Summary
Denne protokol demonstrerer, hvordan til at rense ekstracellulære MicroRNA fra celle kultur medier for små RNA bibliotek opbygning og næste generation sequencing. Forskellige kvalitetskontrol checkpoints er beskrevet til at give læserne til at forstå, hvad de kan forvente når du arbejder med lav input prøver som exRNAs.
Abstract
Ekstracellulære og cirkulerende RNA'er (exRNA) er produceret af mange celletyper i kroppen og findes i talrige kropsvæsker såsom spyt, plasma, serum, mælk og urin. Et undersæt af disse RNA'er er posttranskriptionelle lovgiverne – MicroRNA (miRNAs). For at afgrænse miRNAs produceret af specifikke celletyper, in vitro-kultur systemer kan bruges til at høste og profil exRNAs stammer fra en delmængde af celler. De udskilles faktorer af mesenkymale stamceller er impliceret i lindre mange sygdomme og bruges som in vitro-modelsystemet her. Dette papir beskriver processen for indsamling, rensning af små RNA og bibliotek generation at sekvens ekstracellulære miRNAs. ExRNAs fra kultur medier afviger fra cellulære RNA ved at være lavt RNA input prøver, som opfordrer til optimeret procedurer. Denne protokol giver en omfattende guide til små exRNA sekventering fra dyrkningsmedier, viser kvalitetskontrol checkpoints på hvert trin under exRNA rensning og sekventering.
Introduction
Ekstracellulære og cirkulerende RNA'er (exRNAs) er til stede i forskellige kropsvæsker og er resistente mod RNases1,2. Deres høje overflod, stabilitet og brugervenlighed tilgængelighed er attraktive for klinisk vurdering som diagnostiske og prognostiske markører3. Transportform for exRNAs omfatter ekstracellulære vesikler (EVs), association med lipoprotein (såsom high-density lipoprotein; HDL) og ribonucleoprotein komplekser (såsom med Argonaute2 komplekser)4.
Et undersæt af exRNAs er MicroRNA (miRNAs), som er små, ikke-kodende RNA'er af omkring 22 nt, der regulerer posttranskriptionelle genekspression. Ex-miRNAs har været impliceret i celle-celle kommunikation og regulering af celle homøostase5. For eksempel, HDL leverer ex-miR-223 i endothelial celler til at undertrykke intercellulære vedhæftning molekyle 1 (ICAM-1) og betændelse6. Interessant, ses miR-223 også transporteres af ekstracellulære vesikler fra leukocytter til lunge kræftceller, programmering dem til at påtage sig en mere invasive fænotype7. Således vil transkriptom af ex-miRNAs fra forskellige kropsvæsker og cellekulturmedium forbedre vores forståelse af ex-miRNA signalering.
Små RNA sekventering (små RNA FF.) er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at forstå transcriptomics af små RNA'er. Ikke kun kan sammenlignes med forskellige stikprøver blandt varierende udtrykt kendte RNA'er, men romanen små RNA'er kan også registreres og karakteriseret. Derfor er det også en robust metode til at identificere varierende udtrykt miRNAs under forskellige betingelser. En af forhindringerne for små RNA seq er imidlertid vanskeligheder med at skabe små RNA seq biblioteker fra lav exRNA input væsker som cerebrospinal væsker, spyt, urin, mælk, serum og kultur medier. TruSeq små RNA bibliotek Prep protokollen fra Illumina kræver ca 1 µg af høj kvalitet total RNA og NEBNext små RNA bibliotek Prep indstille protokollen fra New England Biolabs kræver 100 ng-1 µg RNA8,9. Oftentimes, total RNA fra disse prøver er under detektionsgrænsen for konventionelle UV-vis spektrofotometre.
Ex-miRNAs afledt af kropsvæsker er potentielt god diagnostiske og prognostiske markører. Men for at studere de funktionelle virkninger eller for at bestemme oprindelsen af specifikke ex-miRNAs celle kultur systemer ofte bruges i stedet. Mesenchymale stamceller (msc) har været studeret grundigt, fordi deres evt har været impliceret i lindre mange sygdomme, herunder myokardieinfarkt, Alzheimers sygdom og graft versus host sygdommen10. Her, vise vi rensning af ex-miRNAs fra knoglemarv-afledte MSCs (BMSCs) og de specifikke trin bruges til at optimere små RNA bibliotek byggeri, sekventering og dataanalyse (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Vækstmediet mesenchymale stamceller (MSC medier) er udarbejdet på forhånd som angivet i Tabel af materialer.
