Summary
Questo protocollo viene illustrato come purificare i microRNA extracellulari da terreni di coltura cellulare per piccoli RNA libreria costruzione e sequenziamento di nuova generazione. Vari punti di controllo di controllo di qualità sono descritti per permettere ai lettori di capire cosa aspettarsi quando si lavora con campioni di ingresso bassi come exRNAs.
Abstract
Extracellulare e circolanti RNAs (exRNA) sono prodotti da molti tipi di cellule del corpo ed esiste in numerosi liquidi corporei come saliva, plasma, siero, latte e urine. Un sottoinsieme di questi RNA sono i regolatori di posttranscriptional – i microRNA (Mirna). Per delineare i miRNA provocati da tipi cellulari specifici, sistemi di coltura in vitro possono essere utilizzati per la raccolta e il profilo exRNAs derivato da un sottoinsieme delle cellule. I fattori secreti di cellule staminali mesenchimali sono implicati nell'alleviazione numerose malattie e viene utilizzato come sistema modello in vitro qui. Questo articolo descrive il processo di raccolta, purificazione di piccolo RNA e generazione della libreria di sequenza extracellulare Mirna. ExRNAs da cultura media differiscono da RNA cellulare essendo Bassi campioni di RNA inpui, che chiama per procedure ottimizzate. Questo protocollo fornisce una guida completa al sequenziamento di piccolo exRNA da terreni di coltura, mostrando i punti di controllo di controllo di qualità ad ogni passo durante il sequenziamento e la purificazione di exRNA.
Introduction
Extracellulari e circolanti RNAs (exRNAs) sono presenti in vari liquidi corporei e sono resistenti verso RNasi1,2. Loro elevata abbondanza, la stabilità e la facilità di accessibilità sono attraenti per la valutazione clinica come marcatori diagnostici e prognostici3. La modalità di trasporto per exRNAs includere vescicole extracellulari (EVs), associazione con le lipoproteine (ad esempio di lipoproteina ad alta densità; HDL) e della ribonucleoproteina complessi (come con i complessi Argonaute2)4.
Un sottoinsieme di exRNAs sono i microRNA (Mirna), che sono piccoli RNA non codificanti di circa 22 nt che regolano l'espressione genica post-trascrizionale. Ex-miRNA sono stati implicati nella comunicazione cellula-cellula e regolazione di cella omeostasi5. Per esempio, HDL spedisce ex-miR-223 alle cellule endoteliali per reprimere la molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) e infiammazione6. È interessante notare che, miR-223 è visto anche trasportati dalle vescicole extracellulari dai leucociti alle cellule tumorali del polmone, programmazione ad assumere un fenotipo più invasiva7. Così, il trascrittoma di ex-Mirna da vari fluidi corporei e terreno di coltura cellulare migliorerà notevolmente la nostra comprensione della segnalazione ex-miRNA.
Piccolo RNA (piccolo RNA seq) di sequenziamento è un potente strumento che può essere utilizzato per comprendere la trascrittomica di piccoli RNA. Non solo diversi campioni possono essere confrontati tra RNAs conosciuto differenzialmente espressi, ma romanzo piccoli RNA possa anche essere rilevati e caratterizzato. Di conseguenza, è anche un metodo affidabile per identificare Mirna differenzialmente espressi in condizioni diverse. Tuttavia, uno degli ostacoli di piccoli RNA seq è la difficoltà nel generare piccole biblioteche di seq RNA da exRNA basso input fluidi come liquidi cerebrospinali, saliva, urina, latte, siero e terreni di coltura. Il protocollo di TruSeq piccolo RNA biblioteca Prep da Illumina richiede circa 1 µ g di RNA totale di alta qualità e il protocollo di NEBNext piccolo RNA biblioteca Prep Set da New England Biolabs richiede 100 ng-1 µ g di RNA8,9. Spesso, RNA totale da questi campioni sono sotto il limite di rilevamento per spettrofotometri UV-vis convenzionali.
Ex-miRNAs derivati da fluidi corporei sono potenzialmente buoni marcatori diagnostici e prognostici. Tuttavia, al fine di studiare gli effetti funzionali o per determinare l'origine del ex-miRNA specifici, sistemi di coltura cellulare, vengono spesso utilizzati. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono state studiate estesamente perché loro EVs sono stati implicati nell'alleviare molte malattie tra cui l'infarto miocardico, malattia di Alzheimer e dell'innesto contro la malattia ospite10. Qui, dimostriamo la purificazione di ex-Mirna da MSCs derivate da midollo osseo (BMSC) e i passaggi specifici utilizzati per ottimizzare la costruzione della libreria piccola RNA, sequenziamento e analisi dei dati (Figura 1).
