Summary
이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.
Abstract
세포 외 및 순환 RNAs (exRNA)는 신체의 많은 세포 유형에 의해 생산과 타 액, 혈장, 혈 청, 우유와 소변 등 수많은 체액에 존재. 이러한 RNAs의 한 하위 집합은 posttranscriptional 레 귤 레이 터-microRNAs (miRNAs). 특정 세포 유형에 의해 생산 하는 miRNAs의 윤곽을 그리 다 생체 외에서 문화 시스템 수확 사용할 수와 프로필 exRNAs 셀의 한 하위 집합에서 파생 된. 중간 엽 줄기 세포의 secreted 요소 경감 수많은 질병에 연루 되 고 여기에 체 외 모델 시스템으로 사용 된다. 이 문서 수집의 과정, 작은 RNA의 정화 및 시퀀스 extracellular miRNAs에 라이브러리 생성에 설명합니다. 문화 미디어에서 ExRNAs 낮은 RNA 입력된 샘플, 최적화 된 프로시저를 호출 하 여 세포질 RNA에서 다. 이 프로토콜에 포괄적인 가이드를 작은 exRNA 시퀀싱 문화 미디어에서 exRNA 정화 및 시퀀싱 하는 동안 각 단계에서 품질 관리 검사점을 보여주는 제공 합니다.
Introduction
세포 외 및 순환 RNAs (exRNAs) 다양 한 체액에 존재 하 고 저항 RNases1,2쪽으로 있습니다. 그들의 높은 풍부, 안정성과 접근의 용이성 진단 및 예 후 마커3임상 평가 대 한 매력이 있습니다. ExRNAs에 대 한 전송 모드 포함 extracellular 소포 (EVs), 단백질 (예: 고밀도 지 단백;와 협회 HDL) 및 ribonucleoprotein 단지 (와 같은 Argonaute2 단지와 함께)4.
ExRNAs의 하위 집합은 작은 비 코딩 RNAs의 약 22 microRNAs (miRNAs), nt posttranscriptional 유전자 발현을 조절 하는. 전 miRNAs 셀 통신 및 세포 항상성5의 규칙에 연루 되었습니다. HDL 전-미르-223 내 피 세포 세포 접착 분자 1 (ICAM-1)를 억 누르기 위해 제공 하는 예를 들어와 염증을6. 흥미롭게도, 미르-223는 또한 더 많은 침략 형7에 그들을 프로그래밍 하는 폐 암 세포를 백혈구에서 extracellular 소포에 의해 수송 여겨진다. 따라서, 다양 한 체액 및 세포 배양 매체에서 전 miRNAs의 transcriptome 크게 전 미르 신호에 대 한 우리의 이해를 향상 됩니다.
작은 RNA 시퀀싱 (작은 RNA seq) 작은 RNAs의 transcriptomics를 이해 하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 뿐만 아니라 다른 샘플 차동 표현된 알려진된 RNAs 사이 비교 될 수 있다 하지만 소설 작은 RNAs 수 또한 감지 하 고 특징. 따라서, 그것은 또한 다른 조건 하에서 차동 표현된 miRNAs 식별 하는 강력한 방법입니다. 그러나, 작은 RNA seq의 장애물 중 하나는 뇌 척수의 체액, 타 액, 소변, 우유, 혈 청 및 문화 미디어 같은 낮은 exRNA 입력된 액체에서 작은 RNA seq 라이브러리 생성 어려움입니다. TruSeq 작은 RNA 라이브러리 준비 프로토콜 Illumina에서 고품질 총 RNA의 약 1 µ g 필요 하며 뉴 잉글랜드 Biolabs에서 NEBNext 작은 RNA 라이브러리 준비 설정 프로토콜 100 ng-1 µ g의 RNA8,9. 때때로, 이러한 샘플에서 총 RNA 기존의 대 한 UV 광에 대 한 검출 한계 같습니다.
체액에서 파생 된 전 miRNAs는 잠재적으로 좋은 전조와 진단 마커. 그러나, 기능 효과 연구 하거나 특정 전 miRNAs의 원산지 결정, 세포 배양 시스템 자주 대신 사용 됩니다. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 그들의 EVs 심근 경색, Alzheimer의 질병과 접 붙이다 비교 호스트 질병10를 포함 하 여 많은 질병을 경감에 연루 되어 있기 때문에 광범위 하 게 연구 되었습니다 있다. 여기, 우리 골 수 파생 된 MSCs (BMSCs)와 작은 RNA 도서관 건설, 시퀀싱 및 데이터 분석 (그림 1)을 최적화 하는 데 사용 하는 특정 단계에서 전 miRNAs의 정화를 보여 줍니다.
