Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

Published: March 8, 2019 doi: 10.3791/58655
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Interdisciplinary Nanoscience Centre, Aarhus University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

هذا البروتوكول يوضح كيفية تنقية microRNAs خارج الخلية من خلية ثقافة وسائل الإعلام لبناء مكتبة رنا الصغيرة وتسلسل الجيل القادم. مختلف نقاط التفتيش لمراقبة الجودة ويرد وصف للسماح للقراء لفهم ما يمكن توقعه عند العمل مع نماذج الإدخال المنخفضة مثل اكسرناس.

Abstract

الكشف خارج الخلية وتعميم (اكسرنا) يتم إنتاجها بواسطة العديد من أنواع الخلايا في الجسم وتوجد في العديد من سوائل الجسم مثل اللعاب والبلازما والمصل، والحليب والبول. هي واحدة من مجموعة فرعية من هذه الكشف المنظمين بوسترانسكريبشونال – ميكرورناس (ميرناس). لتحديد ميرناس تنتجها أنواع محددة من الخلايا، يمكن استخدام نظم الاستزراع في المختبر للحصاد، واكسرناس الشخصية المستمدة من مجموعة فرعية واحدة من الخلايا. العوامل يفرز من الخلايا الجذعية الوسيطة متورطون في التخفيف من العديد من الأمراض، ويستخدم كالنظام النموذجي في المختبر هنا. وتصف هذه الورقة عملية جمع، وتنقية من الحمض النووي الريبي الصغيرة وتوليد المكتبة إلى تسلسل ميرناس خارج الخلية. اكسرناس من وسائط الثقافة تختلف عن الحمض النووي الريبي الخلوية كونها منخفضة عينات من الحمض النووي الريبي الإدخال، الذي يدعو إلى إجراءات محسنة. يوفر هذا البروتوكول دليل شامل للتسلسل اكسرنا صغيرة من وسائط الثقافة، تظهر نقاط التفتيش لمراقبة الجودة في كل خطوة أثناء تنقية اكسرنا وتسلسلها.

Introduction

خارج الخلية وتعميم الكشف (اكسرناس) موجودة في سوائل الجسم المختلفة وهي مقاومة نحو رنسيس1،2. وفرة عالية، واستقرارها وسهولة الوصول بشكل جذاب للتقييم السريري كعلامات التشخيص وتنبؤاتها3. واسطة النقل اكسرناس وتشمل حويصلات خارج الخلية (EVs)، رابطة مع البروتينات الدهنية (مثل البروتين الدهني الكثافة؛ الحميد) ومجمعات ريبونوكليوبروتين (مثل مع مجمعات Argonaute2)4.

هي مجموعة فرعية اكسرناس ميكرورناس (ميرناس)، وصغيرة غير الترميز الكشف من حوالي 22 nt التي تنظم التعبير الجيني بوسترانسكريبشونال. ميرناس السابقين قد تورطت في خلية خلية الاتصال وتنظيم التوازن الخلية5. على سبيل المثال، يسلم الحميد السابقين-مير-223 إلى خلايا بطانية لقمع جزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1) والتهاب6. من المثير للاهتمام، كما يعتبر المنقولة من حويصلات خارج الخلية من الكريات البيضاء إلى خلايا سرطان الرئة، برمجة إليها اتخاذ على النمط الظاهري أكثر الغازية7مير-223. وهكذا، الترنسكربيتوم ميرناس السابقين من مختلف سوائل الجسم وخلية الثقافة المتوسطة سوف تحسن كثيرا من فهمنا لإشارات السابقين-ميرنا.

الجيش الملكي النيبالي الصغيرة تسلسل (seq رنا الصغيرة) هو أداة قوية يمكن استخدامها لفهم ترانسكريبتوميكس الكشف الصغيرة. ويمكن مقارنة عينات مختلفة بين الكشف عن خلطات المعروفة، بل يمكن أيضا الكشف عن رواية الكشف الصغيرة وتتميز. ونتيجة لذلك، كما أنها وسيلة قوية لتحديد ميرناس أعرب عن خلطات تحت ظروف مختلفة. واحدة من عقبات تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة غير أن الصعوبة في توليد مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة من السوائل اكسرنا منخفضة المدخلات مثل السوائل المخية، اللعاب، البول، والحليب، والمصل ووسائل الإعلام الثقافة. يتطلب البروتوكول "تراسك الصغيرة رنا المكتبة الإعدادية" من إيلومينا تقريبا 1 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي إجمالي جودة عالية ويتطلب البروتوكول "نيبنيكست الصغيرة رنا المكتبة الإعدادية مجموعة" من نيو إنجلاند Biolabs 100 ميكروغرام 1 نانوغرام من الجيش النيبالي الملكي8،9. وفي أحيان كثيرة، مجموع الجيش الملكي النيبالي من هذه العينات الكشف عن الحد الأدنى للتقليدية تجاه الأشعة فوق البنفسجية الطيفية.

السابقين-ميرناس المستمدة من سوائل الجسم علامات تشخيصية والتشخيص يحتمل أن تكون جيدة. بيد من أجل دراسة الآثار الفنية أو لتحديد منشأ محددة السابقين-ميرناس، خلية ثقافة النظم غالباً ما تستخدم بدلاً من ذلك. وقد درست الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على نطاق واسع لأن تلك المركبات قد تورطت في التخفيف من كثير من الأمراض بما في ذلك احتشاء عضلة القلب ومرض الزهايمر والابتزاز مقابل المرض المضيف10. هنا، نحن إظهار تنقية ميرناس السابقين من MSCs المشتقة من نخاع العظام (بمسكس) والخطوات المحددة المستخدمة لتحسين البناء مكتبة رنا الصغيرة وتسلسل وتحليل البيانات (الشكل 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: متوسط نمو الخلايا الجذعية الوسيطة (ماجستير وسائل الإعلام) أعد مسبقاً كما هو مبين في الجدول للمواد.