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Protocol
Nota: Terreno di coltura delle cellule staminali mesenchimali (media MSC) è preparato in anticipo, come indicato nella Tabella materiali.
1. coltura cellulare
Nota: Le cellule staminali mesenchimali umane possono essere ottenute da midollo osseo, tessuto adiposo o altre fonti11. In alternativa, hMSCs possono essere acquistati tramite un fornitore. BMSCs utilizzata nel presente protocollo sono state derivate dal midollo osseo dei pazienti e comprato da una società.
- Scongelare 1 x 106 BMSCs in un matraccio da T175 contenente 20 mL di media MSC. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2 e sostituire i media ogni 2-3 giorni fino al confluency di 80%.
- Lavare le cellule con 5 mL di 1X PBS e scartare il PBS.
- Staccare le cellule aggiungendo 5 mL di 0.05% tripsina-EDTA e incubando le cellule per 5 min a 37 ° C. Toccare i lati del pallone per facilitare il distacco.
- Aggiungere 15 mL di media MSC per inattivare la tripsina, staccare le cellule dalla superficie e pipetta su e giù per ottenere sospensioni di cellule singole.
- Raccogliere le cellule in una provetta da 50 mL e centrifugare per 5 minuti a 300 x g per agglomerare le cellule.
- Risospendere le cellule in 1 mL di media MSC e contare le celle utilizzando un emocitometro.
Nota: Midollo osseo umano primario MSCs al confluency di 80% in un pallone di T175 è circa 2 x 106 cellule. - Piastra hMSCs a 2.000 cellule/cm2 fresco media di MSC in 5 T175 boccette. Crescere le cellule a 37 ° C con 5% CO2 e sostituire i media ogni 2-3 giorni fino a quando si ottengono 5 boccette di 90% confluenti T175 boccette.
2. sve e biomolecole RNA-collegati insieme
Nota: Supporto di raccolta EV è preparato in anticipo (per volta Eagle di Dulbecco esente [DMEM] con 10% siero bovino fetale [FB] e 1% di penicillina/streptomicina [P/S]). EV raccolta media è normale media MSC, ma preparato con commerciale EV-vuotati FBS (Tabella materiali). Questo è per evitare la contaminazione di bovino exRNA da FBS, che normalmente contiene exRNAs associato di EVs, ribonucleoproteine e lipoproteine. Per la preparazione di libreria piccolo RNA, exRNAs derivato da 5 boccette confluenti di cellule staminali mesenchimali sono necessaria per consentire la costruzione della libreria.
- Lavare le cellule 3 x con 20 mL di PBS per T175 fiaschetta. Aggiungere 20 mL di media di raccolta di EV per confluenti T175 fiaschetta di MSCs e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 48 h.
- Raccogliere i media e centrifugare i media per 10 minuti a 300 x g e 4 ° C.
- Raccogliere il surnatante e centrifugare i media per 20 min a 2.000 x g a 4 ° C.
- Raccogliere il surnatante e centrifugare i media per 30 min a 15.500 x g a 4 ° C. Poi raccogliere il surnatante.
- Trasferire i media ultracentrifuga provette e pellet exRNAs per 90 min a 100.000 x g e a 4 ° C. È qui utilizzato un rotore ad angolo fisso e il pellet è ancorato al lato del tubo. Contrassegnare il lato del coperchio e disegnare un cerchio sul lato del tubo in cui è previsto il pellet.
- Rimuovere il supernatante, asciugare l'interno del tubo capovolgendo la provetta su carta assorbente e usare piccoli pezzi di carta assorbente per togliere il liquido all'interno del tubo senza toccare il fondo del tubo. Risospendere il pellet in 200 μL di PBS nel Vortex per 30 s e pipettaggio su e giù per 20 volte.
- Valutare l'EVs e biomolecole con nanoparticle tracking analysis (NTA) (Figura 2).
Nota: Il server virtuale di Exchange e biomolecole possono essere valutati con nanoparticle tracking analysis (NTA), dispersione della luce dinamica (DLS) o trasmissione microscopia elettronica (TEM)12. - Memorizzare le EVs e biomolecole a-80 ° C fino a ulteriori esperimenti a valle.
Nota: Se SVE stanno per essere utilizzati per studi funzionali, glicerolo 20% deve essere aggiunto per proteggerli dalla rottura. Le cellule possono essere raccolti utilizzando le procedure standard, se necessario.