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Protocol
참고: 중간 엽 줄기 세포 성장 매체 (MSC 미디어)은 재료의 테이블에에서 표시 된 대로 미리 준비가 되어 있습니다.
1. 세포 배양
참고: 인간 중간 엽 줄기 세포는 골 수, 지방 조직 또는 다른 소스11에서 얻어질 수 있다. 양자 택일로, hMSCs는 공급 업체를 통해 구입하실 수 있습니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 BMSCs는 환자의 골 수에서 파생 되었고 회사에서 구입.
- 1 x 106 BMSCs MSC 미디어의 20 mL를 포함 하는 T175 플라스 크에 녹여 5% CO2 와 37 ° C에서 세포를 품 어 고 대체 미디어 80 %confluency 매 2-3 일.
- 1 x PBS의 5 mL로 세포 세척 하 고 PBS를 삭제.
- 0.05%의 5 mL을 추가 하 여 셀을 분리 트립 신-EDTA와 37 ° c.에 5 분에 대 한 세포 배양 분리를 촉진 하기 위하여 플라스 크의 측면을 누릅니다.
- MSC 미디어 비활성화는 트립 신, 표면, 그리고 단일 셀 정지를 아래로 피 펫에서 셀 분리의 15 mL를 추가 합니다.
- 50 mL 튜브에 스핀 아래로 작은 셀을 300 x g 에 5 분에 대 한 셀을 수집 합니다.
- MSC 미디어의 1 mL에 셀 resuspend과 hemocytometer를를 사용 하 여 셀.
참고: 기본 인간의 골 MSCs에서 80% confluency T175 플라스 크에 약 2 × 106 세포입니다. - 2, 000 셀/cm2 5 T175 플라스 크에 신선한 MSC 미디어 판 hMSCs. 5% CO2 와 37 ° C에서 세포를 성장 하 고 미디어 90% confluent T175 플라스 크 5 flasks 얻을 때까지 2-3 일 마다 교체.
2. EVs와 RNA 관련 된 생체 컬렉션
참고: EV 컬렉션 미디어는 사전 준비 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 [DMEM] 10% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS]와 1% 페니실린/스 [P/S]). EV 컬렉션 미디어 정상적인 MSC 미디어, 하지만 상업 EV 고갈 FBS (자료 테이블)와 함께. 이 FBS, 일반적으로 exRNAs 관련 된 EVs, ribonucleoproteins, 및 단백질을 포함에서 소 exRNA 오염 방지 하는. 작은 RNA 라이브러리 준비에 대 한 MSCs의 5 confluent 플라스 크에서 파생 하는 exRNAs 도서관 건축을 활성화 해야 합니다.
- 3 세포를 씻어 플라스 크 T175 당 20 mL PBS의 x. MSCs의 confluent T175 플라스 크 당 EV 컬렉션 미디어의 20 mL를 추가 하 고 5% CO2 48 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
- 미디어를 수집 하 고 원심 300 x g 에서 10 분 및 4 ° c.에 대 한 미디어
- 상쾌한을 수집 하 고 원심 2000 x g 에서 20 분 및 4 ° c.에 대 한 미디어
- 수집 하는 상쾌한 고 원심 15500 x g 30 분 및 4 ° c.에 대 한 미디어 다음에 상쾌한을 수집 합니다.
- Ultracentrifuge 관에 미디어를 전송 하 고 작은 공의 100000 x g 와 4 ° C에서 90 분 exRNAs 펠 릿은 튜브의 측면에 고정 되 고 고정된 각도 터 여기 사용 됩니다. 뚜껑의 측면을 표시 하 고 펠 릿으로 예상 튜브 측에 원을 그립니다.
- 상쾌한 제거, 흡수 성 종이에 튜브를 거꾸로 하 여 튜브의 내부를 건조 하 고 흡수 성 종이의 작은 조각을 사용 하 여 튜브의 바닥을 건드리지 않고 튜브 내부 액체를 제거. 30에 대 한 vortexing에 의해 PBS의 200 μ에 펠 릿을 resuspend s 및 20 x 위아래로 pipetting.
- EVs와 생체 나노 추적 분석 (NTA) (그림 2)와 함께 평가 합니다.
참고: EVs와 생체 나노 분석 (NTA), 동적 산란 (DL) 또는 전송 전자 현미경 (TEM)12추적으로 평가 될 수 있다. - 추가 다운스트림 실험까지 EVs와 생체-80 ° C에 저장 합니다.
참고: EVs 기능 연구에 사용 될 경우, 20% 글리세롤 파열에서 그들을 보호 하기 위해 추가 해야 합니다. 필요한 경우에 표준 절차를 사용 하 여 셀을 수집할 수 있습니다.
