इस प्रोटोकॉल immunomodulators की अभिव्यक्ति के लिए जनरेशन और oncolytic वायरस के पूर्व vivo लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत कार्यप्रवाह का वर्णन, खसरा वायरस एंकोडिंग bispecific टी सेल engagers एक उदाहरण के रूप में का उपयोग कर । अन्य वेक्टर प्लेटफार्मों और transgenes के लिए आवेदन और अनुकूलन नैदानिक अनुवाद के लिए उपंयास immunovirotherapeutics के विकास में तेजी लाने के लिए होगा ।
सफल कैंसर immunotherapy के लिए दीर्घकालिक ट्यूमर नियंत्रण प्राप्त करने की क्षमता है । हाल ही में नैदानिक सफलताओं के बावजूद, वहां सुरक्षित और प्रभावी व्यक्तिगत ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रोफाइल के अनुरूप चिकित्सा के लिए एक तत्काल जरूरत बनी हुई है । Oncolytic वायरस विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ ही ट्यूमर प्रतिबंधित जीन अभिव्यक्ति की प्रेरण सक्षम । इस प्रोटोकॉल पीढ़ी और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी oncolytic वैक्टर के पूर्व vivo विश्लेषण का वर्णन है । खसरा वैक्सीन वायरस एंकोडिंग bispecific टी सेल engagers पर ध्यान केंद्रित एक उदाहरण के रूप में, सामांय पद्धति अंय वायरस प्रजातियों और transgenes के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । प्रस्तुत कार्यप्रवाह डिजाइन, क्लोनिंग, बचाव, और रिकॉमबिनेंट वायरस के प्रसार में शामिल हैं । परख की प्रतिकृति कैनेटीक्स और lytic गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए वेक्टर के रूप में अच्छी तरह के रूप में अलग immunomodulator पूर्व vivo की कार्यक्षमता शामिल हैं, इस प्रकार और अधिक विकास के लिए नैदानिक मॉडल में उपंयास एजेंटों की पीढ़ी की सुविधा अंततः नैदानिक अनुवाद ।
Oncolytic वायरस (OVs) विरोधी कैंसर चिकित्सकीय के रूप में विकसित किया जा रहा है कि विशेष रूप से भीतर की नकल और स्वस्थ ऊतकों को छोड़ जबकि ट्यूमर कोशिकाओं को मार डालो । यह अब आम समझ है कि oncolytic virotherapy (OVT), ज्यादातर मामलों में, कुशल प्रतिकृति और वायरस के प्रसार के द्वारा पूरा ट्यूमर lysis पर पूरी तरह भरोसा नहीं है, लेकिन उपचार की सफलता के लिए कार्रवाई के अतिरिक्त तंत्र की आवश्यकता है, सहित संवहनी और stromal लक्ष्यीकरण और, महत्वपूर्ण बात, प्रतिरक्षा उत्तेजना1,2,3,4। जबकि कई जल्दी OV अध्ययन unmodified वायरस का इस्तेमाल किया, वर्तमान अनुसंधान एक बेहतर जैविक समझ से लाभ हुआ है, वायरस जैव कि संभावित उपंयास OVs होते हैं, और आनुवंशिक इंजीनियरिंग द्वारा की पेशकश की संभावनाओं को उंनत OV बनाने के लिए 5,6,7प्लेटफार्मों ।
immunotherapy की हालिया सफलता को देखते हुए, इम्यूनोमॉड्यूलेटरी transgenes OVs की जेनेटिक इंजीनियरिंग के संबंध में विशेष रुचि के हैं। OV-संक्रमित ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा ऐसे जीन उत्पादों की लक्षित अभिव्यक्ति प्रणालीगत प्रशासन की तुलना में विषाक्तता को कम कर देता है । लक्ष्यीकरण या तो अंतर्निहित oncoselectivity के साथ वायरस का उपयोग करके या वायरल tropism8को संशोधित करके हासिल की है । स्थानीय चुहियों OVT के बहुआयामी विरोधी ट्यूमर तंत्र को बढ़ाता है । इसके अलावा, इस रणनीति वायरस, ट्यूमर कोशिकाओं, और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच एक साथ खेलना पूछताछ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । इस अंत करने के लिए, इस प्रोटोकॉल एक लागू और समायोज्य कार्यप्रवाह डिजाइन प्रदान करता है, क्लोन, बचाव, प्रचार, और oncolytic paramyxovirus (विशेष रूप से खसरा वायरस) ऐसे transgenes एंकोडिंग वैक्टर मांय ।
प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मॉडुलन transgene कैंसर के विभिंन चरणों को लक्षित उत्पादों की एक विस्तृत विविधता से प्राप्त किया जा सकता है-प्रतिरक्षा चक्र9, बढ़ाने ट्यूमर प्रतिजन मांयता सहित [जैसे, ट्यूमर से जुड़े एंटीजन (ताळा) या के उत्प्रेरण प्रमुख histocompatibility जटिल (MHC) वर्ग मैं अणु] कुशल प्रतिजन प्रस्तुति (साइटोकिंस) के लिए वृक्ष सेल परिपक्वता पर समर्थन; भर्ती और साइटोटोक्सिक और हेल्पर टी कोशिकाओं जैसे वांछित प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय [chemokines, bispecific टी सेल engagers (BTEs)]; इस तरह के नियामक टी कोशिकाओं, माइलॉयड-व्युत्पंन दमन कोशिकाओं, ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज, और कैंसर से जुड़े fibroblasts (एंटीबॉडी, BTEs, साइटोकिंस) के रूप में दमन कोशिकाओं लक्ष्यीकरण; और प्रभाव सेल अवरोध और थकावट (चौकी अवरोधकों) को रोकने. इस प्रकार, जैविक एजेंटों की एक बहुतायत उपलब्ध है । ऐसे वायरस के मूल्यांकन-इनकोडिंग immunomodulators चिकित्सीय प्रभावकारिता और संभव तालमेल के बारे में के रूप में अच्छी तरह से संबंधित तंत्र की समझ के बारे में कैंसर थेरेपी में सुधार करने के लिए आवश्यक है ।