1-خلية ثقافة

ملاحظة: يمكن الحصول على الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة من نخاع العظام، والأنسجة الدهنية أو مصادر أخرى11. وبدلاً من ذلك، يمكن شراء همسكس من خلال مورد. بمسكس المستخدمة في هذا البروتوكول كانت مستمدة من نخاع العظام من المرضى واشترى من شركة.

  1. ذوبان الجليد 1 × 106 بمسكس في قارورة T175 التي تحتوي على 20 مل وسائط MSC. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 واستبدال وسائط الإعلام كل 2-3 أيام حتى 80% كونفلوينسي.
  2. تغسل الخلايا مع 5 مل من 1 x PBS وتجاهل برنامج تلفزيوني.
  3. فصل الخلايا عن طريق إضافة 5 مل من 0.05% يدتا التربسين وتفرخ الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. اضغط على جانبي قارورة تيسيرا لمفرزة.
  4. إضافة 15 مل وسائط MSC لإلغاء تنشيط التربسين، وفصل الخلايا من السطح، وماصة صعودا وهبوطاً للحصول على تعليق خلية مفردة.
  5. جمع الخلايا في أنبوب 50 مل وتدور إلى أسفل لمدة 5 دقائق في 300 x ز بيليه الخلايا.
  6. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل وسائط MSC وعد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
    ملاحظة: نخاع العظام الأولية البشرية MSCs في كونفلوينسي 80% في قارورة T175 حوالي 2 × 106 خلايا.
  7. لوحة همسكس في 2,000 الخلايا/سم2 في وسائل الإعلام لجنة السلامة البحرية الطازجة في قوارير T175 5. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 واستبدال وسائط الإعلام كل 2-3 أيام حتى يتم الحصول على 5 قوارير من قوارير T175 المتلاقية 90%.

2-المركبات الكهربائية وجمع الجزيئات الحيوية المرتبطة بالجيش الملكي النيبالي

ملاحظة: EV مجموعة وسائل الإعلام مستعدة مسبقاً (المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو [دميم] مع 10% مصل بقرى الجنين [FBS] و 1% البنسلين/ستربتوميسين [P/S]). EV مجموعة وسائل الإعلام العادي ماجستير الإعلام، ولكن أعد مع FBS المستنفد EV التجارية (جدول المواد). هذا هو لتجنب تلوث اكسرنا البقري من FBS، التي عادة ما تحتوي على اكسرناس المرتبطة بالمركبات الكهربائية، ريبونوكليوبروتينس، والبروتينات الدهنية. لإعداد مكتبة رنا الصغيرة، اكسرناس المستمدة من قوارير المتلاقية 5 من MSCs مطلوبة لتمكين بناء المكتبة.

  1. تغسل الخلايا 3 x مع 20 مل من برنامج تلفزيوني في قارورة T175. إضافة 20 مل من EV مجموعة وسائل الإعلام كل قارورة T175 متكدسة من MSCs واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 48.
  2. جمع وسائل الإعلام والطرد المركزي وسائط الإعلام عن 10 دقيقة في 300 x ز و 4 درجة مئوية.
  3. جمع المادة طافية والطرد المركزي وسائط الإعلام عن 20 دقيقة في 2,000 س ز و 4 درجة مئوية.
  4. جمع المادة طافية والطرد المركزي وسائط الإعلام عن 30 دقيقة في 15,500 س ز و 4 درجة مئوية. ثم جمع المادة طافية.
  5. نقل الوسائط إلى أنابيب ultracentrifuge وبيليه اكسرناس لمدة 90 دقيقة في 100000 x ز و 4 درجات مئوية. دوار زاوية ثابتة تستخدم هنا وبيليه يرتكز إلى جانب الأنبوب. وضع علامة على الجانب من الغطاء ورسم دائرة على جانب الأنبوب حيث من المتوقع بيليه.
  6. إزالة المادة طافية والجاف داخل الأنبوب بعكس الأنبوبة على ورقة ماصة واستخدم قطعة صغيرة من ورقة ماصة لإزالة السائل داخل الأنبوب دون لمس الجزء السفلي من الأنبوب. ريسوسبيند بيليه في 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني من فورتيكسينج لمدة 30 ثانية وبيبيتينج صعودا وهبوطاً 20 x.
  7. تقييم المركبات الكهربائية والجزيئات الحيوية مع نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA) (الشكل 2).
    ملاحظة: المركبات الكهربائية والجزيئات الحيوية يمكن أن تقيم مع نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA)، وتشتت الضوء الحيوي (DLS) أو انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)12.
  8. تخزين المركبات والجزيئات الحيوية في-80 درجة مئوية حتى المزيد من تجارب المتلقين للمعلومات.
    ملاحظة: إذا تسير المركبات الكهربائية التي ستستخدم للدراسات الفنية، يجب إضافة الجلسرين 20% لحمايتهم من يمزق. ويمكن جمع الخلايا باستخدام إجراءات معيارية إذا لزم الأمر.