3. EVs와 차별화 된 세포의 RNA 관련 된 생체 컬렉션
참고: EVs와 RNA 관련 된 생체 세포 분화를 받아야 하는 동안 세포 배양에서 수도 있습니다. 프로토콜에 표시 된 예제에서는 osteoblastic 감 별 법 및 하루 0와 차별화의 7에서 exRNA 컬렉션에 설명 합니다. 없는 차별화가 필요한 경우 제 3 항을 생략 하 고 섹션 4로가 서.
- Osteoblastic 감 별 법 미디어 준비 (DMEM 10 %FBS, 1 %P / S, 10 m m β-glycerophosphate, 10 nM dexamethasone, 50 μ M 하는데-2-인산 염, 및 10 mM 1.25 비타민 D3) 신선한 모든 시간.
- MSCs는 80% 합칠, MSC 미디어 osteoblastic 감 별 법 미디어 변경.
- 2-3 일 후 osteoblastic 감 별 법 미디어를 보충.
- 차별화의 날 5, 미디어를 제거 하 고 씻어 3 셀 T175 플라스 크 당 20 mL PBS의 x.
- EV 컬렉션 포함 된 미디어 10 m m β-glycerophosphate, 10 nM dexamethasone, 50 μ M 하는데-2-인산 및 MSCs. 품 5% CO2 되도록 48 h에 대 한 37 ° C에서 셀 계속의 confluent T175 플라스 크 당 10 mM 1.25 비타민 D3 의 20 mL를 추가 EVs 및 생체 수집 하면서 차별화입니다.
- 7 일 미디어를 수집 하 고 분리 EVs와 생체 단계 2.2-2.6에에서 설명 된 대로 진행.
- 품질 관리에 대 한 씨 셀 96-웰 스 또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 활동 분석 결과 사용 하 여 차별화를 평가 하기 위해 6-우물 또는 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), 각각.
참고: 그림 3 셀의 osteogenic 차별화를 보여 주는 예제입니다.
4. RNA 추출 및 품질 관리
- 샘플 단계 얼음에 2.8에서 녹여 RNA는 RNA 격리 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 압축을 풉니다.
- RNase 무료 물 100 μ에 RNA 격리 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 열 로부터 RNA을 elute.
- 순화 된 RNA의 100 μ로 글 리 코겐, 2 M pH 5.5 나트륨 아세테이트의 10 μ와 미리 냉장된 99% 에탄올의 250 μ 1 μ를 추가 하 여 에탄올 강 수를 통해 RNA를 집중.
- -20 ° C 하룻밤 RNA 침전에서 샘플을 품 어. 16000 x g 와 4 ° C에서 20 분 동안 centrifuging으로 RNA를 펠 렛
참고: 펠 릿 glycogen으로 공동 강수량 때문에 흰색입니다. - 상쾌한을 제거 하 고 75% 에탄올의 1 mL와 RNA 펠 릿을 세척. 16000 x g 와 4 ° C에서 5 분 동안 다시 RNA를 펠 렛
- 에탄올을 열어두고 RNA 튜브의 뚜껑 공기를 5 ~ 10 분 건조 RNA 펠 릿. RNase 무료 물 7 μ에 RNA 펠 릿을 resuspend.
- RNA 품질 및 제조 업체의 프로토콜 도서관 건축 이전에 따라 RNA를 검출 하 칩 기반 모 세관 전기 이동 법 기계를 사용 하 여 농도 확인 하십시오.
참고: RNA의 대표적인 크기 분포는 그림 4에 표시 됩니다. - 필요한 경우에 상업적인 정화 키트 (자료 테이블)를 사용 하 여 세포질 RNA를 추출 합니다.
5. 도서관 건설 및 품질 관리
참고: 작은 RNA 라이브러리 입력 낮은 RNA 인해 조정 상업 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 구성 됩니다. 라이브러리 건설 냉장된 블록에서 수행 됩니다.
- 얼음에 0.2 mL PCR 튜브에 대 한가 열 블록을 진정 하 고 플라스틱 단계 4.6 0.2 mL RNase 무료 PCR 튜브에 냉장된 블록에서에서 RNA의 5 μ.
- 3' 어댑터 (1:10) 0.2 mL RNase 무료 PCR 튜브에 RNase 무료 물에 희석. 희석된 어댑터의 0.5 μ를 추가 하 고 8 x 및 원심 분리기 튜브의 하단에 모든 액체를 수집 하는 짧게 위아래로 pipetting으로 RNA의 5 μ와 혼합.
- 품 어 데워 열 cycler에 2 분 동안 70 ° C에서 RNA와 3' 어댑터 믹스 하 고 냉장된 블록에 다시 샘플을 놓습니다.