3. sve e collezione di biomolecole RNA-collegato di cellule differenziate
Nota: EVs e RNA associati biomolecole possono anche essere raccolti dai terreni di coltura delle cellule mentre le cellule subiscono differenziazione. Nell'esempio raffigurato nel protocollo descrive differenziazione osteoblastica ed exRNA insieme ai giorni 0 e 7 di differenziazione. Se nessuna differenziazione è necessaria, quindi saltare la sezione 3 e vai alla sezione 4.
- Preparare il supporto di differenziamento osteoblastico (DMEM con 10% FBS, 1% P/S, 10 mM β-glicerofosfato, 10 nM desametasone, 50 μM ascorbato-2-fosfato e 10 mM 1,25-vitamina D3) fresco ogni volta.
- Una volta che MSCs sono 80% confluenti, cambiare il supporto MSC ai media di differenziamento osteoblastico.
- Reintegrare i media di differenziamento osteoblastico dopo 2-3 giorni.
- Il giorno 5 di differenziazione, rimuovere il supporto e lavare le cellule 3 x con 20 mL di PBS per T175 fiaschetta.
- Aggiungere 20 mL di EV media raccolta contenente β-glicerofosfato di 10 mM, 10 nM desametasone, 50 μM ascorbato-2-fosfato e 10 mM 1,25-vitamina D3 per confluenti T175 fiaschetta di MSCs. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2 per 48 h garantire continuate differenziazione, pur raccogliendo le EVs e biomolecole.
- Raccogliere i media il giorno 7 e procedere per isolare l'EVs e biomolecole come descritto ai punti 2.2-2.6.
- Per il controllo qualità, seme cellule a 96 pozzetti o 6-pozzetti per valutare la differenziazione usando un'analisi di attività della fosfatasi alcalina (ALP), o con reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), rispettivamente.
Nota: Nella figura 3 è un esempio che mostra la differenziazione osteogenica delle cellule.
4. RNA estrazione e controllo di qualità
- Scongelare i campioni dal passaggio 2.8 sul ghiaccio. Estrarre RNA usando un kit di isolamento del RNA (Tabella materiali).
- Eluire il RNA dalla colonna fornito nel kit di isolamento di RNA (Tabella materiali) in 100 μL di acqua RNAsi-libera.
- Concentrare il RNA attraverso precipitazione dell'etanolo aggiungendo 1 μL di glicogeno, 10 μL 2 M pH 5,5 dell'acetato del sodio e 250 µ l di etanolo al 99% pre-refrigerati in 100 μL di RNA purificato.
- Incubare i campioni a-20 ° C durante la notte a precipitare il RNA. Pellet di RNA mediante centrifugazione per 20 min a 16.000 x g e a 4 ° C.
Nota: Il pellet è bianco dovuto co-precipitazione con glicogeno. - Eliminare il surnatante e lavare la pallina del RNA con 1 mL di etanolo al 75%. Pellet al RNA ancora per 5 min a 16.000 x g e a 4 ° C.
- Rimuovere l'etanolo e lasciare il coperchio del tubo RNA aperta per 5-10 minuti all'aria asciutta la pallina del RNA. Risospendere il pellet di RNA in 7 μL di acqua RNAsi-libera.
- Controllare la qualità di RNA e la concentrazione utilizzando una macchina basata su chip elettroforesi capillare per rilevare il RNA secondo il protocollo del produttore prima della costruzione della libreria.
Nota: Una distribuzione delle dimensioni rappresentative del RNA è illustrata nella Figura 4. - Estrarre RNA cellulare utilizzando un kit di purificazione commerciale (Tabella materiali) se necessario.
5. libreria costruzione e controllo qualità
Nota: Le librerie Small RNA vengono costruite utilizzando kit commerciali (Tabella materiali) con regolazioni dovuto il RNA basso ingresso. La costruzione della libreria viene eseguita sul blocco refrigerato.
- Chill blocco riscaldante per provette per PCR 0,2 mL sul ghiaccio e aggiungere 5 μL del RNA dal passo 4.6 in provette per PCR 0,2 mL RNAsi-libera su un blocco di refrigerati.
- Diluire 3' adattatori (01:10) in acqua RNAsi-libera in un tubo PCR 0,2 mL RNAsi-libera. Aggiungere 0,5 μL di adattatore diluito e mescolare con 5 μL di RNA pipettando su e giù 8 x e centrifugare brevemente per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore del tubo.