3-المركبات والجزيئات الحيوية المرتبطة بالجيش النيبالي الملكي مجموعة من الخلايا المتمايزة

ملاحظة: المركبات الكهربائية، والجيش الملكي النيبالي ترتبط الجزيئات الحيوية كما يمكن جمعها من وسائط الثقافة الخلية بينما الخلايا الخضوع للتمايز. مثال يصور في البروتوكول وصف التمايز أوستيوبلاستيك وجمع اكسرنا في اليوم 0 و 7 من التفريق. إذا كان مطلوباً أي تمييز، ثم تخطي 3 القسم وانتقل إلى القسم 4.

  1. تحضير الوسائط التمايز أوستيوبلاستيك (دميم مع 10% FBS، 1% P/S، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، 10 الديكساميتازون شمال البحر الأبيض المتوسط، 50 ميكرومتر اسكوربات-2-الفوسفات، و 10 ملم 1.25-فيتامين-D3) جديدة كل مرة.
  2. مرة MSCs روافد 80%، تغيير الوسائط MSC للتمايز أوستيوبلاستيك وسائل الإعلام.
  3. تجديد وسائط الإعلام التمايز أوستيوبلاستيك بعد 2-3 أيام.
  4. في يوم 5 من التمايز، قم بإزالة الوسائط وتغسل الخلايا 3 x مع 20 مل من برنامج تلفزيوني في قارورة T175.
  5. إضافة 20 مل وسائط جمع EV التي تحتوي على 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، 10 الديكساميتازون شمال البحر الأبيض المتوسط و 50 ميكرومتر اسكوربات-2-الفوسفات و 10 ملم 1.25-فيتامين-د3 كل قارورة T175 متكدسة من MSCs. إينكوباتي الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ل 48 ساعة لضمان استمرار التفريق بين حين جمع المركبات الكهربائية والجزيئات الحيوية.
  6. جمع وسائل الإعلام في يوم 7 والمضي قدما لعزل المركبات الكهربائية والجزيئات الحيوية كما هو موضح في الخطوات من 2، 2، 2-6.
  7. لمراقبة الجودة، والبذور الخلايا في 96-الآبار أو 6-آبار لتقييم التمايز باستخدام مقايسة نشاط الفوسفاتيز قلوية (حزب العمال الأسترالي) أو مع الكمية البلمرة المتسلسل (qPCR)، على التوالي.
    ملاحظة: الرقم 3 مثال على إظهار التمايز أوستيوجينيك الخلايا.

4-رنا الاستخراج ومراقبة الجودة

  1. ذوبان الجليد عينات من الخطوة 2.8 على الجليد. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة مواد عزل الحمض النووي الريبي (جدول المواد).
  2. الوت الجيش الملكي النيبالي من العمود المنصوص عليها في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي (جدول المواد) في 100 ميكروليتر من المياه خالية من رناسي.
  3. يركز الجيش الملكي النيبالي خلال هطول الأمطار الإيثانول بإضافة 1 ميكروليتر الجليكوجين و 10 ميكروليتر من خلات الصوديوم 5.5 درجة الحموضة 2 م 250 ميكروليتر برود قبل 99 ٪ الإيثانول إلى 100 ميكروليتر من الجيش النيبالي الملكي المنقي.
  4. احتضانها العينات من-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها يعجل بالجيش الملكي النيبالي. بيليه الجيش الملكي النيبالي سينتريفوجينج لمدة 20 دقيقة في 16,000 س ز و 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: بيليه أبيض بسبب هطول الأمطار المشارك مع الجليكوجين.
  5. إزالة المادة طافية وتغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي مع 1 مل إيثانول 75%. بيليه الجيش الملكي النيبالي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 16,000 س ز و 4 درجة مئوية.
  6. إزالة الإيثانول وترك غطاء أنبوب الحمض النووي الريبي مفتوحة لمدة 5-10 دقيقة للهواء الجاف بيليه الجيش الملكي النيبالي. ريسوسبيند بيليه الجيش الملكي النيبالي في ميكروليتر 7 من المياه خالية من رناسي.
  7. التحقق من نوعية الجيش الملكي النيبالي وتركيز باستخدام جهاز التفريد شعرية القائم على رقاقة للكشف عن الجيش الملكي النيبالي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة قبل بناء المكتبة.
    ملاحظة: يرد توزيع حجم ممثل الجيش الملكي النيبالي في الشكل 4.
  8. استخراج الحمض النووي الريبي الخلوية باستخدام مجموعة أدوات تنقية تجارية (جدول المواد) إذا لزم الأمر.

5-مكتبة البناء ومراقبة الجودة

ملاحظة: المكتبات الصغيرة الحمض النووي الريبي هي التي شيدت باستخدام مجموعات تجارية (جدول المواد) مع إجراء تعديلات بسبب الجيش الملكي النيبالي منخفضة المدخلات. يتم بناء مكتبة على كتلة مبردة.

