Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Published: March 8, 2019 doi: 10.3791/58655
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Interdisciplinary Nanoscience Centre, Aarhus University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol laat zien hoe om te zuiveren van extracellulaire microRNAs van cel voedingsbodems voor kleine RNA bibliotheek constructie en de volgende generatie sequencing. Verschillende kwaliteitscontrole controlepunten worden beschreven om lezers te begrijpen wat u kunt verwachten wanneer u werkt met lage input monsters als exRNAs.

Abstract

Extracellulaire en circulerende RNAs (exRNA) worden geproduceerd door vele celtypes van het lichaam en in talrijke lichaamsvloeistoffen zoals speeksel, plasma, serum, melk en urine bestaan. Een subset van deze RNAs zijn de posttranscriptional regelgevende instanties – microRNAs (miRNAs). Om de miRNAs geproduceerd door specifieke celtypes af te bakenen, in vitro cultuur systemen kunnen worden gebruikt om te oogsten en profiel exRNAs afgeleid van een subset van de cellen. De secreted factoren van mesenchymale stamcellen zijn betrokken bij het verlichten van talrijke ziekten en wordt gebruikt als het modelsysteem van in-vitro hier. Deze paper beschrijft het proces van collectie, zuivering van kleine RNA en bibliotheek generatie reeks extracellulaire miRNAs. ExRNAs van voedingsbodems verschillen van cellulaire RNA door lage input monsters van RNA, waarin wordt gepleit voor geoptimaliseerde procedures. Dit protocol biedt een uitvoerige gids voor kleine exRNA sequencing van voedingsbodems, met kwaliteitscontrole controlepunten bij elke stap tijdens de zuivering van de exRNA en de sequencing.

Introduction

Extracellulaire en circuleren RNAs (exRNAs) zijn aanwezig in de verschillende lichaamsvloeistoffen en resistent zijn naar RNases1,2. Hun hoge overvloed, de stabiliteit en het gemak van toegankelijkheid zijn aantrekkelijk voor klinische beoordeling als diagnostische en prognostische markeringen3. De wijze van vervoer voor exRNAs omvatten extracellulaire blaasjes (EVs), vereniging met lipoproteïnen (zoals high-density lipoprotein; HDL) en ribonucleoprotein complexen (zoals met Argonaute2 complexen)4.

Een subset van exRNAs zijn microRNAs (miRNAs), die kleine niet-coderende RNAs van ongeveer 22 nt die regelen posttranscriptional genexpressie. Ex-miRNAs zijn betrokken bij de cel-cel communicatie en regulering van de cel homeostase5. Bijvoorbeeld, HDL ex-miR-223 levert aan endotheliale cellen te onderdrukken intercellulaire adhesie molecuul 1 (ICAM-1) en ontsteking6. MiR-223 is interessant, ook tijdens het vervoer door extracellulaire blaasjes uit leukocyten aan Long kankercellen, programmering te nemen op een meer invasieve fenotype7gezien. Transcriptome van ex-miRNAs van de verschillende lichaamsvloeistoffen en cel kweekmedium zal dus aanzienlijk verbeteren ons begrip van ex-miRNA signalering.

Kleine RNA sequencing (kleine RNA seq) is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om te begrijpen de transcriptomics van kleine RNAs. Niet alleen kunnen verschillende steekproeven onder differentially uitgedrukte bekende RNAs worden vergeleken, maar nieuwe kleine RNAs kunnen ook worden gedetecteerd en gekenmerkt. Het is bijgevolg ook een robuuste methode te identificeren differentially uitgedrukte miRNAs onder verschillende omstandigheden. Echter, een van de horden voor kleine RNA seq is de moeilijkheid bij het genereren van kleine RNA seq bibliotheken van lage exRNA input vloeistoffen zoals cerebrospinaal vocht, speeksel, urine, melk, serum en kweekmedia. Het TruSeq kleine RNA bibliotheek Prep-protocol van Illumina vereist ongeveer 1 microgram van totaal RNA van hoge kwaliteit en het instellen van NEBNext kleine RNA bibliotheek Prep protocol van New England Biolabs vereist 100 ng-1 µg van RNA8,9. Vaak, totaal RNA van deze monsters zijn onder de detectiegrens voor conventionele UV-vis spectrofotometers.

Ex-miRNAs afgeleid van lichaamssappen zijn potentieel goede prognostische en diagnostische markers. Echter, om de functionele gevolgen te bestuderen of om te bepalen van de oorsprong van bepaalde ex-miRNAs, cel cultuur systemen worden vaak gebruikt in plaats daarvan. Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn uitvoerig bestudeerd omdat hun EVs zijn betrokken bij het verlichten van vele ziekten met inbegrip van myocardinfarct, ziekte van Alzheimer en graft versus host ziekte10. Hier tonen we de zuivering van ex-miRNAs van beenmerg-afgeleide MSCs (BMSCs) en de specifieke stappen gebruikt om kleine RNA bibliotheek constructie, sequencing en data-analyse (Figuur 1) te optimaliseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Mesenchymale stamcellen groeimedium (MSC media) bereid is vooraf zoals aangegeven in de Tabel van materialen.

1. de celkweek

Opmerking: Menselijke mesenchymale stamcellen kan worden verkregen uit het beenmerg, adipeus weefsel of andere bronnen11. U kunt ook kunnen hMSCs gekocht worden via een leverancier. De BMSCs gebruikt in dit protocol werden afgeleid van het beenmerg van de patiënt en gekocht van een bedrijf.

  1. 1 x 106 BMSCs in een maatkolf van de T175 met 20 mL MSC media ontdooien. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 en vervangen de media elke 2-3 dagen tot 80% confluentie.
  2. Spoel de cellen met 5 mL 1 x PBS en negeren de PBS.
  3. Loskoppelen van de cellen door toevoeging van 5 mL van 0,05% trypsine-EDTA en incuberen de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Tik op de zijkanten van de kolf te vergemakkelijken detachement.
  4. Voeg toe 15 mL MSC media inactivering van de trypsine, loskoppelen van de cellen van het oppervlak, en Pipetteer op en neer voor het verkrijgen van eencellige schorsingen.
  5. Het verzamelen van de cellen in een tube 50 mL en spin down voor 5 min op 300 x g tot pellet van de cellen.
  6. Resuspendeer de cellen in 1 mL MSC media en met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
    Opmerking: Primaire menselijke beenmerg MSCs op 80% confluentie in de kolf van een T175 is ongeveer 2 x 106 cellen.
  7. Plaat hMSCs op 2.000 cellen/cm2 in verse MSC media in 5 T175 kolven. De cellen bij 37 ° C met 5% CO2 groeien en vervangen de media om 2-3 dagen tot 5 maatkolven van 90% confluente T175 kolven worden verkregen.

2. EVs en RNA-geassocieerde biomoleculen collectie

Opmerking: EV collectie media is vooraf bereid (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium [DMEM] met het foetale runderserum [FBS] 10% en 1% penicilline/streptomycine [P/S]). EV collectie media is normale MSC media, maar bereid met commerciële EV-verarmd FBS (Tabel van materialen). Dit is het voorkomen van boviene exRNA verontreiniging van FBS, waarin normaal exRNAs EVs, ribonucleoproteins en lipoproteïnen is gekoppeld. Voor kleine RNA bibliotheek voorbereiding, zijn exRNAs afgeleid van 5 confluente maatkolven van MSCs vereist om de bouw van de bibliotheek.

  1. Wassen van de cellen 3 x met 20 mL PBS per T175 kolf. Voeg 20 mL EV collectie media per confluente T175 kolf van MSCs en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 48 uur.
  2. Verzamelen van de media en centrifugeer de media voor 10 min bij 300 x g - en 4 ° C.
  3. De bovendrijvende vloeistof verzamelen en centrifugeer de media voor 20 min op 2.000 x g - en 4 ° C.
  4. De bovendrijvende vloeistof verzamelen en centrifugeer de media voor 30 min bij 15.500 x g - en 4 ° C. Vervolgens verzamelen de bovendrijvende substantie.
  5. De media overbrengen ultracentrifuge buizen- and -pellet van de exRNAs voor 90 min op 100.000 x g - en 4 ° C. Een vaste hoek rotor is hier gebruikt en de pellet wordt verankerd aan de kant van de buis. Mark van de kant van het deksel en teken een cirkel aan de kant van de buis waar de pellet wordt verwacht.
  6. Verwijder het supernatant, droog de binnenkant van de buis door het omkeren van de buis op absorberend papier en gebruik van kleine stukjes van absorberend papier te verwijderen van de vloeistof in de buis zonder het aanraken van de onderkant van de buis. Resuspendeer de pellet in 200 μL van PBS van vortexing voor 30 s en pipetteren op en neer 20 x.
  7. Beoordeling van de EVs en biomoleculen met nanoparticle voor het bijhouden van analyse (NTA) (Figuur 2).
    Opmerking: De EVs en biomoleculen kan worden beoordeeld met nanoparticle bijhouden analyse (NTA), Dynamische lichtverstrooiing (DLS) of Transmissie Electronenmicroscopie (TEM)12.
  8. Bewaren de EVs en biomoleculen bij-80 ° C tot verder stroomafwaarts experimenten.
    Opmerking: Als EVs worden gebruikt voor functionele studies gaat, 20% glycerol moet worden toegevoegd om hen te beschermen van bezwijken. De cellen kunnen worden verzameld met behulp van standaardprocedures indien nodig.

