Этот протокол описывает подробный рабочий процесс для поколения и ex vivo характеристика онколитического вирусов для выражения иммуномодуляторов, используя вирусы Кори кодирования bispecific Т-клеток Ингейджер качестве примера. Применение и адаптация для других платформ вектор и трансгенов будет ускорить разработку Роман immunovirotherapeutics для клинических перевода.
Успешное Рак иммунотерапия имеет потенциал для достижения долгосрочного управления опухоли. Несмотря на недавние успехи клинической сохраняется настоятельная необходимость для безопасного и эффективного лечения, с учетом индивидуального тумора иммунной профилей. Онколитического вирусов позволяют индукции противоопухолевого иммунного ответа, а также экспрессии генов, опухоль ограничена. Этот протокол описывает поколения и ex vivo анализ иммуномодулирующих онколитического векторов. Сосредоточение внимания на вирусы вакцины кори кодирования bispecific Т-клеток Ингейджер качестве примера, Общая методология может быть адаптирована для других видов вирусов и трансгенов. Представлен рабочий процесс включает в себя дизайн, клонирование, спасения и распространение рекомбинантных вирусов. Анализы для анализа кинетики репликации и литические деятельность вектора, а также функциональных возможностей изолированных иммуномодулятора ex vivo включены, способствуя тем самым поколения Роман агентов для дальнейшего развития в доклинических моделях и в конечном счете Клинические перевод.
Онколитического вирусы (ОВС) разрабатываются как против рака терапии, что конкретно реплицировать в пределах и убить опухолевые клетки, оставляя нетронутыми здоровые ткани. Это сейчас стало общее понимание что онколитического Виротерапии (ОВТ), в большинстве случаев, не полагаться исключительно на распад опухоли полной эффективности репликации и распространение вируса, но требует дополнительных механизмов действий, для успеха лечения, включая сосудистой и стромальных ориентации и, главное, стимуляции иммунной1,2,3,4. Хотя многие ранние исследования ов используется неизмененное вирусов, текущие исследования выгоду от улучшения биологических, понимание, вирус биобанках, что потенциально содержат Роман OVs и возможности, предоставляемые генной инженерии для создания передовых OV платформы5,6,7.
Учитывая недавний успех иммунотерапия, иммуномодулирующих трансгенов представляют особый интерес о генной инженерии OVs. Целевые выражение такого гена продукции OV-инфицированных опухолевых клеток снижает токсичность, по сравнению с системного администрирования. Таргетинг достигается с помощью вирусов с присущие oncoselectivity или изменяя вирусный тропизм8. Местные иммуномодуляция повышает многогранный механизмы противоопухолевого ОВТ. Кроме того эта стратегия играет важную роль в опрашивания взаимодействие между вирусов, опухолевых клеток и иммунной системе хоста. С этой целью этот протокол обеспечивает применимым и регулируемый рабочий процесс проектирования, клонировать, спасение, распространять и проверить онколитического парамиксовирус (специально вирус кори) векторы кодирования такие трансгенов.
Модуляции иммунного ответа может быть достигнуто путем широкий спектр продукции трансген, ориентация различные этапы рака иммунитет цикла9, включая укрепление опухолевые антигены [например, опухольассоциированных антигенов (ТААС) или индукторов из комплекс гистосовместимости (MHC) сорта молекул] над поддержкой дендритные клетки созревания для презентации эффективного антигена (цитокинов); Рекрутинг и такие как активация желаемого иммунные клетки цитотоксическим и вспомогательные Т-клеток [chemokines, bispecific Ингейджер Т-клеток (BTEs)]; ориентация подавляющие клетки, такие как регулирования T-клетки, клетки миелоидного производные супрессор, связанный тумором макрофагов и связанных рака фибробластов (антител, BTEs, цитокинов); и предотвращение эффекторных клеток торможение и истощения (ингибиторы контрольно-пропускного пункта). Таким образом имеется множество биологических агентов. Оценка таких вирусов кодировке иммуномодуляторов о терапевтической эффективности и возможного синергизма, а также понимания соответствующих механизмов необходимо усовершенствовать терапии рака.
Негативном смысле одноцепочечной РНК-вирусов Paramyxoviridae семьи были характерны несколько функций способствуют их использования как онколитического векторов. К ним относятся природные oncotropism, большой геномной емкости для трансгенов (более 5 КБ)10,11, эффективного распространения, включая syncytia формирования и высокую иммуногенность12. Таким образом OV платформы, основанные на плотоядных вирус13, паротита вирус14, вирус болезни Ньюкасла15, Сэндай вирус16,17, обезьяний вирус 518и Tupaia парамиксовирус19 были разработаны. Наиболее заметно живой аттенуированной вакцины от кори вирус вакцины штаммов (MV) продвинулись в доклинической и клинической разработки20,21. Эти штаммы вируса были использованы на протяжении десятилетий для плановой иммунизации с отличным безопасности записи22. Кроме того нет никакого риска для инсерционному мутагенезу благодаря строго цитозольной репликации парамиксовирусы. Универсальный обратной генетики система, основанная на анти геномной cDNA, который позволяет для вставки трансгенов в дополнительных транскрипции единиц (АТУС) является наличие11,23,24. MV векторов кодирования Симпорт йодистого натрия (MV-ННГ) для изображений и радиотерапии или растворимые раковоэмбрионального антиген (MV-Сеа) как суррогат маркера для экспрессии вирусных генов в настоящее время оцениваются в клинических исследованиях (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 и NCT00408590). Безопасное управление было подтверждено и эффективности противоопухолевой были случаи в предыдущих исследованиях25,26,27,28,29, 30 (обзор Msaouel et др.31), проложив путь для дополнительных онколитического Кори вирусов, которые были разработаны и испытаны preclinically. MV, кодирование иммуномодулирующих, молекулы, ориентация разнообразные шаги цикла рака иммунитет показали задержки роста опухоли и/или продлить выживание в мышей, с доказательствами для иммунной системы эффективности и долгосрочной защитной иммунной памяти в сингенных модели мыши. Вектор кодировке трансгенов включают гранулоцитарно макрофагальный колонии стимулирующий фактор (ГМ-КСФ)32,33, активация нейтрофилов белка пилорусов 34, ингибиторы иммунной контрольно-пропускного пункта35, Интерлейкин-12 (IL-12)36, ТААС37и BTEs38, которые перекрестные ссылки опухоль поверхностного антигена с CD3 и таким образом побудить противоопухолевую активность поликлональных Т-клеток, независимо от того, Т-клеток рецепторов специфичность и Сопредседатель стимуляции ( Рисунок 1). Перспективных доклинические результаты, полученные для этих конструкций спроса дальнейшие поступательные усилия.
Talimogene laherparepvec (Т-VEC), типа я кодирования ГМ-КСФ, вирус простого герпеса является единственным онколитического терапевтический одобрен США продовольствия и медикаментов (FDA) и Европейское агентство лекарственных средств (EMA). Не исследование III фазы, ведущих к утверждения в конце 2015 года только показал эффективность на сайте интра опухолевой инъекции, но и абскопальные эффекты (то есть, ремиссии не вводили поражений) в передовые меланомы39. T-VEC вступил дополнительные испытания для применения в других опухолевых образований (например,, не Меланома кожи рак, NCT03458117; рак поджелудочной железы, NCT03086642) и для оценки комбинированной терапии, особенно с иммунной контрольно-пропускной пункт ингибиторы (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 и Рибас et др.40).
Это демонстрирует не только потенциал иммунотерапия онколитического, но и необходимость дальнейших научных исследований для выявления Улучшенный комбинации ОВТ и имуннокорекция. Рациональная конструкция дополнительных векторов и их развития для доклинических испытаний является ключом к этой деятельности. Это будет также способствовать понимание основных механизмов и имеет последствия для перехода к более персонализированные лечения рака. С этой целью эта публикация представляет методологию для модификации и развития Парамиксовирусы для целевых Рак иммунотерапия и, более конкретно, вирусы Кори онколитического, кодирование Т клеток привлечение антител (рис. 2).
Иммунотерапия онколитического (т.е.., ОВТ в сочетании с иммуномодуляция) имеет большие перспективы для лечения рака, требуют дальнейшего развития и оптимизации онколитического вирусов кодирования иммуномодулирующих белков. Этот протокол описывает методы для создания и проверки ?…
The authors have nothing to disclose.
Эти методы были установлены в группе Виротерапии, возглавляемая Проф д-р д-р Ги Ungerechts в национальном центре опухолевых болезней в Гейдельберге. Мы признательны ему и всем членам группы лаборатории, особенно спек Тобиас доктор, доктор Rūta Veinalde, Джудит Förster, Биргит Hoyler и Джессика Альберт. Эта работа была поддержана, остальное Kröner-Fresenius-Stiftung (Грант 2015_A78 до н.э. Engeland) и немецкий Национальный научный фонд (DFG, Грант EN 1119/2-1 до н.э. Engeland). J.P.W. Heidbuechel получает стипендию, Гельмгольца Международная высшая школа для исследований рака.
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit | Roche Life Science, Mannheim, Germany | 4898117001 | |
CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A9539-500G | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 28704 | |
NEB 10-beta Competent E. coli | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | C3019I | |
LB medium after Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X964.1 | |
Ampicillin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HP62.1 | |
QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 27104 | |
Restriction enzyme HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | R3104S | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 31966-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera, Boussens, France | FB-1280/500 | |
FugeneHD | Promega, Mannheim, Germany | E2311 | may be replaced by transfection reagent of choice |
Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | K0129 | |
Vero cells | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | |
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | available upon request | |
Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Germany | ACC 342 | |
Opti-MEM (serum-free medium) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 31985070 | |
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Germany | PK-CA20-300-1000 | includes XTT reagent |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 14190-094 | |
QIAquick Ni-NTA Spin Columns | QIAGEN, Hilden, Germany | 31014 | |
Sodium chloride | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.3 | |
Imidazole | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | I5513-25G | |
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck, Darmstadt, Germany | UFC901024 | |
BCA Protein Assay Kit | Merck Milipore | 71285-3 | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I4506 | |
Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-257 | RRID: AB_871939 |
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 555749 | RRID: AB_396091 |
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 12158167001 | RRID: AB_390915 |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-090-485 | |
MS Columns | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
RIPA buffer | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA | MB-030-0050 | |
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega, Mannheim, Germany | G1780 | includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution |
Cell lifter | Corning, Reynosa, Mexico | 3008 | |
10 cm dishes | Corning, Oneonta, NY, USA | 430167 | |
15 cm dishes | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 639160 | |
96-well plates, U-bottom | TPP, Trasadingen, Switzerland | 92097 | |
96-well plates, flat bottom | Neolab, Heidelberg, Germany | 353072 | |
6-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353046 | |
12-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353043 | |
50 mL tubes | nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany | 02-572-3001 | |
T175 cell culture flasks | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
0.22 µm filters | Merck, Darmstadt, Germany | SLGPM33RS |