  1. البرد في كتلة التدفئة لأنابيب PCR 0.2 مل على الجليد و "الماصة؛" 5 ميكروليتر من الجيش الملكي النيبالي من الخطوة 4.6 في أنابيب PCR 0.2 مل رناسي خالية في كتلة مبردة.
  2. تمييع 3 ' محولات (01:10) في المياه خالية من رناسي في أنبوب بكر 0.2 مل رناسي مجاناً. إضافة ميكروليتر 0.5 من محول المخفف ويخلط مع 5 ميكروليتر من الجيش الملكي النيبالي من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 x وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز لجمع جميع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  3. احتضان هذا المزيج محول الحمض النووي الريبي و 3 ' على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في cycler حرارية مسخن ومن ثم ضع العينة مرة أخرى على كتلة مبردة.
  4. إضافة 1 ميكروليتر من ربط المخزن المؤقت وميكروليتر 0.5 من مثبط رناسي ميكروليتر 0.5 من الحمض النووي الريبي T4 ليجاسى (حذف المسخ) إلى الخليط محول الحمض النووي الريبي و 3 '. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 س والطرد المركزي بإيجاز.
  5. احتضان الأنبوب عند 28 درجة مئوية ح 1 في cycler الحرارية مسخن.
  6. إضافة 0.5 ميكروليتر من حل توقف في أنبوب عينة مع أنبوب البقاء في cycler الحرارية، ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 x والاستمرار في احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  7. تمييع 5 ' محولات (01:10) في المياه خالية من رناسي في أنبوب بكر 0.2 مل رناسي مجاناً. إضافة ميكروليتر 0.5 5 'محول في منفصلة خالية رناسي 0.2 مل PCR أنبوب، الحرارة محول 5' على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في cycler الحرارية مسخن، ثم قم بوضع العينة على كتلة مبردة.
  8. إضافة 0.5 ميكروليتر من 10 نانومتر ATP، ميكروليتر 0.5 من ليجاسى الجيش الملكي النيبالي T4 إلى أنبوب محول 5 '، ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 س والطرد المركزي بإيجاز في تجميع جميع السوائل إلى الأسفل.
    ملاحظة: الاحتفاظ في محول 5 ' في كتلة مبردة بقدر الإمكان.
  9. إضافة 1.5 ميكروليتر من خليط محول 5 ' إلى العينة من الخطوة 5، 6، وتخلط بلطف جداً من بيبيتينج 8 س ببطء. احتضان العينة عند 28 درجة مئوية ح 1 في cycler الحرارية مسخن.
  10. تمييع RT التمهيدي 01:10 في المياه خالية من رناسي في أنبوب بكر 0.2 مل رناسي مجاناً. إضافة ميكروليتر 0.5 من المخفف RT التمهيدي في العينة من الخطوة 5-9، المزيج بلطف جداً من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 x ببطء والطرد المركزي بإيجاز.
  11. احتضان العينة على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في cycler الحرارية مسخن ثم قم بوضع العينة على كتلة مبردة.
  12. أضف 1 ميكروليتر من 5 × أول حبلا العازلة، ميكروليتر 0.5 من مزيج دنتب 12.5 ملم، ميكروليتر 0.5 من 100 مم ديثيوثريتول (DTT)، ميكروليتر 0.5 من مثبط رناسي، و 0.5 ميكروليتر من المنتسخة العكسية. المزيج بلطف جداً من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 x ببطء والطرد المركزي بإيجاز.
  13. احتضان العينة عند 50 درجة مئوية ح 1 في cycler الحرارية مسخن للحصول على كدنا.
  14. إضافة ميكروليتر 4.25 من الماء عالي النقاوة ميكروليتر 12.5 من مزيج PCR، 1 ميكروليتر من الفهرس التمهيدي و 1 ميكروليتر من التمهيدي العالمي إلى كدنا. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 س والطرد المركزي بإيجاز.
  15. ضع العينة في cycler حرارية وإعداد cycler النحو التالي: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ دورات 15 98 درجة مئوية لمدة 10 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية؛ وفي نهاية الدورة مع 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: يمكن تخزين مكتبة معدّة في-20 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.
  16. تنقية المكتبة الجيش الملكي النيبالي بفصل المكتبة على جل الحمض النووي وخفض الهلام (جل الاستخراج) بين 140 bp و 160 شركة بريتيش بتروليوم والتينج المكتبة من الجل بعد البروتوكول قدمته مجموعة البناء مكتبة.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، المكتبة معدّة من الخطوة 5.15 يتم تحميلها على جل تجارية (جدول المواد) والمكتبة بين 140 bp و 160 bp هو تنقية خارجاً من الآلي الحمض النووي حجم فراكتيوناتور (جدول المواد) ووفقا البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  17. التركيز وتغسل المكتبة من الخطوة 5.16 استخدام عدة تنقية PCR المستندة إلى عمود (جدول المواد) والوت المكتبة في المياه خالية من رناسي 10 ميكروليتر أخيرا.
  18. تحميل ميكروليتر 1 مكتبة المنقي على رقاقة الحمض النووي (جدول المواد) التحقق من حجم المكتبة بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  19. تمييع ميكروليتر 1 مكتبة المنقي (1: 1000) في الأس الهيدروجيني 10 ملم 8.0 تريس-HCl مع 0.05% بوليسوربيت 20 والتحديد الكمي للمكتبة التي قبكر باستخدام مجموعة أدوات القياس الكمي مكتبة تجارية لقياس تركيز المكتبة باستخدام معايير الحمض النووي في عدة.
  20. تجمع كميات متساوية من المكتبات وفقا لمتطلبات جهاز التسلسل، والتسلسل في نظام تسلسل الفائق.
    ملاحظة: يمكن أن يتم بناء مكتبة من الحمض النووي الريبي الخلوية باستخدام مجموعات نفسه باتباع بروتوكول قياسي للمجموعات.