- RNA와 3' 어댑터 혼합물으로의 결 찰 버퍼 1 μ, RNase 억제제의 0.5 μ 및 T4 RNA 리가 (삭제 돌연변이)의 0.5 μ를 추가 합니다. 8 x 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 짧게 원심.
- 데워 열 cycler에서 1 시간에 28 ° C에서 튜브를 품 어.
- 열 cycler에서 튜브 샘플 튜브에 정지 솔루션의 0.5 μ를 추가 하 고 8 x 위아래로 pipetting으로 혼합 계속 15 분 동안 28 ° C에 품 어.
- 5' 어댑터 (1:10) 0.2 mL RNase 무료 PCR 튜브에 RNase 무료 물에 희석. 별도 RNase 무료 0.2 mL PCR 튜브, 열 데워 열 cycler에서 2 분 동안 70 ° C에서 5' 어댑터에 5' 어댑터의 0.5 μ를 추가 하 고 냉장된 블록에 샘플을 놓습니다.
- 10 nM ATP, 5' 어댑터 튜브에 T4 RNA 리가의 0.5 μ의 0.5 μ 추가, 8 x 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 하단에 모든 액체를 수집을 간단히 원심.
참고: 가능한 냉장된 블록에 5' 어댑터를 유지. - 5.6 단계에서 샘플을 5' 어댑터 혼합물의 1.5 μ를 추가 하 고 천천히 pipetting 8 x 매우 부드럽게 혼합. 데워 열 cycler에서 1 시간에 28 ° C에서 샘플을 품 어.
- RNase 무료 물 0.2 mL RNase 무료 PCR 튜브에서에 RT 뇌관 1시 10분 희석. 단계의 5.9, 8 x 위아래로 천천히 pipetting으로 매우 부드럽게 혼합 샘플에 희석된 RT 뇌관의 0.5 μ를 추가 하 고 간단히 원심.
- 데워 열 cycler에서 2 분 동안 70 ° C에서 샘플을 품 어 그리고 냉장된 블록에 샘플을 놓습니다.
- 첫 번째 가닥 버퍼, 12.5 m m dNTP 믹스의 0.5 μ, 100 m m dithiothreitol (DTT), RNase 억제제의 0.5 μ 그리고 역전사의 0.5 μ의 0.5 μ x 5의 1 μ를 추가 합니다. 8 x 위아래로 천천히 pipetting으로 매우 부드럽게 혼합 하 고 짧게 원심.
- CDNA를 데워 열 cycler에서 1 h 50 ° C에서 샘플을 품 어.
- 초순의 4.25 μ, PCR 혼합의 12.5 μ, 인덱스 뇌관의 1 μ 그리고 보편적인 뇌관의 1 μ는 cDNA에 추가 합니다. 8 x 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 짧게 원심.
- 열 cycler에서 샘플을 놓고는 자전거 타는 사람을 다음과 같이 설정: 98 ° C 30에 대 한 s; 10에 대 한 98 ° C의 15 주기 s, 60 ° C 30에 대 한 s와 15 72 ° C s; 그리고 마지막 10 분 동안 72 ° C를 가진 주기.
참고: 준비 라이브러리 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 1 주일 동안. - 140 사이 젤 (젤 추출) DNA 젤에 라이브러리를 분리 하 여 RNA 라이브러리를 정화 혈압과 160 혈압과 젤 라이브러리 건설 키트에 의해 주어진 프로토콜을 다음에서 라이브러리를 방출.
참고:이 연구 단계 5.15에서에서 준비 된 라이브러리에 로드 됩니다 상업 젤 (자료 테이블)와 140 사이 도서관 혈압과 160 bp를 밖으로 정화 하는 자동화 된 DNA 크기 fractionator (자료 테이블)에 따라 여는 제조 업체의 프로토콜입니다. - 집중 및 단계의 5.16 열 기반 PCR 정화 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 라이브러리를 세척 하 고 마침내 10 μ RNase 무료 물에 도서관을 elute.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 라이브러리의 크기를 확인 하려면 DNA 칩 (자료 테이블)에 순화 된 라이브러리의 1 μ를 로드 합니다.
- 10 m m pH 8.0에서에서 순화 된 라이브러리 (1:1000)의 1 μ 희석 Tris HCl 0.05% 폴 20와 정량 키트에 DNA 표준을 사용 하 여 라이브러리 농도 계량 하는 상용 라이브러리 정량화 키트를 사용 하 여 라이브러리를 계량 하 고.
- 수영장 높은 처리량 시퀀싱 시스템에 시퀀싱 컴퓨터와 시퀀스의 요구에 따라 라이브러리의 동일 금액
참고: 세포질 RNA의 도서관 건축을 할 수 있습니다 키트의 표준 프로토콜에 따라 같은 키트를 사용 하 여.