3. EVs en RNA-geassocieerde biomoleculen collectie van gedifferentieerde cellen

Opmerking: EVs en RNA verbonden biomoleculen kan ook worden verzameld uit de cel voedingsbodems terwijl de cellen ondergaan differentiatie. Het voorbeeld afgebeeld in het protocol wordt beschreven osteoblastic differentiatie en exRNA collectie op dag 0 en 7 van differentiatie. Als geen differentiatie vereist is, dan slaat u sectie 3 en gaat u naar sectie 4.

  1. Osteoblastic differentiatie media voorbereiden (DMEM met 10% FBS, 1% P/S 10 mM β-glycerophosphate, 10 nM dexamethason, 50 μM ascorbaat-2-fosfaat en 10 mM 1,25-vitamine-D3) vers elke keer.
  2. Zodra MSCs 80% heuvels zijn, omzetten in de media MSC osteoblastic differentiatie media.
  3. Vullen de osteoblastic differentiatie media na 2-3 dagen.
  4. Op dag 5 van differentiatie, verwijder het medium en wassen van de cellen 3 x met 20 mL PBS per T175 kolf.
  5. Voeg 20 mL EV collectie media met 10 mM β-glycerophosphate, 10 nM dexamethason, 50 μM ascorbaat-2-fosfaat en 10 mM 1,25-vitamine-D3 per confluente T175 kolf van MSCs. de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 voor 48 uur om ervoor te zorgen bleef Incubate differentiatie en verzamel de EVs en biomoleculen.
  6. Verzamelen van de media op dag 7 en overgaan tot het isoleren van de EVs en biomoleculen zoals beschreven in stappen 2.2-2.6.
  7. Voor kwaliteitscontrole, seed cellen in 96-wells- of 6-putten te beoordelen van de differentiatie met behulp van een alkalische fosfatase (ALP) activiteit bepaling of met kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR), respectievelijk.
    Opmerking: Figuur 3 is een voorbeeld waaruit blijkt osteogenic differentiatie van de cellen.

4. RNA extractie en kwaliteitscontrole

  1. Ontdooi monsters uit stap 2.8 op ijs. Uittreksel RNA met behulp van een RNA isolatie kit (Tabel van materialen).
  2. Elueer RNA van de kolom waarin de RNA isolatie kit (Tabel van materialen) in 100 μl RNase-gratis water.
  3. Concentreren het RNA door ethanol neerslag door het toevoegen van 1 μL van glycogeen, 10 μL van 2 M pH 5.5 natriumacetaat en 250 μL van vooraf gekoeld 99% ethanol in 100 μl van gezuiverde RNA.
  4. Incubeer de monsters bij-20 ° C's nachts te precipiteren van RNA. Het RNA pellet door centrifugeren voor 20 min op 16.000 x g - en 4 ° C.
    Opmerking: De pellet is wit als gevolg van co precipitatie met glycogeen.
  5. Verwijder het supernatant en wassen van de RNA-pellet met 1 mL van 75% ethanol. Pellet RNA weer voor 5 min op 16.000 x g - en 4 ° C.
  6. Verwijder de ethanol en laat het deksel van de RNA-buis open gedurende 5-10 minuten in de lucht droog de RNA-pellet. Resuspendeer de pellet RNA in 7 μL van RNase-gratis water.
  7. Controleer de kwaliteit van RNA en de concentratie een capillaire elektroforese chip gebaseerde machine met behulp van het RNA volgens de fabrikant protocol vóór de bouw van de bibliotheek.
    Opmerking: Een representatieve grootteverdeling van het RNA wordt weergegeven in Figuur 4.
  8. Uittreksel cellulaire RNA met behulp van een commerciële zuivering kit (Tabel of Materials), indien nodig.

5. bibliotheek bouw en kwaliteitscontrole

Opmerking: Kleine RNA bibliotheken worden geconstrueerd met behulp van commerciële kits (Tabel of Materials) met aanpassingen als gevolg van de lage RNA input. Bouw van de bibliotheek wordt uitgevoerd op het gekoeld blok.