नकारात्मक भावना Paramyxoviridae परिवार के एकल असहाय आरएनए वायरस oncolytic वैक्टर के रूप में उनके उपयोग के लिए अनुकूल कई सुविधाओं की विशेषता है । ये एक प्राकृतिक oncotropism, transgenes के लिए बड़ी जीनोमिक क्षमता (5 kb से अधिक)10,11, syncytia गठन सहित कुशल प्रसार, और उच्च immunogenicity12शामिल हैं । इसलिए, OV प्लेटफार्मों पर आधारित कुत्ते temper वायरस13, कण्ठमाला वायरस14, न्यूकैसल रोग वायरस15, सेंडाइ वायरस16,17, simian वायरस 518, और Tupaia paramyxovirus19 विकसित किए गए हैं । सबसे प्रमुखता से, लाइव तनु खसरा वायरस वैक्सीन उपभेदों (एमवी) नैदानिक और नैदानिक विकास में प्रगति की है20,21। इन वायरस उपभेदों एक उत्कृष्ट सुरक्षा रिकॉर्ड22के साथ नियमित प्रतिरक्षण के लिए दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसके अलावा, paramyxoviruses की कड़ाई से cytosolic प्रतिकृति के कारण mutagenesis के लिए कोई जोखिम नहीं है । एक बहुमुखी रिवर्स आनुवंशिकी विरोधी जीनोमिक सीडीएनए जो अतिरिक्त प्रतिलेखन इकाइयों (ATUs) में transgenes के सम्मिलन के लिए अनुमति देता है पर आधारित प्रणाली11,23,24उपलब्ध है । MV वेक्टर्स एंकोडिंग सोडियम-आयोडाइड symporter (एमवी-एनआईएस) इमेजिंग और रेडियोथेरेपी या घुलनशील carcinoembryonic प्रतिजन के लिए (एमवी-सीईए) वायरल जीन अभिव्यक्ति के लिए एक किराए मार्कर के रूप में वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों में मूल्यांकन किया जा रहा है (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590, और NCT00408590) । सुरक्षित प्रशासन की पुष्टि की गई है और विरोधी के मामलों ट्यूमर प्रभावकारिता पिछले अध्ययन में सूचित किया गया है25,26,27,28,29, 30 (Msaouel ईटी al.31द्वारा समीक्षित), अतिरिक्त oncolytic खसरा वायरस है कि विकसित किया गया है और नैदानिक परीक्षण के लिए जिस तरह फ़र्श । एमवी एंकोडिंग इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कैंसर के विविध चरणों को लक्षित अणुओं-उन्मुक्ति चक्र को ट्यूमर के विकास में देरी और/या चूहों में अस्तित्व को लम्बा, प्रतिरक्षा की मध्यस्थता प्रभावकारिता और syngeneic में दीर्घकालिक सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा स्मृति के लिए सबूत के साथ दिखाया गया है माउस मॉडल । वेक्टर-एनकोडेड transgenes में शामिल है granulocyte-मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ)३२,३३, H. हेलिकोबेक्टर न्युट्रोफिल-सक्रिय प्रोटीन३४, प्रतिरक्षा चौकी अवरोधकों३५, interleukin-12 (IL-12)३६, ताळा३७, और BTEs३८, जो पार-CD3 के साथ एक ट्यूमर सतह प्रतिजन लिंक और इस तरह polyclonal टी कोशिकाओं द्वारा विरोधी ट्यूमर गतिविधि पैदा, टी सेल रिसेप्टर विशिष्टता और सह उत्तेजना के बावजूद ( चित्रा 1) । इन निर्माणों के लिए प्राप्त होनहार नैदानिक परिणाम आगे शोधों के प्रयासों की मांग करते हैं ।
Talimogene laherparepvec (T-VEC), एक प्रकार की मैं दाद सिंप्लेक्स वायरस एंकोडिंग जीएम-सीएसएफ, केवल oncolytic संयुक्त राज्य अमेरिका खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) और यूरोपीय दवाओं एजेंसी (EMA) द्वारा अनुमोदित चिकित्सीय है । देर से २०१५ में अनुमोदन के लिए अग्रणी चरण III अध्ययन अंतर ट्यूमर इंजेक्शन के स्थल पर ही नहीं दिखाया गया है, लेकिन यह भी abscopal प्रभाव (यानी, गैर इंजेक्शन घावों की छूट) उन्नत मेलेनोमा३९में. T-VEC के बाद से अंय ट्यूमर संस्थाओं में आवेदन के लिए अतिरिक्त परीक्षण में प्रवेश किया है (जैसे, गैर मेलेनोमा त्वचा कैंसर, NCT03458117; अग्नाशय के कैंसर, NCT03086642) और संयोजन चिकित्सा के मूल्यांकन के लिए, विशेष रूप से प्रतिरक्षा चौकी के साथ अवरोधकों (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297, और Ribas ईटी al.४०) ।
यह न केवल oncolytic immunotherapy की क्षमता को दर्शाता है, लेकिन यह भी आगे अनुसंधान के लिए की जरूरत है OVT और चुहियों के बेहतर संयोजन की पहचान । अतिरिक्त वैक्टर और नैदानिक परीक्षण के लिए उनके विकास के तर्कसंगत डिजाइन इस उपक्रम के लिए महत्वपूर्ण है । यह भी अंतर्निहित तंत्र की समझ अग्रिम जाएगा और अधिक व्यक्तिगत कैंसर के इलाज की दिशा में प्रगति के लिए निहितार्थ है । इस अंत करने के लिए, इस प्रकाशन के संशोधन और लक्षित कैंसर immunotherapy के लिए paramyxoviruses के विकास के लिए पद्धति प्रस्तुत करता है और, और अधिक विशेष रूप से, oncolytic खसरा वायरस टी सेल-आकर्षक एंटीबॉडी (चित्रा 2) एंकोडिंग के ।
Oncolytic immunotherapy (यानी, चुहियों के साथ संयोजन में OVT) कैंसर के इलाज के लिए महान वादा रखती है, और विकास और Oncolytic इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रोटीन एंकोडिंग वायरस के अनुकूलन की मांग की । इस प्रोटोकॉल तरीकों का वर्णन करन?…
The authors have nothing to disclose.
इन तरीकों Virotherapy समूह में प्रो डॉ डॉ गाइ Ungerechts हीडलबर्ग में ट्यूमर रोगों के लिए राष्ट्रीय केंद्र में स्थापित किया गया था । हम उनके ऋणी हैं और प्रयोगशाला दल के सभी सदस्य, विशेष रूप से डॉ॰ टोबीस धब्बा, डॉ॰ Rūta Veinalde, जूडिथ Förster, Birgit Hoyler, और जेसिका अल्बर्ट । इस काम को और Kröner-Fresenius-Stiftung (ग्रांट 2015_A78 टू C.E. Engeland) और जर्मन नेशनल साइंस फाउंडेशन (DFG, ग्रांट एन 1119/2-1 को C.E. Engeland) ने सपोर्ट किया था । J.P.W. Heidbuechel कैंसर अनुसंधान के लिए Helmholtz इंटरनेशनल ग्रेजुएट स्कूल द्वारा एक वजीफा प्राप्त करता है ।
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit | Roche Life Science, Mannheim, Germany | 4898117001 | |
CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A9539-500G | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 28704 | |
NEB 10-beta Competent E. coli | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | C3019I | |
LB medium after Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X964.1 | |
Ampicillin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HP62.1 | |
QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 27104 | |
Restriction enzyme HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | R3104S | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 31966-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera, Boussens, France | FB-1280/500 | |
FugeneHD | Promega, Mannheim, Germany | E2311 | may be replaced by transfection reagent of choice |
Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | K0129 | |
Vero cells | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | |
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | available upon request | |
Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Germany | ACC 342 | |
Opti-MEM (serum-free medium) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 31985070 | |
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Germany | PK-CA20-300-1000 | includes XTT reagent |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 14190-094 | |
QIAquick Ni-NTA Spin Columns | QIAGEN, Hilden, Germany | 31014 | |
Sodium chloride | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.3 | |
Imidazole | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | I5513-25G | |
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck, Darmstadt, Germany | UFC901024 | |
BCA Protein Assay Kit | Merck Milipore | 71285-3 | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I4506 | |
Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-257 | RRID: AB_871939 |
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 555749 | RRID: AB_396091 |
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 12158167001 | RRID: AB_390915 |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-090-485 | |
MS Columns | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
RIPA buffer | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA | MB-030-0050 | |
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega, Mannheim, Germany | G1780 | includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution |
Cell lifter | Corning, Reynosa, Mexico | 3008 | |
10 cm dishes | Corning, Oneonta, NY, USA | 430167 | |
15 cm dishes | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 639160 | |
96-well plates, U-bottom | TPP, Trasadingen, Switzerland | 92097 | |
96-well plates, flat bottom | Neolab, Heidelberg, Germany | 353072 | |
6-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353046 | |
12-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353043 | |
50 mL tubes | nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany | 02-572-3001 | |
T175 cell culture flasks | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
0.22 µm filters | Merck, Darmstadt, Germany | SLGPM33RS |