6. 생물 정보학 파이프라인
참고: 이것은 내부 파이프라인 및 여기에 사용 되는 프로그램에 나와 있는 테이블의 자료.
- 멀리 낮은 품질 읽기를 트림 하 고 원시 읽기에서 어댑터 시퀀스를 제거 합니다.
- 깨끗 한 읽기 RNAs의 다른 종류에 매핑됩니다.
- 무 겁 게 수정된 tRNA 시퀀스 자주 기본 misincorporation 역전사에 의해 때문에 두 개의 불일치를 함으로써 tRNAs 주석을.
- 매핑 제로 불일치를 허용 하는 miRBase v21에서 인간의 miRNAs에 의해 miRNAs 주석을. 이후 A는 miRNAs와 U nontemplated 3' 끝 추가, 매핑되지 않는 시퀀스는 3' 최대 3 A / T 국세청 후 읽기 매핑됩니다 인간의 miRNAs와 제로 불일치를 허용 하는 miRBase v21에서 다른 miRNAs의 손질.
- 한 불일치를 함으로써 (snRNA, snoRNA, 피 르 나, 그리고 Y RNAs) 다른 관련 작은 RNAs를 주석을.
- 나머지 매핑되지 않은 읽기를 저하를 평가 하 긴 RNA 데이터 집합 (rRNA, Rfam, 및 mRNA에서 다른 RNA)에 매핑됩니다.
- 인간 게놈 시퀀스를 주석을.
- 주석을 세균성 게놈을 시퀀스.
- MiRNA 식 다음 수식을 사용 하 여 정규화: 미르 계산 / 모든 매핑된 miRNAs의 총 계산) x 106.
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Representative Results
이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 다음 세대 시퀀싱 MSC 문화에서 exRNA 수집 최적화 됩니다. 워크플로의 전체 체계는 그림 1 에 왼쪽에 있으며 각각 품질 관리 검사점 오른쪽에.
컬렉션에 대 한의 날에 세포의 형태학 undifferentiated (그림 3A)와 (그림 3B) 분화 세포 표시 됩니다. 또한, 7 일 대 한 유도 하는 세포의 ALP 활동의 대표적인 정규화 된 레벨 (그림 3C)에 표시 됩니다. 여기, ALP 활동은 약 2.5 배 uninduced 셀의.
3. 플라스 크 T175 confluent MSCs의 항복 1010 입자/mL (그림 2) x 2-5. 평균 입자 크기는 약 160-165 nm 입자의 대부분은 130-140 nm. 대형 단지 또는 큰 집계를 나타내는 것이 200, 500 nm 사이 작은 봉우리를 몇 가지 있었다.
RNA는 신속 하 게 저하 될 수 있습니다, 이후 RNA 추출 키트 또는 사용 되는 프로토콜에 따라 조건에 엄격 하 게 준수 합니다. RNase 무료 조건을 사용 하 여, 특히 RNA를 resuspend 하 고 가능 하면 얼음에 RNA 계속 물 RNase 무료. 추출 후 RNA 칩 기반 모 세관 전기 이동 법 기계를 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 분석 되 고 후 RNA의 대표 electropherograms는 그림 4에 나와 있습니다. ExRNAs의 electropherogram는 광범위 한 범위 RNAs (그림 4A) 포함 되어 있습니다. 반면, 세포질 RNA 주위에서 매우 독특한 봉우리는 70-120, 1800, 그리고 tRNA/5에 해당 하는 3800 nt rRNA / 5.8S rRNA, 18S rRNA, 그리고 28S rRNA, 각각 (그림 4B). RNA 무결성 번호 (린)는 RNA의 품질을 나타냅니다. 세포질 RNA의 좋은 린은 > (나타내는 RNA 저하 거의 없음) 8. 린 기반 알고리즘 28S와 18S 사이의 비율입니다. 즉, 린 아니다는 것을 exRNAs의 RNA 품질의 좋은 지표 전체 길이 rRNAs는 일반적으로 exRNAs에서 감지 되지 않으므로.
RNA 추출 다음 미르 라이브러리 건설 되었다 고 cDNA 라이브러리 젤 전기 이동 법으로 분리 되었다. 어댑터 출혈 cDNA는 miRNAs의 140 그리고 160 nt 사이 일반적으로 있다. 라이브러리의 품질은 다음 모 세관 전기 영동 칩 기반 시스템 (그림 5)에 시각. 그림 5A 와 그림 5B 는 세포질 RNA에서 라이브러리 0 일과 7 일에 각각. 그림 5C 및 그림 5D exRNA 라이브러리에 있습니다 0 일과 7 일 각각. 모든 4 개의 샘플 약 140 봉우리 했다 성공적인 미르 도서관 건축을 나타내는 nt. 도서관에서 cDNA의 양은 정량 라이브러리 정량화 키트를 사용 하 여 정량 했다. 표준의 정량화 주기 (Cq) 농도를 표준 곡선 (그림 6)의 로그에 대해 구성 했다. 표준 곡선의 방정식 다음 라이브러리 (표 1)의 농도 계산 하기 위해 사용 되었다. 우리의 샘플에서 exRNAs에서 라이브러리의 농도가 이었다 5-8 nM는 셀룰러 RNAs (8-30 nM)에서 라이브러리 보다 크게 낮은. 라이브러리 동일한 금액으로 풀링 그리고 시퀀싱에 대 한 전송 했다.
라이브러리 시퀀싱 했다 낮은 품질 읽기 FASTX 툴킷으로 멀리 손질 했다 고 라이브러리 exRNAs의 결과 품질은 높은의 비교는 라이브러리 (그림 7AB) 세포에서. 셀에서 라이브러리의 시퀀스 길이 약 22에서 단일 피크를 했다 nt (그림 ℃), miRNAs와 연결 합니다. 대조적으로, exRNAs에서 라이브러리 더 이질적인 되었고 3 주요 봉우리를 포함: 22 30 nt nt, 및 33 nt (그림 7D). 그들의 휴대 전화 대응, 22에서 피크와 마찬가지로 nt는 miRNAs입니다. 가까이 검사 밝혀 30 및 33 nt에서 봉우리는 tRNAs 반쪽/조각 또는 piRNAs. 매핑된 읽기의 주석은 다음 구성 했다. 대부분의 읽기 (65.1%) 인간의 miRNAs에는 매핑된의 작은 부분을 차지 하 고 다른 작은 RNAs의 각 매핑된 세포질 RNA에서 (그림 8A)를 읽습니다. 반면, 단지 8 %exRNAs 인간 miRNAs (그림 8B)에 매핑됩니다. 가장 풍부한 작은 RNA 읽기 매핑된 tRNAs 했다. 읽기의 대부분은 "뛰어난된 읽기" (43%) 했다. 글로벌 데이터베이스에 exRNAs에서 타의 추종을 불허 읽기 시험 세균 시퀀스에 해당 하는 대부분 그들의 놀라운 발견에 지도 하는 더 (74%, 85 %D0 및 d 7 exRNA, 각각; 표 2)입니다. 대조적으로, 세포질 RNA의 0.9%만 일치 되었고, 그 중 10%만 박테리아 매핑됩니다. 1% 미만 보여주었다 소 게놈을 비교 FBS 오염 (표 2)의 원천이 아니었다 제안 일치. 따라서, exRNAs는 정상적인 세포질 RNA에 비해 비정형 프로필 전시.
그림 1: exRNA 시퀀싱 및 분석의 워크플로. 전체 워크플로 회색 상자에서 왼쪽에 표시 되며 각 단계와 관련 된 품질 관리 오른쪽에 빨간 상자에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 0와 차별화의 7 일에는 세포에 의해 분 비 하는 입자의 크기. 입자의 대표 NTA 결과 0 및 (B) 하루 7 차별화의 3 x T175 플라스 크 (A)에서에서 수집. 각각 평균 및 모드 크기 뿐만 아니라 입자의 농도 그래프 아래 표로 않는다. SD: 표준 편차입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 세포 형태학 및 세포 외 RNA 컬렉션 이전 osteogenic 차별화. (A) undifferentiated BMSCs 컬렉션의 당일 컬렉션 미디어와 교양의 현미경 사진. BMSCs (B) 현미경 사진 컬렉션 당일 컬렉션 미디어와 함께 7 일에 대 한 차별. 바 규모 = 100 µ m. (C) 셀의 ALP 활동 그들의 각각 셀 viabilities로 표준화 되었다. 표시 값의 3 개의 독립적인 실험을 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: RNA 추출 후 RNA 무결성의 대표 electropherogram. (A) extracellular RNA의 RNA 분석 및 세포질 RNA (B). X 축 (nt) RNA의 길이 이며, y는 형광. 첫 번째 피크는 25에서 사다리 nt. 리보솜 RNAs 18로 표시 됩니다 (1800 nt) 및 28S (3800 nt). RNA 무결성 번호 (린) 및 28S 18S 리보솜 RNA 무결성에 따라 RNA 품질의 지표 이다. 높은 린 숫자 동등한 더 나은 품질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: cDNA 라이브러리 라이브러리 건설 후의 대표 electropherogram. (A) 세포 0, 하루 7, 0, 터에서 (C) extracellular RNA와 하루 7에서 (D) extracellular RNA에서 (B) 세포에서에서 라이브러리의 DNA 분석. 녹색과 보라색 번호 35에 사다리는 nt와 10,380 nt, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: cDNA 라이브러리 정량화 및 계산. 라이브러리 했다 희석 사이 500-1000 시간 분 exRNA에서 1000 사이 4000 시간 셀 RNA에 대 한. 라이브러리는 라이브러리 정량화 키트에서 표준을 함께 실행 했다. DNA 표준의 Cq 평균값 표준 곡선, 표준 곡선 및 R2 값에 대 한 방정식을 생성 하는 로그10 농도 (오후)에 대 한 구성 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 품질 평가 점수와 시퀀스의 길이 분포. 낮은 품질 읽어들이고 어댑터 시퀀스 셀 (A) 및 (B) exRNAs FASTX 툴킷으로 손질 했다. 깨끗 한의 길이 분포 (C) 세포 및 (D) exRNAs 읽습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 시퀀싱 후 작은 RNAs의 주석. 주석 (A) 세포 그리고 (B) exRNAs에 대 한 깨끗 한 읽기 비율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 샘플 | 희석 비율 | Cq 값 | log(pM) | 농도 (오후) | 농도 평균 (오후) | 농도 평균 * (452/143) | Dillution 요소 (오후)를 곱하면 |
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7.72 | 0.702 | 5.036 | 5.276 | 16.678 | 8338.993 |
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7.57 | 0.754 | 5.677 | |||
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7.7 | 0.709 | 5.117 | |||
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8.64 | 0.383 | 2.416 | 2.365 | 7.477 | 7476.846 |
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D7 exRNA | 500 | 8.52 | 0.425 | 2.659 | 3.221 | 10.182 | 5090.913 |
| BMSC D7 exRNA | 500 | 8.42 | 0.459 | 2.880 | |||
| BMSC D7 exRNA | 500 | 7.97 | 0.615 | 4.125 | |||
| BMSC D7 exRNA | 1000 | 8.87 | 0.303 | 2.011 | 1.933 | 6.110 | 6110.391 |
| BMSC D7 exRNA | 1000 | 8.92 | 0.286 | 1.932 | |||
| BMSC D7 exRNA | 1000 | 8.97 | 0.269 | 1.857 | |||
| BMSC D0 셀 | 1000 | 6.86 | 1.000 | 10.005 | 9.810 | 31.007 | 31006.974 |
| BMSC D0 셀 | 1000 | 6.91 | 0.983 | 9.614 | |||
| BMSC D0 셀 | 4000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | 2.398 | 7.581 | 30322.041 |
| BMSC D0 셀 | 4000 | 8.59 | 0.400 | 2.514 | |||
| BMSC D0 셀 | 4000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D7 셀 | 1000 | 8.44 | 0.452 | 2.834 | 2.880 | 9.104 | 9104.439 |
| BMSC D7 셀 | 1000 | 8.43 | 0.456 | 2.857 | |||
| BMSC D7 셀 | 1000 | 8.39 | 0.470 | 2.950 | |||
| BMSC D7 셀 | 4000 | 10.36 | -0.213 | 0.612 | 0.702 | 2.218 | 8872.689 |
| BMSC D7 셀 | 4000 | 10.27 | -0.182 | 0.658 | |||
| BMSC D7 셀 | 4000 | 9.97 | -0.078 | 0.836 | |||
| 계산: | |||||||
| log(pM) =-0.3467 (샘플 Cq 값) x + 3.3786; 표준 곡선 및 수식을 사용 하 여 | |||||||
| 농도 (오후) = 10^log(pM) | |||||||
| 크기 조정 계산 크기의 DNA 표준 = (452 bp) 평균 조각 길이 나눈 (143 bp) | |||||||
표 1: 미르 라이브러리 정량화
| 샘플: | # 읽기 하지 인간의 매핑 | #는 박테리아를 읽으십시오 | % 세균 읽기 | # 암소를 읽으십시오 | % 소 읽기 |
| BMSC D0 셀 | 131007 | 9858 | 8% | 99 | 0.08% |
| BMSC D7 셀 | 169730 | 7935 | 5% | 188 | 0.11% |
| BMSC D0 exRNA | 6122833 | 4551477 | 74% | 891 | 0.01% |
| BMSC D7 exRNA | 7046691 | 5970086 | 85% | 771 | 0.01% |
표 2: 타의 추종을 불허의 비율은 박테리아와 소 읽기 지도 읽습니다.
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Discussion
여기, 우리는 낮은 입력된 샘플에서 차동 식 분석을 가능 하 게 exRNAs의 다음 세대 시퀀싱에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 심지어 작은 변경 (즉, ultracentrifugation 단계 또는 회전자 유형 변경)는 transcriptome 영향을 미칠 수 있기 때문에 miRNA 레벨13,14EV 및 exRNA 격리에 대 한 특정 프로토콜을 준수 하는 것이 중요 합니다. 따라서, 어떻게는 exRNA는 절연, 결과 비교할 수 실험에서 모든 샘플에 동일한 실험 및 bioinformatic 절차를 적용 하는 것이 중요 하다.
RNA 무결성은 일반적으로 bioanalyzer에 평가 됩니다. ExRNAs의 없는 상태 이므로 전체 길이 rRNA, 그들의 린 값은 매우 낮은, 그러나,이 낮은 품질 RNA 샘플을 반드시 반영 하지 않습니다. 또한, RNA 농도 exRNAs의 크게 다양 하 고 자주 정확 하지 않다. 따라서, RNA 품질을 평가 하 고 측정 하는 대신 RNA는 bioanalyzer에 사용 하 여 미디어의 동일한 볼륨 때마다 추가 처리를 위해. 또한, 물의 resuspension 버퍼의 같은 볼륨에서 추출한 RNA를 resuspend 하 고 도서관 건설에 대 한 동일한 볼륨을 사용 합니다.
작은 RNA 도서관 건설 표준 프로토콜의 10 분의 1을 어댑터의 양을 줄이는 다른 시 약의 절반을 사용 하 여 최적화 되었다. 뿐만 아니라 어댑터 이합체 방지는 어댑터를 감소, 그것은 또한 intramolecular RNA circularization15를 방지 합니다. 시 약에 감소 Illumina TruSeq 작은 RNA 샘플 준비 키트에 대 한 최적화 되어 있습니다. 다른 키트를 사용 해야 합니다, 그것은 권장 또한 어댑터 및 시 약을 적절 하 게, 낮은 키트 낮은 맞춤형된 입력된 샘플 다는 것을 지정 하지 않는 경우. 마지막으로, 도서관 건설에 대 한 PCR 주기 exRNAs의 낮은 농도 대 한 계정에이 프로토콜에서 15 주기 12에서 증가 되었다. 우리는이 증폭 편견15보고 없이 최적의 조정 발견.
다양 한 품질 관리 통계 기본 품질 평가 점수를 포함 하 여 평가 하 고 길이 프로필을 읽을 수 있습니다. 생물 정보학 분석을 하 고, 세포질 RNA 및 exRNAs 읽기의 기본 품질 비슷; 그러나, 길이 분포와 시퀀스의 주석된 기원 완전히 다른 했다. 그러나 대부분 인간의 miRNAs,, exRNA 읽기의 큰 비율에 매핑된 세포질 RNA에서 읽기의 뛰어난된 읽기 했다. 가까이 검사 시, 뛰어난된 읽기 세균성 드러났다 (표 2)를 읽습니다. 이것은 놀라운 항생제 우리의 문화에서 일상적으로 사용 했다. 우리의 결과 또한 뛰어난된 읽기의 큰 비율 exRNA16파생 된 세포 배양을 시퀀싱 하는 경우 다른 보고서와 잘 맞춥니다. 이러한 오염 물질에 대 한 이유 중 하나는 박테리아 크기 extracellular 단지 또는 EVs, 중복 하 고 따라서 공동 ultracentrifugation 단계17동안 정화입니다. 이전 간행물 문화 미디어에 들 키 지 않고 정상 세포 실험실 절차18에서 남아 있는 특정 박테리아의 광범위 한 오염을 확인 했습니다. 날짜 하려면,이 문제가 크게 무시 하지만 계정 정화 하 고 exRNAs를 분석 하는 경우에가 야 한다.
이 프로토콜 세부 문화 미디어에서 exRNAs을 수확, 작은 RNA 라이브러리 준비 최적화 원시 라이브러리 데이터를 처리 하는 완전 한 가이드. 이 프로토콜은 특히 낮은 입력된 샘플 작업 다른 무엇을 알 수 있도록 (예: exRNAs) 입력된 샘플 일반 샘플 준비에서 일탈 할 수 있다 어떻게 낮은 입증 과정 전반에 걸쳐 다양 한 품질 관리 검사점 하이라이트 기대 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 그들의 기술 지원에 대 한 iNANO에 감사 미스터 클로스 버스 하 양 리 타 Rosendahl입니다. 그의 ultracentrifuge의 빈번한 사용을 허용에 대 한 특별 박사 다니엘 Otzen 감사 합니다. 이 연구는 혁신 기금 덴마크 (소집 프로젝트)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
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