  1. Chill de verwarming blok voor 0,2 mL PCR buizen op ijs en Pipetteer 5 μL van RNA van stap 4.6 in 0,2 mL RNase-vrije PCR buizen op een koud blok.
  2. 3' adapters (1:10) verdund in RNase-gratis water in een buis van 0,2 mL RNase-gratis e-PCR. Voeg 0,5 μL van verdunde adapter en meng met 5 μL van RNA door pipetteren naar boven en beneden de 8 x en centrifuge kort voor het verzamelen van alle van de vloeistof bij de onderkant van de buis.
  3. Incubeer de RNA en 3' adapter mix bij 70 ° C gedurende 2 min. in een voorverwarmde thermische cycler en plaats vervolgens het monster terug op het gekoeld blok.
  4. 1 μL van afbinding buffer, 0,5 μL van RNase remmer en 0,5 μL van T4 RNA ligase (schrapping mutant) in het RNA en 3' adapter mengsel toevoegen. Meng door pipetteren op en neer 8 x, en kort centrifugeren.
  5. Incubeer de buis bij 28 ° C gedurende 1 uur in de voorverwarmde thermische cycler.
  6. Voeg 0,5 μL van eindeoplossing in het monsterbuisje met het verblijf in de thermische cycler buis, Meng door pipetteren op en neer 8 x en blijven broeden bij 28 ° C gedurende 15 minuten.
  7. 5' adapters (1:10) verdund in RNase-gratis water in een buis van 0,2 mL RNase-gratis e-PCR. 0,5 μL van 5' adapter toevoegen in een afzonderlijke RNase storingsvrije 0,2 mL PCR buis, warmte de adapter 5' bij 70 ° C gedurende 2 min. in de voorverwarmde thermische cycler, en plaats dan het monster op het gekoeld blok.
  8. Voeg 0,5 μL van 10 nM ATP, 0,5 μL van T4 RNA ligase aan de adapter buis 5', Meng door pipetteren op en neer 8 x en centrifugeer kort voor het verzamelen van alle vloeistoffen in de bodem.
    Opmerking: Houd de 5'-adapter op gekoeld blok zo veel mogelijk.
  9. Voeg 1,5 μl van het mengsel 5' adapter aan het monster uit stap 5.6, en meng heel zachtjes door pipetting 8 x langzaam. Incubeer het monster bij 28 ° C gedurende 1 uur in de voorverwarmde thermische cycler.
  10. RT primer 1:10 verdunnen in RNase-gratis water in een tube RNase storingsvrije 0,2 mL PCR. Voeg 0,5 μL van verdunde RT primer in het monster uit stap 5,9, meng heel zachtjes door het langzaam op en neer 8 x pipetteren en kort centrifugeren.
  11. Incubeer het monster bij 70 ° C gedurende 2 min. in de voorverwarmde thermische cycler en plaats vervolgens het monster op een koud blok.
  12. Voeg 1 μl van 5 x eerste onderdeel buffer, 0,5 μL van 12.5 mM dNTP mix, 0,5 μL van 100 mM dithiothreitol (DTT), 0,5 μL van RNase remmer en 0,5 μL van reverse-transcriptase. Meng heel zachtjes door het langzaam op en neer 8 x pipetteren en kort centrifugeren.
  13. Incubeer het monster bij 50 ° C gedurende 1 uur in de voorverwarmde thermische cycler cDNA verkrijgen.
  14. 4,25 μL van ultrazuiver water, 12,5 μL van de PCR-mix, 1 μL van index primer en 1 μL van universele primer in cDNA toevoegen. Meng door pipetteren op en neer 8 x, en kort centrifugeren.
  15. Leg het monster in een thermische cycler en de cycler als volgt instellen: 98 ° C gedurende 30 s; 15 cycli van 98 ° C voor 10 s, 60 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 15 s; en het einde van de cyclus met 72 ° C gedurende 10 minuten.
    Opmerking: De bereid bibliotheek kan worden opgeslagen bij-20 ° C gedurende één week.
  16. Zuiveren van de RNA-bibliotheek door te scheiden van de bibliotheek op een DNA-gel en snijden van de gel (gel extractie) tussen 140 bp en 160 bp en de bibliotheek van de gel na het protocol gegeven door het bouwpakket bibliotheek eluerende.
    Opmerking: In deze studie, de bereid bibliotheek vanaf stap 5.15 is geladen op een commerciële gel (Tabel van materialen) en de bibliotheek tussen 140 bp en 160 bp is gezuiverd uit door een geautomatiseerde DNA grootte fractionator (Tabel of Materials) volgens de protocol van de fabrikant.
  17. Concentreren en wassen van de bibliotheek vanaf stap 5.16 met behulp van een kolom gebaseerde PCR zuivering kit (Tabel van materialen) en elueer de bibliotheek in 10 μL RNase-gratis water tot slot.
  18. Laden 1 μL van de gezuiverde bibliotheek naar een DNA-chip (Tabel van materialen) om te controleren van de grootte van de bibliotheek volgens protocol van de fabrikant.
  19. Verdunnen 1 μL van de gezuiverde bibliotheek (1:1000) in pH 8.0 van de 10 mM Tris-HCl met 0,05% Polysorbaat 20 en kwantificeren van de bibliotheek door qPCR met behulp van een commerciële bibliotheek kwantificering kit te kwantificeren van de concentratie van de bibliotheek met behulp van de DNA-normen in de kit.
  20. Gelijke hoeveelheden van het zwembad van de bibliotheken overeenkomstig de eisen van de machine rangschikken en de volgorde op een systeem met hoge gegevensdoorvoer sequencing.
    Opmerking: De bouw van de bibliotheek van cellulaire RNA kan worden gedaan met behulp van de dezelfde kits door volgens standaard protocol van de kits.

6. Bioinformatics pijpleiding

Nota: Dit is een in-house pijpleiding en de programma's die hier gebruikt zijn vermeld de tabel of Materials.