6-المعلوماتية الحيوية خط أنابيب

ملاحظة: هذا أنبوب داخل المنظمة، ويتم سرد البرامج المستخدمة هنا في "الجدول للمواد"-

  1. تقليم بعيداً منخفضة الجودة ما يلي: وإزالة تسلسل محول من يقرأ الخام.
  2. خريطة يقرأ نظيفة لأنواع مختلفة من الكشف.
    1. إضافة تعليق توضيحي ترنس بالسماح لاثنين من عدم التطابق لأنه يتسبب تسلسل الحمض الريبي النووي النقال معدلة بشكل كبير ميسينكوربوريشن قاعدة متكررة بعكس المنتسخة.
    2. إضافة تعليق ميرناس برسم خرائط للبشرية ميرناس من v21 ميرباسي السماح بالصفر عدم التطابق. حيث تخضع ميرناس أ وهي يو nontemplated 3 'نهاية الإضافات، متواليات التي لا تقم بتعيين 3' قلص من nts يصل إلى ثلاثة ألف و/أو تي بعدها يتم تعيين ما يلي ميرناس البشرية وأخرى ميرناس من v21 ميرباسي السماح بالصفر عدم التطابق.
    3. إضافة تعليق توضيحي إلى أخرى الكشف صغيرة ذات الصلة (سنرنا، سنورنا و piRNA والكشف Y) بالسماح لعدم تطابق واحد.
    4. خريطة القراءات غير المعينة المتبقية إلى طويلة من مجموعات بيانات الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي، الجيش الملكي النيبالي غيرها من رفام، ومرناً) لتقييم التدهور.
    5. إضافة تعليق توضيحي في تسلسل الجينوم البشري.
    6. إضافة تعليق توضيحي تسلسلات الجينوم البكتيري.
    7. تطبيع ميرنا التعبير باستخدام الصيغة التالية: حساب ميرنا/المجموع التهم من جميع ميرناس المعينة) x 106.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول هو الأمثل لجمع اكسرنا من الثقافة لجنة السلامة البحرية لتسلسل الجيل القادم. الخطة الشاملة لسير العمل في الشكل رقم 1 على اليسار ونقاط التفتيش كل منها مراقبة الجودة على الحق.

مورفولوجيا الخلايا في يوم جمع متمايز (الشكل 3A) ومتباينة (الشكل 3B) يتم عرض الخلايا. وعلاوة على ذلك، كما تظهر الممثل مستويات طبيعية من النشاط الب الخلايا التي يسببها لمدة 7 أيام (الشكل 3). هنا، نشاط حزب العمال الأسترالي حوالي 2.5 إضعاف الخلايا أونيندوسيد.

ثلاثة قوارير T175 من MSCs المتلاقية العائد 2-5 × 1010 جزيئات/مليلتر (الشكل 2). حجم الجسيمات يعني حوالي 160-165 نانومتر بينما معظم الجسيمات nm 130-140. كانت هناك قمم صغيرة قليلة بين 200 و 500 نانومتر، مما يدل على المجمعات الكبيرة أو المجاميع الكبيرة.

نظراً للجيش الملكي النيبالي يمكن أن يتحلل بسرعة، التقيد الصارم بشروط استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لمجموعة أو البروتوكول المستخدم. استخدام شروط خالية من رناسي، لا سيما المياه خالية من رناسي ريسوسبيند الجيش الملكي النيبالي، وإبقاء الجيش الملكي النيبالي على الجليد عندما يكون ذلك ممكناً. بعد الاستخراج، الجيش الملكي النيبالي يمكن قياسها كمياً باستخدام جهاز التفريد شعرية المستندة إلى شرائح. وترد اليكتروفيروجرامس ممثل للجيش الملكي النيبالي بعد يجري تحليله في الشكل 4. ويشمل اليكتروفيروجرام اكسرناس نطاق واسع من الكشف (الشكل 4 أ). وفي المقابل، قد رنا الخلوية قمم متميزة للغاية في جميع أنحاء 70-120، 1800، و nt 3800، التي تتوافق مع الحمض الريبي النووي النقال/5S الرنا الريباسي/5.8S الرنا الريباسي و 18S الرنا الريباسي الرنا الريباسي 28S، على التوالي (الشكل 4 باء). ويمثل عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) النوعية من الجيش الملكي النيبالي. رين جيدة من الحمض النووي الريبي الخلوية > 8 (التي تشير إلى تقريبا أي تحلل الحمض النووي الريبي). الخوارزمية التي يستند إليها رين هو النسبة بين 28S و 18S. وهذا يعني أن رين ليس مؤشرا جيدا لنوعية الجيش الملكي النيبالي اكسرناس لكامل طول ررناس لا يمكن كشفها في اكسرناس عادة.

بعد استخراج الحمض النووي الريبي، وشيدت المكتبات ميرنا وتم فصل المكتبات كدنا بالتفريد هلام. عادة ما يكون كدنا محول متصلة ميرناس بين 140 و 160 nt. ثم كان تصور نوعية المكتبة على جهاز التفريد شعرية القائم على رقاقة (الشكل 5). الشكل 5A و 5B الشكل هي المكتبات من الجيش الملكي النيبالي الخلوية في اليوم 0 و 7 اليوم، على التوالي. الرقم 5 و الرقم 5 هي المكتبات اكسرنا في اليوم 0 و 7 يوم على التوالي. كانت جميع العينات أربع قمم في حوالي 140 nt، التي تشير إلى بناء مكتبة ميرنا ناجحة. كان كمياً مقدار كدنا في المكتبات التي قبكر باستخدام مجموعة أدوات القياس الكمي في مكتبة. كان رسم دائرة القياس الكمي (Cq) المعايير ضد السجل في تركيز للحصول على منحنى قياسي (الشكل 6). ثم تم استخدام معادلة المنحنى القياسي لحساب تركيز المكتبات (الجدول 1). وكان تركيز المكتبات من اكسرناس في العينة، 5-8 شمال البحر الأبيض المتوسط، الذي كان أقل بكثير من المكتبات من الكشف الخلوية (8-30 نانومتر). ثم كانت المكتبات المجمعة مع كمية متساوية وأرسلت للتسلسل.

بعد أن تم تعيين تسلسل المكتبات، يقرأ منخفضة الجودة قد قلصت بعيداً مع فاستكس--أدوات ونوعية الناتج من اكسرناس مكتبة كانت عالية وقابلة للمقارنة لأن المكتبات من الخلايا (الشكل 7 أ، ب). طول التسلسل للمكتبات من الخلايا كانت ذروة واحدة في حوالي 22 nt (الشكل 7)، الذي يرتبط مع ميرناس. وفي المقابل، كانت غير متجانسة أكثر المكتبات من اكسرناس والواردة القمم الرئيسية 3: 22 nt، 30 nt، و 33 nt (الشكل 7). مماثلة لنظرائهم الخلوية، الذروة في 22 nt هو ميرناس. توثيق التفتيش كشفت أن القمم في nt 30 و 33 ترنس نصفين/الشظايا أو برنس. ثم تم رسمها شروح للقراءات المعينة. معظم من يقرأ (65.1%) من الحمض النووي الريبي الخلوية تعيينها إلى ميرناس البشرية وكل من الكشف الصغيرة الأخرى التي تمثل جزءا صغيراً من المعين على ما يلي (الشكل 8 أ). كونتراستينجلي، 8% فقط من اكسرناس التي تم تعيينها إلى ميرناس البشري (الشكل 8B). وكان الجيش الملكي النيبالي الأكثر وفرة الصغيرة التي تم تعيينها على ما يلي ترناس. وكان معظم من يقرأ "لا مثيل له ما يلي:" (43 في المائة). كذلك أدت دراسة القراءة لا مثيل لها من اكسرناس إلى قواعد البيانات العالمية إلى إيجاد الدهشة التي تتوافق مع معظمهم إلى تسلسل البكتيرية (74 في المائة و 85 في المائة بالنسبة اكسرنا D0 و D7، على التوالي؛ الجدول 2). وفي المقابل، 0.9 في المائة فقط من الجيش الملكي النيبالي الخلوية لا مثيل لها، وتلك، تعيين 10 في المائة فقط للبكتيريا. مقارنة للأبقار الجينوم أظهرت أقل من 1 ٪ المباراة مما يوحي بأن FBS لم يكن مصدرا للتلوث (الجدول 2). ومن ثم، اكسرناس يحمل صورة شاذة مقارنة بالجيش الملكي النيبالي الخلوية العادية.

Figure 1
رقم 1: سير العمل تسلسل اكسرنا والتحليل- ويرد العمل كله على اليسار في مربعات رمادية ومراقبة الجودة المرتبطة بكل خطوة في مربعات حمراء على اليمين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: حجم توزيع جزيئات التي يفرزها الخلايا في اليوم 0 واليوم 7 من التمايز. نتائج الإدارة الوطنية للسياحة الممثل لجسيمات جمعت من 3 قوارير x T175 في () 0 واليوم (ب) 7 من التمايز. هي جداول الأحجام الوسط ووضع كل منهما، فضلا عن تركيز الجسيمات أسفل الرسوم البيانية. التنمية المستدامة: الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الخلية مورفولوجيا والتمايز osteogenic قبل جمع الحمض النووي الريبي خارج الخلية. (أ) صورة مجهرية غير متمايز بمسكس مثقف مع مجموعة وسائل الإعلام اليوم من جمع. صورة مجهرية بمسكس (ب) متباينة لمدة 7 أيام مع مجموعة وسائل الإعلام اليوم من المجموعة. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. (ج) تم تطبيع أنشطة حزب العمال الأسترالي من الخلايا إلى فيابيليتيس الخلية الخاصة بهم. وكانت القيم المرسومة لثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: اليكتروفيروجرام الممثل لسلامة الجيش الملكي النيبالي بعد استخراج الحمض النووي الريبي. تحاليل الحمض النووي الريبي لخارج الخلية الحمض النووي الريبي (A)، والجيش الملكي النيبالي الخلوية (ب). المحور س هو طول الحمض النووي الريبي (nt) وهو المحور الصادي الأسفار. هو الذروة الأولى السلم في 25 nt. الكشف الريباسي تظهر ك 18S (1,800 nt) و 28 (3,800 nt). عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) مؤشرا من مؤشرات نوعية الجيش الملكي النيبالي على سلامة الحمض النووي الريبي الريباسي 18S و 28S أساس. أعلى رين الأرقام متساوية أفضل نوعية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: اليكتروفيروجرام الممثل من مكتبات كدنا بعد بناء مكتبة. إجراء تحاليل الحمض النووي للمكتبات من الخلايا (A) في اليوم 0، خلايا (ب) في يوم 7 ورنا خارج الخلية (ج) من اليوم 0 ورنا خارج الخلية (د) من يوم 7. أرقام خضراء والأرجواني هي السلالم في 35 10,380 و nt nt، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: كدنا مكتبة القياس الكمي والحساب- كانت تضعف المكتبات بين 500-000 1 من إضعاف لأولئك من اكسرنا وبين 1,000 ومرات 4,000 للجيش الملكي النيبالي الخلية. تم تشغيل المكتبات جنبا إلى جنب مع المعايير من أدوات القياس الكمي المكتبة. تم رسم القيم Cq متوسط مستويات الحمض النووي مقابل تركيز10 سجل (بعد الظهر) لإنشاء منحنى قياسي، معادلة للمنحنى المعياري وقيمة2 R. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: نقاط الجودة والتوزيع طول تسلسلات. يقرأ منخفضة الجودة، وقد قلصت تسلسل محول مع فاستكس--أدوات للخلايا (أ) و (ب) اكسرناس. توزيع طول نظيفة ما يلي للخلايا (ج) و (د) اكسرناس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: شرح الكشف الصغيرة بعد التسلسل. شروح تمثل النسب المئوية للقراءات نظيفة للخلايا (أ) و (ب) اكسرناس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

عينة عامل إضعاف قيمة Cq log(pM) تركيز (بعد الظهر) يعني تركيز (بعد الظهر) يعني تركيز * (452/143) قم بضرب معامل ديلوشن (بعد الظهر)
D0 بمسك اكسرنا 500 7.72 0.702 5.036 5.276 16.678 8338.993
D0 بمسك اكسرنا 500 7.57 0.754 5.677
D0 بمسك اكسرنا 500 7.7 0.709 5.117
D0 بمسك اكسرنا 1000 8.64 0.383 2,416 2.365 7.477 7476.846
D0 بمسك اكسرنا 1000 8.68 0.369 2.340
D0 بمسك اكسرنا 1000 8.68 0.369 2.340
D7 بمسك اكسرنا 500 8.52 0.425 2.659 3.221 10.182 5090.913
D7 بمسك اكسرنا 500 8.42 0.459 2.880
D7 بمسك اكسرنا 500 7.97 0.615 4.125
D7 بمسك اكسرنا 1000 8.87 0.303 2.011 1.933 6.110 6110.391
D7 بمسك اكسرنا 1000 8.92 0.286 1.932
D7 بمسك اكسرنا 1000 8.97 0.269 1، 857
خلية D0 بمسك 1000 6.86 1.000 10.005 9.810 31.007 31006.974
خلية D0 بمسك 1000 6.91 0.983 9.614
خلية D0 بمسك 4000 8.68 0.369 2.340 2.398 7.581 30322.041
خلية D0 بمسك 4000 8.59 0.400 2.514
خلية D0 بمسك 4000 8.68 0.369 2.340
الخلية D7 بمسك 1000 8.44 0.452 2.834 2.880 9.104 9104.439
الخلية D7 بمسك 1000 8.43 0.456 2.857
الخلية D7 بمسك 1000 8.39 0.470 2.950
الخلية D7 بمسك 4000 10.36 -0.213 0.612 0.702 2.218 8872.689
الخلية D7 بمسك 4000 10.27 -0.182 0.658
الخلية D7 بمسك 4000 9.97 -0.078 0.836
العمليات الحسابية:
log(pM) =-0.3467 (قيمة عينة الاستبيان المفاهيمي) س + 3.3786؛ استخدام المنحنى المعياري والصيغة
تركيز (م) = 10^log(pM)
حجم حساب تسوية = معيار "حجم الحمض النووي" (452 bp) مقسوماً على طول جزء متوسط (143 bp)

الجدول 1: ميرنا مكتبة القياس الكمي.

العينة: # يقرأ لا رسم الخرائط البشرية # يقرأ الخرائط للبكتيريا % البكتيرية ما يلي: # يقرأ الخرائط للبقر % البقري ما يلي:
خلية D0 بمسك 131007 9858 8% 99 0.08 في المائة
الخلية D7 بمسك 169730 7935 5% 188 0.11 في المائة
D0 بمسك اكسرنا 6122833 4551477 74% 891 0.01 ٪
D7 بمسك اكسرنا 7046691 5970086 85 في المائة 771 0.01 ٪

الجدول 2: النسبة المئوية للا مثيل لها يقرأ تلك الخريطة للبكتيريا والبقر ما يلي:.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتسلسل الجيل القادم من اكسرناس التي تمكن من تحليل التعبير التفاضلية من العينات المدخلات المنخفضة. الانضمام إلى بروتوكول معين لعزل EV واكسرنا مهم لأن التعديلات حتى الصغيرة (أي خطوة تنبيذ فائق أو تغيير نوع الدوار) يمكن أن تؤثر الترنسكربيتوم وميرنا المستويات13،14. وهكذا، بغض النظر عن كيف اكسرنا معزولة، من المهم تطبيق نفس الإجراء التجريبي وبيوينفورماتيك لجميع العينات في تجربة ليتمكن من مقارنة النتائج.

عادة ما يتم تقييم سلامة الحمض النووي الريبي على بيواناليزير. ومع ذلك، منذ اكسرناس خالية من كامل طول الرنا الريباسي، قيمتها رين منخفض جداً، ولكن هذا لا يعكس بالضرورة العينات منخفضة الجودة الجيش الملكي النيبالي. بالإضافة إلى ذلك، تركيز الجيش النيبالي الملكي اكسرناس تختلف اختلافاً كبيرا وغير دقيقة في كثير من الأحيان. ومن ثم، بدلاً من تقييم نوعية الجيش الملكي النيبالي، والتحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي في بيواناليزير، استخدم نفس الحجم من وسائل الإعلام في كل مرة لمزيد من المعالجة. أيضا، ريسوسبيند الحمض النووي الريبي المستخرج في نفس حجم المخزن المؤقت لاستثارة واستخدام نفس وحدة التخزين لإنشاء مكتبة.

بناء مكتبة رنا الصغيرة الأمثل بتخفيض مقدار محولات إلى العاشرة من بروتوكول قياسي واستخدام نصف الكواشف الأخرى. تخفيض المحولات يمنع ليس فقط محول dimers، كما يمنع على الجيش الملكي النيبالي إينتراموليكولار15. الحد من الكواشف هو الأمثل "إيلومينا تراسك الصغيرة رنا عينة الإعدادية الطقم". ينبغي أن تستخدم مجموعات أخرى، ينصح أيضا خفض محول والكواشف تبعاً لذلك، ما لم يحدد عدة أنها مصممة خصيصا لانخفاض نماذج الإدخال. أخيرا، زاد دورة PCR لبناء مكتبة من 12 إلى 15 دورات في هذا البروتوكول لحساب تركيز منخفض من اكسرناس. وقد وجدنا أن التكيف الأمثل دون رؤية التضخيم التحيزات15هذا.

ويمكن تقييمها بما في ذلك نقاط جودة قاعدة مختلف مقاييس مراقبة الجودة وقراءة الشخصية طول. عند القيام بالتحليلات المعلوماتية الحيوية، كانت نوعية على ما يلي في الجيش الملكي النيبالي واكسرناس الخلوية قاعدة مماثلة؛ ومع ذلك، توزيع طول والأصل المشروح من تسلسل كانت مختلفة تماما. كان معظم من يقرأ من الحمض النووي الريبي الخلوية تعيينها إلى ميرناس البشرية، غير أن نسبة كبيرة من اكسرنا على ما يلي لا مثيل لها على ما يلي. على توثيق التفتيش، تنص على ما يلي لا مثيل لها تبين أن البكتيريا (الجدول 2). وهذا يبعث على الدهشة لأنه تم استخدام المضادات الحيوية بشكل روتيني في ثقافتنا. لدينا نتيجة محاذاة جيدا مع التقارير الأخرى التي أظهرت أيضا نسبة كبيرة من القراءات لا مثيل لها عند تسلسل خلية ثقافة مشتقة اكسرنا16. أحد الأسباب لهذه الملوثات هي أن البكتيريا التداخل في الحجم مع مجمعات خارج الخلية أو المركبات الكهربائية، ومن ثم تنقية شارك خلال الخطوة تنبيذ فائق17. وقد حددت المنشورات السابقة التلوث على نطاق واسع لبعض البكتيريا في ثقافة وسائل الإعلام التي تبقى غير مكتشفة تحت الخلية الطبيعية مختبر إجراءات18. وحتى الآن، هذه المشكلة قد تم تجاهلها إلى حد كبير ولكن ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تنقية وتحليل اكسرناس.

تفاصيل هذا البروتوكول دليل كامل لحصاد اكسرناس من ثقافة وسائل الإعلام، وتحسين إعداد مكتبة صغيرة في الجيش الملكي النيبالي وتجهيز البيانات الخام المكتبة. ويبرز هذا البروتوكول تحديداً مختلف نقاط التفتيش مراقبة الجودة في جميع مراحل عملية تثبت كيف منخفضة نماذج الإدخال (مثل اكسرناس) يمكن أن تنحرف عن الاستعدادات عينة العادي حيث أن الآخرين الذين يعملون مع العينات المدخلات المنخفضة قد تعرف ما تتوقع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نحن ممتنون للسيد كلاوس الحافلة والسيدة ريتا Rosendahl في إينانو الخاصة بالمساعدة التقنية. شكر خاص إلى الدكتور دانييل أوتزين للسماح لنا الاستخدام المتكرر لبلده أولتراسينتريفوجي. وأيد هذه الدراسة أن الدانمرك "صندوق الابتكار" (حشد المشروع).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells ATCC PCS-500-012 Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit Lonza PT-3001 Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS Gibco A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA Gibco 25200056
T175 Flask Sarstedt 833,912
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline Sigma 806552
Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly Beckman Coulter 355618
Beckman Coulter Type 60 Ti Rotor used here
NucleoCounter Chemometec NC-3000 Cell Counter
β-glycerophosphate Calbiochem 35675 Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone Sigma D4902-25MG Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma D1530-1MG Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1514 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits Roche KK4824 Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) Illumina RS-200-0012 Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep Sage Science Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit Cold Spring Harbor Lab Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt Adaptor removal in step 6
Bowtie Mapping of clean reads in step 6
Samtools To make the expression profile in step 6
Bedtools To make the expression profile in step 6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
  2. Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
  3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
  4. Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
  5. Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
  6. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
  7. Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
  8. Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
  9. NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
  10. Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
  11. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
  12. Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  13. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
  14. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  15. Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
  16. Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
  17. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  18. Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).

Tags

الخلايا الجذعية الوسيطة علم الوراثة، العدد 145،، الكشف خارج الخلية، اكسوسوميس، حويصلات خارج الخلية، ريبونوكليبروتينس، ميكرورناس، صغيرة الكشف، تسلسل الجيل المقبل، بناء مكتبة رنا الصغيرة
عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. … More

Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. T., Mothershead, C. R., Su, J., Kjems, J. Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e58655, doi:10.3791/58655 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter