Summary
该协议演示了如何从细胞培养培养基中纯化细胞外微 rna, 用于小型 rna 文库构建和下一代测序。描述了各种质量控制检查点, 以使读者了解在处理低输入样本 (如 exrna) 时的预期结果。
Abstract
细胞外和循环 rna (exrna) 是由身体的许多细胞类型产生的, 并存在于许多体液中, 如唾液、血浆、血清、牛奶和尿液。这些 rna 的一个子集是转录后的调节剂--微 rna (mirna)。为了描述特定细胞类型产生的 mirna, 体外培养系统可用于从一个细胞子集中提取和分析 exrna。骨髓间充质干细胞的分泌因子与减轻多种疾病有关, 并作为本研究的体外模型系统。本文介绍了小 rna 的采集、纯化和细胞外 mirna 序列库的生成过程。培养基中的 exrna 与细胞 rna 的不同之处在于 rna 样本较低, 这就需要优化程序。该协议为来自培养基的小 exrna 测序提供了全面的指南, 显示了 exrna 纯化和测序过程中每个步骤的质量控制检查点。
Introduction
细胞外和循环 rna (exrna) 存在于各种体液中, 并对 rnase1, 2 具有耐药性。它们的高丰度、稳定性和易用性作为诊断和预后标志物 3, 对临床评估很有吸引力。外生殖器的运输方式包括细胞外囊泡 (ev), 与脂蛋白 (如高密度脂蛋白) 的联系;高密度脂蛋白) 和核糖核酸蛋白复合物 (如与 Argonaute2 复合物)4。
exrna 的一个子集是微 rna (mirna), 它们是大约22码的小非编码 rna, 调节转录后的基因表达。前 mirna 与细胞通讯和细胞稳态调节有关。例如, hdl 将前 mir-223 传递给内皮细胞, 以抑制细胞间粘附分子 1 (icam-1) 和炎症6。有趣的是, mir-223 也是由细胞外泡从白细胞转移到肺癌细胞, 编程它们采取更具侵入性的表型 7.因此, 从各种体液和细胞培养培养基的前 mirna 转录组将大大提高我们对前 mirna 信号的理解。
小 rna 测序 (小 rna seq) 是一个强大的工具, 可用于了解小 rna 的转录组学。不仅可以在不同表达的已知 rna 中比较不同的样品, 而且还可以检测和表征新的小 rna。因此, 在不同条件下识别差异表达的 mirna 也是一种鲁棒性。然而, 小 rna seq 的障碍之一是难以从低外显侧 nna 输入液 (如脑脊液、唾液、尿液、牛奶、血清和培养基) 产生小的 rna seq 库。来自 illumina 的 truseq 小型 rna 库准备协议需要大约1μg 的高质量总 rna, 而 nebnext 小型 rna 库准备集协议来自新英格兰 biolabs需要100 ng-1μg 的 rna 8,9。对于传统的 uv-vis 分光光度计, 这些样品的总 rna 通常低于检测极限。
来自体液的前 mirna 具有潜在的良好预后和诊断标志物。然而, 为了研究功能效应或确定特定的前 mirna 的起源, 经常使用细胞培养系统。间充质干细胞 (mscs) 已经被广泛的研究, 因为他们的电动车已涉及减轻许多疾病, 包括心肌梗死, 阿尔茨海默病和移植物抗宿主病10。在这里, 我们演示了从骨髓衍生的 mscs (bmscs) 中纯化前 mirna 的方法, 以及用于优化小型 rna 库构建、测序和数据分析的具体步骤 (图 1)。
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Protocol
注: 间充质干细胞生长介质 (msc 培养基) 如材料表所示预先制备。
1. 细胞培养
注: 人骨髓间充质干细胞可从骨髓、脂肪组织或其他来源获得 11。或者, 可以通过供应商购买 hmscs。本协议中使用的骨髓间充质干细胞来自患者的骨髓, 并从一家公司购买。
- 将 1 x 10 6个混合努力链解冻到包含20毫升 msc 介质的 t175 瓶中。在37°c 下用5% 的 co2 培养细胞, 每 2-3天更换一次介质, 直到80% 融合。
- 用 1 x pbs 的5毫升清洗细胞, 并丢弃 pbs。
- 通过添加0.05% 的胰蛋白酶-edta 5 毫升分离细胞, 并在37°c 孵育细胞5分钟。点击烧瓶的两侧, 方便分遣。
- 加入15毫升的 msc 培养基来灭活胰蛋白酶, 将细胞从表面分离, 上下移液器获得单个细胞悬浮液。
- 将细胞收集在一个50毫升的管中, 在 300 x克的情况下旋转 5分钟, 使细胞颗粒状。
- 在 msc 培养基的1毫升中重新移植细胞, 并使用血细胞计对细胞进行计数。
注: 在 t175 瓶中80% 汇合度的初级人骨髓骨髓间充质干细胞约为 2 x10 6 细胞。 - 在 5 t175 瓶的新鲜 msc介质中, 将 hmscs 板在 2, 000 勒/厘米2处。在37°c 下使用5% 的 co2 将电池体生长, 并每2-3天更换一次介质, 直到获得5瓶90% 汇合 t175 瓶。
2. 电动车和 rna 相关的生物分子收集
注: ev 收集介质事先准备好 (dulbecco 的改性鹰培养基 [dmem], 含有10% 的胎牛血清 [fbs] 和1% 的 penicilin/stretomycin [pbe])。ev 收集介质是正常的 msc 介质, 但使用商用 ev-d制 fbs (材料表) 制备。这是为了避免牛外周 rna 污染从 fbs, 通常包含与电动车, 核糖核酸蛋白和脂蛋白相关的 exrna。对于小型 rna 库的制备, 需要从5个骨髓间充质干细胞的融合瓶中提取的 exrna, 以实现库的构建。
- 用每 t175 烧瓶20毫升的 pbs 清洗细胞3倍。在骨髓间充质干细胞的 t175 瓶中添加20毫升 ev 收集介质, 并在37°c 孵育, 5% co 2 48小时.
- 在 300 x g和4°c 下收集介质并离心介质10分钟。
- 在 2, 000 x g 和4°c 下收集上清液并离心 20分钟。
- 在 15,500 x克和4°c 下收集上清液并离心30分钟。然后收集上清液。
- 将培养基转移到超离心管和颗粒中, 在 100, 000xg 和4°c 的温度下, 将其转移到周围90分钟。这里使用固定的角度转子, 颗粒固定在管的一侧。在盖子的一侧标记, 并在管道的一侧画一个圆圈, 在那里需要颗粒。
- 取下上清液, 将管倒置在吸水纸上, 将管内干燥, 并使用小块吸水纸取出管内的液体, 而不接触管底。通过涡流30秒和移液 20x, 将颗粒在200μl 的 pbs 中重新化。
- 用纳米粒子跟踪分析 (nta) 评估电动车和生物分子 (图 2)。
注: 可以使用纳米粒子跟踪分析 (nta)、动态光散射 (dls) 或透射电子显微镜 (tem)12来评估 ev 和生物分子。 - 将 ev 和生物分子存放在-80°c, 直到进一步的下游实验。
注: 如果要使用 ev 进行功能研究, 必须添加20% 的甘油, 以防止其破裂。如有必要, 可以使用标准程序收集细胞。
3. ev 和 rna 相关的生物分子的分化细胞的采集
注: 当细胞分化时, 还可以从细胞培养培养基中收集 ev 和 rna 相关的生物分子。该协议中描述的示例描述了分化的第0天和第7天的成骨细胞分化和 exrna 的收集。如果不需要区分, 则跳过第3节, 转到第4节。
- 每次制备成骨细胞分化介质 (dmem 与 10% fbs、1% pss、10mm β-甘油磷酸盐、10 nm 地塞米松、50μm 抗坏血酸-2-磷酸酯和 10 mm 1.25-维生素-d3) 新鲜。
- 一旦骨髓间充质干细胞融合了 80%, 将 msc 培养基转变为成骨细胞分化培养基。
- 2-3天后补充成骨细胞分化介质。
- 在分化的第5天, 取出培养基, 用每 t175 烧瓶20毫升的 pbs 清洗细胞3x。
- 添加含有 10 mm β-甘油磷酸盐的 ev 收集介质20毫升, 10 nm 地塞米松、50μm 抗坏血酸-2-磷酸和 10 mm 1.25-维生素 d 3, 每混合 t175 瓶,在37°c 将细胞与 5% co2 培养 48小时, 以确保持续 在收集 ev 和生物分子时分化。
- 在第7天收集介质, 并按照步骤 2.2-2.6 中的描述, 继续分离 ev 和生物分子。
- 为了进行质量控制, 96 口或6口井的种子细胞分别使用碱性磷酸酶 (alp) 活性测定法或定量聚合酶链反应 (qpcr) 来评估分化情况。
注:图 3是显示细胞成骨分化的示例。
4. rna 提取和质量控制
- 解冻在冰上的第2.8 步样品。使用 rna 隔离试剂盒 (材料表) 提取 rna。
- 在100μl 的无 rnis 水中从 rna 隔离试剂盒 (材料表) 中提供的柱中排除 rna。
- 通过乙醇沉淀浓缩 rna, 将1μl 的糖原、10μl 的 2 m ph 5.5 钠和250μl 的预冷99% 乙醇添加到100μl 的纯化 rna 中。
- 在-20°c 下隔夜培养样品, 沉淀 rna。在 16, 000 x g 和4°c 下离心 20分钟, 将 rna 颗粒状。
注: 由于与糖原共沉淀, 颗粒为白色。 - 去除上清液, 用75% 乙醇1毫升清洗 rna 颗粒。在 16, 000 x g和4°c 下再次将 rna 颗粒状5分钟。
- 取出乙醇, 使 rna 管的盖子打开 5-10, 使 rna 颗粒干燥。在7μl 的无 rnase 水中重新释放 rna 颗粒。
- 使用基于芯片的毛细管电泳机检查 rna 质量和浓度, 以便在库建设之前根据制造商的协议检测 rna。
注: rna 的一个有代表性的大小分布如图 4所示。 - 如有必要, 使用商业净化试剂盒 (材料表) 提取细胞 rna。
5. 图书馆建设和质量控制
注: 小型 rna 库使用商业试剂盒 (材料表) 构建, 但由于 rna 输入量较低, 可进行调整。库的构造是在冷块上进行的。
- 将 0.2 ml pcr 管的加热块冷却在冰上, 将液器 5μl rna 从步骤4.6 冷却到 0.2 ml 无 rnase pcr 管在冷却块上。
- 在 0.2 ml 无 rnase pcr 管中, 在无 rnase 的水中稀释 3 ' 适配器 (1:10)。加入0.5 μl 的稀释适配器, 通过上下向上和向下向上移液8x 和离心机, 将所有液体收集在管底, 与5微米的 rna 混合。
- 在预热热循环器中, 在70°c 下将 rna 和 3 ' 适配器混合 2分钟, 然后将样品放回冷却块上。
- 在 rna 和 3 ' 适配器混合物中加入1μl 的结扎缓冲液、0.5μl 的 rnase 抑制剂和0.5μl 的 t4 rna 连接酶 (缺失突变体)。通过上下向上和向下混合8倍和离心机。
- 在预热热循环器中, 在28°c 下将管材加氢1小时。
- 在样品管中加入0.5 μl 的停止溶液, 将试管留在热循环器中, 通过向上和向下混合 8倍, 并在28°c 下继续孵育15分钟。
- 在 0.2 ml 无 rnase pcr 管中, 在无 rnase 的水中稀释 5 ' 适配器 (1:10)。将0.5 μl 的 5 ' 适配器加入单独的无 RNase-free ml pcr 管中, 在预热热循环中在70°c 时加热 5 ' 适配器 2分钟, 然后将样品放在冷却块上。
- 在 5 ' 适配器管中加入0.5μl 的 10 nm atp、0.5μl t4 rna 连接酶, 通过上下移液8倍混合, 并短暂离心以将所有液体收集到底部。
注: 将 5 ' 适配器尽可能地放在冷却块上。 - 从步骤5.6 开始, 将 5 ' 适配器混合物的1.5 微米加入样品, 然后通过缓慢的移液8x 非常温和地混合。在预热热循环器中, 在28°c 下将样品加氢1小时。
- 稀释 rt 底漆 1:10 在无 rnase 水中的无 rnase 0.2 ml pcr 管中。从第5.9 步开始, 将0.5 μl 稀释的 rt 底漆加入样品中, 慢慢地向上和向下向上和向下搅拌 8x, 并短暂离心机, 非常温和地混合。
- 在预热热循环器中, 在70°c 下将样品加氢 2分钟, 然后将样品放在冷块上。
- 加入1μl 的5倍第一链缓冲液, 0.5μl 的 12.5 mm dntp 混合物, 0.5μl 的 100 mm 二硫醇 (dNTP), 0.5μl 的 rnase 抑制剂, 0.5μl 的逆转录酶。慢慢地向上和向下向上和向下混合 8x, 并短暂地离心。
- 在预热热循环器中, 在50°c 下将样品培养 1小时, 以获得 cdna。
- 在 cdna 中加入4.25μl 的超纯水、12.5μl 的 pcr 混合物、1μl 的指数底漆和1μl 的通用引物。通过上下向上和向下混合8倍和离心机。
- 将样品放入热循环器中, 并按如下方式设置循环器: 98°c 为 30秒;15个循环98°c 为 10秒, 60°c 为 30秒, 72°c 为 15秒;并以72°c 结束循环10分钟。
注: 准备好的库可以在-20°c 下存储一周。 - 通过分离 dna 凝胶上的文库并在 140 bp 和 160 bp 之间切割凝胶 (凝胶提取), 并按照库构造套件提供的协议从凝胶中洗脱库, 来纯化 rna 库。
注: 在本研究中, 步骤5.15 中准备好的库被加载到商业凝胶 (材料表) 上, 140 bp 至 160 bp 之间的库由自动 dna 大小分馏器 (材料表) 根据制造商的协议。 - 使用基于柱状的 pcr 纯化试剂盒 (材料表) 从步骤5.16 开始, 将库中的库浓缩和清洗, 最后将其在 10μl rnase 水中清洗。
- 将纯化后的库的1μl 加载到 dna 芯片 (材料表) 上, 以按照制造商的协议检查库的大小。
- 在 10 mm ph 8.0 tris-hcl 中稀释纯化文库的 1:1000 (1:1000), 其中含有0.05% 的聚山梨酸盐 20, 并使用商业文库定量试剂盒通过 qpcr 对文库进行量化, 以便使用试剂盒中的 dna 标准对文库浓度进行量化。
- 根据测序机的要求和高通量测序系统上的序列, 汇集等量的库。
注: 细胞 rna 的库构建可以使用相同的试剂盒, 通过遵循该试剂盒的标准协议。
6. 生物信息学管道
注: 这是一个内部管道, 此处使用的程序列在 "材料表" 中。
- 修剪掉低质量的读取, 并从原始读取中删除适配器序列。
- 将干净的读取映射到不同类型的 rna。
- 注释 rna 允许两个不匹配, 因为大量修改的 trna 序列导致经常基地错合逆转录酶。
- 通过映射到人类 mirna 从 mirbase v21 允许零不匹配来注释 mirna。由于 mirna 受 a 和 u 非模板化 3 ' 端添加的约束, 因此不映射的序列将被裁剪 3 ' 至 3 a 和/或 nt, 之后读取将映射到 mirbase 21 中的人工 mirna 和其他 mirna, 从而实现零不匹配。
- 通过允许一个不匹配, 对其他相关的小 rna (snrna、snorna、pirna 和 y rna) 进行注释。
- 将剩余的未映射读取映射到长 rRNA 数据集 (rrna、来自 rRNA 的其他 rRNA 和 mrna), 以评估降解。
- 给人类基因组注释序列。
- 对细菌基因组的序列进行注释。
- 使用以下公式使 mirna 表达正常化: mirna 计数/所有映射的 mirna 的总数) x 106.
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Representative Results
本协议中描述的方法经过优化, 可从 msc 培养中收集 exrna, 用于下一代测序。工作流的总体方案在左图1中,相应的质量控制检查点位于右侧。
未分化 (图 3 a) 和分化 (图 3A) 细胞收集当天的形态如下所示。此外, 还显示了7天诱导的细胞 alp 活性的代表性归一化水平 (图 3c)。在这里, alp 活性大约是非诱导细胞的2.5倍。
三个 t175 瓶的融合骨髓间充质干细胞产生 2-5 x 10 (图 2)。平均粒径约为160-165 纳米, 而大多数颗粒为130-140 纳米。在200至500纳米之间有几个较小的峰, 这将表明大型复合物或大型集料。
由于 rna 可以快速降解, 严格遵守 rna 提取的条件, 按照使用的试剂盒或协议。使用无 rnase 的条件, 特别是不含 rnase 的水, 重新悬浮 rna, 并在可能的情况下将 rna 保持在冰上。提取后, rna 可以用基于芯片的毛细管电泳机进行定量。图 4显示了分析后 rna 的代表性电泳图。exrna 的电泳图包括范围广泛的 rna (图 4 a)。相反, 细胞 rna 在70-120、1800和 3800 nt 时有非常明显的峰值, 分别对应于 trna s rna/5.8s rrrna、18s rrrna 和 28s rrna (图 4b)。rna 完整性数 (rin) 表示 rna 的质量。良好的细胞 rna rin 是 & & gt;8 (表明几乎没有 rna 降解)。rin 所基于的算法是28s 和18s 之间的比率。这意味着 rin 不是 exrna rna 质量的一个很好的指标, 因为在 exrna 中通常无法检测到全长 rrna。
rna 提取后, 用凝胶电泳构建 mirna 文库, 分离 cdna 文库。mirna 的自适应体结扎 cdna 通常在140至 160 nt 之间。然后在基于芯片的毛细管电泳机上对库的质量进行可视化 (图 5)。图 5a和图5A 分别是第0天和第7天细胞 rna 的文库。图 5c和图 5C分别是第0天和第7天的 exrna 库。这四个样本的峰值都在 140, 000, 这表明 mirna 文库建设是成功的。利用库量化试剂盒, 用 qpcr 对图书馆中的 cdna 量进行了量化。根据浓度日志绘制了标准的量化周期 (cq), 以获得标准曲线 (图 6)。然后用标准曲线的方程来计算库的浓度 (表 1)。在我们的样本中, exrna 的文库浓度为 5-8 nm, 明显低于来自蜂窝 rna 的文库 (8-30 nm)。然后将这些库集中在等量的集合中, 并发送这些库进行排序。
对库进行排序后, 低质量的读取被使用 fastx-toul格包进行了修剪, 因此库的质量很高, 与单元格中的库的质量相当 (图 7a, b)。细胞中的文库序列长度在 22 kt 左右 (图 7c) 有一个单一的峰值, 这与 mirna 有关。相反, 来自 exrna 的库更加异构, 包含3个主要峰值: 22nt、30 nt 和 33 nt (图 7d)。与细胞上的峰值相似, 22nt 的峰值是 mirna。仔细观察后发现, 30 和33nt 的峰值是 trra---------------------------------------------------------------------然后绘制映射读取的批注。大部分读数 (651%)从细胞 rna 映射到人类 mirna 和其他每个小 rna 占映射读数的一小部分 (图 8a)。相反, 只有8% 的 exrna 映射到人类 mirna (图 8b)。读取映射到的最丰富的小 rna 是 rna。大多数读数都是 "无与伦比的读数" (43%)。对 exrna 到全球数据库的无与伦比的读数进行进一步检查, 令人惊讶地发现, 大多数读数对应于细菌序列 (d0 和 d7 exrna 分别为74% 和 85%;表 2)。相比之下, 只有0.9% 的细胞 rna 是无与伦比的, 其中只有10% 映射到细菌。与牛基因组的比较显示, 与牛基因组的匹配率不到 1%, 这表明 fbs 不是污染源 (表 2)。因此, 与正常的细胞 rna 相比, exrna 表现出一种非典型的特征。
图 1: exrna 测序和分析的工作流程.整个工作流程在左侧的灰色框中显示, 与每个步骤关联的质量控制位于右侧的红色框中。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 分化第0天和第7天细胞分泌的颗粒的大小分布.代表 nta 结果收集的粒子从 3 x t175 瓶在 (a) 天0和 (b) 第7天的分化。相应的平均值和模式大小以及粒子的浓度在图表下方进行制表。sd: 标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 细胞外 rna 采集前的细胞形态和成骨分化.(a) 在收集当天用收集介质培养的未分化骨髓间充质干细胞的显微镜。(b) 在收集当天, 用收集媒体对骨髓间充质干细胞进行了为期7天的区分。标度条 = 100μm. (c) alp 细胞的活动被归一化为各自的细胞活力。绘制的数值是三个独立实验的值。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: rna 提取后 rna 完整性的代表性电泳图谱.细胞外 rna (a) 和细胞 rna (b) 的 rna 分析。x 轴是 rna (nt) 的长度, y 轴是荧光。第一个高峰是25nt 的梯子, 核糖体 rna 显示为 18s (1800 nt) 和 28s (3800 nt)。rna 完整性数 (rin) 是基于18s 和28s 核糖体 rna 完整性的 rna 质量指标。较高的 rin 数字等于较好的质量。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 库构建后 cdna 文库的代表性电泳图.从第0天开始 (a) 细胞的 dna 分析, 第7天 (b) 细胞的 dna 分析, (d) 第7天开始的细胞外 rna 的 dna 分析, 以及 (d) 第7天开始的细胞外 rna。绿色和紫色数字分别为35分和 10, 380 米的梯子。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: cdna 库的定量和计算.图书馆被稀释500至1000倍的那些从 exrna 和 1, 000到4, 000倍为细胞 rna。图书馆与图书馆量化套件中的标准一起运行。根据日志10浓度 (pm) 绘制 dna 标准的平均 cq 值, 以生成标准曲线、标准曲线方程和 r2 值.请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 质量得分和序列的长度分布.低质量读取和适配器序列被修剪为 fastx 工具包 (a) 细胞和 (b) exrna。(c) 细胞和 (d) 外核的清洁读取长度分布。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: 排序后小 rna 的注释.批注表示 (a) 单元格和 (b) exrna 的干净读取百分比。请点击这里查看此图的较大版本.
| 样品 | 稀释系数 | cq 值 | 日志 (pm) | 浓度 (pm) | 浓度平均值 (pm) | 浓度均值 * (4521/143) | 乘以 d析度系数 (pm) |
| bmsc d0 exrna | 500元 | 7.72 | 0.702 | 5.0 36 | 5.276 | 16.678 | 8338.993 |
| bmsc d0 exrna | 500元 | 7.57 | 0.754 | 5.6 677 | |||
| bmsc d0 exrna | 500元 | 7。8 | 0.709 | 5.117 | |||
| bmsc d0 exrna | 1000元 | 8.64 | 0.383 | 2.416 | 22。5 | 7.477 | 7476.846 |
| bmsc d0 exrna | 1000元 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| bmsc d0 exrna | 1000元 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| bmsc d7 exrna | 500元 | 8.52 | 0.425 | 2.659 | 3.221 | 10.182 | 5090.913 |
| bmsc d7 exrna | 500元 | 8.42 | 0.459 | 2.82 | |||
| bmsc d7 exrna | 500元 | 7.97 | 0.615 | 4.125 | |||
| bmsc d7 exrna | 1000元 | 8.87 | 0.303 | 2.04 11 | 1.933 | 6.110 | 61110.391 |
| bmsc d7 exrna | 1000元 | 8.92 | 0.286 | 1.932 | |||
| bmsc d7 exrna | 1000元 | 8.97 | 0.269 | 1.857 | |||
| bmsc d0 电池 | 1000元 | 6.86 | 1.000 | 10.005 | 9.88 | 31.007 | 31006.974 |
| bmsc d0 电池 | 1000元 | 6.91 | 0.9. 8 | 9.614 | |||
| bmsc d0 电池 | 4400 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | 2.398 | 7.581 | 30322.041 |
| bmsc d0 电池 | 4400 | 8.59 | 0.400 | 2.52 | |||
| bmsc d0 电池 | 4400 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| bmsc d7 电池 | 1000元 | 8.44 | 0.452 | 2.834 | 2.82 | 9.104 | 9104.4 439 |
| bmsc d7 电池 | 1000元 | 8.43 | 0.456 | 2.8 557 | |||
| bmsc d7 电池 | 1000元 | 8.39 | 0.470 | 2.950 | |||
| bmsc d7 电池 | 4400 | 10.36 | -0.213 | 0.612 | 0.702 | 2.218 | 8872.689 |
| bmsc d7 电池 | 4400 | 10.27 | -0.182 | 0.658 | |||
| bmsc d7 电池 | 4400 | 9.97 | -0.078 | 0.836 | |||
| 计算： | |||||||
| 日志 (pm) =-0.3467 x (样本 cq 值) + 3.3786;使用标准曲线和公式 | |||||||
| 浓度 (pm) = 10^log(pM) | |||||||
| 大小调整计算 = dna 标准 (452 bp) 的大小除以平均片段长度 (143 bp) | |||||||
表 1: mirna 图书馆定量。
| 样品： | # 读不映射人类 | # 读取映射到细菌 | 细菌读数百分比 | # 读取映射到奶牛 | 牛阅读的百分比 |
| bmsc d0 电池 | 131007 | 9858 | 8% | 99 | 0.08% |
| bmsc d7 电池 | 169730 | 7935 | 5% | 188 | 0.11 |
| bmsc d0 exrna | 6122833 | 4551477 | 74% | 891 | 0.01% |
| bmsc d7 exrna | 7046691 | 5970086 | 85% | 771 | 0.01% |
表 2: 映射到细菌和牛读取的无与伦比的读数百分比。
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Discussion
在这里, 我们描述了一种用于下一代 exrna 测序的协议, 该协议支持从低输入样本进行差异表达式分析。坚持电动汽车和 exRNA 分离的特定协议是很重要的, 因为即使是微小的改变 (即超离心步骤或转子类型的变化) 也会影响转录组和 mirna 水平 13,14.因此, 无论 exrna 是如何分离的, 重要的是应用相同的实验和生物信息程序的所有样本在实验中能够比较的结果。
rna 完整性通常在生物分析仪上进行评估。但是, 由于 exrna 没有全长 rRNA, 它们的 rin 值很低, 但这不一定反映低质量 rRNA 样本。此外, exrna 的 rna 浓度差异很大, 而且往往不准确。因此, 与其评估 rna 质量和量化生物分析仪上的 rna, 不如每次使用相同数量的介质进行进一步处理。此外, 重新悬挂提取的 rna 在相同体积的再悬浮缓冲液中, 并使用相同的体积进行库建设。
通过将适配器的数量减少到标准协议的十分之一, 并使用其他试剂的一半, 优化了小型 rna 库的构建。减少适配器不仅可以防止适配器二聚体, 还可以防止分子内 rna 循环 15.试剂的减少是针对 illumina truseq 小 rna 样品制备试剂盒进行优化的。如果使用其他试剂盒, 建议也相应降低适配器和试剂, 除非试剂盒指定它是为低输入样品量身定制的。最后, 该协议中图书馆建设的 pcr 周期从12个周期增加到15个周期, 以解释 exrna 浓度低的原因。我们发现这是最佳的调整, 没有看到放大偏差15。
可以评估各种质量控制指标, 包括基本质量得分和读取长度配置文件。在进行生物信息学分析时, 细胞 rna 和 exrna 中的读数基本质量相似;然而, 序列的长度分布和注释原点是完全不同的。大多数来自细胞 rna 的读数映射到人类 mirna, 然而, 很大一部分的 exrna 读数是无与伦比的。仔细观察, 不匹配的读数被证明是细菌读数 (表 2)。这令人惊讶, 因为抗生素在我们的文化中经常使用。我们的结果与其他报告很好地吻合, 这些报告也显示了在测序细胞培养源 exrna16 时大量不匹配的读数。这些污染物的原因之一是细菌的大小与细胞外复合物或 ev 重叠, 因此在超离心步骤17期间共同纯化。以前的出版物已经发现, 培养基中的某些细菌受到广泛污染, 根据正常的细胞实验室程序, 这些细菌仍未被发现。到目前为止, 这个问题在很大程度上被忽略了, 但在净化和分析 exrna 时应该考虑到。
该协议详细介绍了从培养基中获取 exna 的完整指南, 优化了小型 rna 库的准备和原始库数据的处理。该协议特别突出了整个过程中的各种质量控制检查点, 以演示低输入样本 (如 exrna) 如何偏离正常的样品制备, 以便其他使用低输入样本的人可能知道该做什么。期望。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢克劳斯·布斯先生和伊纳诺的丽塔·罗森达尔女士的技术援助。特别感谢丹尼尔·奥特森博士允许我们频繁使用他的超离心机。这项研究得到了丹麦创新基金 (教育部项目) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
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