1. cellekultur
Bemærk: Humane mesenkymale stamceller kan fås fra knoglemarven, fedtvæv eller andre kilder11. Alternativt kan hMSCs købes gennem en leverandør. BMSCs anvendes i denne protokol blev afledt fra knoglemarven af patienter og købt fra et firma.
- Tø 1 x 106 BMSCs i en T175 kolbe indeholdende 20 mL af MSC medier. Inkuber celler ved 37 ° C med 5% CO2 og erstatte medierne hver 2-3 dage indtil 80% confluency.
- Cellerne vaskes med 5 mL af 1 x PBS og kassér PBS.
- Frigør cellerne ved tilsætning af 5 mL 0,05% Trypsin-EDTA og inkubere celler i 5 min ved 37 ° C. Tryk på siderne af kolben til lette detachement.
- Der tilsættes 15 mL af MSC medier til at inaktivere trypsin, frigør celler fra overfladen og pipetteres op og ned for at få enkelt celle suspensioner.
- Indsamle cellerne i en 50 mL tube og spin-ned i 5 min på 300 x g at sammenpresse cellerne.
- Resuspend celler i 1 mL af MSC medier og tælle de celler ved hjælp af en hemocytometer.
Bemærk: Primære menneskelige knoglemarv MSCs på 80% confluency i en T175 kolbe er omkring 2 x 106 celler. - Plade hMSCs på 2.000 celler/cm2 i friske MSC medier i 5 T175 kolber. Vokser celler ved 37 ° C med 5% CO2 og erstatte medierne hver 2-3 dage indtil 5 kolber af 90% sammenflydende T175 kolber er opnået.
2. evt og RNA-associerede biomolekyler samling
Bemærk: EV samling medier er forberedt på forhånd (Dulbeccos modificerede Eagle Medium [DMEM] med 10% føtal bovint serum [FBS] og 1% penicillin/streptomycin [Poulsen]). EV samling medier er normale MSC medier, men tilberedt med kommercielle EV-forarmet FBS (Tabel af materialer). Dette er for at undgå bovin exRNA forurening fra FBS, som normalt indeholder exRNAs tilknyttet evt, ribonucleoproteins og lipoprotein. For små RNA bibliotek forberedelse skal exRNAs stammer fra 5 sammenflydende kolber af MSC'er aktivere bibliotek konstruktion.
- Vaske cellerne 3 x med 20 mL PBS pr. T175 kolbe. Der tilsættes 20 mL EV samling media pr. sammenflydende T175 kolbe af MSC'er og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 for 48 h.
- Indsamle medierne og centrifugeres medier til 10 min på 300 x g og 4 ° C.
- Indsamle supernatanten og centrifugeres medier for 20 min på 2.000 x g og 4 ° C.
- Indsamle supernatanten og centrifugeres medier for 30 min på 15.500 x g og 4 ° C. Derefter indsamle supernatanten.
- Overføre medier til ultracentrifuge rør og pellet exRNAs i 90 min. på 100.000 x g og 4 ° C. En fast vinkel rotor bruges her og pellet er forankret til siden af røret. Marker siden af låget og tegn en cirkel på siden af røret hvor pellet forventes.
- Fjern supernatanten, tør inde i røret ved at vende røret på absorberende papir og bruge små stykker af absorberende papir til at fjerne væske inde i røret uden at røre bunden af røret. Resuspenderes i 200 μl af PBS af vortexing for 30 s og pipettering op og ned ad 20 x.
- Vurdere evt og biomolekyler med nanopartikel tracking analyse (NTA) (figur 2).
Bemærk: Evt og biomolekyler kan vurderes med nanopartikel tracking analyse (NTA), dynamisk lysspredning (DLS) eller transmissions Elektron Mikroskopi (TEM)12. - Gemme evt og biomolekyler ved-80 ° C indtil videre downstream eksperimenter.
Bemærk: Hvis elbiler skal bruges til funktionelle studier, 20% glycerol skal tilføjes for at beskytte dem mod brud. Cellerne kan indsamles ved hjælp af standardprocedurer, hvis nødvendigt.
3. evt og RNA-associerede biomolekyler samling af differentierede celler
Bemærk: Evt og RNA forbundet biomolekyler kan også blive indsamlet fra celle kultur medier mens cellerne gennemgå differentiering. Eksemplet med afbildet i protokollen beskriver osteoblastic differentiering og exRNA samling på dag 0 og 7 af differentiering. Hvis der kræves ingen differentiering, derefter springe afsnit 3 og gå til afsnit 4.
- Forberede osteoblastic differentiering media (DMEM med 10% FBS, 1% P/S, 10 mM β-glycerophosphate, 10 nM dexamethason, 50 μM Ascorbat-2-fosfat og 10 mM 1,25-vitamin-D3) frisk hver gang.
- Når MSCs er 80% sammenflydende, ændre MSC medier til osteoblastic differentiering medier.
- Genopbygge osteoblastic differentiering medier efter 2-3 dage.
- På dag 5 af differentiering, fjerne medier og vaske cellerne 3 x med 20 mL PBS pr. T175 kolbe.
- Der tilsættes 20 mL af EV samling medier indeholdende 10 mM β-glycerophosphate, 10 nM dexamethason, 50 μM Ascorbat-2-fosfat og 10 mM 1,25-vitamin-D3 pr. sammenflydende T175 kolbe af MSC'er. Incubate celler ved 37 ° C med 5% CO2 for 48 h at sikre fortsatte differentiering mens indsamling evt og biomolekyler.
- Indsamle mediet på dag 7 og gå videre til at isolere evt og biomolekyler som beskrevet i trin 2.2-2.6.
- For kvalitetskontrol, seed celler i 96-brønde eller 6-brønde at vurdere differentiering ved hjælp af en alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet assay eller med kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR), henholdsvis.
Bemærk: Figur 3 er et eksempel på osteogenic differentiering af celler.
4. RNA udvinding og kvalitetskontrol
- Tø prøver fra trin 2.8 på is. Uddrag RNA bruger et RNA isolering kit (Tabel af materialer).
- Elueres RNA fra kolonnen findes i RNA isolering kit (Table of Materials) i 100 μL af RNase-fri vand.
- Koncentrere RNA gennem ethanol nedbør ved at tilføje 1 μL af glykogen, 10 μL 2 M pH 5,5 natriumacetat og 250 μL pre kølet 99% ethanol i 100 μL af oprenset RNA.
- Inkuber prøver ved-20 ° C natten over at udfælde RNA. Pellet RNA ved centrifugering i 20 min. på 16.000 x g og 4 ° C.
Bemærk: Pellet er hvidt fordi de udfældes sammen med glykogen. - Fjern supernatanten og skyl RNA toerstoffet med 1 mL af 75% ethanol. Pellet RNA igen i 5 min på 16.000 x g og 4 ° C.
- Fjerne ethanolen og åbner låget af RNA rør for 5-10 min til luft tørre RNA pellet. RNA resuspenderes i 7 μL af RNase-fri vand.
- Kontrol RNA kvalitet og koncentration af en chip-baserede kapillær elektroforese maskine til påvisning af RNA efter producentens protokol før bibliotek konstruktion.
Bemærk: En repræsentativ størrelse fordeling af RNA er vist i figur 4. - Uddrag cellulære RNA ved hjælp af en kommerciel rensning kit (Table of Materials), hvis det er nødvendigt.
5. bibliotek opbygning og kvalitetskontrol
Bemærk: Små RNA biblioteker er konstrueret ved hjælp af kommercielle kits (Tabel af materialer) med justeringer på grund af den lave RNA input. Biblioteket konstruktion udføres på den kølede blok.
- Chill varme blok til 0,2 mL PCR rør på is og tilsæt 5 μl af RNA fra trin 4.6 til 0,2 mL RNase-fri PCR rør på en kølet blok.
- Fortyndes 3' adaptere (1:10) i RNase-fri vand i en 0,2 mL RNase-fri PCR rør. Der tilsættes 0,5 μL fortyndet adapter og blandes med 5 μl af RNA ved pipettering op og ned 8 x og centrifugeres kort at indsamle alle væske i bunden af røret.
- Inkuber RNA og 3' adapter mix på 70 ° C i 2 min. i en forvarmet termisk cycler og prøven anbringes derefter tilbage på den kølede blok.
- Tilføj 1 μL ligatur buffer, 0,5 μl af RNase hæmmer og 0,5 μl af T4 RNA ligase (sletning mutant) i RNA og 3' adapter blandingen. Mix af pipettering op og ned 8 x og centrifugeres kort.
- Inkuber rør ved 28 ° C i 1 time i forvarmet termisk cycler.
- Tilsæt 0,5 μL stopopløsning i prøveglas med røret opholder sig i den termiske cycler, mix af pipettering op og ned 8 x og fortsat inkuberes ved 28 ° C i 15 min.
- Fortynd 5' adaptere (1:10) i RNase-fri vand i en 0,2 mL RNase-fri PCR rør. Tilsæt 0,5 μl af 5' adapter i en separat RNase-fri 0,2 mL PCR tube, heat 5'-adapter på 70 ° C i 2 min. i en forvarmet termisk cycler, og derefter placere prøven på kølet blokken.
- Tilsæt 0,5 μl af 10 nM ATP, 0,5 μl af T4 RNA ligase til 5' adapter tube, mix af pipettering op og ned 8 x og centrifugeres kortvarigt for at indsamle alle væsker ind i bunden.
Bemærk: Hold 5'-adapter på kølet blok så meget som muligt. - Tilføje 1,5 μL af 5' adapter blandingen til prøven fra trin 5.6, og bland meget forsigtigt af pipettering 8 x langsomt. Inkuber prøve ved 28 ° C i 1 time i forvarmet termisk cycler.
- Fortynd RT primer 1:10 i RNase-fri vand i en RNase-fri 0,2 mL PCR rør. Tilføje 0,5 μL fortyndet RT primer til prøven fra trin 5.9, mix meget forsigtigt af pipettering op og ned 8 x langsomt og centrifugeres kort.
- Inkuber prøve ved 70 ° C i 2 min. i en forvarmet termisk cycler og derefter placere prøven på en kølet blok.
- Tilsæt 1 μL af 5 x første strand buffer, 0,5 μl af 12.5 mM dNTP mix, 0,5 μL 100 mM dithiothreitol (DTT), 0,5 μl af RNase hæmmer, og 0,5 μl af reverse transkriptase. Bland meget forsigtigt af pipettering op og ned 8 x langsomt og centrifugeres kort.
- Inkuber sample ved 50 ° C i 1 time i forvarmet termisk cycler at opnå cDNA.
- Tilføje 4,25 μL ultrarent vand, 12,5 μl PCR mix, 1 μL af indeks primer og 1 μL af universal primer til cDNA. Mix af pipettering op og ned 8 x og centrifugeres kort.
- Prøven anbringes i et termisk cycler og oprette cycler som følger: 98 ° C til 30 s; 15 cyklusser af 98 ° C til 10 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 15 s; og slutter cyklussen med 72 ° C i 10 min.
Bemærk: Forberedt biblioteket kan opbevares ved-20 ° C for en uge. - Rense RNA-biblioteket ved at adskille bibliotek på en DNA-gel og skære gel (gel udvinding) mellem 140 bp og 160 bp og eluerer biblioteket fra gel efter protokollen af byggesæt bibliotek.
Bemærk: I denne undersøgelse, de forberedte bibliotek fra trin 5.15 er læsset på en kommerciel gel (Table of Materials) og bibliotek mellem 140 bp og 160 bp er renset ud af et automatiseret DNA størrelse fraktioneringskolonne (Table of Materials) i henhold til den producentens protokol. - Koncentrere sig og vaske bibliotek fra trin 5.16 ved hjælp af en kolonne-baserede PCR rensning kit (Table of Materials) og elueres bibliotek i 10 μL RNase-fri vand til sidst.
- Indlæse 1 μL af biblioteket renset på et DNA chip (Table of Materials) til at kontrollere størrelsen af biblioteket efter producentens protokol.
- Fortyndes 1 μL af den oprensede bibliotek (1:1000) i 10 mM pH 8.0 Tris-HCl med 0,05% Polysorbat 20 og kvantificere biblioteket af qPCR ved hjælp af en kommerciel bibliotek kvantificering kit til at kvantificere bibliotek koncentrationen ved hjælp af DNA-standarder i sættet.
- Pool lige store mængder af biblioteker af kravene i sekventering maskine og rækkefølgen på en høj overførselshastighed sekventering system.
Bemærk: Bibliotek opbygning af cellulære RNA kan gøres ved hjælp af de samme kits ved at følge standard protokol af kits.
6. Bioinformatik pipeline
Bemærk: Dette er en in-house pipeline og de programmer, der bruges her er opført i den tabel of Materials.
- Trim væk lav kvalitet læsninger og fjerne adapteren sekvenser fra de rå læsninger.
- Knyt de rene læser til forskellige slags RNA'er.
- Anmærke tRNAer af tillade to mismatchproblemer fordi de stærkt modificerede tRNA sekvenser forårsage hyppige base misincorporation ved reverse transkriptase.
- Anmærke miRNAs ved tilknytning til menneskelig miRNAs fra miRBase v21 giver nul uoverensstemmelser. Da miRNAs er underlagt A og U nontemplated 3' enden tilføjelser, sekvenser, der ikke knyttes er 3' trimmet af op til tre A og/eller T nts efter som læser er knyttet til menneskelige miRNAs og andre miRNAs fra miRBase v21 giver nul uoverensstemmelser.
- Anmærke til andre relevante små RNA'er (snRNA, snoRNA, piRNA og Y RNA'er) ved at tillade en uoverensstemmelse.
- Knyt de resterende ikke-tilknyttede læser til lange RNA datasæt (rRNA, andre RNA fra Rfam og mRNA) for at vurdere nedbrydningen.
- Anmærke sekvenser til det menneskelige genom.
- Anmærke sekvenser til bakteriel genomer.
- Normalisere miRNA udtryk ved hjælp af følgende formel: miRNA tæller / totalen tæller af alle tilknyttede miRNAs) x 106.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De i denne protokol beskrevne metode er optimeret til at indsamle exRNA fra MSC kultur for næste generation sequencing. Den samlede ordning af arbejdsprocessen er i figur 1 til venstre og de respektive kvalitetskontrol checkpoints er til højre.
Morfologi af celler på indsamlingsdagen for udifferentierede (figur 3A) og differentieret (figur 3B) celler er vist. Derudover er repræsentative normaliseret niveauer af ALP aktivitet af celler inducerede i 7 dage også vist (figur 3 c). Her, er ALP aktivitet ca 2,5 gange de uninduced celler.
Tre T175 kolber af sammenflydende MSCs udbytte 2-5 x 1010 partikler/mL (figur 2). Gennemsnitlige partikelstørrelse er ca 160-165 nm, mens de fleste af partikler er 130-140 nm. Der var et par mindre tinder mellem 200 og 500 nm, hvilket tyder på stor komplekser eller store aggregater.
Da RNA kan være nedbrudt hurtigt, overholde betingelserne for RNA udvinding som kit eller protokol, der bruges. Bruge RNase-fri betingelser, navnlig RNase-fri vand for at resuspend RNA og holde RNA på is, når det er muligt. Efter ekstraktion, kan RNA kvantificeres ved hjælp af en chip-baserede kapillær elektroforese maskine. Repræsentant elektroferogrammer af RNA efter at blive analyseret er vist i figur 4. Elektroferogrammet af exRNAs omfatter en bred vifte af RNA'er (figur 4A). Derimod cellulære RNA har meget tydelige toppe på omkring 70-120, 1800, og 3800 nt, som svarer til tRNA/5S rRNA / 5.8S rRNA, 18S rRNA og 28S rRNA, henholdsvis (figur 4B). RNA integritet nummer (RIN) repræsenterer kvaliteten af RNA. En god RIN af cellulære RNA er > 8 (der angiver næsten ingen RNA nedbrydning). Den algoritme, der er baseret på RIN er forholdet mellem 28S og 18S. Det betyder, at RIN ikke er en god indikator for RNA kvaliteten af exRNAs, fordi fuld længde rRNAs ikke er normalt kan påvises i exRNAs.
Efter RNA udvinding, miRNA biblioteker blev bygget og cDNA-biblioteker var adskilt af gelelektroforese. Den adapter-forbundet cDNA af miRNAs er typisk mellem 140 og 160 nt. Kvaliteten af biblioteket blev derefter visualiseres på en chip-baserede kapillær elektroforese maskine (figur 5). Figur 5A og figur 5B er biblioteker fra den cellulære RNA på dag 0 og dag 7, henholdsvis. Figur 5 c og fig. 5 d er exRNA biblioteker på dag 0 og dag 7 henholdsvis. Alle fire prøver havde toppe på omkring 140 nt, som indikerer succesfulde miRNA bibliotek konstruktion. Mængden af cDNA i bibliotekerne var kvantificeres ved qPCR ved hjælp af et bibliotek kvantificering kit. Kvantificering cyklus (Cq) standarder var plottes log af koncentration for at få en standardkurve (figur 6). Ligning af standardkurven blev derefter brugt til at beregne koncentrationen af biblioteker (tabel 1). I vores eksempel var koncentrationen af biblioteker fra exRNAs 5-8 nM, som var betydeligt lavere end biblioteker fra cellulære RNA'er (8-30 nM). Bibliotekerne blev derefter samlet med lige store beløb og sendt til sekvensering.
Efter bibliotekerne blev sekventeret, lav kvalitet læser var trimmet væk med FASTX-Toolkit og den resulterende kvalitet af bibliotek exRNAs var høj og sammenlignelig med bibliotekerne fra cellerne (figur 7AB). Sekvens længden af biblioteker fra celler havde en enkelt peak på omkring 22 nt (figur 7C), som korrelerer med miRNAs. Derimod biblioteker fra exRNAs var mere heterogene og indeholdt 3 store toppe: 22 nt, 30 nt og 33 nt (figur 7 d). Svarende til deres cellulære modparter, peak på 22 nt er miRNAs. Nærmere eftersyn viste, at toppe på 30 og 33 nt er tRNAer halvdele/fragmenter eller piRNAs. Anmærkninger af den tilknyttede læser blev derefter afbildet. De fleste af læser (65,1%) fra cellulære RNA knyttet til menneskelige miRNAs og hver af de andre små RNA'er tegner sig for en lille del af den tilknyttede læser (figur 8A). Contrastingly, kun 8% af exRNAs kortlagt til menneskelige miRNAs (fig. 8B). Den mest udbredte små RNA som læser tilknyttet var tRNAer. De fleste af læser var "uovertruffen læser" (43%). Yderligere undersøgelse af den umatchede læser fra exRNAs til globale databaser førte til den overraskende konklusion om, at de fleste af dem svarer til bakteriel sekvenser (74% og 85% for D0 og D7 exRNA, henholdsvis; Tabel 2). Derimod kun 0,9% af den cellulære RNA var uovertruffen, og af dem, kun 10% er knyttet til bakterier. En sammenligning af kvæg genom viste er mindre end 1% match tyder på, at FBS ikke var en kilde til kontaminering (tabel 2). Derfor udviser exRNAs en atypisk profil i forhold til normal cellulære RNA.
Figur 1: arbejdsgang for exRNA sekvensering og analyse. Hele arbejdsgangen er afbildet til venstre i de grå bokse og kvalitetskontrol er forbundet med hvert trin er i de røde bokse til højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: størrelse distribution af partikler udskilles af celler på dag 0 og 7 i differentiering. Repræsentant NTA resultaterne af partikler indsamlet fra 3 x T175 kolber på (en) dag 0 og (B) dag 7 af differentiering. De respektive middelværdi og mode størrelser samt koncentrationen af partikler er tabulerede under graferne. SD: standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: celle morfologi og osteogenic differentiering inden ekstracellulære RNA indsamlingen. (A) Mikrograf af udifferentierede BMSCs kulturperler med samling medier på indsamlingsdagen. (B) Mikrograf af BMSCs differentieret i 7 dage med samling medier på indsamlingsdagen. Skalere barer = 100 µm. (C) ALP aktiviteter af cellerne var normaliseret til deres respektive celle viabilities. Værdierne afbildet var der tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentant elektroferogrammet RNA integritet efter RNA ekstraktion. RNA analyser af ekstracellulære RNA (A) og cellulære RNA (B). X-aksen er længden af RNA (nt) og y-aksen er fluorescens. Den første top er stigen på 25 nt. ribosomale RNA'er er vist som 18S (1.800 nt) og 28S (3.800 nt). RNA integritet nummer (RIN) er en indikator for RNA kvalitet baseret på 18S og 28S ribosomale RNA integritet. Højere RIN tal lig med bedre kvalitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentant elektroferogrammet af cDNA-biblioteker efter bibliotek konstruktion. DNA analyser af biblioteker fra (A) celler på dag 0, (B) celler på dag 7, (C) ekstracellulære RNA fra dag 0 og (D) ekstracellulære RNA fra dag 7. Grøn og lilla numre er stiger på 35 nt og 10,380 nt, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: cDNA bibliotek kvantificering og beregningen. Biblioteker var fortyndet mellem 500 - 1.000 gange for dem fra exRNA og mellem 1.000 og 4.000 gange for celle RNA. Bibliotekerne blev kørt sideløbende med standarderne fra biblioteket kvantificering kit. Cq middelværdierne af DNA-standarderne var plottes log10 koncentration (pM) til at generere en standardkurve, en ligning for standardkurven og en R2 værdi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: kvalitetsresultater og længde distribution af sekvenser. Lav kvalitet læser og adapter sekvenser blev trimmet med FASTX-Toolkit for (A) celler og (B) exRNAs. Længde fordelingen af ren læser for (C) celler og (D) exRNAs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: anmærkning af små RNA'er efter sekvensering. Anmærkninger repræsenterer procentdele af ren læser for (A) celler og (B) exRNAs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Stikprøve | Fortyndingsfaktoren | CQ værdi | Log(PM) | Koncentration (pM) | Koncentration betyder (pM) | Koncentration betyder * (452/143) | Multiplicer af dillution faktor (pM) |
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7,72 | 0.702 | 5.036 | 5.276 | 16.678 | 8338.993 |
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7.57 | 0.754 | 5.677 | |||
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7.7 | 0.709 | 5.117 | |||
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8,64 | 0.383 | 2.416 | 2.365 | 7.477 | 7476.846 |
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D7 exRNA | 500 | 8.52 | 0.425 | 2.659 | 3.221 | 10.182 | 5090.913 |
| BMSC D7 exRNA | 500 | 8.42 | 0.459 | 2.880 | |||
| BMSC D7 exRNA | 500 | 7.97 | 0.615 | 4,125 | |||
| BMSC D7 exRNA | 1000 | 8.87 | 0.303 | 2.011 | 1.933 | 6.110 | 6110.391 |
| BMSC D7 exRNA | 1000 | 8.92 | 0.286 | 1.932 | |||
| BMSC D7 exRNA | 1000 | 8,97 | 0.269 | 1.857 | |||
| BMSC D0 celle | 1000 | 6,86 | 1,000 | 10,005 | 9.810 | 31.007 | 31006.974 |
| BMSC D0 celle | 1000 | 6,91 | 0.983 | 9.614 | |||
| BMSC D0 celle | 4000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | 2.398 | 7.581 | 30322.041 |
| BMSC D0 celle | 4000 | 8.59 | 0.400 | 2.514 | |||
| BMSC D0 celle | 4000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D7 celle | 1000 | 8,44 | 0.452 | 2.834 | 2.880 | 9.104 | 9104.439 |
| BMSC D7 celle | 1000 | 8.43 | 0.456 | 2.857 | |||
| BMSC D7 celle | 1000 | 8.39 | 0.470 | 2.950 | |||
| BMSC D7 celle | 4000 | 10.36 | -0.213 | 0.612 | 0.702 | 2.218 | 8872.689 |
| BMSC D7 celle | 4000 | 10.27 | -0.182 | 0.658 | |||
| BMSC D7 celle | 4000 | 9.97 | -0.078 | 0.836 | |||
| Beregninger: | |||||||
| Log(PM) =-0.3467 x (prøve Cq værdi) + 3.3786; Brug af standardkurven og formel | |||||||
| koncentration (pM) = 10^log(pM) | |||||||
| Størrelse beregning = størrelse af DNA standard (452 bp) divideret med den gennemsnitlige fragment længde (143 bp) | |||||||
Tabel 1: miRNA bibliotek kvantificering.
| Prøve: | # læser ikke kortlægning menneskelige | # læser kortlægning til bakterier | % bakteriel læser | # læser kortlægning til ko | % kvæg læser |
| BMSC D0 celle | 131007 | 9858 | 8% | 99 | 0,08% |
| BMSC D7 celle | 169730 | 7935 | 5% | 188 | 0,11% |
| BMSC D0 exRNA | 6122833 | 4551477 | 74% | 891 | 0,01% |
| BMSC D7 exRNA | 7046691 | 5970086 | 85% | 771 | 0,01% |
Tabel 2: Andelen af uovertruffen læser at kort til bakterier og kvæg læser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, beskriver vi en protokol for næste generation sequencing af exRNAs, der muliggør differentieret udtryk analyser fra lav input prøver. Tilslutte sig en bestemt protokol for EV og exRNA isolation er vigtig, fordi selv små ændringer (dvs. ultracentrifugering trin eller en ændring i rotoren type) kan påvirke transkriptom og miRNA niveauer13,14. Derfor, uanset hvordan exRNA er isoleret, er det vigtigt at anvende samme eksperimentelle og bioinformatic procedure på alle prøver i et eksperiment at kunne sammenligne resultaterne.
RNA integritet vurderes normalt på bioanalyzer. Men da exRNAs er blottet for fuld længde rRNA, deres RIN værdi er meget lav, men dette afspejler ikke nødvendigvis lav kvalitet RNA prøver. Derudover RNA-koncentrationen af exRNAs varierede betydeligt og er ofte unøjagtige. Derfor, i stedet for vurdering af RNA kvalitet og kvantificere RNA på bioanalyzer, bruge den samme mængde af medier hver gang til videreforarbejdning. Også, resuspend ekstraheret RNA i den samme mængde af resuspension buffer og bruge den samme mængde for biblioteket konstruktion.
Små RNA bibliotek konstruktion var optimeret ved at reducere mængden af adaptere til en tiendedel af standard-protokol og bruge halvdelen af andre reagenser. At reducere adaptere ikke kun forhindrer adapter dimerer, det forhindrer også intramolekylære RNA circularization15. Reduktionen af reagenser er optimeret til Illumina TruSeq små RNA prøve Prep Kit. Skal andre kits bruges, anbefales det også lavere adapter og reagenser i overensstemmelse hermed, medmindre kit angiver, at det er skræddersyet til lav input prøver. Endelig, PCR cyklus for biblioteket konstruktion var steget fra 12 til 15 cykler i denne protokol for at tage højde for den lave koncentration af exRNAs. Vi har fundet dette at være den optimale justering uden at se forstærkning bias15.
Forskellige kvalitetskontrol målinger kan vurderes herunder base kvalitetsresultater og læse længde profil. Når du laver Bioinformatik analyser, læser i cellulære RNA og exRNAs base kvalitet var ens; længde distribution og kommenteret oprindelsen af sekvenser var dog helt anderledes. De fleste af læsninger fra cellulære RNA knyttet til menneskelige miRNAs, men en stor del af exRNA læst var uovertruffen læser. Ved nærmere eftersyn læser de umatchede læser viste sig for at være bakteriel (tabel 2). Dette var overraskende, fordi antibiotika blev rutinemæssigt anvendes i vores kultur. Vores resultat flugter godt med andre rapporter, der også viste stor del af uovertruffen læser når sekventering cellekultur afledt exRNA16. En af årsagerne til disse forurenende stoffer er at bakterier overlapper hinanden i størrelse med ekstracellulære komplekser eller EVs, og dermed Co rense under ultracentrifugering trin17. Tidligere publikationer har identificeret udbredt forurening af visse bakterier i dyrkningsmedier, som forbliver uopdaget under normal celle lab procedurer18. Til dato, dette problem er stort set blevet ignoreret men bør tages i betragtning når rensende og analysere exRNAs.
Denne protokol detaljer en komplet guide til høst exRNAs fra dyrkningsmedier, optimering af små RNA bibliotek forberedelse og behandling af rå bibliotek data. Denne protokol fremhæver specielt forskellige kvalitetskontrol kontrolposter hele processen med at demonstrere hvordan lav input prøver (ligesom exRNAs) kan afvige fra normal prøve præparater så at andre, der arbejder med lav input prøver kan vide hvad man skal Forvent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Mr. Claus Bus og Ms. Rita Rosendahl ved iNANO for deres tekniske bistand. En særlig tak til Dr. Daniel Otzen for at tillade vores hyppige brug af hans ultracentrifuge. Denne undersøgelse blev støttet af Danmarks innovationsfond (MUSTER projekt).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
- NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
