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Genetics

आइसोलेटिंग, अनुक्रमण और मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से extracellular micrornas का विश्लेषण

Published: March 8, 2019 doi: 10.3791/58655
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Interdisciplinary Nanoscience Centre, Aarhus University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कि सेल संस्कृति मीडिया से छोटे आरएनए पुस्तकालय निर्माण और अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए extracellular micrornas शुद्ध करने के लिए कैसे । विभिंन गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों को समझने के लिए क्या जब exrnas की तरह कम इनपुट नमूनों के साथ काम करने की उंमीद करने के लिए पाठकों को अनुमति देने के लिए वर्णित हैं ।

Abstract

extracellular और प्रसारित rnas (exrna) शरीर के कई कोशिका प्रकार के द्वारा उत्पादित कर रहे हैं और लार, प्लाज्मा, सीरम, दूध और मूत्र के रूप में कई शारीरिक तरल पदार्थ में मौजूद. इन rnas के एक सबसेट posttranscriptional नियामकों-micrornas (mirnas) हैं । विशिष्ट सेल प्रकार द्वारा उत्पादित mirnas चित्रित करने के लिए, इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों फसल और प्रोफाइल exrnas कोशिकाओं के एक सबसेट से व्युत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मध्योतक स्टेम कोशिकाओं के स्रावित कारकों कई रोगों को समाप्त करने में फंसाया जाता है और यहां में विट्रो मॉडल प्रणाली के रूप में प्रयोग किया जाता है । इस कागज संग्रह की प्रक्रिया का वर्णन, छोटे आरएनए के शुद्धिकरण और पुस्तकालय पीढ़ी के अनुक्रम extracellular mirnas करने के लिए । संस्कृति मीडिया से exrnas कम आरएनए इनपुट नमूने, जो अनुकूलित प्रक्रियाओं के लिए कॉल किया जा रहा द्वारा सेलुलर आरएनए से अलग । इस प्रोटोकॉल exrna शुद्धि और अनुक्रमण के दौरान प्रत्येक कदम पर गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों दिखा रहा है, संस्कृति मीडिया से छोटे exrna अनुक्रमण के लिए एक व्यापक गाइड प्रदान करता है.

Introduction

extracellular और प्रसारित rnas (exrnas) विभिन्न शारीरिक तरल पदार्थ में मौजूद हैं और rnases1,2की ओर प्रतिरोधी रहे हैं. उनके उच्च बहुतायत, स्थिरता और पहुंच में आसानी नैदानिक आकलन और शकुन मार्करों के रूप में के लिए आकर्षक है3। exrnas के लिए परिवहन की विधा extracellular vesicles (evs), लिपोप्रोटीन के साथ सहयोग (जैसे उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन शामिल हैं; एचडीएल) और राइबोन्यूलियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स (जैसे Argonaute2 कॉम्प्लेक्स के साथ)4.

exrnas का एक सबसेट micrornas (mirnas), जो छोटे गैर के बारे में 22 nt के rnas है कि posttranscriptional जीन अभिव्यक्ति को विनियमित कर रहे हैं । पूर्व-मिर्नास सेल-सेल संचार और सेल होमियोस्टेसिस के विनियमन में फंसा दिया गया है5. उदाहरण के लिए, एचडीएल इंटरसेलुलर आसंजन अणु 1 (ईकैम-1) और सूजन6को दबाने के लिए एंडोथेलीयल कोशिकाओं को पूर्व-मीर-२२३ बचाता है । दिलचस्प है, मीर-२२३ भी ल्यूकोसाइट्स से फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को extracellular vesicles द्वारा जाया देखा जाता है, उंहें एक अधिक आक्रामक phenotype7पर लेने के लिए प्रोग्रामिंग । इस प्रकार, विभिंन शारीरिक तरल पदार्थ और सेल संस्कृति माध्यम से पूर्व mirnas के transcriptome बहुत पूर्व mirnas संकेतन की हमारी समझ में सुधार होगा ।

छोटे आरएनए अनुक्रमण (छोटे आरएनए seq) छोटे rna के transcriptomics को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली उपकरण है । न केवल विभिंन नमूनों के बीच तुलना किया जा सकता है व्यवकलीय व्यक्त ज्ञात rnas, लेकिन उपंयास छोटे rnas भी पता लगाया जा सकता है और विशेषता । नतीजतन, यह भी एक मजबूत विधि अलग शर्तों के तहत व्यवकलीय व्यक्त mirnas की पहचान करने के लिए है । हालांकि, छोटे आरएनए सीक्यू की बाधाओं में से एक छोटी आरएनए सीक्यू पुस्तकालयों को सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ, लार, मूत्र, दूध, सीरम और संस्कृति मीडिया जैसे कम exrna इनपुट तरल पदार्थ से पैदा करने में कठिनाई है । illumina से truseq छोटे आरएनए लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल की आवश्यकता है लगभग 1 μg उच्च गुणवत्ता कुल आरएनए और नेबनेक्स्ट स्मॉल आरएनए लाइब्रेरी तैयारी सेट प्रोटोकॉल ंयू इंग्लैंड biolabs से १०० ng-1 μg of rna8,9की आवश्यकता है । oftentimes, इन नमूनों से कुल आरएनए पारंपरिक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए पता लगाने की सीमा से नीचे हैं ।

शारीरिक तरल पदार्थ से व्युत्पंन पूर्व mirnas संभावित अच्छे शकुन और नैदानिक मार्कर हैं । हालांकि, कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए या विशिष्ट पूर्व mirnas की उत्पत्ति का निर्धारण करने के लिए, सेल संस्कृति प्रणालियों अक्सर बजाय इस्तेमाल कर रहे हैं. mesenchymal स्टेम सेल (mscs) बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है क्योंकि उनके evs मायोकार्डियल रोधगलन, अल्जाइमर रोग और भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग10सहित कई रोगों को समाप्त करने में फंसाया गया है । यहां, हम अस्थि मज्जा से पूर्व mirnas के शुद्धिकरण-व्युत्पन्न mscs (bmscs) और विशिष्ट छोटे आरएनए पुस्तकालय निर्माण, अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण (चित्रा 1) का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया कदम का प्रदर्शन ।

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Protocol

नोट: mesenchymal स्टेम सेल ग्रोथ मीडियम (एमएससी मीडिया) सामग्री की तालिकामें संकेत के रूप में पहले से तैयार है ।

1. सेल संस्कृति

नोट: मानव मध्योतक स्टेम कोशिकाओं अस्थि मज्जा से प्राप्त किया जा सकता है, वसा ऊतक या अंय स्रोतों11। वैकल्पिक रूप से, hmscs एक सप्लायर के माध्यम से खरीदा जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल bmscs रोगियों की अस्थि मज्जा से प्राप्त की और एक कंपनी से खरीदा गया था ।

  1. गल 1 x 106 bmscs एक T175 कुप्पी में एमएससी मीडिया के 20 मिलीलीटर युक्त । 5% CO2 के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं और मीडिया को ८०% कन्फ्लुएंसी तक हर 2-3 दिनों की जगह ।
  2. 1x pbs के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोएं और पीबीएस छोड़ें ।
  3. 5 मिलीलीटर ०.०५% ट्रिप्सिन-एडीटीए जोड़कर कोशिकाओं को अलग करें और कोशिकाओं को ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनकोनेट कर दीजिये । टुकड़ी की सुविधा के लिए फ्लास्क के पक्षों ठोकर.
  4. ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए एमएससी मीडिया की 15 मिलीलीटर जोड़ें, सतह से कोशिकाओं को अलग करें, और एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें ।
  5. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को ले लीजिए और कोशिकाओं को गोली करने के लिए ३०० एक्स जी पर 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन ।
  6. MSC मीडिया के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना ।
    नोट: प्राथमिक मानव अस्थि मज्जा एक T175 कुप्पी में ८०% कन्फ्लुएंसी पर mscs 2 x 106 कोशिकाओं के आसपास है ।
  7. थाली hmscs में २,००० कोशिकाओं/सेमी2 में ताजा एमएससी मीडिया में 5 T175 flasks है । 5% CO2 के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बढ़ाएं और मीडिया को हर 2-3 दिनों तक बदलें, जब तक 5 बोतल ९०% संगामी T175 बोतल प्राप्त कर लिया जाता है ।

2. ईसीएस और आरएनए-संबद्ध जैवअणु संग्रह

नोट: EV संग्रह मीडिया पहले से तैयार है (है dulbecco संशोधित ईगल मध्यम [dmem] 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ [fbs] और 1% penicillin/स्ट्रेप्टोमाइसिन [पी/ ev संग्रह मीडिया सामांय एमएससी मीडिया है, लेकिन वाणिज्यिक EV-समाप्त fbs (सामग्री की तालिका) के साथ तैयार है । यह fbs से गोजातीय exrna संदूषण से बचने के लिए है, जो आम तौर पर evs के साथ जुड़े exrna शामिल, ribonucleoproteins, और लिपोप्रोटीन. छोटे आरएनए पुस्तकालय की तैयारी के लिए, mscs के 5 संगामी बोतल से व्युत्पंन exrnas पुस्तकालय निर्माण सक्षम करने के लिए आवश्यक हैं ।

  1. T175 flask प्रति pbs के 20 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं 3x धो लें । mscs के T175 संगामी प्रति EV संग्रह मीडिया के 20 मिलीलीटर जोड़ें और ४८ एच के लिए 5% सह2 के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं ।
  2. मीडिया को लीजिए और 10 मिनट के लिए मीडिया को ३०० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रेसेज करें ।
  3. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और २,००० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मीडिया को सेंट्रेसेज ।
  4. सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए और १५,५०० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मीडिया को अपकेंद्रिप । फिर सुपरनांट लीजिए ।
  5. ultracentrifuge ट्यूबों के लिए मीडिया स्थानांतरण और ९० मिनट के लिए गोली exrnas १००,००० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर । एक निश्चित कोण रोटर यहां प्रयोग किया जाता है और गोली ट्यूब के पक्ष में लंगर डाला है । ढक्कन की ओर मार्क और ट्यूब की ओर एक चक्र आकर्षित जहां गोली की उंमीद है ।
  6. supernatant निकालें, ट्यूब के अंदर सुखाने के लिए शोषक कागज पर ट्यूब उलटा और ट्यूब के नीचे छू बिना ट्यूब के अंदर तरल हटाने के लिए शोषक कागज के छोटे टुकड़े का उपयोग करें । 30 एस के लिए vortexing द्वारा pbs के २०० μl में गोली resuspend और ऊपर और नीचे 20x ।
  7. evs और नैनोपैर्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (nta) (चित्रा 2) के साथ जैव अणुओं का आकलन करें ।
    नोट: evs और जैव अणुओं नैनोलेख ट्रैकिंग विश्लेषण (nta), गतिशील प्रकाश बिखरने (dls) या संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM)12के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है ।
  8. आगे के बहाव के प्रयोगों तक ईसीएस और बायोअणु को-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
    नोट: अगर evs कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए जा रहे हैं, 20% ग्लिसरीन उन्हें टूटना से बचाने के लिए जोड़ा जाना चाहिए. यदि आवश्यक हो तो मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर कोशिकाओं को एकत्र किया जा सकता है ।

3. evs और आरएनए-संबद्ध जैव अणु संग्रह विभेदित कोशिकाओं का

नोट: evs और आरएनए संबद्ध जैव अणुओं भी सेल संस्कृति मीडिया से एकत्र किया जा सकता है जबकि कोशिकाओं को भेदभाव से गुजरना । प्रोटोकॉल में दर्शाया गया उदाहरण 0 दिन और भेदभाव के 7 में osteoblastic भेदभाव और exrna संग्रह का वर्णन करता है । यदि कोई भेदभाव की आवश्यकता है, तो अनुभाग 3 छोड़ और अनुभाग 4 पर जाएं ।

  1. osteoblastic विभेद मीडिया तैयार करें (dmem के साथ 10% fbs, 1% P/S, 10 मिमी β-ग्लिसफोस्फेट, 10 एनएम डेक्सामैथोसोन, ५० μm एस्कॉर्बेट-2-फॉस्फेट, और 10 मिमी १.२५-विटामिन-D3) हर बार ताजा ।
  2. एक बार mscs ८०% संगामी हैं, तो MSC मीडिया को ऑस्टिब्लास्टिक डिफरेशन मीडिया में बदलें ।
  3. 2-3 दिनों के बाद osteoblastic विभेदन मीडिया की भरपाई ।
  4. भेदभाव के दिन 5 पर, मीडिया को हटाने और T175 flask प्रति pbs के 20 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं 3x धोने ।
  5. ईवी संग्रह मीडिया की 20 मिलीलीटर जोड़ें जिसमें 10 मिमी β-ग्लिसोफॉस्फेट, 10 एनएम डेक्सामैथोसोन, ५० μm एस्कॉर्बेट-2-फॉस्फेट और 10 मिमी १.२५-विटामिन-डी3 प्रति संगामी T175 mscs की फ्लास्क । ४८ एच के लिए 5% सह2 के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए जारी ईसीएस और जैव अणु का संग्रह करते समय विभेद ।
  6. 7 दिन पर मीडिया ले लीजिए और चरण 2.2-2.6 में वर्णित के रूप में evs और जैव अणुओं को अलग करने के लिए आगे बढ़ें ।
  7. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, ९६ में बीज कोशिकाओं-कुओं या 6 कुओं एक alkaline फॉस्फोटेस (एएलपी) गतिविधि परख या मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qpcr), क्रमशः का उपयोग कर भेदभाव का आकलन करने के लिए ।
    नोट: चित्रा 3 कोशिकाओं के osteogenic भेदभाव दिखा एक उदाहरण है ।

4. आरएनए निष्कर्षण और गुणवत्ता नियंत्रण

  1. बर्फ पर कदम २.८ से गल नमूने । एक आरएनए आइसोलेशन किट (सामग्री तालिका) का उपयोग कर आरएनए निकालें ।
  2. rna अलगाव किट (सामग्री की तालिका) में १०० μl rnase मुक्त पानी में प्रदान की कॉलम से elute ।
  3. 1 μl की glycogen, 10 μl of 2 M pH ५.५ सोडियम एसीटेट और २५० μl के पूर्व-ठंडा ९९% इथेनॉल के १०० μl में शुद्ध rna जोड़कर इथेनॉल वर्षा के माध्यम से आरएनए को ध्यान लगाओ ।
  4. आरएनए हाला करने के लिए रातोंरात-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों सेते । आरएनए को १६,००० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रण करके गोली दें ।
    नोट: गोली glycogen के साथ सह वर्षा के कारण सफेद है ।
  5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और ७५% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ आरएनए गोली धो लें । १६,००० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए आरएनए को फिर से गोली दें ।
  6. इथेनॉल निकालें और आरएनए ट्यूब के ढक्कन को 5-10 मिनट के लिए खुला छोड़ दो आरएनए गोली सूखी । rnase मुक्त पानी के 7 μl में आरएनए गोली resuspend ।
  7. rna गुणवत्ता और एकाग्रता एक चिप आधारित केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस मशीन का उपयोग करने के लिए पुस्तकालय निर्माण से पहले निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए का पता लगाने की जांच करें ।
    नोट: आरएनए का एक प्रतिनिधि आकार वितरण चित्रा 4में दिखाया गया है ।
  8. यदि आवश्यक हो तो एक वाणिज्यिक शुद्धि किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर सेलुलर आरएनए निकालें ।

5. पुस्तकालय निर्माण और गुणवत्ता नियंत्रण

नोट: कम आरएनए इनपुट के कारण समायोजन के साथ वाणिज्यिक किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके छोटे आरएनए पुस्तकालयों का निर्माण किया जाता है । पुस्तकालय निर्माण चिल्ड ब्लॉक पर किया जाता है ।

  1. ठंडा हीटिंग ब्लॉक के लिए ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों पर बर्फ और पिपेट 5 μl के आरएनए से चरण ४.६ में ०.२ एमएल rnase-नि: शुल्क पीसीआर ट्यूबों एक ठंडा ब्लॉक पर ।
  2. एक ०.२ एमएल rnase मुक्त पीसीआर ट्यूब में rnase-मुक्त पानी में 3 ' adaptors (1:10) पतला । पतला अडैप्टर के ०.५ μl जोड़ें और ऊपर और नीचे 8x और सेंट्रेसेज संक्षेप में ट्यूब के तल पर सभी तरल इकट्ठा करने के लिए के साथ 5 μl rna के मिश्रण ।
  3. एक preheated थर्मल cycler में 2 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर आरएनए और 3 ' एडाप्टर मिश्रण सेते और फिर ठंडा ब्लॉक पर वापस नमूना जगह है ।
  4. 1 μl के लिगेशन बफर, ०.५ μl के rnase अवरोधक, और ०.५ μl के T4 आरएनए लिगाज़ (विलोपन उत्परिवर्ती) को आरएनए और 3 ' एडेप्टर मिश्रण में जोड़ें । ऊपर और नीचे 8x और सेंट्रेसेज संक्षेप में pipetting द्वारा मिक्स ।
  5. preheated थर्मल cycler में 1 एच के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते ।
  6. थर्मल cycler में रह ट्यूब के साथ नमूना ट्यूब में बंद समाधान के ०.५ μl जोड़ें, ऊपर और 8x नीचे pipetting द्वारा मिश्रण और 15 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते करने के लिए जारी है ।
  7. एक ०.२ एमएल rnase मुक्त पीसीआर ट्यूब में rnase-मुक्त पानी में 5 ' adaptors (1:10) पतला । एक अलग rnase मुक्त ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में 5 ' अडैप्टर के ०.५ μl जोड़ें, preheated थर्मल cycler में 2 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर 5 ' अनुकूलक गर्मी, और फिर ठंडा ब्लॉक पर नमूना जगह है ।
  8. 10 एनएम एटीपी के ०.५ μl जोड़ें, ०.५ μl के T4 आरएनए ligase करने के लिए 5 ' अडैप्टर ट्यूब, नीचे और 8x नीचे pipetting द्वारा मिश्रण और संक्षेप में नीचे में सभी तरल पदार्थ इकट्ठा करने के लिए सेंट्रेज ।
    नोट: जितना संभव हो उतना ठंडा ब्लॉक पर 5 ' एडेप्टर रखें ।
  9. जोड़ें १.५ μl के 5 ' एडेप्टर मिश्रण से नमूना करने के लिए चरण ५.६, और बहुत धीरे धीरे से 8x को pipetting द्वारा मिश्रण. preheated थर्मल cycler में 1 एच के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते ।
  10. एक rnase मुक्त ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में rnase-मुक्त पानी में पतला आरटी प्राइमरी 1:10 । चरण ५.९ से नमूना में पतला आरटी प्राइमर के ०.५ μl जोड़ें, बहुत धीरे से ऊपर और नीचे 8x धीमा और अपकेंद्री संक्षेप में pipetting द्वारा मिश्रण ।
  11. preheated थर्मल cycler में 2 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते और फिर एक ठंडा ब्लॉक पर नमूना जगह है ।
  12. 5x पहले भूग्रस्त बफर, ०.५ μl के १२.५ मिमी dntp मिक्स, ०.५ μl के १०० मिमी डाइथायोथ्रिटॉल (डीटीटी), ०.५ μl के rnase अवरोधक, और रिवर्स transcriptase के ०.५ μl के 1 μl जोड़ें । बहुत धीरे से मिक्स और 8x नीचे धीमा और सेंट्रेसेज संक्षेप में ।
  13. cdna प्राप्त करने के लिए preheated थर्मल cycler में 1 एच के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं ।
  14. ४.२५ μl का ultrapure पानी, पीसीआर मिक्स का १२.५ μl, इंडेक्स प्राइमर का 1 μl, और cdna में यूनिवर्सल प्राइमर के 1 μl जोड़ें । ऊपर और नीचे 8x और सेंट्रेसेज संक्षेप में pipetting द्वारा मिक्स ।
  15. एक थर्मल cycler में नमूना प्लेस और इस प्रकार के रूप में cycler सेट: ९८ ° c के लिए 30 s; 15 एस के लिए ९८ ° c के 10 चक्र, ६० ° c के लिए 30 s और ७२ ° c के लिए 15 s; और 10 मिनट के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस के साथ चक्र समाप्त ।
    नोट: तैयार लाइब्रेरी को एक सप्ताह के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  16. एक डीएनए जेल पर पुस्तकालय को अलग करके आरएनए पुस्तकालय को शुद्ध और १४० बीपी और १६० बीपी के बीच जेल (जेल निष्कर्षण) काटने और पुस्तकालय निर्माण किट द्वारा दिए गए प्रोटोकॉल के बाद जेल से पुस्तकालय eluting ।
    नोट: इस अध्ययन में, चरण ५.१५ से तैयार पुस्तकालय एक वाणिज्यिक जेल (सामग्री की तालिका) पर भरी हुई है और १४० बीपी और १६० बीपी के बीच पुस्तकालय बाहर एक स्वचालित डीएनए आकार प्रभाजक द्वारा शुद्ध है (सामग्री की तालिका) के अनुसार निर्माता के प्रोटोकॉल ।
  17. एक कॉलम आधारित पीसीआर शुद्धिकरण किट (सामग्री तालिका) का उपयोग करके पुस्तकालय को ध्यान से और धो लें ५.१६ और 10 μl rnase-मुक्त पानी में पुस्तकालय अंत में elute ।
  18. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद पुस्तकालय के आकार की जांच करने के लिए एक डीएनए चिप (सामग्री की तालिका) पर शुद्ध पुस्तकालय के 1 μl लोड ।
  19. शुद्ध पुस्तकालय के 1 μl पतला (1:1000) में 10 मिमी पीएच ८.० Tris-HCl के साथ ०.०५% पॉल्यसोरबट 20 और यों तो qpcr द्वारा एक वाणिज्यिक पुस्तकालय यों तो किट का उपयोग कर पुस्तकालय एकाग्रता किट में डीएनए मानकों का उपयोग करने के लिए यों तो.
  20. पूल एक उच्च-थ्रपुट अनुक्रमण सिस्टम पर अनुक्रमण मशीन और अनुक्रम की आवश्यकताओं के अनुसार लायब्रेरीज़ की बराबर मात्रा ।
    नोट: सेलुलर आरएनए के पुस्तकालय निर्माण किट के मानक प्रोटोकॉल का पालन करके एक ही किट का उपयोग किया जा सकता है ।

6. जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन

नोट: यह एक में घर पाइप लाइन है और यहां इस्तेमाल किया कार्यक्रमों सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं ।

  1. दूर ट्रिम कम गुणवत्ता पढ़ता है और रॉ से एडेप्टर दृश्यों को पढ़ता है ।
  2. नक्शा साफ rnas के विभिंन प्रकार के लिए पढ़ता है ।
    1. भारी संशोधित trnas अनुक्रम रिवर्स transcriptase द्वारा लगातार आधार misincorporation के कारण क्योंकि दो बेमेल अनुमति देकर एनोटेट trnas.
    2. mirnas से मानव mirnas करने के लिए मानचित्रण द्वारा एनोटेट mirnas शूंय बेमेल अनुमति v21 । के बाद से mirnas एक और U nontemplated 3 ' अंत परिवर्धन के अधीन हैं, अनुक्रम है कि नक्शा नहीं है 3 ' अप करने के लिए छंटनी की तीन एक और/या टी एनटीएस के बाद पढ़ता है जो मानव mirnas करने के लिए मैप किया गया है और mirnas से अन्य mirnas शून्य बेमेल की अनुमति v21.
    3. अन्य प्रासंगिक छोटे rnas करने के लिए एनोटेट (snrna, स्नोर्ना, पिरना, और वाई rnas) एक बेमेल की अनुमति देकर.
    4. शेष मैप करने के लिए लंबी आरएनए डेटासेट (rrna, rna से अंय आरएनए, और mrna) के लिए गिरावट का आकलन नक्शा ।
    5. मानव जीनोम को जुगाड़ को एनोटेट करें ।
    6. जीवाणु जीनोम को दृश्यों को एनोटेट करें ।
    7. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग कर mirna अभिव्यक्ति सामान्य: mirna गिना जाता है/सभी मैप किए गए mirna की कुल गिनती) x 106.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि अगली पीढ़ी sequencing के लिए एमएससी संस्कृति से exrna इकट्ठा करने के लिए अनुकूलित है । वर्कफ़्लो की समग्र योजना बाईं ओर चित्रा 1 में है और संबंधित गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों पर सही हैं ।

अभेदित (चित्रा 3a) और विभेदित (चित्रा 3a) कोशिकाओं के लिए संग्रह के दिन पर कोशिकाओं की आकारिकी दिखाया जाता है । इसके अलावा, 7 दिनों के लिए प्रेरित कोशिकाओं की एएलपी गतिविधि के प्रतिनिधि सामान्यीकृत स्तर भी दिखाए गए हैं (चित्रा 3 सी) । यहां, एएलपी गतिविधि लगभग २.५ बार है कि अप्रेरित कोशिकाओं की ।

तीन T175 बोतल संगामी mscs उपज 2-5 x 1010 कणों/एमएल (चित्रा 2) । मतलब कण आकार लगभग 160-165 एनएम है जबकि कणों के सबसे 130-140 एनएम रहे हैं । २०० और ५०० एनएम के बीच कुछ छोटे चोटियों थे, जो बड़े परिसरों या बड़े समुच्चय का संकेत होता है ।

चूंकि आरएनए को जल्दी से नीचा किया जा सकता है, तो किट या प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए निष्कर्षण की शर्तों का कड़ाई से पालन करें । rnase मुक्त शर्तों का उपयोग करें, विशेष रूप से rnase-मुक्त पानी आरएनए resuspend और जब संभव हो तो बर्फ पर आरएनए रखने के लिए । निष्कर्षण के बाद, आरएनए एक चिप आधारित केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस मशीन का उपयोग कर मात्रा निर्धारित जा सकता है । विश्लेषण किया जा रहा है के बाद आरएनए के प्रतिनिधि electropherograms चित्रा 4में दिखाया गया है । exrnas के इलेक्ट्रोफोरोग्राम में rnas (चित्रा 4a) की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है । इसके विपरीत, सेलुलर आरएनए के आसपास 70-120, १८००, और ३८०० nt, जो trna/5s rrna/5.8 एस rrna, 18s rrna, और 28s rrna, क्रमशः (चित्रा 4b) के अनुरूप बहुत विशिष्ट चोटियों है । आरएनए अखंडता संख्या (०११) आरएनए की गुणवत्ता का प्रतिनिधित्व करता है । सेलुलर आरएनए का एक अच्छा रिण 8 > है (लगभग कोई आरएनए गिरावट का संकेत) । एल्गोरिथ्म जिस पर ०११ आधारित है 28s और 18s के बीच अनुपात है । इसका मतलब यह है कि रिण exrnas की rna गुणवत्ता का एक अच्छा संकेतक नहीं है, क्योंकि पूर्ण लंबाई rrnas exrnas में आमतौर पर detectable नहीं हैं ।

आरएनए निष्कर्षण के बाद, मिरना पुस्तकालयों का निर्माण किया गया था और cdna पुस्तकालयों को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किया गया था । एडेप्टर की ligated cdna के बीच आम तौर पर है mirnas १४० और १६० nt । पुस्तकालय की गुणवत्ता तो एक चिप आधारित केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस मशीन (चित्रा 5) पर कल्पना की थी । चित्रा 5a और चित्रा 5a 0 और दिन 7 दिन में सेलुलर आरएनए से पुस्तकालयों रहे हैं, क्रमशः. चित्रा 5c और चित्रा 5d क्रमशः 0 दिन और 7 दिन में exrna पुस्तकालयों रहे हैं । सभी चार नमूनों में चारों ओर चोटियों था १४० nt, जो सफल mirna पुस्तकालय निर्माण का संकेत. पुस्तकालयों में cdna की राशि qpcr द्वारा मात्रा निर्धारित था एक पुस्तकालय मात्रा निर्धारित किट का उपयोग. मानकों के परिमाणीकरण चक्र (सीक्यू) एक मानक वक्र प्राप्त करने के लिए एकाग्रता के प्रवेश के खिलाफ साजिश रची गई थी (चित्रा 6). इसके बाद मानक वक्र के समीकरण का उपयोग पुस्तकालयों की सांद्रता (सारणी 1) की गणना के लिए किया गया । हमारे नमूने में, exrnas से पुस्तकालयों की एकाग्रता 5-8 एनएम, जो सेलुलर rnas (8-30 एनएम) से पुस्तकालयों की तुलना में काफी कम था । लायब्रेरी तब बराबर राशि के साथ परित और sequencing के लिए भेजा गया था ।

पुस्तकालयों अनुक्रम थे के बाद, कम गुणवत्ता पढ़ता fastx-टूलकिट के साथ दूर छंटनी की गई थी और पुस्तकालय exrnas के परिणामस्वरूप गुणवत्ता उच्च और कोशिकाओं से पुस्तकालयों के लिए तुलनीय था (चित्रा 7a, बी). कोशिकाओं से पुस्तकालयों के अनुक्रम लंबाई लगभग 22 nt (चित्रा 7c), जो mirnas के साथ संबद्ध पर एक चोटी था । इसके विपरीत, exrnas से पुस्तकालयों और अधिक विषम थे और शामिल 3 प्रमुख चोटियों: 22 nt, 30 nt, और ३३ nt (चित्रा 7d) । उनके सेलुलर समकक्षों के समान, चोटी पर 22 nt mirnas है । करीब निरीक्षण से पता चला है कि चोटियों पर 30 और ३३ nt है trnas halves/ प्रतिचित्रित पढ़ता के एनोटेशन फिर प्लॉट किए गए थे । अधिकांश पुस्तकें (६५.१%) सेलुलर आरएनए से मानव mirnas करने के लिए मैप किया गया और अन्य छोटे rna के प्रत्येक मैप किए गए पढ़ता के एक छोटे से हिस्से के लिए जिम्मेदार (चित्र 8a). contrastingly, मानव mirnas (चित्र 8b) के लिए मैप exrnas का केवल 8% । सबसे प्रचुर मात्रा में छोटे आरएनए जो पढ़ता मैप किया गया trnas थे । पढ़ता के अधिकांश थे "बेजोड़ पढ़ता" (४३%). बेजोड़ के आगे की परीक्षा वैश्विक डेटाबेस के लिए exrnas से पढ़ता आश्चर्य की बात है कि उनमें से ज्यादातर जीवाणु अनुक्रम के अनुरूप है (७४% और ८५% के लिए D0 और D7 exrnas, क्रमशः; तालिका 2) । इसके विपरीत, सेलुलर आरएनए का केवल ०.९% बेजोड़ और, उन में से, केवल 10% बैक्टीरिया के लिए मैप किया गया था । गोजातीय जीनोम की तुलना से कम 1% से पता चलता है कि fbs संदूषण का स्रोत नहीं था मैच (2 तालिका) । इसलिए, exrnas सामान्य सेलुलर आरएनए की तुलना में एक अटूट प्रोफ़ाइल प्रदर्शन.

Figure 1
चित्रा 1: exrna अनुक्रमण और विश्लेषण के कार्यप्रवाह. संपूर्ण वर्कफ़्लो धूसर बक्सों में बाईं ओर दर्शाया गया है और प्रत्येक चरण से संबद्ध गुणवत्ता नियंत्रण दाईं ओर लाल बक्सों में है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: दिन 0 और भेदभाव के दिन 7 पर कोशिकाओं द्वारा स्रावित कणों का आकार वितरण । 3 x से एकत्र कणों के प्रतिनिधि nta परिणाम T175 (एक) दिन 0 और (ख) भेदभाव के दिन 7 पर बोतल है । संबंधित मतलब है और मोड आकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कणों की एकाग्रता रेखांकन के नीचे सारणीबद्ध कर रहे हैं । एसडी: मानक विचलन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: कोशिका आकारिकी और osteogenic विभेदन से पहले extracellular आरएनए संग्रह करने के लिए । (A) संग्रह के दिन पर संग्रह मीडिया के साथ अभेदित bmscs के सूक्ष्मग्राफ । (ख) bmscs के माइक्रोग्राफ संग्रह के दिन पर संग्रह मीडिया के साथ 7 दिनों के लिए विभेदित. स्केल पट्टियां = १०० μm । (ग) कोशिकाओं की एएलपी गतिविधियों उनके संबंधित सेल viabilities के लिए सामान्यीकृत थे । प्लॉट किए गए मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों के थे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: rna अखंडता के प्रतिनिधि electropherogram आरएनए निष्कर्षण के बाद । extracellular आरएनए (ए) और सेलुलर आरएनए (बी) का आरएनए विश्लेषण । x-अक्ष rna (nt) की लंबाई है और y-अक्ष प्रतिदीप्ति है । पहली चोटी पर सीढ़ी है 25 nt. राइबोसोमल rnas 18s (१,८०० nt) और 28s (३,८०० nt) के रूप में दिखाया गया है । आरएनए अखंडता संख्या (०११) आरएनए गुणवत्ता 18s और 28s राइबोसोमल आरएनए अखंडता के आधार पर एक संकेतक है । उच्च रिण संख्या समान बेहतर गुणवत्ता । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पुस्तकालय निर्माण के बाद cdna पुस्तकालयों के प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफोरोग्राम. 0 दिन में (क) कोशिकाओं से पुस्तकालयों का डीएनए विश्लेषण, (ख) 7 दिन में कोशिकाओं, (ग) 0 दिन से extracellular आरएनए, और (घ) 7 दिन से extracellular आरएनए । हरे और बैंगनी संख्या क्रमशः ३५ nt और १०,३८० nt पर सीढ़ी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: cdna पुस्तकालय परिमाणन और गणना. पुस्तकालयों के बीच 500-1000 बार exrna से उन लोगों के लिए और १,००० और सेल आरएनए के लिए ४,००० बार के बीच पतला थे । पुस्तकालयों पुस्तकालय परिमाणन किट से मानकों के साथ चला रहे थे. डीएनए मानकों के औसत सीक्यू मूल्यों को एक मानक वक्र, मानक वक्र के लिए एक समीकरण और एक R2 मान उत्पन्न करने के लिए लॉग10 एकाग्रता (पीएम) के खिलाफ प्लॉट किए गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: गुणवत्ता स्कोर और दृश्यों की लंबाई वितरण । कम गुणवत्ता पढ़ता है और अनुकूलक अनुक्रम (एक) कोशिकाओं और (ख) exrnas के लिए fastx-टूलकिट के साथ छंटनी की गई. साफ की लंबाई वितरण (ग) कोशिकाओं और (घ) exrnas के लिए पढ़ता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: अनुक्रमण के बाद छोटे rnas के एनोटेशन । एनोटेशन (A) कक्षों और (B) exrnas के लिए क्लीन पढ़ता प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

नमूना तनुता गुणक सीक्यू मान log (pM) एकाग्रता (पीएम) एकाग्रता माध्य (पीएम) एकाग्रता माध्य * (452/143) dillution फ़ैक्टर (pM) द्वारा गुणा
बीएमएससी D0 exrna ५०० ७.७२ ०.७०२ ५.०३६ ५.२७६ १६.६७८ ८३३८.९९३
बीएमएससी D0 exrna ५०० ७.५७ ०.७५४ ५.६७७
बीएमएससी D0 exrna ५०० ७.७ ०.७०९ ५.११७
बीएमएससी D0 exrna १००० ८.६४ ०.३८३ २.४१६ २.३६५ ७.४७७ ७४७६.८४६
बीएमएससी D0 exrna १००० ८.६८ ०.३६९ २.३४०
बीएमएससी D0 exrna १००० ८.६८ ०.३६९ २.३४०
bmsc D7 exrna ५०० ८.५२ ०.४२५ २.६५९ ३.२२१ १०.१८२ ५०९०.९१३
bmsc D7 exrna ५०० ८.४२ ०.४५९ २.८८०
bmsc D7 exrna ५०० ७.९७ ०.६१५ ४.१२५
bmsc D7 exrna १००० ८.८७ ०.३०३ २.०११ १.९३३ ६.११० ६११०.३९१
bmsc D7 exrna १००० ८.९२ ०.२८६ १.९३२
bmsc D7 exrna १००० ८.९७ ०.२६९ १.८५७
बीएमएससी D0 सेल १००० ६.८६ १.००० १०.००५ ९.८१० ३१.००७ ३१००६.९७४
बीएमएससी D0 सेल १००० ६.९१ ०.९८३ ९.६१४
बीएमएससी D0 सेल ४००० ८.६८ ०.३६९ २.३४० २.३९८ ७.५८१ ३०३२२.०४१
बीएमएससी D0 सेल ४००० ८.५९ ०.४०० २.५१४
बीएमएससी D0 सेल ४००० ८.६८ ०.३६९ २.३४०
बीएमएससी D7 सेल १००० ८.४४ ०.४५२ २.८३४ २.८८० ९.१०४ ९१०४.४३९
बीएमएससी D7 सेल १००० ८.४३ ०.४५६ २.८५७
बीएमएससी D7 सेल १००० ८.३९ ०.४७० २.९५०
बीएमएससी D7 सेल ४००० १०.३६ -०.२१३ ०.६१२ ०.७०२ २.२१८ ८८७२.६८९
बीएमएससी D7 सेल ४००० १०.२७ -०.१८२ ०.६५८
बीएमएससी D7 सेल ४००० ९.९७ -०.०७८ ०.८३६
गणना:
log (pM) =-०.३४६७ x (नमूना cq मान) + ३.३७८६; मानक वक्र और सूत्र का उपयोग करें
एकाग्रता (pm) = 10 ^ log (pm)
आकार समायोजन परिकलन = औसत अंश लंबाई (१४३ bp) द्वारा विभाजित डीएनए मानक (४५२ bp) का आकार

तालिका 1: mirna पुस्तकालय quantification ।

नमूना: # पढ़ता नहीं मानव मानचित्रण # पढ़ता बैक्टीरिया को मानचित्रण % बैक्टीरियल पढ़ता है # गाय को मानचित्रण पढ़ता % बोवाइन पढ़ता है
बीएमएससी D0 सेल १३१००७ ९८५८ 8 ९९ ०.०८%
बीएमएससी D7 सेल १६९७३० ७९३५ 5 १८८ ०.११%
बीएमएससी D0 exrna ६१२२८३३ ४५५१४७७ ७४% ८९१ ०.०१%
bmsc D7 exrna ७०४६६९१ ५९७००८६ ८५% ७७१ ०.०१%

तालिका 2: बेजोड़ का प्रतिशत पढ़ता है कि बैक्टीरिया और गोजातीय के लिए नक्शा पढ़ता है.

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Discussion

यहां, हम एक प्रोटोकॉल exrnas कि कम इनपुट नमूनों से अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण सक्षम बनाता है की अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए वर्णन । EV और exrna अलगाव के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल का पालन महत्वपूर्ण है क्योंकि यहां तक कि छोटे परिवर्तन (यानी, ultracentrifugation कदम या रोटर प्रकार में एक परिवर्तन) transcriptome और mirna के स्तर को प्रभावित कर सकते है13,14। इस प्रकार, कैसे exrna अलग है की परवाह किए बिना, यह एक प्रयोग में सभी नमूनों के लिए एक ही प्रयोगात्मक और bioinformatic प्रक्रिया को लागू करने के लिए परिणामों की तुलना करने में सक्षम होना महत्वपूर्ण है ।

आरएनए अखंडता जैव विश्लेषक पर आम तौर पर मूल्यांकन किया जाता है । हालांकि, के बाद से exrnas पूर्ण लंबाई rrna रहित हैं, उनके RIN मूल्य बहुत कम है, लेकिन यह जरूरी कम गुणवत्ता rna नमूनों को प्रतिबिंबित नहीं करता है. इसके अतिरिक्त, आरएनए एकाग्रता के exrnas बहुत विविध और अक्सर गलत है. इसलिए, आरएनए गुणवत्ता का आकलन और जैव विश्लेषक पर आरएनए बढ़ाता के बजाय, आगे की प्रक्रिया के लिए हर बार मीडिया की एक ही मात्रा का उपयोग करें । इसके अलावा, resuspend पुनर्पेंशन बफर की एक ही मात्रा में निकाला आरएनए और पुस्तकालय निर्माण के लिए एक ही मात्रा का उपयोग करें ।

लघु आरएनए पुस्तकालय निर्माण मानक प्रोटोकॉल के दसवें करने के लिए adaptors की राशि को कम करने और अन्य अभिकर्मकों का एक आधा का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था । adaptors न केवल अडैप्टर dimers रोकता है को कम करने, यह भी अंत: अणुक आरएनए परिपत्र15रोकता है । अभिकर्मकों में कमी illumina truseq छोटे आरएनए नमूना तैयारी किट के लिए अनुकूलित है । अन्य किट का इस्तेमाल किया जाना चाहिए, यह भी कम एडाप्टर के लिए सिफारिश की है और अभिकर्मकों तदनुसार, जब तक किट निर्दिष्ट करता है कि यह निम्न इनपुट नमूनों के लिए सिलवाया है. अंत में, पुस्तकालय निर्माण के लिए पीसीआर साइकिल इस प्रोटोकॉल में 12 से 15 चक्र से बढ़ गया था exrnas की कम एकाग्रता के लिए खाते में । हमने यह पाया है कि प्रवर्धन15को देखने के बिना इष्टतम समायोजन किया जा सकता है ।

विभिन्न गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स आधार गुणवत्ता स्कोर और पढ़ें लंबाई प्रोफ़ाइल सहित मूल्यांकन किया जा सकता है । जब जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण कर रहा है, सेलुलर आरएनए और exrnas में पढ़ता के आधार गुणवत्ता समान थे; हालांकि, लंबाई वितरण और एनोटेटेड अनुक्रम की उत्पत्ति पूरी तरह से अलग थी । अधिकांश सेलुलर आरएनए से पढ़ता है मानव mirnas करने के लिए मैप, हालांकि, exrna पढ़ता का एक बड़ा अनुपात बेजोड़ पढ़ता था. करीब निरीक्षण पर, बेजोड़ पढ़ता है बाहर निकला जीवाणु पढ़ता है (तालिका 2) । यह आश्चर्य की बात है क्योंकि एंटीबायोटिक दवाओं नियमित रूप से हमारी संस्कृति में इस्तेमाल किया गया था । हमारे परिणाम अन्य रिपोर्टों के साथ अच्छी तरह से संरेखित करता है जो भी बेजोड़ पढ़ता है जब अनुक्रमण सेल संस्कृति16exrna व्युत्पंन के बड़े अनुपात दिखाया । इन contaminants के लिए कारणों में से एक यह है कि बैक्टीरिया extracellular परिसरों या evs के साथ आकार में ओवरलैप, और इसलिए ultracentrifugation कदम17के दौरान सह शुद्ध । पिछले प्रकाशनों ने संस्कृति मीडिया में कुछ बैक्टीरिया के व्यापक संक्रमण की पहचान की है जो सामान्य सेल लैब प्रक्रियाओं के तहत नहीं चल पाता है18. तिथि करने के लिए, इस समस्या को काफी हद तक नजरअंदाज कर दिया गया है, लेकिन शुद्ध और exrnas का विश्लेषण करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए.

इस प्रोटोकॉल विवरण संस्कृति मीडिया, छोटे आरएनए पुस्तकालय की तैयारी के अनुकूलन और कच्चे पुस्तकालय डेटा प्रसंस्करण से कटाई exrnas के लिए एक पूरा गाइड । इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से कैसे कम इनपुट नमूने (exrnas की तरह) सामान्य नमूना तैयारी से विचलित कर सकते हैं प्रदर्शन करने के लिए प्रक्रिया भर में विभिन्न गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों पर प्रकाश डाला गया ताकि कम निवेश के नमूनों के साथ काम कर रहे अन्य लोगों को पता हो सकता है उम्मीद.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उनके तकनीकी सहायता के लिए inano में श्री क्लॉस बस और सुश्री रीता rosendahl के लिए आभारी हैं । अपने ultracentrifuge के हमारे लगातार उपयोग की अनुमति के लिए डॉ डैनियल otzen के लिए विशेष धन्यवाद । इस स्टडी को इनोवेशन फंड डेनमार्क (muster project) ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells ATCC PCS-500-012 Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit Lonza PT-3001 Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS Gibco A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA Gibco 25200056
T175 Flask Sarstedt 833,912
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline Sigma 806552
Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly Beckman Coulter 355618
Beckman Coulter Type 60 Ti Rotor used here
NucleoCounter Chemometec NC-3000 Cell Counter
β-glycerophosphate Calbiochem 35675 Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone Sigma D4902-25MG Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma D1530-1MG Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1514 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits Roche KK4824 Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) Illumina RS-200-0012 Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep Sage Science Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit Cold Spring Harbor Lab Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt Adaptor removal in step 6
Bowtie Mapping of clean reads in step 6
Samtools To make the expression profile in step 6
Bedtools To make the expression profile in step 6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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आइसोलेटिंग, अनुक्रमण और मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से extracellular micrornas का विश्लेषण
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Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. T., Mothershead, C. R., Su, J., Kjems, J. Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e58655, doi:10.3791/58655 (2019).

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