  1. Trim weg lage kwaliteit leest en verwijder adapter sequenties van het ruwe luidt als volgt.
  2. De schone leest toewijzen aan verschillende soorten RNAs.
    1. Aantekeningen tRNAs doordat twee incongruenties omdat de sterk veranderde tRNA-sequenties frequente basis misincorporation door reverse-transcriptase.
    2. Aantekeningen toevoegen aan miRNAs door te verwijzen naar de miRNAs van de mens van miRBase v21 waardoor nul incongruenties. Sinds miRNAs gelden A en U nontemplated 3' eind toevoegingen, sequenties die wijs niet zijn 3' ontdaan van maximaal drie A en/of T nts waarna leest zijn toegewezen aan menselijke miRNAs en andere miRNAs uit miRBase v21 waardoor nul incongruenties.
    3. Aantekeningen aan andere relevante kleine RNAs (snRNA, snoRNA, piRNA en Y RNAs) doordat een mismatch.
    4. De resterende niet-toegewezen leest aan lange datasets van RNA (rRNA, andere RNA van Rfam en mRNA) om te beoordelen van de afbraak toewijzen.
    5. Aantekeningen van de sequenties aan het menselijk genoom.
    6. Aantekeningen van de sequenties aan bacteriële genoom.
    7. Normaliseren van miRNA expressie met de volgende formule: miRNA telt / het totaal telt van alle toegewezen miRNAs) x 106.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De in dit protocol beschreven methode is geoptimaliseerd voor het verzamelen van exRNA van MSC cultuur voor de volgende generatie sequencing. De algemene regeling van de workflow is in Figuur 1 aan de linkerkant en de respectieve kwaliteitscontrole controlepunten zijn aan de rechterkant.

De morfologie van de cellen op de dag van inzameling voor gedifferentieerdeproductie (Figuur 3 bis) en gedifferentieerde (figuur 3B) cellen worden weergegeven. Representatieve genormaliseerde niveaus van ALP activiteit van cellen geïnduceerde voor 7 dagen staan bovendien ook (Figuur 3 c). Hier, ALP activiteit is ongeveer 2,5 maal die van de uninduced cellen.

Drie T175 maatkolven van confluente MSCs opbrengst 2-5 x 1010 deeltjes/mL (Figuur 2). Gemiddelde deeltjesgrootte is ongeveer 160-165 nm, terwijl de meeste van de deeltjes zijn 130-140 nm. Er waren een paar kleinere toppen tussen 200 en 500 nm, die zou duiden op een grote complexen of grote aggregaten.

Aangezien RNA kan snel worden afgebroken, zich strikt houden aan de voorwaarden van RNA extractie volgens de kit of het protocol dat wordt gebruikt. RNase-gratis gebruiksvoorwaarden, in het bijzonder RNase-gratis water resuspendeer de RNA te houden van RNA op ijs indien mogelijk. Na extractie, kan RNA worden gekwantificeerd aan de hand een capillaire elektroforese chip gebaseerde machine. Vertegenwoordiger electropherograms van het RNA na de analyse wordt uitgevoerd, worden weergegeven in Figuur 4. De electropherogram van exRNAs omvat een brede waaier van RNAs (figuur 4A). In tegenstelling, cellulaire RNA heeft zeer verschillende toppen op rond 70-120, 1800, en 3800 nt, die overeenkomen met tRNA/5S rRNA / 5.8S rRNA, 18S rRNA en 28 rRNA, respectievelijk (figuur 4B). Het RNA integriteit nummer (RIN) staat voor de kwaliteit van het RNA. Een goede RIN van cellulaire RNA is > 8 (met vermelding van bijna geen aantasting van het RNA). Het algoritme waarop RIN is gebaseerd is de verhouding tussen 28 en 18S. Dit betekent dat RIN niet een goede indicator van RNA kwaliteit van exRNAs is omdat full-length rRNAs meestal niet in exRNAs worden opgespoord zijn.

Na extractie van RNA, de miRNA bibliotheken werden gebouwd en de cDNA bibliotheken werden gescheiden door gelelektroforese. Adapter-afgebonden cDNA van de miRNAs is meestal tussen 140 en 160 nt. De kwaliteit van de bibliotheek was dan gevisualiseerd op een capillaire elektroforese chip gebaseerde machine (Figuur 5). Figuur 5A en 5B van de figuur zijn de bibliotheken van de cellulaire RNA op dag 0 en dag 7, respectievelijk Figuur 5C en figuur 5D zijn de exRNA-bibliotheken op dag 0 en dag 7 respectievelijk. Alle vier monsters had pieken op ongeveer 140 nt, die duiden op een succesvolle miRNA bibliotheek bouw. De hoeveelheid cDNA in de bibliotheken werd gekwantificeerd door qPCR met behulp van een bibliotheek kwantificering kit. De cyclus (Cq) van de kwantificering van de normen was uitgezet tegen het logboek van de concentratie op het verkrijgen van een standaard curve (Figuur 6). De vergelijking van de standaard curve werd vervolgens gebruikt voor het berekenen van de concentratie van de bibliotheken (tabel 1). In ons voorbeeld was de concentratie van de bibliotheken van exRNAs 5-8 nM, die aanzienlijk lager is dan de bibliotheken van cellulaire RNAs (8-30 nM). De bibliotheken werden vervolgens samengevoegd met eenzelfde bedrag en gestuurd voor het rangschikken.

Nadat de bibliotheken werden sequenced, de lage kwaliteit leest weg werden bijgesneden met FASTX-Toolkit en de daaruit voortvloeiende kwaliteit van de bibliotheek exRNAs was hoog en vergelijkbaar is met dat van de bibliotheken van de cellen (figuur 7AB). De lengte van de reeks van de bibliotheken van cellen had een enkele piek op ongeveer 22 nt (Figuur 7 c), die met miRNAs correleert. In tegenstelling, de bibliotheken van exRNAs werden meer heterogene en bevatte 3 belangrijke bergen: 22 nt, 30 nt en 33 nt (figuur 7D). Vergelijkbaar met hun cellulaire tegenhangers, de piek op 22 nt is de miRNAs. Nadere inspectie bleek dat de pieken bij 30 en 33 nt tRNAs helften/fragmenten of piRNAs. De aantekeningen van de toegewezen luidt werden vervolgens uitgezet. De meeste van de leest (65.1%) van cellulaire RNA toegewezen aan menselijke miRNAs en elk van de andere kleine RNAs tekende voor een klein gedeelte van de toegewezen luidt als volgt (figuur 8A). Productiestappen, slechts 8% van de exRNAs toegewezen aan menselijke miRNAs (Figuur 8). De meest voorkomende kleine RNA waaraan het luidt als volgt toegewezen werden tRNAs. De meeste van de luidt waren "ongeëvenaarde leest" (43%). Verder onderzoek van de ongeëvenaarde leesbewerkingen van exRNAs tot global databases hebben geleid tot de verrassende bevinding dat de meesten van hen correspondeert met bacteriële sequenties (74% en 85% voor D0 en D7 exRNA, respectievelijk; Tabel 2). Daarentegen slechts 0,9% van de cellulaire RNA was ongeëvenaard, en voor degenen, slechts 10% toegewezen aan bacteriën. Een vergelijking met het boviene genoom bleek minder dan 1% match suggereren dat FBS niet een bron van besmetting (tabel 2 was). Vandaar, exRNAs vertonen een atypische profiel in vergelijking met normale cellulaire RNA.