- Incubare il mix di adattatore RNA e 3' a 70 ° C per 2 min in un termociclatore preriscaldato e quindi posizionare il campione indietro sul blocco refrigerato.
- Aggiungere 1 μL di tampone di legatura, 0,5 μL di inibitore di RNAsi e 0,5 μL della ligasi T4 RNA (mutante di delezione) nell'impasto adattatore RNA e 3'. Mescolare pipettando su e giù 8x e centrifugare.
- Incubare la provetta a 28 ° C per 1 h in termociclatore preriscaldato.
- Aggiungere 0,5 μL di soluzione di arresto nel tubo del campione con il tubo di soggiornare nel termociclatore, Miscelare pipettando su e giù x 8 e continuare a mantenere in incubazione a 28 ° C per 15 min.
- Diluire 5' adattatori (01:10) in acqua RNAsi-libera in un tubo PCR 0,2 mL RNAsi-libera. Aggiungere 0,5 μL di 5' adattatore in una separato RNAsi-libera 0,2 mL provetta PCR, calore l'adattatore 5' a 70 ° C per 2 min in termociclatore preriscaldato e poi posizionare il campione sul blocco refrigerato.
- Aggiungere 0,5 μL di 10 nM ATP, 0,5 μL della ligasi T4 RNA al tubo adattatore 5', mescolare pipettando su e giù 8x e centrifugare per raccogliere tutti i liquidi nella parte inferiore.
Nota: Tenere l'adattatore 5' sul blocco refrigerato per quanto possibile. - Aggiungere 1,5 µ l della miscela adattatore 5' al campione dal punto 5.6 e mescolare molto delicatamente di pipettaggio 8x lentamente. Incubare il campione a 28 ° C per 1 h in termociclatore preriscaldato.
- Diluire RT primer 01:10 in acqua RNAsi-libera in un tubo PCR 0,2 mL RNAsi-libera. Aggiungere 0,5 µ l di primer RT diluito nel campione dal passaggio 5.9, mix molto dolcemente pipettando su e giù 8x lentamente e centrifugare.
- Incubare il campione a 70 ° C per 2 min in termociclatore preriscaldato e quindi il campione viene posto su un blocco di refrigerati.
- Aggiungere 1 μL di 5 x primo strand buffer, 0,5 μL di miscela del dNTP 12,5 mM, 0,5 μL di 100 mM dithiothreitol (DTT), 0,5 μL di inibitore di RNAsi e 0,5 μL della trascrittasi inversa. Mescolare molto delicatamente pipettando su e giù 8x lentamente e centrifugare.
- Incubare il campione a 50 ° C per 1 h in termociclatore preriscaldato per ottenere cDNA.
- Aggiungere 4.25 μL di acqua ultrapura, 12,5 μL di miscela di PCR, 1 μL di primer indice e 1 µ l di primer universali nel cDNA. Mescolare pipettando su e giù 8x e centrifugare.
- Il campione viene posto in un termociclatore e impostare come segue il ciclatore: 98 ° C per 30 s; 15 cicli di 98 ° C per 10 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 15 s; e alla fine il ciclo con 72 ° C per 10 min.
Nota: La libreria preparata possa essere memorizzata a-20 ° C per una settimana. - Purificare la libreria di RNA che separa la libreria su un gel di DNA e tagliando il gel (gel di estrazione) tra 140 bp e 160 bp e medicati la libreria dal gel seguendo il protocollo dato da libreria costruzione kit.
Nota: In questo studio, la libreria preparata dal passaggio 5.15 viene caricata su un gel commerciale (Tabella materiali) e la libreria tra 140 bp e 160 bp è purificata fuori da un frazionatore automatizzato di dimensione del DNA (Tabella materiali) secondo la protocollo del produttore. - Concentrarsi e lavare la libreria dal passaggio 5.16 utilizzando un kit di purificazione di PCR basata su colonne (Tabella materiali) ed eluire la libreria in acqua RNAsi-libera di 10 μL infine.
- Caricare 1 μL della biblioteca purificata su un chip di DNA (Tabella materiali) per verificare le dimensioni della libreria seguendo il protocollo del produttore.
- Diluire 1 μL della biblioteca purificata (1: 1000) di 10 mM a pH 8.0 Tris-HCl con 0.05% polisorbato 20 e quantificare la libreria di qPCR utilizzando un kit di quantificazione di libreria commerciale per quantificare la concentrazione di libreria utilizzando gli standard di DNA nel kit.
- Quantità uguali di piscina delle librerie secondo i requisiti del computer di sequenziazione e sequenza su un sistema di sequenziamento ad alte prestazioni.
Nota: La costruzione della libreria del RNA cellulare può essere fatto utilizzando gli stessi Kit seguendo il protocollo standard dei kit.
6. bioinformatica pipeline
Nota: Si tratta di una pipeline in-House e i programmi usati qui sono elencati nella tabella materiali.
- Tagliare via bassa qualità letture e rimuovere adattatore sequenze dal crude letture.
- Mappa la legge pulita ai generi differenti di RNA.
- Annotare i tRNAs consentendo due mancate corrispondenze perché le sequenze di tRNA fortemente modificati causano frequenti misincorporation del base dal transcriptase d'inversione.
- Annotare i miRNA mediante il mapping di miRNA umani da miRBase v21 permettendo zero mismatch. Dal momento che i miRNA sono soggetti A divieto e U nontemplated 3' fine aggiunte, sequenze che non eseguono il mapping sono 3' assettato di nts fino a tre A e/o T, dopo di che letture vengono mappate a miRNA umani e altri miRNA da miRBase v21 permettendo zero mismatch.
- Annotare per altri pertinenti piccoli RNA (snRNA, snoRNA, piRNA e Y RNAs) consentendo una mancata corrispondenza.
- Mappa il restante letture non mappate ai lunghi RNA DataSet (rRNA, altri RNA da Rfam e mRNA) per valutare la degradazione.
- Annotare le sequenze di genoma umano.
- Annotare le sequenze di genomi batterici.
- Normalizzare l'espressione dei miRNA utilizzando la seguente formula: miRNA conta / totale conta di tutti i miRNA mappati) x 106.
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Representative Results
Il metodo descritto in questo protocollo è ottimizzato per raccogliere exRNA da cultura MSC per il sequenziamento di nuova generazione. Lo schema generale del flusso di lavoro è nella Figura 1 a sinistra e i checkpoint di rispettivo controllo di qualità sono sulla destra.
La morfologia delle cellule il giorno della raccolta per indifferenziato (Figura 3A) e differenziata (Figura 3B) le cellule sono indicate. Inoltre, rappresentante normalizzato i livelli di ALP attività delle cellule indotte per 7 giorni sono mostrati (Figura 3). Qui, attività ALP è circa 2,5 volte quella delle cellule uninduced.
Tre T175 boccette di MSCs confluenti resa di 2-5 x 1010 particelle/mL (Figura 2). Dimensione media delle particelle è circa 160-165 nm, mentre la maggior parte delle particelle sono 130-140 nm. C'erano alcuni piccoli picchi fra 200 e 500 nm, che indicherebbe grandi complessi o grandi aggregati.
Poiché il RNA può essere degradato rapidamente, rispettare rigorosamente le condizioni di estrazione di RNA secondo il kit o il protocollo utilizzato. Utilizzare le condizioni di RNAsi-libera, in particolare RNAsi-libera acqua per risospendere il RNA e mantenere RNA su ghiaccio quando possibile. Dopo l'estrazione, il RNA può essere quantificato utilizzando una macchina basata su chip elettroforesi capillare. Elettroferogrammi rappresentante del RNA dopo aver analizzato sono mostrati in Figura 4. L'elettroferogramma di exRNAs include una vasta gamma di RNA (Figura 4A). Al contrario, RNA cellulare ha picchi molto distinti alle intorno 70-120, 1800 e 3800 nt, che corrispondono al tRNA/5S rRNA / 5.8S rRNA, rRNA 18S e 28S rRNA, rispettivamente (Figura 4B). Il numero di integrità di RNA (RIN) rappresenta la qualità del RNA. Un buon RIN di RNA cellulare è > 8 (che indica quasi nessuna degradazione di RNA). L'algoritmo su cui si basa il RIN è il rapporto tra 28S e 18S. Questo significa che RIN non è un buon indicatore della qualità di RNA di exRNAs perché i rRNAs full-length di solito non sono rilevabili in exRNAs.
A seguito dell'estrazione di RNA, le librerie di miRNA sono state costruite e le librerie di cDNA sono state separate mediante elettroforesi in gel. Il cDNA adattatore-legati dei miRNA è tipicamente fra 140 e 160 nt. La qualità della biblioteca è stato quindi visualizzata su un computer basato su chip elettroforesi capillare (Figura 5). Figura 5A e 5B figura sono le librerie da RNA cellulare al giorno 0 e 7 giorno, rispettivamente. Figura 5 e Figura 5 sono le librerie di exRNA al giorno 0 e 7 giorno rispettivamente. Tutti e quattro i campioni avevano picchi a circa 140 nt, che indicano la costruzione della libreria successo miRNA. La quantità di cDNA nelle librerie è stata quantificata tramite qPCR utilizzando un kit di quantificazione di biblioteca. Il ciclo di quantificazione (Cq) degli standard è stato tracciato contro il logaritmo della concentrazione per ottenere una curva standard (Figura 6). L'equazione della curva standard è stato poi utilizzato per calcolare la concentrazione delle librerie (tabella 1). Nel nostro campione, la concentrazione delle librerie da exRNAs era 5-8 nM, che era significativamente più bassa di librerie da RNA cellulare (8-30 nM). Le librerie sono stati poi riunite con pari quantità ed inviate per il sequenziamento.
Dopo che le librerie sono state sequenziate, le letture di bassa qualità sono state tagliate via con FASTX-Toolkit e la conseguente qualità dei exRNAs biblioteca era alta e paragonabile a quella delle librerie dalle cellule (figura 7AB). La lunghezza della sequenza delle librerie dalle cellule aveva un singolo picco a circa 22 nt (Figura 7), che correla con Mirna. Al contrario, le librerie da exRNAs erano più eterogenee e conteneva 3 vette principali: 22 nt, 30 nt e 33 nt (Figura 7). Simili alle loro controparti cellulari, il picco a 22 nt è i miRNA. Esame più attento ha rivelato che i picchi al nt 30 e 33 sono tRNAs metà/frammenti o piRNAs. Quindi sono state tracciate le annotazioni del legge mappate. La maggior parte delle letture (65,1%) da RNA cellulare mappato a miRNA umani e ciascuno degli altri piccoli RNA hanno rappresentati una piccola porzione del legge mappate (Figura 8A). Confermarsi, solo l'8% di exRNAs mappato a miRNA umani (Figura 8B). Il piccolo RNA più abbondante a cui è mappato le letture erano tRNAs. La maggior parte della legge erano "letture senza eguali" (43%). Ulteriore esame della legge senza eguali da exRNAs ai database globali ha condotto all'individuazione sorprendente che la maggior parte di essi corrispondono a sequenze batteriche (74% e 85% per exRNA D0 e D7, rispettivamente; Tabella 2). Al contrario, solo 0,9% del RNA cellulare era impareggiabile e, di questi, solo il 10% mappati ai batteri. Un confronto con il genoma bovino ha mostrato meno di 1% partita suggerendo che FB non era una fonte di contaminazione (tabella 2). Quindi, exRNAs esibiscono un profilo atipico rispetto al normale RNA cellulare.
Figura 1: flusso di lavoro di analisi e sequenziamento di exRNA. L'intero flusso di lavoro è raffigurato a sinistra nelle caselle grigie e controllo di qualità associata a ogni passaggio è nelle caselle rosse sulla destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: distribuzione delle particelle secernuta dalle cellule al giorno 0 e 7 ° giorno di differenziazione dimensione. Risultati rappresentante NTA di particelle raccolti da 3 x T175 matracci a (un) giorno 0 e 7 ° giorno (B) di differenziazione. Le rispettive taglie media e modalità, nonché la concentrazione delle particelle è tabulata sotto i grafici. SD: deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: morfologia e differenziamento osteogenico prima della raccolta di RNA extracellulare delle cellule. (A) micrografo di BMSCs indifferenziate coltivate con media insieme il giorno di raccolta. (B) micrografo di BMSCs differenziate per 7 giorni con media insieme il giorno di raccolta. Scala bar = 100 µm. (C) ALP attività delle cellule sono stati normalizzati al loro viabilità cellula rispettiva. I valori tracciati erano quello di tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: rappresentante elettroferogramma di integrità di RNA dopo estrazione del RNA. Analisi di RNA di RNA extracellulare (A) e RNA cellulare (B). L'asse x è la lunghezza del RNA (nt) e l'asse y è la fluorescenza. Il primo picco è la scala a 25 nt. RNA ribosomiale (rRNA) sono mostrati come 18S (1.800 nt) e 28S (3.800 nt). Numero di RNA integrità (RIN) è un indicatore di qualità di RNA basato sull'integrità rRNA 18S e 28S. I numeri più alti di RIN migliore qualità uguale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: elettroferogramma rappresentante delle librerie di cDNA dopo la costruzione della libreria. Analisi del DNA delle biblioteche da (A) di cellule al giorno 0, (B) al giorno 7, il RNA extracellulare (C) dal giorno 0 e (D) RNA extracellulare da giorno 7. Numeri verdi e viola sono le scale alle 35 nt e 10.380 nt, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: cDNA biblioteca quantificazione e calcolo. Le librerie sono state diluite tra 500 - 1.000 volte per quelli da exRNA e tra 1.000 e 4.000 volte per RNA cellulare. Le librerie sono state eseguite a fianco gli standard dai kit di quantificazione di libreria. I valori medi di Cq degli standard del DNA sono stati tracciati rispetto alla concentrazione di10 log (pM) per generare una curva standard, un'equazione per la curva standard e un valore di2 R. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: punteggi di qualità e la distribuzione di lunghezza delle sequenze. Legge di bassa qualità e sequenze di adattatore erano rifiniti con FASTX-Toolkit per le cellule (A) e (B) exRNAs. La distribuzione di lunghezza di pulito legge per le cellule (C) e (D) exRNAs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: annotazione di piccoli RNA dopo la sequenziazione. Le annotazioni sono espressi in percentuale di letture pulite per le cellule (A) e (B) exRNAs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Campione | Fattore di diluizione | Valore di CQ | log(PM) | Concentrazione (pM) | Media concentrazione (pM) | Media concentrazione * (452/143) | Moltiplicare per il fattore di dillution (pM) |
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7,72 | 0.702 | 5.036 | 5.276 | 16.678 | 8338.993 |
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7.57 | 0.754 | 5.677 | |||
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7.7 | 0.709 | 5.117 | |||
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8.64 | 0.383 | 2,416 | 2.365 | 7.477 | 7476.846 |
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| ExRNA di BMSC D7 | 500 | 8,52 | 0.425 | 2,659 | 3.221 | 10.182 | 5090.913 |
| ExRNA di BMSC D7 | 500 | 8,42 | 0,459 | 2.880 | |||
| ExRNA di BMSC D7 | 500 | 7,97 | 0.615 | 4,125 | |||
| ExRNA di BMSC D7 | 1000 | 8,87 | 0.303 | 2.011 | 1.933 | 6.110 | 6110.391 |
| ExRNA di BMSC D7 | 1000 | 8,92 | 0.286 | 1.932 | |||
| ExRNA di BMSC D7 | 1000 | 8,97 | 0,269 | 1,857 | |||
| Cella di BMSC D0 | 1000 | 6,86 | 1.000 | 10,005 | 9.810 | 31.007 | 31006.974 |
| Cella di BMSC D0 | 1000 | 6,91 | 0.983 | 9.614 | |||
| Cella di BMSC D0 | 4000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | 2.398 | 7.581 | 30322.041 |
| Cella di BMSC D0 | 4000 | 8,59 | 0.400 | 2.514 | |||
| Cella di BMSC D0 | 4000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| Cella di BMSC D7 | 1000 | 8,44 | 0.452 | 2,834 | 2.880 | 9.104 | 9104.439 |
| Cella di BMSC D7 | 1000 | 8,43 | 0,456 | 2,857 | |||
| Cella di BMSC D7 | 1000 | 8,39 | 0,470 | 2.950 | |||
| Cella di BMSC D7 | 4000 | 10.36 | -0.213 | 0.612 | 0.702 | 2.218 | 8872.689 |
| Cella di BMSC D7 | 4000 | 10,27 | -0.182 | 0.658 | |||
| Cella di BMSC D7 | 4000 | 9,97 | -0.078 | 0.836 | |||
| Calcoli: | |||||||
| log(PM) =-0.3467 x (valore campione Cq) + 3.3786; utilizzare la curva standard e la formula | |||||||
| concentrazione (pM) = 10^log(pM) | |||||||
| Calcolo della regolazione di dimensioni = dimensione del DNA standard (452 bp) diviso per la lunghezza del frammento medio (143 bp) | |||||||
Tabella 1: miRNA quantificazione di biblioteca.
| Esempio: | # legge mappatura non umano | # legge mapping a batteri | % batterica letture | # legge mapping a mucca | legge % bovino |
| BMSC D0 cella | 131007 | 9858 | 8% | 99 | 0,08% |
| Cella D7 BMSC | 169730 | 7935 | 5% | 188 | 0,11% |
| BMSC D0 exRNA | 6122833 | 4551477 | 74% | 891 | 0,01% |
| ExRNA di BMSC D7 | 7046691 | 5970086 | 85% | 771 | 0,01% |
Tabella 2: La percentuale di ineguagliata legge quella mappa ai batteri e alle letture bovina.
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Discussion
Qui, descriviamo un protocollo per il sequenziamento di nuova generazione di exRNAs che consente l'analisi di espressione differenziale da campioni di ingresso Bassi. Aderendo a un protocollo specifico per l'isolamento di EV ed exRNA è importante perché anche piccole alterazioni (cioè, il passo di ultracentrifugazione o un cambiamento nel tipo di rotore) possono influenzare il trascrittoma e miRNA livelli13,14. Così, indipendentemente da come il exRNA è isolato, è importante applicare la stessa procedura sperimentale e bioinformatica per tutti i campioni in un esperimento per essere in grado di confrontare i risultati.
Integrità di RNA è valutata solitamente il bioanalyzer. Tuttavia, poiché exRNAs sono prive di integrale rRNA, loro valore RIN è molto bassa, ma questo non riflette necessariamente esempi di scarsa qualità RNA. Inoltre, la concentrazione di RNA della exRNAs varia notevolmente e spesso è imprecisa. Quindi, invece di valutare la qualità di RNA e quantificare il RNA il bioanalyzer, utilizzare lo stesso volume di media ogni volta per un'ulteriore elaborazione. Inoltre, risospendere il RNA estratto nello stesso volume di tampone di risospensione e utilizzare lo stesso volume per la costruzione della libreria.
Piccola costruzione della libreria del RNA è stata ottimizzata riducendo la quantità di adattatori ad un decimo del protocollo standard e utilizzando metà di altri reagenti. Riducendo gli adattatori non solo impedisce dimeri adattatore, impedisce anche intramolecolare RNA circularization15. La riduzione di reagenti è ottimizzata per Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kit. Altri kit deve essere utilizzato, si raccomanda di abbassare anche adattatore e reagenti di conseguenza, a meno che il kit specifica che è su misura a basso inpui campioni. Infine, il ciclo PCR per la costruzione della libreria è stato aumentato da 12 a 15 cicli in questo protocollo per compensare la bassa concentrazione di exRNAs. Abbiamo trovato questo per essere la regolazione ottima senza vedere amplificazione pregiudizi15.
Varie metriche di controllo di qualità possono essere valutati tra cui punteggi di qualità di base e leggere il profilo di lunghezza. Quando si fa analisi bioinformatica, la qualità base di letture in RNA cellulare ed exRNAs erano simili; Tuttavia, la distribuzione di lunghezza e l'origine con annotazioni di sequenze erano completamente differenti. La maggior parte delle letture da RNA cellulare mappato a miRNA umani, tuttavia, gran parte del exRNA si legge erano letture senza eguali. Esame più approfondito, le letture senza pari si è rivelate per essere batterica legge (tabella 2). Questo è stato sorprendente, perché gli antibiotici sono stati usati ordinariamente nella nostra cultura. Il nostro risultato si allinea bene con altri rapporti che inoltre ha mostrato gran parte delle letture senza pari quando sequenziazione di coltura delle cellule derivate exRNA16. Uno dei motivi per questi contaminanti è che i batteri si sovrappongono dimensioni con complessi extracellulare o EVs e quindi co-purificano durante l'ultracentrifugazione passo17. Precedenti pubblicazioni hanno identificato una contaminazione diffusa di alcuni batteri in terreni di coltura che rimangono inosservati sotto cellula normale laboratorio procedure18. Ad oggi, questo problema è stato in gran parte ignorato ma dovrebbe essere presi in considerazione quando la purificazione e l'analisi exRNAs.
Una guida completa alla raccolta exRNAs da terreni di coltura, ottimizzando la preparazione di libreria piccolo RNA e l'elaborazione dei dati grezzi biblioteca i dettagli di questo protocollo. Questo protocollo evidenzia in particolare i vari punti di controllo di controllo di qualità durante tutto il processo per dimostrare quanto in basso inpui campioni (come exRNAs) possono deviare dalla preparazione del campione normale affinché altri che lavorano con i campioni di ingresso bassi possono sapere che cosa si aspettano.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati al signor Claus Bus e Sig. ra Rita Rosendahl a iNANO per loro assistenza tecnica. Si ringrazia Dr. Daniel Otzen per permettere che il nostro uso frequente della sua ultracentrifuga. Questo studio è stato sostenuto dal fondo per l'innovazione Danimarca (progetto MUSTER).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
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