模型。定期进行流式细胞测量，以评估功能免疫系统的发展，并观察艾滋病毒感染对免疫细胞的影响。在双人性小鼠中，功能免疫细胞的发育范围为淋巴细胞门的15%至90%。免疫细胞的代表性子集以点图显示（图3）。为了评估人类肝细胞的移植，ELISA每月在小鼠血清上执行人类特异性白蛋白水平。同时与HSP和HEP结合的小鼠在一个月内显示人类特异性白蛋白水平，从+7微克/mL到377微克/mL，在观察时间（6个月）继续增长（图4）。HIV感染对双human小鼠血液中人体免疫细胞的影响通过流动细胞测定和人特异性白蛋白ELISA监测肝脏中的HEP。ELISA评估，HIV-1在5周内导致血清中人类白蛋白水平下降，并且人类CK18-肝细胞在双人性小鼠的肝脏部分的消耗，如免疫组织化学评估（图5）。CD4：CD8的比例通常低于感染HIV小鼠的血液和肝脏，按流动细胞测定，与感染前同一小鼠的含量相比（图6）。材料表中讨论了对协议重要的所有试剂和材料。
图 1：CD34+脐带血细胞富集的原理图。（A） 脐带血在淋巴细胞分离培养基（LSM）上分层，离心以分离布皮大衣。（B） LS 柱被放置在磁性支架上，然后用 BSA 缓冲液冲洗，然后添加浅色涂层。CD34的细胞阳性被夹在柱中，CD34-细胞在单独的管中洗脱。被困的CD34–柱树脂中的细胞用柱塞柱状柱塞柱状，细胞被收集到一个新的管中。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：人体化肝脏和免疫系统小鼠双重重组实验设计的原理图，其次是HIV-1感染。TK-NOG小鼠在-7日和第5天以6mg/kg的剂量注射甘西洛韦（GCV），每天2次，然后在第-3、-2和-1天注射硫丹。为了筛选小鼠进行移植 （Tx），在手术前一天进行丙氨酸氨基转移酶 （ALT） 测定，并选择 ALT 水平为 >200 和 <600 U/L 的小鼠。移植后，通过流动细胞测定（FACS）检查小鼠免疫系统的重组，并通过使用ELISA评估其白蛋白水平来重建肝脏。小鼠在牺牲前5周感染了HIV-1。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3: 血液人体细胞分布的流式细胞分析门控策略。（A） 首先，淋巴细胞基于FSC-A和SSC-A全血封闭。（B） 单细胞在淋巴细胞上封闭。（C） 人类CD45+白细胞用小鼠CD45和人类CD45在单个细胞上封闭。（D） CD3+ T 细胞和 CD19+ B 细胞在门控 CD45+人白细胞上识别。（E） CD4+ T 帮助细胞和 CD8+细胞毒性 T 细胞在门控 CD3+ T 细胞中识别。（F） CD14=单核细胞从人类 CD45+白细胞门控。这里所呈现的结果来自一只用双人类肝细胞和HSPCs移植的小鼠。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图 4：白蛋白浓度由ELISA在双human小鼠的血清中测量。小鼠移植了人类肝细胞 （HEPs） 和 CD34–造血干细胞/祖细胞 （HSPCs） （n = 11）。在移植后1、4和6个月的不同时间收集血清，进行稀释以调整标准范围内的未知样品浓度。每个符号表示单独的鼠标值。结果表示中位数以及单个值。• P < 0.05，通过单向方差分析。这个数字已由Dagur等人8修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5：对HIV-1对血清中白蛋白水平的影响和CK18+人肝细胞在双人性小鼠肝脏中的耗竭作用。（A） 在1个月和4个月时移植的带有人类HEP和HSPCs的未感染小鼠（n = 9）中监测白蛋白浓度。小鼠在移植后4-5个月感染HIV（n = 10），并在感染后5周内牺牲。每个符号表示单独的鼠标值。结果表示中位数以及单个值。• P < 0.05，通过单向方差分析。这个数字已由达古尔等人修改。8. （B） 未感染（HEPs + HSPCs，左面板）和HIV感染的TK-NOG小鼠（HEPs + HSPCs + HIV，右侧面板）的五微米肝部分是固定的，石蜡嵌入，并染色用于抗人细胞角蛋白-18（CK18）抗体。HIV-1导致CK18的耗竭——肝细胞由CK18人类细胞占用较少的区域证明。这里所呈现的结果来自一只未感染的小鼠和一只感染了HIV的小鼠，它们移植了双人肝细胞和HSPCs。比例条 = 100 μm。请点击此处查看这个数字的较大版本。
图 6：CD4+细胞与CD8+外周血和双重组未感染小鼠和HIV-1感染小鼠肝脏中的T细胞的比例。对于双重组未感染小鼠：闭环;HEP = HSPC;血n = 7;肝脏n = 6。对于HIV-1感染小鼠：开放圆圈;HEPs = HSPCs = 艾滋病毒;血n = 10;肝脏n = 11。结果表示中位数以及单个值。• P < 0.05，通过艾滋病毒感染小鼠和未感染小鼠之间的单向方差分析测试。这个数字已由Dagur等人8修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在HIV感染者24日肝脏受损。实验性小动物模型研究人类肝脏疾病在HIV-1的存在是极其有限的，尽管有一些联合移植的动物模型与CD34+ HSPCs和肝细胞7，12， 25.在体外实验中，肝细胞被证明有低水平的HIV-1感染26。携带这两种人类细胞的人类小鼠是理想的模型。在人类调节T细胞20、27的实验耗竭下，仅由人体免疫系统重组的小鼠肝脏已受到HIV感染的影响。然而，小鼠和人类肝细胞的免疫和功能特性的差异可能突显出它们对HIV-1和免疫细胞的反应的差异。在本综述中，描述了一个方案，用于重建人体免疫系统和肝脏，并解决HIV-1相关的肝脏免疫病理学，如在HIV-1感染患者中观察到的。由于HSV-TK转基因的肝选择性高mRNA表达和GCV毒性对小鼠转基因肝脏的易感性21，选择TK-NOG雄性小鼠。此外，它们可以在移植后长期保持，不使用外源性药物，并且不会发展自发性全身性疾病28。为了建立人体免疫系统和肝脏重组，需要消融小鼠免疫系统和对小鼠特异性肝细胞的损害，并使用非骨髓剂量的三硫丹和GCV实现，如前文所示，TK-NOG雄性小鼠13 ， 23.小鼠在6-8周时注射GCV和三硫丹，因为ALT水平评估的转基因和GCV引起的肝损伤的表达是最佳的，因此，为提供利基移植的人体细胞21。通常选择显示 ALT 水平 >200 U/L，但 <600 U/L 的小鼠进行移植。显示 ALT 水平 >600 U/L 的小鼠面临更大的死亡风险，因为人类肝细胞无法挽救受损的小鼠肝功能。
目前，人类CD34+HSPC和胎儿肝细胞的移植具有双重人性化性;然而，操纵新生动物造成了技术问题13，14。HSPCs可以从多种来源（如胎儿肝细胞（FLCs）、胚胎干细胞（ESCs）和CB）中衍生或分离。然而，伦理问题限制了ESCs和FLCs的使用。 CB没有这种限制，是获得HSPC的最有用的替代方法，也是原始造血干细胞和祖细胞的宝贵来源，可以重组功能免疫系统。脐带血在用于分离HSPC时不应超过一天，因为HSPC的产量受年龄影响很大。在冷冻细胞之前，需要检查分离的HSPCs的纯度。避免CD3+T细胞的交叉污染，因为它可能导致系统性小鼠移植对宿主疾病和HEP的急性异位排斥，同时移植不匹配的细胞。
商业上可用的肝细胞被用作肝脏重建的来源8，13。成人肝细胞是建立肝脏重建的首选，因为他们在长期的移植和可持续性提高效率29。
小鼠模型中人体免疫系统的存在增加了ALB水平，如前30、31所示。然而，肝细胞和免疫系统重组的效率可能因供体细胞的不同来源而不同，并且取决于受体小鼠。因此，每只小鼠都需要评估移植物，最关键的部分是利用人体特异性且不与小鼠细胞交叉反应的抗体或试剂。此处介绍的研究中使用的人体特异性试剂和抗体详见材料表。如果研究使用了材料表中提供的抗体以外的抗体，请务必检查人体特异性。
最佳条件是联合细胞的移植;然而，这在技术上是很难实现的。在可能的情况下，HSPCs和肝细胞应从具有部分匹配的人类白细胞1类抗原（如HLA-A2）的捐赠者中汇集。
为了筛选小鼠进行HIV研究，在多个时间点绘制血液，以确定最佳的免疫和肝脏重组;流式细胞学和ELISA是首选，因为它们只需少量血液即可进行。同一样本的血细胞和血清分别可用于流式细胞测定和ELISA。重要的是在每个时间点（1，000 - 40，000 范围内）对血清进行适当的稀释，以评估ALB水平，以便将未知浓度在标准浓度范围内（试剂范围：6.25 - 400 纳克/mL）。
在人类免疫系统存在的情况下，在HIV-1感染时，抗炎细胞因子也可用于解决肝细胞和免疫细胞的相互作用。该模型可用于显示HIV-1诱发肝病的免疫机能，因为它以与人类相同的方式重述肝脏损伤，CD4：CD8的低比率、ALB水平下降、人肝细胞死亡和肝免疫都证明了这一点。激活。该模型也有一些限制，如细胞毒性T细胞活性水平低和免疫球蛋白类切换受损。由于人体免疫系统和肝脏的存在，本文提出的模型有望用于HIV-1和肝炎病毒的合并感染、慢性肝炎感染（以澄清抗肝炎免疫反应的机制）以及肝硬化模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院的拨款R24OD018546（给L.Y.P.和S.G.）的支持。作者要感谢李伟哲博士，在外科手术方面的帮助，阿曼达·科科·伍兹，B.S.，严成免疫性组学，UNMC流式细胞学研究设施成员菲利普·赫克斯利主任，博士，维多利亚B.史密斯，B.S.和萨曼莎沃尔，B.S.，UNMC高级显微镜核心设施成员Janice A. 泰勒，B.S.和詹姆斯R.塔斯卡拉斯，B.S.，技术支持。作者承认CIEA的Mamoru Ito博士和Hiroshi Suemizu博士提供TK-NOG小鼠，约阿希姆·鲍姆加特博士提供硫磺范。作者感谢UNMC的阿德里安·科斯特斯博士对手稿的编辑贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
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