Figure 1
Figuur 1: Workflow van de exRNA rangschikking en analyse. De hele workflow wordt afgebeeld op de links in de grijze vakken en kwaliteitscontrole gekoppeld aan elke stap is in de rode vakken aan de rechterkant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: het formaat van de verdeling van de deeltjes afgescheiden door de cellen op dag 0 en dag 7 van differentiatie. Vertegenwoordiger NTA resultaten van deeltjes bijeengezocht uit 3 x T175 kolven op (A) dag 0 en (B) dag 7 van differentiatie. De respectieve gemiddelde en de opgegeven modus maten, evenals de concentratie van de deeltjes zijn tabelvorm onder de grafieken. SD: standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: cel morfologie en osteogenic differentiatie voorafgaand aan de extracellulaire RNA collectie. (A) opname van ongedifferentieerde BMSCs gekweekt met collectie media op de dag van de collectie. (B) opname van BMSCs gedifferentieerd voor 7 dagen met collectie media op de dag van de collectie. Schaal bars = 100 µm. (C) ALP activiteiten van de cellen werden genormaliseerd naar hun respectieve cel viabilities. De waarden die zijn uitgezet waren met drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: vertegenwoordiger electropherogram van RNA integriteit na RNA extractie. RNA analyses van extracellulaire RNA (A) en cellulaire RNA (B). De x-as is de lengte van het RNA (nt) en de y-as is de fluorescentie. De eerste piek is de ladder op 25 nt. ribosomaal RNAs staan als 18S (1.800 nt) en 28 (3.800 nt). RNA integrity nummer (RIN) is een indicator van RNA kwaliteit gebaseerd op de 18S en 28 ribosomaal RNA-integriteit. Hogere RIN getallen gelijk aan betere kwaliteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: electropherogram van de vertegenwoordiger van de cDNA bibliotheken na bibliotheek bouw. DNA-analyses van de bibliotheken van (A) cellen op dag 0, (B) cellen in de extracellulaire RNA (C) vanaf dag 0, dag 7 en de extracellulaire RNA (D) van dag 7. Groene en paarse nummers zijn de ladders op 35 nt en 10,380 nt, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: cDNA Bibliotheek kwantificering en berekening. Bibliotheken zijn verdund tussen 500 - 1.000 keer voor degenen uit exRNA en tussen 1000 en 4000 keer voor RNA van de cel. De bibliotheken zijn uitgevoerd naast de normen uit de bibliotheek kwantificering kit. De gemiddelde Cq waarden van de DNA-normen werden uitgezet tegen de log10 concentratie (pM) voor het genereren van een standaard curve, een vergelijking voor de standaard curve en een R-waarde voor2 . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: kwaliteitsscores en lengte distributie van sequenties. Lage kwaliteit leest en adapter sequenties werden bijgesneden met FASTX-Toolkit voor cellen (A) en (B) exRNAs. De verdeling van de lengte van de schone leest voor cellen (C) en (D) exRNAs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: aantekening van kleine RNAs na sequencing. Aantekeningen vertegenwoordigen percentages van schone luidt voor cellen (A) en (B) exRNAs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Monster Verdunningsfactor CQ waarde Log(pM) Concentratie (pM) Gemiddelde van de concentratie (pM) De gemiddelde concentratie * (452/143) Vermenigvuldig met dillution factor (pM)
BMSC D0 exRNA 500 7.72 0.702 5.036 5.276 16.678 8338.993
BMSC D0 exRNA 500 7.57 0.754 5.677
BMSC D0 exRNA 500 7.7 0.709 5.117
BMSC D0 exRNA 1000 8.64 0.383 2.416 2.365 7.477 7476.846
BMSC D0 exRNA 1000 8.68 0.369 2.340
BMSC D0 exRNA 1000 8.68 0.369 2.340
BMSC D7 exRNA 500 8.52 0.425 2.659 3.221 10.182 5090.913
BMSC D7 exRNA 500 8,42 0.459 2.880
BMSC D7 exRNA 500 7.97 0.615 4.125
BMSC D7 exRNA 1000 8,87 0.303 2.011 1.933 6.110 6110.391
BMSC D7 exRNA 1000 8.92 0.286 1.932
BMSC D7 exRNA 1000 8.97 0.269 1.857
BMSC D0 cel 1000 6.86 1,000 10,005 9.810 31.007 31006.974
BMSC D0 cel 1000 6.91 0.983 9.614
BMSC D0 cel 4000 8.68 0.369 2.340 2.398 7.581 30322.041
BMSC D0 cel 4000 8.59 0.400 2.514
BMSC D0 cel 4000 8.68 0.369 2.340
BMSC D7 cel 1000 8.44 0.452 2.834 2.880 9.104 9104.439
BMSC D7 cel 1000 8,43 0.456 2.857
BMSC D7 cel 1000 8.39 0.470 2.950
BMSC D7 cel 4000 10.36 -0.213 0.612 0.702 2.218 8872.689
BMSC D7 cel 4000 10.27 -0.182 0.658
BMSC D7 cel 4000 9,97 -0.078 0.836
Berekeningen:
Log(pM) =-0.3467 x (monster Cq waarde) + 3.3786; Gebruik de standaard curve en de formule
concentratie (pM) = 10^log(pM)
Grootte aanpassing berekening = grootte van DNA standaard (452 bp) gedeeld door de lengte van de gemiddelde fragment (143 bp)

Tabel 1: miRNA bibliotheek kwantificering.

Voorbeeld: # leest niet toewijzen van menselijke # leest toewijzen aan bacteriën % bacteriële leest # leest toewijzen aan koe % boviene leest
BMSC D0 cel 131007 9858 8% 99 0,08%
BMSC D7 cel 169730 7935 5% 188 0,11%
BMSC D0 exRNA 6122833 4551477 74% 891 0,01%
BMSC D7 exRNA 7046691 5970086 85% 771 0,01%

Tabel 2: Het percentage van niet-gecompenseerde leest die kaart aan bacteriën en boviene leest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschrijven we een protocol voor de volgende generatie sequentiebepaling van exRNAs waarmee differentiële expressie analyses van lage input monsters. Vasthouden aan een specifiek protocol voor EV en exRNA isolatie is belangrijk omdat zelfs kleine veranderingen (dat wil zeggen, de ultracentrifugatie stap of een verandering in de rotor type) invloed op transcriptome uitoefenen kunnen en miRNA niveaus13,14. Dus, ongeacht hoe de exRNA geïsoleerd is, is het belangrijk toe te passen dezelfde experimentele en bioinformatic procedure op alle monsters in een experiment om te kunnen vergelijken de resultaten.

RNA integriteit wordt meestal beoordeeld op de bioanalyzer. Aangezien exRNAs verstoken van zijn volledige lengte rRNA, hun waarde RIN is zeer laag, maar dit betekent niet noodzakelijk overeen met lage kwaliteit RNA monsters. Bovendien, de RNA-concentratie van de exRNAs sterk gevarieerd en vaak onjuist is. Vandaar, in plaats van RNA kwaliteit beoordelen en kwantificeren van de RNA op de bioanalyzer, gebruiken dezelfde hoeveelheid media telkens voor verdere verwerking. Ook resuspendeer de uitgepakte RNA in dezelfde hoeveelheid resuspensie buffer en gebruiken hetzelfde volume voor de bouw van de bibliotheek.

