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Genetics

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Published: March 8, 2019 doi: 10.3791/58655
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Interdisciplinary Nanoscience Centre, Aarhus University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie extrazelluläre MicroRNAs von Zellkulturmedien für kleine RNA Bibliotheksbau und Sequenzierung der nächsten Generation zu reinigen. Verschiedenen Qualitätskontrolle Checkpoints werden beschrieben, Leser zu verstehen, was beim Arbeiten mit niedrigen Eingabesamples wie ExRNAs zu erwarten.

Abstract

Extrazelluläre und zirkulierenden RNAs (ExRNA) werden von vielen Zelltypen des Körpers produziert und gibt es in zahlreichen Körperflüssigkeiten wie Speichel, Urin, Milch, Plasma und Serum. Eine Teilmenge von diesen RNAs sind die posttranskritionelle Regler – Micro-RNAs (MiRNAs). Um die MiRNAs, die von bestimmten Zelltypen produziert abzugrenzen, in-vitro-Kultur-Systeme können verwendet werden, um zu ernten und Profil ExRNAs aus einer Teilmenge von Zellen. Die sezernierten Faktoren von mesenchymalen Stammzellen sind involviert in zahlreichen Krankheiten zu lindern und dient als die in-vitro-Modell-System hier. Dieser Artikel beschreibt den Prozess der Sammlung, Reinigung von kleinen RNA und Bibliothek-Generation, die Sequenz extrazelluläre MiRNAs. ExRNAs von Nährmedien unterscheiden sich von zellulären RNA durch die niedrigen RNA Eingabesamples, dem optimierten Verfahren gefordert. Dieses Protokoll bietet eine umfassende Anleitung zum kleinen ExRNA Sequenzierung von Nährmedien, zeigt Qualitätskontrolle Prüfpunkte bei jedem Schritt während ExRNA Reinigung und Sequenzierung.

Introduction

Extrazelluläre und zirkulierenden RNAs (ExRNAs) sind in verschiedenen Körperflüssigkeiten vorhanden und sind resistent gegen RNases1,2. Ihre hohe Fülle, Stabilität und einfache Zugänglichkeit sind attraktiv für klinische Bewertung als diagnostische und prognostische Marker3. Das Transportmittel für ExRNAs umfassen extrazelluläre Vesikel (EVs), Verband mit Lipoproteine (z. B. High-density-Lipoprotein; HDL) und Ribonucleoprotein komplexe (z. B. mit Argonaute2-komplexe)4.

Eine Teilmenge der ExRNAs sind Micro-RNAs (MiRNAs), die kleine nicht-kodierende RNAs von etwa 22 nt, die posttranskritionelle Genexpression regulieren. Ex-MiRNAs haben in Zell-Zell-Kommunikation und Regelung der Zelle Homöostase5verwickelt. Zum Beispiel liefert HDL Ex-MiR-223 an Endothelzellen interzelluläre Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1) zu unterdrücken und Entzündungen6. Interessanterweise wird MiR-223 auch transportiert durch extrazelluläre Vesikel von Leukozyten an Lungenkrebszellen, programmieren sie sich auf eine weitere invasive Phänotyp7gesehen. So wird das Transkriptom des Ex-MiRNAs aus verschiedenen Körperflüssigkeiten und Zellkulturmedium stark unser Verständnis von Ex-MiRNA-Signalisierung verbessern.

Kleine RNA Sequenzierung (kleine RNA Seq) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, zu verstehen, das Transkriptom des kleinen RNAs. Nicht nur verschiedene Proben unter differentiell exprimierten bekannten RNAs verglichen werden können, sondern neuartige kleinen RNAs auch erkannt und gekennzeichnet werden können. Infolgedessen ist es auch eine robuste Methode, differentiell exprimierten MiRNAs unter verschiedenen Bedingungen zu identifizieren. Eine der Hürden von kleinen RNA Seq ist jedoch die Schwierigkeiten bei der Erzeugung von kleinen RNA-Seq-Bibliotheken aus niedrigen ExRNA Eingabe Flüssigkeiten wie Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, Speichel, Urin, Milch, Serum und Nährmedien. Das TruSeq kleine RNA-Bibliothek-Prep-Protokoll von Illumina erfordert ca. 1 µg hochwertige Gesamt-RNS und das NEBNext kleine RNA Bibliothek Prep Set Protokoll von New England Biolabs 100 ng-1 µg RNA8,9. Oft sind total RNA aus diesen Proben unter Nachweisgrenze für konventionelle UV-Vis Spektralphotometer.

Ex-MiRNAs abgeleitet von Körperflüssigkeiten sind potenziell gute prognostische und diagnostische Marker. Jedoch sind um die funktionellen Auswirkungen zu studieren oder zur Bestimmung des Ursprungs von bestimmten Ex-MiRNAs Zellkultursysteme oft stattdessen verwendet. Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) haben ausgiebig untersucht, weil ihre EVs bei der Linderung vieler Krankheiten wie Herzinfarkt, Alzheimer-Krankheit und Graft-Versus-Host-Krankheit10verwickelt waren. Hier zeigen wir die Reinigung des Ex-MiRNAs aus dem Knochenmark stammenden MSCs (BMSCs) und die entsprechenden Schritte zur Optimierung der kleinen RNA Bibliotheksbau, Sequenzierung und Analyse der Daten (Abbildung 1) verwendet.

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Protocol

Hinweis: Wachstumsmedium mesenchymalen Stammzellen (MSC Media) ist im Voraus, wie in der Tabelle von Materialienbereit.

(1) Zellkultur

Hinweis: Humaner mesenchymaler Stammzellen im Knochenmark, Fettgewebe oder anderen Quellen11entnehmen. Alternativ können hMSCs durch einen Lieferanten gekauft werden. Die in diesem Protokoll verwendeten BMSCs wurden abgeleitet aus dem Knochenmark des Patienten und von einer Firma gekauft.

  1. Tauen Sie 1 x 106 BMSCs in einer T175-Flasche mit 20 mL MSC Medien auf. Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 Zellen und ersetzen Sie die Medien alle 2-3 Tage bis 80 % Konfluenz.
  2. Waschen Sie die Zellen mit 5 mL 1 X PBS und entsorgen Sie die PBS.
  3. Lösen die Zellen durch Zugabe von 5 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und Inkubation der Zellen für 5 min bei 37 ° C. Tippen Sie auf den Seiten des Kolbens Loslösung zu erleichtern.
  4. Hinzugeben Sie 15 mL MSC Medien zu inaktivieren die Trypsin, lösen die Zellen von der Oberfläche und Pipette rauf und runter zu einzelnen Zellsuspensionen.
  5. Sammeln Sie die Zellen in einem 50 mL-Tube und Spin-down für 5 min bei 300 X g zu die Zellen zu Pellets.
  6. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL der MSC Medien und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
    Hinweis: Primäre menschlichen Knochenmark MSCs auf 80 % Konfluenz in einem T175 Kolben ist ca. 2 x 106 Zellen.
  7. Platte hMSCs bei 2.000 Zellen/cm2 frische MSC Medien in 5 T175 Fläschchen. Wachsen Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2 und ersetzen Sie die Medien alle 2-3 Tage, bis 5 Flaschen von 90 % konfluierende T175 Flaschen gewonnen werden.

(2) EVs und RNA-assoziierten Biomoleküle Sammlung

Hinweis: EV Sammlung Medien vorbereitet wurde (Dulbeccos geändert Eagle Medium [DMEM] mit fötalen Rinderserum [FBS] 10 % und 1 % Penicillin/Streptomycin [P/S]). EV Sammlung Medien ist normal MSC Medien, sondern mit kommerziellen EV-abgereicherte FBS (Table of Materials) vorbereitet. Dies ist zur Vermeidung von Kontaminationen der bovinen ExRNA von FBS, enthält normalerweise ExRNAs EFD, Ribonucleoproteins und Lipoproteine zugeordnet. Für kleine RNA-Bibliothek-Vorbereitung müssen ExRNAs, abgeleitet aus 5 konfluierende Kolben von MSCs Bibliotheksbau ermöglichen.

  1. Waschen Sie die Zellen 3 X mit 20 mL PBS pro T175 Kolben. 20 mL EV Sammlung Medien pro konfluierende T175 Flasche mit MSCs und Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 48 h.
  2. Sammeln Sie die Medien und Zentrifugieren Sie die Medien für 10 min bei 300 X g und 4 ° C.
  3. Sammeln Sie den Überstand zu und Zentrifugieren Sie die Medien für 20 min bei 2.000 X g und 4 ° C.
  4. Sammeln Sie den Überstand zu und Zentrifugieren Sie die Medien für 30 min bei 15.500 X g und 4 ° C. Dann sammeln Sie die überstand.
  5. Übertragen Sie die Medien auf Ultrazentrifugen Röhren und pellet-ExRNAs 90 Minuten bei 100.000 x g und 4 ° C. Ein festen Winkel Rotor dient hier und das Pellet auf die Seite der Röhre verankert ist. Markieren Sie die Seite des Deckels und zeichnen Sie einen Kreis auf der Seite der Röhre wo das Pellet erwartet wird.
  6. Entfernen Sie den Überstand zu, trocknen Sie das Innere des Rohres durch das Rohr auf saugfähigem Papier umdrehen und verwenden Sie kleine Stücke von saugfähigem Papier, um die Flüssigkeit im Inneren des Rohres zu entfernen, ohne Sie zu berühren den Boden des Röhrchens. Aufschwemmen das Pellet in 200 μl PBS durch Vortexen für 30 s und nach oben und unten 20 X pipettieren.
  7. Bewertung der EVs und Biomoleküle mit Nanopartikel tracking-Analyse (NTA) (Abbildung 2).
    Hinweis: Die EVs und Biomoleküle kann mit Nanopartikel tracking-Analyse (NTA), dynamische Lichtstreuung (DLS) oder Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM)12bewertet werden.
  8. Speichern Sie die EVs und Biomoleküle bei-80 ° C bis weiter stromabwärts Experimente.
    Hinweis: Wenn EVs für funktionelle Studien verwendet werden sollen, muss zum Schutz vor bersten 20 % Glycerin hinzugefügt werden. Die Zellen können mit standard-Verfahren bei Bedarf gesammelt werden.

(3) EVs und RNA-assoziierten Biomoleküle Sammlung von differenzierten Zellen

Hinweis: EVs und RNA verbundenen Biomoleküle können auch von den Zellkulturmedien gesammelt werden, während die Zellen Differenzierung durchlaufen. Das Beispiel dargestellt im Protokoll beschreibt osteoblastischen Differenzierung und ExRNA Abholung am Tag 0 und 7 der Differenzierung. Wenn keine Differenzierung erforderlich ist, dann überspringen Sie Abschnitt 3 und fahren Sie mit Abschnitt 4.

  1. Bereiten Sie osteoblastischen Differenzierung Medien (DMEM mit 10 % FBS, 1 % P/S, 10 mM β-Glycerophosphat, 10 nM Dexamethason, 50 μM Ascorbat-2-Phosphat und 10 mM 1,25-Vitamin-D3) frisch jedes Mal.
  2. Einmal MSCs sind 80 % Zusammenfluss, der MSC-Medien zu osteoblastischen Differenzierung Medien.
  3. Ergänzen Sie die osteoblastischen Differenzierung Medien nach 2-3 Tagen.
  4. Am 5. Tag der Differenzierung, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen 3 X mit 20 mL PBS pro T175 Kolben.
  5. Fügen Sie 20 mL EV Kollektion Medium mit 10 mM β-Glycerophosphat, 10 nM Dexamethason, 50 μM Ascorbat-2-Phosphat und 10 mM 1,25-Vitamin-D-3 pro konfluierende T175 Flasche mit MSCs. Incubate die Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 48 h zu gewährleisten setzte Differenzierung bei der Erhebung der EVs und Biomoleküle.
  6. Sammeln Sie die Medien am 7. Tag und fahren Sie mit der EVs und Biomoleküle wie 2.2-2.6 beschrieben zu isolieren.
  7. Samen Sie für die Qualitätskontrolle Zellen in 96-Brunnen oder 6-Brunnen Differenzierung mit einer alkalischen Phosphatase (ALP) Aktivität Assay bewerten oder mit quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), beziehungsweise.
    Hinweis: Abbildung 3 ist ein Beispiel zeigt osteogene Differenzierung der Zellen.

(4) RNA-Extraktion und Qualitätskontrolle

  1. Proben aus Schritt 2,8 auf Eis auftauen. Extrahieren Sie RNA mittels einer RNA Isolierungskit (Table of Materials).
  2. Eluieren der RNS aus der Spalte mitgelieferten RNA Isolierung (Table of Materials) in 100 μl RNase-freies Wasser.
  3. Die RNA durch Ethanol Niederschlag durch Zugabe von 1 μl von Glykogen, 10 μL der 2 M pH 5,5 Natriumacetat und 250 μL vorgekühlt 99 % Ethanol in 100 μL gereinigtes RNA zu konzentrieren.
  4. Inkubieren Sie die Proben bei-20 ° C über Nacht, die RNA auszufällen. Pellet-RNA durch Zentrifugieren für 20 min bei 16.000 x g und 4 ° C.
    Hinweis: Die Kugel ist weiß aufgrund Co Niederschlag mit Glykogen.
  5. Den Überstand zu entfernen und Waschen der RNA-Pellet mit 1 mL von 75 % Ethanol. Pellet-RNA wieder für 5 min bei 16.000 x g und 4 ° C.
  6. Entfernen Sie das Ethanol und lassen Sie den Deckel der RNA-Röhre offen für 5-10 min an der Luft trocken das RNA-Pellet. Die RNA-Pellet in 7 μl RNase-freies Wasser Aufschwemmen.
  7. Überprüfen Sie die RNS-Qualität und Konzentration mit einer Chip-basierte Kapillarelektrophorese-Maschine, um die RNA laut Protokoll des Herstellers vor Bibliotheksbau zu erkennen.
    Hinweis: Eine repräsentative Größenverteilung der RNA ist in Abbildung 4gezeigt.
  8. Zelluläre RNA mit einem kommerziellen Reinigung-Kit (Table of Materials), ggf. zu extrahieren.

5. Bibliotheksbau und Qualitätskontrolle

Hinweis: Kleine RNA-Bibliotheken werden mit kommerziellen Kits (Table of Materials) mit Anpassungen aufgrund der niedrigen RNA Eingang gebaut. Bibliotheksbau erfolgt auf dem gekühlten Block.

  1. Chill-Heizblock für 0,2 mL PCR Tubes auf Eis und pipette 5 μL der RNA aus Schritt 4.6 in 0,2 mL RNase-freie PCR Tubes auf einem gekühlten Block.
  2. Verdünnen Sie 3' Adapter (01:10) in RNase-freies Wasser in einem 0,2 mL RNase-freie PCR-Röhrchen. 0,5 μL verdünnt Adapter und mischen mit 5 μl RNA durch Pipettieren nach oben und unten 8 X und Zentrifuge kurz, die Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres zu sammeln.
  3. Brüten Sie die RNA und 3' Adapter-Mischung bei 70 ° C für 2 min in einem vorgeheizten Thermocycler und legen Sie die Probe wieder auf den gekühlten Block.
  4. 1 μl der Ligatur Puffer, 0,5 μl RNase-Inhibitor und 0,5 μl T4 RNA Ligase (Löschung Mutant) in die RNA-3'-Adapter-Mischung hinzufügen. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 8 X pipettieren und Zentrifugieren Sie kurz.
  5. Inkubieren Sie das Rohr auf 28 ° C für 1 h in den vorgeheizten Thermocycler.
  6. Fügen Sie 0,5 μl Stopplösung in das Probenröhrchen mit dem Rohr der Aufenthalt in den Thermocycler, mischen, indem Sie nach oben und unten 8 X pipettieren und weiterhin bei 28 ° C für 15 min inkubieren.
  7. Verdünnen Sie 5' Adapter (01:10) in RNase-freies Wasser in einem 0,2 mL RNase-freie PCR-Röhrchen. Fügen Sie 0,5 μL der 5'-Adapter in einem separaten RNase-freie 0,2 mL PCR Rohr, Hitze der 5'-Adapter bei 70 ° C für 2 min in den vorgeheizten Thermocycler und legen Sie die Probe auf dem gekühlten Block.
  8. Fügen Sie 0,5 μL von 10 nM ATP, 0,5 μl T4 RNA Ligase, das 5'-Adapterrohr hinzu, mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 8 X pipettieren und Zentrifugieren Sie kurz um die Flüssigkeiten in den Boden zu sammeln.
    Notiz: Behalten Sie die 5'-Adapter gekühlte Block so weit wie möglich.
  9. Die Probe aus Schritt 5.6 1,5 μL der 5'-Adapter Mischung hinzu, und mischen Sie sehr leicht durch Pipettieren 8 X langsam. Inkubation der Probe bei 28 ° C für 1 Stunde in den vorgeheizten Thermocycler.
  10. Verdünnen Sie RT Primer 01:10 in RNase-freies Wasser in eine RNase-freie 0,2 mL PCR-Röhrchen. 0,5 μL verdünnt RT Grundierung in die Probe aus Schritt 5.9, Mischung sehr sanft durch Pipettieren langsam nach oben und unten 8 X hinzufügen und kurz zentrifugieren.
  11. Inkubation der Probe bei 70 ° C für 2 min in den vorgeheizten Thermocycler und legen Sie die Probe auf einem gekühlten Block.
  12. Hinzufügen von 5 x ersten Strang Puffer, 0,5 μL 12,5 mM dNTP-Mix, 0,5 μL von 100 mM Dithiothreitol (DTT), 0,5 μl RNase-Inhibitor und 0,5 μl Reverse Transkriptase 1 μl. Mischen Sie sehr vorsichtig, indem Sie langsam nach oben und unten 8 X pipettieren und Zentrifugieren Sie kurz.
  13. Inkubation der Probe bei 50 ° C für 1 h in den vorgeheizten Thermocycler cDNA zu erhalten.
  14. Fügen Sie 4,25 μL von Reinstwasser, 12,5 μl des PCR-Mixes, 1 μL Index Grundierung und 1 μl universelle Grundierung in die cDNA. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 8 X pipettieren und Zentrifugieren Sie kurz.
  15. Legen Sie die Probe in einem Thermocycler und der Cycler wie folgt einrichten: 98 ° C für 30 s; 15 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 15 s; und am Ende des Zyklus mit 72 ° C für 10 Minuten.
    Hinweis: Die vorbereitete Bibliothek kann bei-20 ° C eine Woche aufbewahrt werden.
  16. Reinigen die RNA-Bibliothek durch die Trennung der Bibliothek auf einem DNA-Gel und schneiden das Gel (Gel Extraction) zwischen 140 bp und 160 bp und eluierenden der Bibliothek aus dem Gel nach dem Protokoll von der Bibliothek-Baukasten gegeben.
    Hinweis: In dieser Studie die vorbereitete Schritt 5.15-Bibliothek wird geladen auf einem kommerziellen Gel (Table of Materials) und die Bibliothek zwischen 140 bp und 160 bp wird gereinigt, durch eine automatisierte DNA Größe Plasmafraktionierer (Table of Materials) nach der Protokoll des Herstellers.
  17. Konzentrieren und Waschen der Bibliothek aus Schritt 5.16 mit einem spaltenbasierten PCR-Reinigung-Kit (Table of Materials) und die Bibliothek in 10 μl RNase-freies Wasser schließlich eluieren.
  18. 1 μl der gereinigten Bibliothek auf einem DNA-Chip (Table of Materials) überprüfen Sie die Größe der Bibliothek nach Protokoll des Herstellers zu laden.
  19. Verdünnen Sie 1 μL der gereinigten Bibliothek (1: 1000) in 10 mM pH 8.0 Tris-HCl mit 0,05 % Polysorbat 20 und quantifizieren die Bibliothek von qPCR mit einem kommerziellen Bibliothek Quantifizierung Kit, um die Bibliothek-Konzentration mit Hilfe der DNA-Standards im Kit zu quantifizieren.
  20. Pool gleiche Mengen der Bibliotheken entsprechend den Anforderungen der Sequenzierung Maschine und Sequenz auf einem Hochdurchsatz-Sequenzierung System.
    Hinweis: Der Bibliotheksbau zelluläre RNA kann erfolgen unter Verwendung der gleichen Kits durch Anschluss an standard-Protokoll der Kits.

(6) Bioinformatik-pipeline

Hinweis: Dies ist eine interne Pipeline und die hier verwendeten Programme finden Sie in der Tabelle Materialien.

  1. Trim entfernt minderwertige liest und Adapter Sequenzen aus dem rohen lautet entfernen.
  2. Verschiedene Arten von RNAs sauber liest zuordnen.
    1. Kommentieren Sie tRNAs dadurch, dass zwei Unterschiede, weil die stark modifizierte tRNA-Sequenzen durch Reverse Transkriptase häufigen Basis Misincorporation verursachen.
    2. Kommentieren Sie MiRNAs durch Zuordnung zu menschlichen MiRNAs aus MiRBase v21 erlaubt Null Fehlanpassungen. Da MiRNAs unterliegen A und U Nontemplated 3' Ende Ergänzungen, Sequenzen, die nicht zugeordnet werden sind 3' getrimmt von bis zu drei A und/oder T Nts wonach liest menschlichen MiRNAs und andere MiRNAs aus MiRBase v21 erlaubt Null Fehlanpassungen zugeordnet sind.
    3. Anmerkungen Sie zu anderen relevanten kleinen RNAs (SnRNA, SnoRNA, PiRNA und Y RNAs) dadurch, dass ein Missverhältnis.
    4. Ordnen Sie die verbleibenden nicht zugeordnete liest lange Datasets in RNA (rRNA, andere RNA aus Rfam und mRNA) um Abbau zu beurteilen.
    5. Beschriften Sie die Sequenzen des menschlichen Genoms.
    6. Beschriften Sie die Sequenzen mit bakteriellen Genomen.
    7. MiRNA Ausdruck mithilfe der folgenden Formel zu normalisieren: MiRNA zählt / zählt die Summe von allen zugeordneten MiRNAs) X 106.

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Representative Results

In diesem Protokoll beschriebene Methode ist optimiert, um ExRNA von MSC-Kultur für die Sequenzierung der nächsten Generation zu sammeln. Die allgemeine Systematik des Workflows ist in Abbildung 1 auf der linken Seite und die jeweiligen Qualitätskontrolle Checkpoints sind auf der rechten Seite.

Die Morphologie der Zellen am Tag der Sammlung für undifferenziert (Abbildung 3A) und (Abb. 3 b) differenzierte Zellen gezeigt. Darüber hinaus sind repräsentative normalisierte ALP Aktivität der Zellen induziert für 7 Tage auch (Abbildung 3) gezeigt. Hier ist ALP Aktivität ca. 2,5-fache der uninduced Zellen.

Drei T175 Fläschchen von konfluierende MSCs Ertrag 2-5 x 1010 Partikel/mL (Abbildung 2). Mittlere Teilchengröße ist ca. 160-165 nm, während die meisten Partikel 130-140 nm sind. Gab es ein paar kleinere Gipfel zwischen 200 und 500 nm, die großen komplexen oder großen Aggregaten anzeigen würde.

Da RNA schnell beeinträchtigt werden kann, halten Sie uns strikt an die Bedingungen der RNA-Extraktion gemäß Kit oder verwendete Protokoll. RNase-freie Nutzungsbedingungen, insbesondere RNase-freies Wasser Aufschwemmen der RNS und RNA auf Eis als möglich zu halten. Nach der Extraktion kann die RNA mit einem Chip-basierte Kapillarelektrophorese Maschine quantifiziert werden. Vertreter Electropherograms der RNA nach analysierten sind in Abbildung 4dargestellt. Die Electropherogram des ExRNAs umfasst eine breite Palette von RNAs (Abb. 4A). Zelluläre RNA hat dagegen sehr ausgeprägte Peaks bei rund 70-120, 1800 und 3800 nt, die tRNA/5 s entsprechen rRNA / 5.8S rRNA 18 s rRNA und 28 s rRNA, bzw. (Abbildung 4 b). Die RNA-Integrität-Anzahl (RIN) repräsentiert die Qualität der RNA. Eine gute RIN zelluläre RNA ist > 8 (d. h. fast keine RNA-Abbau). Der Algorithmus RIN basiert ist das Verhältnis zwischen 28 s und 18 s. Dies bedeutet, dass RIN kein guter Indikator für RNS-Qualität des ExRNAs ist, weil in voller Länge rRNAs in der Regel nicht im ExRNAs nachweisbar sind.

Im Anschluss an RNA-Extraktion die MiRNA-Bibliotheken wurden gebaut und die cDNA-Bibliotheken wurden durch Gelelektrophorese getrennt. Die Adapter ligiert cDNA von der MiRNAs beträgt zwischen 140 und 160 nt. Die Qualität der Bibliothek wurde dann auf einem Chip-basierte Kapillarelektrophorese-Rechner (Abbildung 5) visualisiert. Abbildung 5A und 5 b Abbildung sind die Bibliotheken aus der zellulären RNA bzw. am Tag 0 und Tag 7. Abbildung 5 und Abbildung 5 sind die ExRNA Bibliotheken bzw. am Tag 0 und Tag 7. Alle vier Proben hatte Gipfel bei rund 140 nt, das erfolgreiche MiRNA Bibliotheksbau anzugeben. Die Höhe der cDNA in den Bibliotheken wurde durch qPCR mit einer Bibliothek Quantifizierung Kit quantifiziert. Die Quantifizierung Zyklus (Cq) des Standards wurde gegen den Logarithmus der Konzentration zu einer Standardkurve (Abbildung 6) aufgetragen. Die Gleichung der Standardkurve wurde dann verwendet, um die Konzentration der Bibliotheken (Tabelle 1) zu berechnen. In unserem Beispiel war die Konzentration der Bibliotheken von ExRNAs 5 bis 8 nM, die deutlich unter Bibliotheken aus zellulärer RNAs (8-30 nM). Die Bibliotheken wurden dann gebündelt mit gleicher Höhe und schickte für die Sequenzierung.

Nachdem die Bibliotheken sequenziert wurden, wurden minderwertige liest entfernt mit FASTX-Toolkit und die resultierende Qualität der Bibliothek ExRNAs war hoch und vergleichbar mit der von den Bibliotheken aus den Zellen (Abbildung 7AB). Die Länge der Sequenz der Bibliotheken von Zellen hatte einen einzigen Höhepunkt bei rund 22 nt (Abbildung 7), das mit MiRNAs korreliert. Im Gegensatz dazu die Bibliotheken von ExRNAs wurden heterogener und 3 großen Gipfel enthalten: 22 nt, 30 nt und 33 nt (Abbildung 7). Ähnlich wie ihre zellulären Pendants, der Peak bei 22 nt ist die MiRNAs. Näherer Betrachtung ergab, dass die Peaks bei 30 und 33 nt tRNAs Hälften/Fragmente oder PiRNAs. Anschließend wurden die Anmerkungen des zugeordneten lautet geplottet. Die meisten der liest (65,1 %) von der zellulären RNA auf menschliche MiRNAs und jeder von den anderen kleinen RNAs entfielen auf einen kleinen Teil des zugeordneten lautet (Abb. 8A) abgebildet. Kontrastreich, nur 8 % der ExRNAs menschlichen MiRNAs (Abbildung 8 b) zugeordnet. Die am häufigsten vorkommende kleine RNA, der das liest zugeordnet, wurden tRNAs. Die meisten der lautet waren "unübertroffene liest" (43 %). Weitere Prüfung der unübertroffene liest aus ExRNAs zu globalen Datenbanken führte zu der überraschenden Erkenntnis, die meisten von ihnen die bakterielle Sequenzen entsprechen (74 % und 85 % für D0 und D7 ExRNA; ( Tabelle 2). Im Gegensatz dazu nur 0,9 % der zellulären RNA war unübertroffen, und von denen, nur 10 % zugeordnet Bakterien. Ein Vergleich mit der bovinen Genom zeigte weniger als 1 % Übereinstimmung darauf hindeutet, dass FBS keine Quelle der Verschmutzung (Tabelle 2 war). ExRNAs zeigen daher eine atypische Profil im Vergleich zu normalen zellulären RNA.

Figure 1
Abbildung 1: Workflow ExRNA Sequenzierung und Analyse. Der gesamte Workflow ist auf der linken Seite in die grauen Kästchen dargestellt und Qualitätskontrolle verbunden mit jedem Schritt ist in die roten Kästchen auf der rechten Seite. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Größenverteilung der Partikel an Tag 0 und Tag 7 der Differenzierung von Zellen sezerniert. Vertreter NTA Ergebnisse der Partikel gesammelt aus 3 x T175 Kolben bei (A) 0 und (B) Tag 7 der Differenzierung. Unter den Diagrammen sind die jeweiligen Mittelwert und Modus-Größen sowie der Konzentration der Partikel tabellarisch dargestellt. SD: Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Zelle Morphologie und osteogene Differenzierung vor der extrazellulären RNA Sammlung. (A) Schliffbild der undifferenzierten BMSCs am Tag der Sammlung mit Sammlung Medien kultiviert. (B) Schliffbild der BMSCs differenziert für 7 Tage mit Sammlung Medien am Tag der Sammlung. Skalieren von Balken = 100 µm. (C) ALP Aktivitäten der Zellen wurden auf ihre jeweiligen Zelle künstliche normalisiert. Die Werte aufgetragen wurden, die von drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Vertreter Electropherogram RNA Integrität nach RNA Extraktion. RNA-Analysen der extrazellulären RNA (A) und zelluläre RNA (B). Die x-Achse ist die Länge der RNA (nt) und die y-Achse ist die Fluoreszenz. Der erste Gipfel ist die Leiter bei 25 nt. ribosomalen RNAs sind dargestellt als 18 (1.800 nt) und 28 s (3.800 nt). RNA-Integrität-Anzahl (RIN) ist ein Indikator für RNS-Qualität basiert auf der 18 s und 28 s ribosomalen RNA-Integrität. Höheren RIN Zahlen gleich besseren Qualität. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Vertreter Electropherogram der cDNA-Bibliotheken nach Bibliotheksbau. DNA-Analysen der Bibliotheken von (A) Zellen am Tag 0, (B) am Tag 7, (C) extrazelluläre RNA von Tag 0 und (D) extrazelluläre RNA von Tag 7. Grüne und violette Zahlen sind die Leitern bei 35 nt und 10.380 nt, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: cDNA Bibliothek Quantifizierung und Berechnung. Bibliotheken wurden zwischen 500 - 1.000 Mal für diejenigen die aus ExRNA und zwischen 1.000 und 4.000 Mal für Zelle RNA verdünnt. Die Bibliotheken wurden neben den Standards aus der Bibliothek Quantifizierung Kit ausgeführt. Cq-Mittelwerte der DNA-Standards wurden aufgetragen gegen Log10 Konzentration (pM) um eine Standardkurve, eine Gleichung für die Standardkurve und eine R-2 -Wert zu generieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Qualitätsfaktoren und Längenverteilung Sequenzen. Niedriger Qualität liest und Adapter-Sequenzen wurden mit FASTX-Toolkit für Zellen (A) und (B) ExRNAs getrimmt. Die Längenverteilung sauberer liest für Zellen (C) und (D) ExRNAs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: Annotation von kleinen RNAs nach Sequenzierung. Anmerkungen sind Prozentsätze der sauberen Lesevorgänge für Zellen (A) und (B) ExRNAs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Probe Verdünnungsfaktor CQ-Wert Log(PM) Konzentration (pM) Konzentration bedeutet (pM) Konzentration bedeutet * (452/143) Multiplizieren Sie mit Faktor Dillution (pM)
BMSC D0 exRNA 500 7,72 0.702 5.036 5.276 16.678 8338.993
BMSC D0 exRNA 500 7.57 0.754 5.677
BMSC D0 exRNA 500 7.7 0.709 5.117
BMSC D0 exRNA 1000 8.64 0.383 2.416 2.365 7.477 7476.846
BMSC D0 exRNA 1000 8.68 0.369 2.340
BMSC D0 exRNA 1000 8.68 0.369 2.340
BMSC D7 exRNA 500 8,52 0.425 2.659 3.221 10.182 5090.913
BMSC D7 exRNA 500 8.42 0.459 2.880
BMSC D7 exRNA 500 7.97 0.615 4,125
BMSC D7 exRNA 1000 8,87 0.303 2.011 1.933 6.110 6110.391
BMSC D7 exRNA 1000 8,92 0.286 1,932
BMSC D7 exRNA 1000 8.97 0.269 1.857
BMSC D0 Zelle 1000 6,86 1.000 10,005 9.810 31.007 31006.974
BMSC D0 Zelle 1000 6,91 0.983 9.614
BMSC D0 Zelle 4000 8.68 0.369 2.340 2.398 7.581 30322.041
BMSC D0 Zelle 4000 8.59 0,400 2.514
BMSC D0 Zelle 4000 8.68 0.369 2.340
BMSC D7 Zelle 1000 8.44 0.452 2.834 2.880 9.104 9104.439
BMSC D7 Zelle 1000 8.43 0.456 2.857
BMSC D7 Zelle 1000 8,39 0.470 2.950
BMSC D7 Zelle 4000 10,36 -0.213 0.612 0.702 2.218 8872.689
BMSC D7 Zelle 4000 10.27 -0.182 0,658
BMSC D7 Zelle 4000 9.97 -0.078 0.836
Berechnungen:
Log(PM) =-0.3467 x (Beispiel Cq Wert) + 3.3786; Verwenden Sie die Standardkurve und Formel
Konzentration (pM) = 10^log(pM)
Größe der Ausgleichungsberechnung = Größe der DNA-Standard (452 bp) dividiert durch die durchschnittliche Fragmentlänge (143 bp)

Tabelle 1: MiRNA Bibliothek Quantifizierung.

Beispiel: # liest nicht zuordnen von menschlichen # liest zuordnen zu Bakterien % bakterielle mal gelesen # liest Kuh zuordnen % Rinder mal gelesen
BMSC D0 Zelle 131007 9858 8 % 99 0,08 %
BMSC D7 Zelle 169730 7935 5 % 188 0,11 %
BMSC D0 exRNA 6122833 4551477 74 % 891 0,01 %
BMSC D7 exRNA 7046691 5970086 85 % 771 0,01 %

Tabelle 2: Der Prozentsatz der unübertroffene liest die Karte gegen Bakterien und Rinder mal gelesen.

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Discussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation von ExRNAs, die differentielle Expressionsanalysen aus niedrigen Eingabesamples ermöglicht. Die Einhaltung eines bestimmten Protokolls für EV und ExRNA Isolation ist wichtig, weil auch kleine Änderungen (z.B. der Ultrazentrifugation Schritt oder eine Änderung im Rotor Typ) auf das Transkriptom Einfluss können und MiRNA13,14 Ebenen. Also, unabhängig davon, wie die ExRNA isoliert ist, ist es wichtig, das gleiche experimentelle und bioinformatischen Verfahren zuweisen, die Proben in einem Experiment, um die Ergebnisse vergleichen zu können.

Integrität der RNA ist in der Regel auf die Bioanalyzer bewertet. Jedoch da ExRNAs frei von sind voller Länge rRNA, ihr RIN-Wert ist sehr niedrig, aber dies nicht unbedingt geringer Qualität RNA-Proben. Darüber hinaus die RNA-Konzentration von der ExRNAs sehr unterschiedlich und ist oft ungenau. Daher anstelle von RNA Qualitätsbeurteilung und Quantifizierung die RNA auf das Bioanalyzer verwenden die gleiche Menge an Medien jedes Mal zur Weiterverarbeitung. Auch Aufschwemmen der extrahierten RNS in das gleiche Volumen der Wiederfreisetzung Puffer und verwenden das gleiche Volumen für Bibliotheksbau.

Kleine RNA Bibliotheksbau wurde durch Verringerung der Menge an Adaptern auf ein Zehntel des standard-Protokolls und die Hälfte der anderen Reagenzien mit optimiert. Reduzierung der Adapter Adapter Dimere nicht nur verhindert, sondern verhindert auch intramolekulare RNA Circularization15. Der Rückgang der Reagenzien ist optimiert für die Illumina TruSeq kleine RNA Sample Prep Kit. Andere Kits verwendet werden soll, empfiehlt es sich, auch Adapter und Reagenzien entsprechend senken, wenn das Kit gibt an, dass es maßgeschneiderte zu niedrig Eingabesamples. Schließlich stieg der PCR-Zyklus für Bibliotheksbau von 12 auf 15 Zyklen in diesem Protokoll, um die geringe Konzentration von ExRNAs zu berücksichtigen. Wir haben festgestellt, dass dies die optimale Anpassung ohne Verstärkung Vorurteile15zu sehen sein.

Verschiedene Metriken Qualitätskontrolle können einschließlich Basis Qualitätskennzahlen bewertet und Längsprofil gelesen werden. Dabei Bioinformatik-Analysen, die Basis Qualität des lautet in zelluläre RNA und ExRNAs waren ähnlich; die Längenverteilung und die kommentierten Herkunft der Sequenzen waren jedoch völlig anders. Die meisten Lesevorgänge von zellulären RNA auf menschliche MiRNAs, jedoch ein großer Teil des ExRNA lautet abgebildet waren unübertroffen liest. Bei genauerer Betrachtung der unübertroffene liest erwies sich bakterielle liest (Tabelle 2). Das war überraschend, weil Antibiotika routinemäßig in unserer Kultur verwendet wurden. Unser Ergebnis deckt sich gut mit andere Berichte, die zeigte auch großen Anteil der unübertroffene liest bei der Sequenzierung Zellkultur ExRNA16abgeleitet. Einer der Gründe für diese Verunreinigungen ist, dass Bakterien in Größe mit extrazellulären komplexe oder EVs überlappen und daher Co während der Ultrazentrifugation Schritt17reinigen. Bisherige Veröffentlichungen haben großflächige Kontamination bestimmter Bakterien in Kulturmedien identifiziert, die unter normalen Zelle Lab Verfahren18unentdeckt zu bleiben. Bisher weitgehend ignoriert wurde dieses Problem aber beim Reinigen und analysieren der ExRNAs Rechnung getragen werden sollte.

Dieses Protokoll enthält eine vollständige Anleitung zur Ernte ExRNAs aus Kultur, Medien, Optimierung von kleinen RNA-Bibliothek-Vorbereitung und Verarbeitung die rohen Daten. Dieses Protokoll hebt insbesondere die verschiedenen Checkpoints der Qualitätskontrolle während des Prozesses zu zeigen, wie tief Eingabesamples (wie ExRNAs) vom Normalstichprobe Vorbereitungen abweichen können, so dass andere arbeiten mit niedrigen Eingabesamples wissen, was zu erwarten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir sind dankbar, Herr Claus Bus und Frau Rita Rosendahl bei iNANO für ihre technische Unterstützung. Besonderen Dank an Dr. Daniel Otzen dafür, dass unsere häufigen Gebrauch von seinem Ultrazentrifugen. Diese Studie wurde unterstützt durch den Innovationsfonds Dänemark (MUSTER-Projekt).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells ATCC PCS-500-012 Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit Lonza PT-3001 Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS Gibco A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA Gibco 25200056
T175 Flask Sarstedt 833,912
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline Sigma 806552
Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly Beckman Coulter 355618
Beckman Coulter Type 60 Ti Rotor used here
NucleoCounter Chemometec NC-3000 Cell Counter
β-glycerophosphate Calbiochem 35675 Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone Sigma D4902-25MG Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma D1530-1MG Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1514 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits Roche KK4824 Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) Illumina RS-200-0012 Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep Sage Science Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit Cold Spring Harbor Lab Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt Adaptor removal in step 6
Bowtie Mapping of clean reads in step 6
Samtools To make the expression profile in step 6
Bedtools To make the expression profile in step 6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Tags

Genetik Ausgabe 145 mesenchymale Stammzellen extrazelluläre RNAs Exosomen extrazelluläre Vesikel Ribonucleproteins Micro-RNAs kleine RNAs Sequenzierung der nächsten Generation kleine RNA Bibliotheksbau
Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen
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Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. … More

Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. T., Mothershead, C. R., Su, J., Kjems, J. Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e58655, doi:10.3791/58655 (2019).

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