ويصف هذا البروتوكول سير عمل مفصلة لتوليد والسابقين فيفو توصيف الفيروسات أونكوليتيك للتعبير عن إيمونومودولاتورس، باستخدام فيروسات الحصبة ترميز engagers خلية T بيسبيسيفيك كمثال. التطبيق والتكيف مع سائر المنابر ناقلات والمتسلسلات سيتم التعجيل بتنمية إيمونوفيروثيرابيوتيكس الرواية للترجمة السريرية.
العلاج المناعي السرطان الناجح لديه القدرة على تحقيق السيطرة الورم طويلة الأجل. وبالرغم من النجاحات السريرية الأخيرة، لا تزال هناك حاجة ملحة لعلاجات آمنة وفعالة مصممة خصيصا للورم الفردية محصنة ضد التشكيلات الجانبية. فيروسات أونكوليتيك تمكين التعريفي للاستجابات المناعية المضادة للورم وكذلك التعبير الجيني مقيدة بالورم. ويصف هذا البروتوكول تحليل متجهات أونكوليتيك إيمونومودولاتوري جيل والسابقين فيفو. التركيز على الفيروسات لقاح الحصبة ترميز engagers خلية تي بيسبيسيفيك على سبيل مثال، يمكن تكييفها المنهجية العامة لسائر أنواع الفيروسات والمتسلسلات. يتضمن سير العمل عرض تصميم والاستنساخ، والإنقاذ، ونشر الفيروسات المؤتلف. فحوصات لتحليل حركية النسخ المتماثل والنشاط الحال ناقل وكذلك الأداء الوظيفي ل immunomodulator معزولة السابقين فيفو مدرجة، وبالتالي تيسير توليد عوامل جديدة لمزيد من التطوير في نماذج الإكلينيكية وفي نهاية المطاف الترجمة السريرية.
ويجري وضع فيروسات أونكوليتيك (أوفس) كالعلاجات المضادة للسرطان على وجه التحديد إجراء نسخ متماثل داخل وتقتل الخلايا السرطانية بينما تترك الأنسجة صحية سليمة. أصبحت الآن شائعة فهم أن فيروثيرابي أونكوليتيك (عفت)، وفي معظم الحالات، لا تعتمد فقط على تحلل الورم كاملة قبل النسخ المتماثل كفاءة وانتشار الفيروس، ولكن يتطلب آليات إضافية للعمل من أجل نجاح العلاج، بما في ذلك استهداف الأوعية الدموية واللحمية، والأهم من ذلك التحفيز المناعي1،2،،من34. بينما يستخدم العديد من أوائل الدراسات OV فيروسات غير معدلة، البحوث الجارية لقد استفادت من بيولوجية تحسين التفاهم والمصارف البيولوجية الفيروسات التي يحتمل أن تحتوي على رواية أوفس، والإمكانات التي يوفرها الهندسة الوراثية من أجل إنشاء OV متقدمة منصات5،،من67.
ونظرا لنجاح الأخيرة من العلاج المناعي، المتسلسلات immunomodulatory تتسم بأهمية خاصة فيما يتعلق بالهندسة الوراثية من أوفس. التعبير المستهدفة من هذه المنتجات الجينات بالخلايا السرطانية المصابة OV يقلل من سمية مقارنة للإدارة العامة. استهداف تحقيق باستخدام الفيروسات مع أونكوسيليكتيفيتي الأصيل أو عن طريق تعديل انتحاء الفيروسية8. المحلية المرباة يعزز الآليات المضادة للورم متعدد الأوجه لعفت. وعلاوة على ذلك، هذه الاستراتيجية دور أساسي في استجواب التفاعل بين الفيروسات والخلايا السرطانية، والمضيف الجهاز المناعي. وتحقيقا لهذه الغاية، يوفر هذا البروتوكول سير قابل للتعديل والمعمول بها لتصميم واستنساخ، وإنقاذ، ونشر، والتحقق من صحة نواقل فيروس الباراميكسو (تحديداً فيروس الحصبة) أونكوليتيك ترميز هذه المتسلسلات.
تعديل الاستجابة المناعية يمكن أن يتحقق بتشكيلة واسعة من منتجات التحوير استهداف خطوات مختلفة للسرطان-الحصانة دورة9، بما في ذلك تعزيز الاعتراف مستضد ورم [مثل المستضدات المرتبطة بورم (TAAs) أو مستحثات من الرئيسية histocompatibility المعقد (MHC) الفئة الأولى جزيئات] عبر دعم نضوج الخلايا الجذعية لكفاءة مستضد العرض التقديمي (السيتوكينات)؛ تجنيد وتفعيل الخلايا المناعية المرغوبة مثل السامة للخلايا والخلايا مساعد تي [المستقطبات، بيسبيسيفيك خلية T engagers (بتس)]؛ استهداف الخلايا القمعية مثل التنظيمية تي الخلايا والخلايا المستمدة من النقوي القامع والضامة المرتبطة بورم والمرتبطة بسرطان الخلايا الليفية (الأجسام المضادة، بتيس، السيتوكينات)؛ ومنع تثبيط الخلية المستجيب واستنفاد (مثبطات حاجز). وبالتالي، يتوفر عدد كبير عوامل البيولوجية. تقييم مثل هذه إيمونومودولاتورس المرمزة بالفيروس فيما يتعلق بالفعالية العلاجية وأوجه التآزر المحتملة، فضلا عن فهم آليات كل منها ضروري لتحسين علاج السرطان.
المعني السلبي واحد-الذين تقطعت بهم السبل فيروسات الحمض النووي الريبي الأسرة Paramyxoviridae تتسم بميزات عديدة تفضي إلى استخدامها كمتجهات أونكوليتيك. وتشمل هذه أونكوتروبيسم الطبيعية، سعة كبيرة الجينوم المتسلسلات (أكثر من 5 كيلو بايت)10،11، كفاءة الانتشار بما في ذلك تشكيل سينسيتيا، والاستمناع ارتفاع12. ولذلك، OV منصات استناداً إلى سل الكلاب الفيروس13والنكاف فيروس14و فيروس مرض نيوكاسل15،16،الفيروس سينداي17، الفيروس القردي 518وطوبيا فيروس الباراميكسو19 وقد وضعت. أبرزها، يعيش لقاح الحصبة الموهنة سلالات (MV) قد حققت تقدما في التنمية السريرية والسريرية20،21. وقد استخدمت سلالات الفيروسات هذه لعقود من أجل التحصين الروتينية مع سجل سلامة ممتاز22. وعلاوة على ذلك، ليس هناك أي خطر للطفرات insertional بسبب النسخ المتماثل سيتوسوليك تماما من باراميكسوفيروسيس. نظام الوراثة عكس تنوعاً يستند كدنا المضادة الجينوم الذي يسمح بإدراج المتسلسلات في وحدات النسخ الإضافية (عطاس) هو متاح11،،من2324. يجري حاليا تقييم ناقلات MV ترميز يوديد الصوديوم سيمبورتير (MV-شيكل) للتصوير والعلاج بالأشعة أو القابلة للذوبان carcinoembryonic antigen (MV-سيا) كعلامة بديلة للتعبير الجيني الفيروسي في التجارب السريرية (NCT02962167، NCT02068794، NCT02192775، NCT01846091، NCT02364713، NCT00450814، NCT02700230، NCT03456908، NCT00408590، و NCT00408590). وأكدت الإدارة الآمنة وقد أبلغ عن حالات من الفعالية المضادة للورم في السابق دراسات25،،من2627،،من2829، 30 (استعرضها مساويل et al.31)، مما يمهد الطريق لفيروسات الحصبة أونكوليتيك الإضافية التي تم تطويرها واختبارها بريكلينيكالي. MV ترميز immunomodulatory الجزيئات التي تستهدف مختلف خطوات دورة الحصانة السرطان قد ثبت أن تأخير نمو الورم و/أو إطالة البقاء على قيد الحياة في الفئران، مع وجود أدلة على فعالية جهاز المناعة بوساطة والذاكرة المناعية الواقية على المدى الطويل في سينجينيك نماذج الماوس. ترميز ناقلات المتسلسلات تشمل مستعمرة بلعم المحببات حفز عامل (GM-CSF)32،33، H. pylori العَدلات-تفعيل البروتين34، نقطة تفتيش محصنة ضد مثبطات35، انترلوكين-12 (إيل-12)36، TAAs37، وبتس38، الذي تشابك ورم السطحي antigen مع CD3 وهكذا حمل المضادة للورم النشاط بخلايا T [بولكلونل]، بغض النظر عن خلايا تي مستقبلات خصوصية وتحفيز المشاركين ( الشكل 1). الحصول على النتائج السريرية واعدة لهذه الثوابت كذلك جهود متعدية الطلب.
تاليموجيني لاهيرباريبفيك (تي-مركزنا)، نوع أنا فيروس الحلأ البسيط ترميز GM-CSF، هو فقط أونكوليتيك العلاجية وافقت عليها “الولايات المتحدة للأغذية” والدواء (FDA) ووكالة الأدوية الأوروبية (EMA). لم تظهر الدراسة ثالثا المرحلة الرائدة للموافقات في أواخر عام 2015 فقط نجاعة في موقع الحقن داخل الأورام، ولكن أيضا آثار بعاديا (أي، إسقاطها من غير حقن الآفات) في سرطان الجلد المتقدم39. T-مركزنا دخلت منذ محاكمات إضافية للتطبيق في الكيانات الورم الأخرى (مثل سرطان الجلد غير الميلانوما، ، NCT03458117؛ وسرطان البنكرياس، NCT03086642) وتقييم مجموعة من طرق العلاج، لا سيما مع نقطة تفتيش محصنة مثبطات (NCT02978625، NCT03256344، NCT02509507، NCT02263508، NCT02965716، NCT02626000، NCT03069378، NCT01740297، وريباس هt al.40).
وهذا يدل على إمكانية العلاج المناعي أونكوليتيك ليس فقط، بل أيضا الحاجة إلى إجراء مزيد من البحوث لتحديد تركيبات متفوقة عفت والمرباة. التصميم العقلاني ناقلات إضافية وتنميتها للاختبار السريري هو المفتاح لهذا التعهد. وهذا سوف تقدم أيضا فهم الآليات الكامنة وقد آثار بالنسبة للتقدم نحو أكثر تخصيصاً لعلاج السرطان. وتحقيقا لهذه الغاية، يعرض هذا المنشور منهجية لتعديل وتطوير باراميكسوفيروسيس للعلاج المناعي السرطان المستهدفة، وعلى وجه التحديد، فيروسات الحصبة أونكوليتيك ترميز الخلية تي–إشراك أجسام مضادة (الشكل 2).
أونكوليتيك المناعي (أي.، عفت في تركيبة مع المرباة) يحمل وعدا كبيرا لعلاج السرطان، مطالبين بمواصلة التنمية والتحسين من الفيروسات أونكوليتيك ترميز البروتينات إيمونومودولاتوري. ويصف هذا البروتوكول أساليب إنشاء والتحقق من صحة هذه الناقلات للتجارب اللاحقة في النماذج ذات الصلة الإكليني…
The authors have nothing to disclose.
وأنشئت هذه الأساليب في المجموعة فيروثيرابي يرأسه الأستاذ الدكتور الدكتور غي أونجيريتشتس في المركز الوطني “الأمراض السرطانية” في هايدلبرغ. ونحن مدينون له ولجميع أعضاء فريق المختبر، لا سيما الدكتور توبياس ذرة والدكتور Rūta فينالدي، جوديث فورستر، وغراسي البرقي وألبرت جيسيكا. وأيد هذا العمل قبل آخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ (منحة 2015_A78 أن إنجلاند م) و “المؤسسة الوطنية للعلوم الألمانية” (DFG، منح إنجلاند م EN 1119/2-1). هيدبويتشيل J.P.W. يتلقى راتبا من مدرسة الدراسات العليا الدولية هلمهولتز “بحوث السرطان”.
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit | Roche Life Science, Mannheim, Germany | 4898117001 | |
CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A9539-500G | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 28704 | |
NEB 10-beta Competent E. coli | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | C3019I | |
LB medium after Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X964.1 | |
Ampicillin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HP62.1 | |
QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 27104 | |
Restriction enzyme HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | R3104S | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 31966-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera, Boussens, France | FB-1280/500 | |
FugeneHD | Promega, Mannheim, Germany | E2311 | may be replaced by transfection reagent of choice |
Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | K0129 | |
Vero cells | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | |
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | available upon request | |
Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Germany | ACC 342 | |
Opti-MEM (serum-free medium) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 31985070 | |
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Germany | PK-CA20-300-1000 | includes XTT reagent |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 14190-094 | |
QIAquick Ni-NTA Spin Columns | QIAGEN, Hilden, Germany | 31014 | |
Sodium chloride | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.3 | |
Imidazole | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | I5513-25G | |
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck, Darmstadt, Germany | UFC901024 | |
BCA Protein Assay Kit | Merck Milipore | 71285-3 | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I4506 | |
Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-257 | RRID: AB_871939 |
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 555749 | RRID: AB_396091 |
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 12158167001 | RRID: AB_390915 |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-090-485 | |
MS Columns | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
RIPA buffer | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA | MB-030-0050 | |
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega, Mannheim, Germany | G1780 | includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution |
Cell lifter | Corning, Reynosa, Mexico | 3008 | |
10 cm dishes | Corning, Oneonta, NY, USA | 430167 | |
15 cm dishes | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 639160 | |
96-well plates, U-bottom | TPP, Trasadingen, Switzerland | 92097 | |
96-well plates, flat bottom | Neolab, Heidelberg, Germany | 353072 | |
6-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353046 | |
12-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353043 | |
50 mL tubes | nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany | 02-572-3001 | |
T175 cell culture flasks | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
0.22 µm filters | Merck, Darmstadt, Germany | SLGPM33RS |