Kleine RNA bibliotheek constructie is geoptimaliseerd door het verminderen van de hoeveelheid adapters aan een tiende van het standaardprotocol en het gebruik van de helft van de andere reagentia. Vermindering van de adapters voorkomt niet alleen adapter Dimeren, het voorkomt ook intramoleculaire RNA circularization15. De afname van de reagentia is geoptimaliseerd voor de Illumina TruSeq Small RNA monster Prep Kit. Moeten andere kits worden gebruikt, is het aanbevolen om ook lagere adapter en reagentia dienovereenkomstig, tenzij door de kit is aangegeven dat het is aangepast aan lage input monsters. Tot slot werd de PCR cyclus voor bibliotheek bouw verhoogd van 12 tot 15 cycli in dit protocol ter verantwoording voor de lage concentratie van exRNAs. Wij hebben dit als de optimale aanpassing zonder het zien van versterking vertekeningen15gevonden.

Verschillende kwaliteitscontrole statistieken kan worden beoordeeld met inbegrip van basis kwaliteitsscores en lengte profiel gelezen. Bij het doen van analyses van de bio-informatica, de basis kwaliteit van het luidt in cellulaire RNA- en exRNAs waren vergelijkbaar; de verdeling van de lengte en de geannoteerde oorsprong van sequenties waren echter geheel anders. Van de leest uit cellulaire RNA toegewezen aan menselijke miRNAs, echter een groot deel van het exRNA luidt het merendeel ongeëvenaarde leest. Bij nader inzien leest de ongeëvenaarde leest bleek te zijn bacteriële (tabel 2). Dit was verrassend, omdat antibiotica routinematig in onze cultuur gebruikt werden. Ons resultaat wordt uitgelijnd goed met andere rapporten die bleek ook groot aantal ongeëvenaarde leest wanneer sequencing celkweek afgeleid exRNA16. Een van de redenen voor deze verontreinigende stoffen is dat bacteriën in grootte met de extracellulaire complexen of EVs overlappen, en dus mede tijdens de ultracentrifugatie stap17 zuiveren. Eerdere publicaties hebben geïdentificeerd wijdverbreide besmetting van bepaalde bacteriën in voedingsbodems die onopgemerkt onder normale cel lab procedures18 blijven. Tot op heden dit probleem grotendeels is genegeerd maar moet worden rekening gehouden bij zuiveren en analyseren van exRNAs.

Dit protocol details een complete gids voor het oogsten van exRNAs van voedingsbodems, het optimaliseren van kleine RNA bibliotheek voorbereiding en verwerking van de gegevens van de rauwe bibliotheek. Dit protocol benadrukt specifiek de verschillende controlepunten van de kwaliteitscontrole tijdens het proces om aan te tonen hoe laag input monsters (zoals exRNAs) kunnen afwijken van de normale staalvoorbereiding zodat anderen werken met lage input monsters wat te wete verwachten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij zijn dankbaar aan Mr. Claus Bus en mevrouw Rita Rosendahl op iNANO voor hun technische bijstand. Speciale dank aan Dr. Daniel Otzen voor het toestaan van het frequente gebruik van zijn ultracentrifuge. Deze studie werd gesteund door het innovatiefonds Denemarken (MUSTER-project).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells ATCC PCS-500-012 Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit Lonza PT-3001 Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS Gibco A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA Gibco 25200056
T175 Flask Sarstedt 833,912
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline Sigma 806552
Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly Beckman Coulter 355618
Beckman Coulter Type 60 Ti Rotor used here
NucleoCounter Chemometec NC-3000 Cell Counter
β-glycerophosphate Calbiochem 35675 Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone Sigma D4902-25MG Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma D1530-1MG Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1514 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits Roche KK4824 Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) Illumina RS-200-0012 Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep Sage Science Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit Cold Spring Harbor Lab Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt Adaptor removal in step 6
Bowtie Mapping of clean reads in step 6
Samtools To make the expression profile in step 6
Bedtools To make the expression profile in step 6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
  2. Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
  3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
  4. Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
  5. Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
  6. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
  7. Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
  8. Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
  9. NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
  10. Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
  11. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
  12. Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  13. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
  14. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  15. Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
  16. Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
  17. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  18. Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).

Tags

Genetica kwestie 145 mesenchymale stamcellen cellen extracellulaire RNAs extracellulaire blaasjes ribonucleproteins exosomes microRNAs klein RNAs volgende generatie sequencing kleine RNA bibliotheek bouw
Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. … More

Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. T., Mothershead, C. R., Su, J., Kjems, J. Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e58655, doi:10.3791/58655 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter