Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Isolere, sekvensering og analysere ekstracellulære MicroRNAs fra menneskelige stamceller

Published: March 8, 2019 doi: 10.3791/58655
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Interdisciplinary Nanoscience Centre, Aarhus University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen demonstrerer hvordan å rense ekstracellulære microRNAs fra celle kultur medier for små RNA biblioteket konstruksjon og neste generasjons sekvensering. Ulike kvalitetskontroll sjekkpunkter er beskrevet å tillate leserne å forstå hva du kan forvente når du arbeider med lav input prøver som exRNAs.

Abstract

Ekstracellulære og sirkulerende RNAs (exRNA) er produsert av mange celletyper i kroppen og finnes i mange kroppsvæsker som spytt, plasma, serum, melk og urin. Et delsett av disse RNAs er posttranscriptional regulatorer-microRNAs (miRNAs). For å avgrense miRNAs produsert av spesifikke celletyper, i vitro kultur systemer kan brukes til å høste og profil exRNAs avledet fra en gruppe celler. Secreted faktorene av mesenchymal stamceller er innblandet i å lindre mange sykdommer og brukes som i vitro modell systemet her. Dette dokumentet beskriver prosessen med samling, rensing av små RNA og biblioteket generasjon sekvens ekstracellulære miRNAs. ExRNAs fra kultur medier avvike fra mobilnettet RNA ved å være lav RNA innspill prøvene, som krever optimal prosedyrer. Denne protokollen gir en omfattende guide til små exRNA sekvenser fra kultur medier, viser kvalitetskontroll sjekkpunkter på hvert trinn exRNA rensing og sekvenser.

Introduction

Ekstracellulære og sirkulerer RNAs (exRNAs) er i diverse kroppsvæsker og er motstandsdyktig mot RNases1,2. Deres høy overflod, stabilitet og brukervennlighet tilgjengelighet er attraktive for klinisk vurdering som diagnostiske og prognostiske markører3. Transportmiddelet for exRNAs inkluderer ekstracellulære blemmer (EVs), tilknytning lipoproteiner (for eksempel high-density lipoprotein; HDL) og ribonucleoprotein komplekser (som med Argonaute2 komplekser)4.

Et delsett av exRNAs er microRNAs (miRNAs), som er små ikke-koding RNAs av ca 22 nt som regulerer posttranscriptional genuttrykk. Ex-miRNAs har vært innblandet i celle-celle kommunikasjon og regulering av cellen homeostase5. For eksempel HDL leverer ex-miR-223 til endotelceller å undertrykke intercellulær adhesjon molekyl 1 (ICAM-1) og betennelse6. Interessant, er miR-223 også sett transporteres av ekstracellulære blemmer fra leukocytter til lungekreft cellene, programmering dem til å ta på en mer invasiv fenotypen7. Dermed vil transcriptome av ex-miRNAs fra ulike kroppsvæsker og celle kultur medium forbedre vår forståelse av ex-miRNA signalering.

Liten RNA sekvensering (liten RNA seq) er et kraftig verktøy som kan brukes til å forstå transcriptomics av små RNAs. Ikke bare kan forskjellige prøver sammenlignes blant ulikt uttrykt kjent RNAs, men romanen små RNAs kan også oppdages og preget. Derfor er det også en robust metode å identifisere ulikt uttrykt miRNAs under ulike forhold. En av hindrene av små RNA seq er imidlertid vanskeligheten i å generere små RNA seq biblioteker fra lav exRNA input væsker som cerebrospinal væsker, spytt, urin, melk, serum og kultur medier. TruSeq liten RNA biblioteket Prep protokollen fra Illumina krever ca 1 µg av høy kvalitet totalt og NEBNext liten RNA biblioteket Prep angi protokollen fra New England Biolabs krever 100 ng-1 µg RNA8,9. Ofte, totalt RNA fra disse prøvene er under gjenkjenning grensen for konvensjonelle UV-vis Spektrofotometrene.

Ex-miRNAs fra kroppsvæsker er potensielt gode diagnostiske og prognostiske markører. Men for å studere funksjonelle effektene eller fastslå opprinnelsen til bestemte ex-miRNAs, celle kultur systemer blir ofte brukt i stedet. Stamceller (MSCs) har blitt studert grundig fordi deres EVs har vært innblandet i lindre mange sykdommer, inkludert hjerteinfarkt, Alzheimers sykdom og graft versus host sykdom10. Her viser vi rensing av ex-miRNAs fra Ben margtransplantasjon-avledet MSCs (BMSCs) og fremgangsmåten brukes til å optimalisere liten RNA biblioteket konstruksjon, sekvensering og dataanalyse (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Mesenchymal stamceller oppblomstringen medium (MSC media) er forberedt på forhånd som angitt i Tabellen for materiale.

1. celle kultur

Merk: Menneskelige stamceller kan fås fra benmargen, fettvev eller andre kilder11. Alternativt kan hMSCs kjøpes gjennom en leverandør. BMSCs brukes i denne protokollen var avledet fra benmargen av pasienter og kjøpt fra et selskap.

  1. Tine 1 x 106 BMSCs i en T175 kolbe som inneholder 20 mL av MSC media. Inkuber cellene på 37 ° C med 5% CO2 og erstatte media hver 2-3 dager inntil 80% confluency.
  2. Vask cellene med 5 mL 1 x PBS og forkaste PBS.
  3. Koble cellene ved å legge til 5 mL 0,05% Trypsin-EDTA og rugende celler for 5 min på 37 ° C. Trykk sidene av kolbe å lette avdeling.
  4. Legge til 15 mL av MSC media å deaktivere trypsin, koble cellene fra overflaten og pipette opp og ned for å få enkeltcelle suspensjoner.
  5. Samle cellene i en 50 mL rør og spinn ned for 5 min på 300 x g til pellets cellene.
  6. Resuspend cellene i 1 mL av MSC media og telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
    Merk: Primære human benmarg MSCs på 80% confluency i en T175 bolle er rundt 2 x 106 celler.
  7. Platen hMSCs 2000 celler/cm2 i frisk MSC medier i 5 T175 flasker. Vokse cellene på 37 ° C med 5% CO2 og erstatte media hver 2-3 dager til 5 flasker av 90% confluent T175 flasker er oppnådd.

2. EVs og RNA-assosiert biomolecules samling

Merk: EV samling media er forberedt på forhånd (Dulbeccos endret Eagle's Medium [DMEM] med 10% fosterets bovin serum [FBS] og 1% penicillin/streptomycin [P/S]). EV samling media er vanlig MSC media, men tilberedt med kommersielle EV-utarmet FBS (Tabell for materiale). Dette er å unngå bovin exRNA forurensning fra FBS, som vanligvis inneholder exRNAs tilknyttet EVs, ribonucleoproteins og lipoproteiner. For små RNA biblioteket forberedelse må exRNAs avledet fra 5 confluent flasker av MSCs aktivere biblioteket konstruksjon.

  1. Vask cellene 3 x med 20 mL PBS per T175 kolbe. Legg til 20 mL EV samling media per confluent T175 kolbe av MSCs og ruge på 37 ° C med 5% CO2 for 48 timer.
  2. Samle media og sentrifuge media for 10 min på 300 x g og 4 ° C.
  3. Samle nedbryting og sentrifuge media for 20 min 2000 x g og 4 ° C.
  4. Samle nedbryting og sentrifuge media for 30 min 15 500 x g og 4 ° C. Deretter samle nedbryting.
  5. Overføre media til ultracentrifuge rør og pellets exRNAs for 90 min på 100.000 x g og 4 ° C. En fast vinkel rotor brukes her og pellet er forankret ved siden av røret. Merk siden av lokket og tegne en sirkel på siden av røret der pellet er forventet.
  6. Fjerne nedbryting, tørr innsiden av røret ved å snu røret på absorberende papir og bruke små biter av tørkepapir for å fjerne væsken inni røret uten å berøre bunnen av røret. Resuspend pellet i 200 μL av PBS av vortexing for 30 s og pipettering opp og ned 20 x.
  7. Vurdere EVs og biomolecules med hydrogenion sporing analyse (NTA) (figur 2).
    Merk: Den EVs og biomolecules kan vurderes med hydrogenion sporing analyse (NTA), dynamiske lysspredning (DLS) eller overføring elektronmikroskop (TEM)12.
  8. Lagre EVs og biomolecules ved-80 ° C før videre nedstrøms eksperimenter.
    Merk: Hvis EVs skal brukes for funksjonell studier, 20% glyserol må legges for å beskytte dem mot rupturing. Cellene kan samles ved hjelp av standard prosedyrer om nødvendig.

3. EVs og RNA-assosiert biomolecules samling av differensierte celler

Merk: EVs og RNA tilknyttede biomolecules kan også hentes fra celle kultur media mens cellene gjennomgår differensiering. Eksemplet avbildet i protokollen beskriver osteoblastic differensiering og exRNA samling på dag 0 og 7 av differensiering. Hvis ingen differensiering, deretter hoppe del 3 og gå til seksjon 4.

  1. Forberede osteoblastic differensiering medier (DMEM med 10% FBS, 1% P/S 10 mM β-glycerophosphate, 10 nM deksametason, 50 μM ascorbate-2-fosfat og 10 mM 1.25-vitamin-D3) fersk hver gang.
  2. Når MSCs er 80% confluent, endre MSC media osteoblastic differensiering Media.
  3. Fylle osteoblastic differensiering media etter 2-3 dager.
  4. På dag 5 av differensiering, fjerne media og vask cellene 3 x med 20 mL PBS per T175 kolbe.
  5. Legge til 20 mL EV samling mediet som inneholder 10 mM β-glycerophosphate, 10 nM deksametason, 50 μM ascorbate-2-fosfat og 10 mM 1.25-vitamin-D3 per confluent T175 kolbe av MSCs. Incubate cellene på 37 ° C med 5% CO2 for 48 timer å sikre fortsatt differensiering mens samle EVs og biomolecules.
  6. Samle media på dag 7 og fortsette å isolere EVs og biomolecules som beskrevet i trinnene 2.2-2.6.
  7. For kvalitetskontroll, frø celler i 96-wells eller 6-brønner for å vurdere differensiering bruke alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet analysen eller kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR), henholdsvis.
    Merk: Figur 3 er et eksempel viser osteogenic differensiering cellene.

4. RNA utvinning og kvalitetskontroll

  1. Tine prøver fra trinn 2.8 på is. Ekstra RNA bruker en RNA isolering kit (Tabell for materiale).
  2. Elute RNA-kolonnen i RNA isolering kit (Tabell for materiale) i 100 μL RNase-fritt vann.
  3. Konsentrere RNA gjennom etanol nedbør ved å legge til 1 μL glykogen, 10 μL 2 M pH 5,5 natrium acetate og 250 μL pre kjølt 99% etanol i 100 μL av renset.
  4. Inkuber samples ved 20 ° C over natten til å fremkalle RNA. Pellets RNA av sentrifugering etter 20 min på 16.000 x g og 4 ° C.
    NOTE Pellet er hvit på grunn av co nedbør med glykogen.
  5. Fjerne nedbryting og vask RNA pellets med 1 mL av 75% etanol. Pellets RNA igjen for 5 min på 16.000 x g og 4 ° C.
  6. Fjern etanol og la lokket av RNA røret åpen for 5-10 min å luften tørr RNA-pellets. Resuspend RNA pellet i 7 μL RNase-fritt vann.
  7. Kontroller RNA kvalitet og konsentrasjon bruker en chip-baserte kapillært geleelektroforese maskin for å oppdage RNA i henhold til produsentens protokollen før biblioteket konstruksjon.
    Merk: En representant størrelsesDistribusjon av den er vist i Figur 4.
  8. Ekstra mobilnettet RNA bruker en kommersiell rensing kit (Tabell for materiale) om nødvendig.

5. biblioteket konstruksjon og kvalitetskontroll

Merk: Liten RNA biblioteker er konstruert med kommersielle kits (Tabell for materiale) justeringer på grunn av den lave RNA inngang. Biblioteket konstruksjon utføres på kjølt blokken.

  1. Chill oppvarming blokk for 0,2 mL PCR rør på is og Pipetter 5 μL RNA fra trinn 4.6 inn 0,2 mL RNase gratis PCR rørene på kjølt blokk.
  2. Fortynne 3 adaptere (1:10) i RNase-fritt vann i et 0,2 mL RNase gratis PCR rør. Legg 0,5 μL utvannet adapter og bland med 5 μL RNA av pipettering opp og ned 8 x og sentrifuger kort for å samle alle flytende nederst på røret.
  3. Inkuber RNA og 3 adapter blandingen på 70 ° C i 2 minutter i en forvarmet termisk cycler og plasser prøven på kjølt blokken.
  4. Legge til 1 μL ligation buffer og 0,5 μL RNase hemmer 0,5 μL T4 RNA ligase (sletting mutant) i RNA og 3 adapter blandingen. Blande av pipettering opp og ned 8 x og sentrifuge kort.
  5. Inkuber røret på 28 ° C i 1 time i forvarmet termisk cycler.
  6. Legg 0,5 μL stopp løsning til eksempel røret med røret i termisk cycler, blande av pipettering opp og ned 8 x og fortsette å ruge på 28 ° C i 15 min.
  7. Fortynne 5' adaptere (1:10) i RNase-fritt vann i et 0,2 mL RNase gratis PCR rør. Legg til 0,5 μL 5' adapter i en separat RNase-fri 0,2 mL PCR tube, varme 5' adapteren på 70 ° C i 2 minutter i forvarmet termisk cycler, og plasser prøven på kjølt blokken.
  8. Legge til 0,5 μL 10 nM ATP, 0,5 μL T4 RNA ligase til 5' adapter røret, blande av pipettering opp og ned 8 x og sentrifuge kort for å samle alle væsker i bunnen.
    Merk: Holde 5' adapteren på kjølt blokk som mulig.
  9. Legg 1,5 μL 5' adapter blandingen til prøven fra trinn 5.6, og bland svært forsiktig av pipettering 8 x sakte. Inkuber prøven på 28 ° C i 1 time i forvarmet termisk cycler.
  10. Fortynne RT primer 1:10 i RNase-fritt vann i en RNase-fri 0,2 mL PCR rør. Legg til 0,5 μL utvannet RT primer inn prøven fra trinn 5,9, blandingen svært forsiktig av pipettering opp og ned 8 x sakte og sentrifuge kort.
  11. Inkuber prøven på 70 ° C i 2 minutter i forvarmet termisk cycler og plasser prøven på kjølt blokk.
  12. Tilsett 1 μL av 5 x første strand buffer, 0,5 μL 12.5 mM dNTP blanding, 0,5 μL 100 mM dithiothreitol (DTT), 0,5 μL RNase hemmer og 0,5 μL revers transkriptase. Bland svært forsiktig av pipettering opp og ned 8 x sakte og sentrifuge kort.
  13. Inkuber prøven ved 50 ° C i 1 time i forvarmet termisk cycler å få cDNA.
  14. Legge til 4,25 μL ultrapure vann, 12.5 μL PCR mix, 1 μL indeks primer og 1 μL universell primer i cDNA. Blande av pipettering opp og ned 8 x og sentrifuge kort.
  15. Plasser prøven i en termisk cycler og sette opp cycler som følger: 98 ° C for 30 s; 15 sykluser av 98 ° C for 10 s, 60 ° C for 30 s og 72 ° C i 15 s; og avslutte gjennomgangssyklusen med 72 ° C i 10 min.
    Merk: Forberedt biblioteket kan lagres på 20 ° C i en uke.
  16. Rense RNA biblioteket ved å skille biblioteket på en DNA-gel og kutte gel (gel utvinning) mellom 140 bp og 160 bp og eluting biblioteket fra gel følger protokollen gitt av biblioteket construction kit.
    Merk: I denne studien forberedt biblioteket fra trinn 5.15 er lastet opp på en kommersiell gel (Tabell for materiale) og biblioteket mellom 140 bp og 160 bp er renset ut ved en automatisert DNA størrelse fractionator (Tabell for materiale) i henhold til den produsentens protokollen.
  17. Konsentrere seg og vask biblioteket fra trinn 5,16 bruker en kolonne-baserte PCR rensing kit (Tabell for materiale) og elute biblioteket i 10 μL RNase-fritt vann til slutt.
  18. Legg 1 μL renset biblioteket på en DNA chip (Table of Materials) til å kontrollere størrelsen på biblioteket etter produsentens protokoll.
  19. Fortynne 1 μL renset biblioteket (1:1000) i 10 mM pH 8.0 Tris-HCl med 0,05% polysorbat 20 og kvantifisere biblioteket av qPCR ved hjelp av en kommersiell biblioteket kvantifisering kit for å kvantifisere biblioteket konsentrasjonen ved DNA standarder i pakken.
  20. Bassenget like mengder av bibliotekene i henhold til kravene av sekvensering maskinen og rekkefølgen på en høy gjennomstrømming sekvensering system.
    Merk: Biblioteket byggingen av mobilnettet RNA kan gjøres ved hjelp av den samme kits etter standardprotokoll av kits.

6. bioinformatikk rørledning

Merk: Dette er en egen rørledning og programmene som brukes her er oppført i den tabellen of Materials.

  1. Trim vekk lav kvalitet leser og fjerne adapter sekvenser fra lese rådata.
  2. Tilordne den rene lest til ulike typer RNAs.
    1. Kommentere tRNAs ved at to uoverensstemmelser fordi kraftig modifisert tRNA sekvenser føre hyppige base misincorporation av revers transkriptase.
    2. Kommentere miRNAs ved tilordning til menneskelig miRNAs fra miRBase v21 tillater null uoverensstemmelser. Siden miRNAs kan A og U nontemplated 3 slutten tillegg, sekvenser som ikke tilordner er 3' trimmet av opptil tre A og/eller T nts som leser tilordnes til menneskelig miRNAs og andre miRNAs fra miRBase v21 tillater null uoverensstemmelser.
    3. Merknader til andre relevante liten RNAs (snRNA, snoRNA, piRNA og Y RNAs) ved en feil.
    4. Tilordne den gjenværende ikke er tilordnede lest til lang RNA datasett (rRNA, andre RNA fra Rfam og mRNA) for å vurdere degradering.
    5. Kommentere sekvenser til det menneskelige genomet.
    6. Kommentere sekvenser til bakteriell genomer.
    7. Normalisere miRNA uttrykk ved hjelp av følgende formel: miRNA teller / totalt teller av alle tilordnede miRNAs) x 106.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoden beskrevet i denne protokollen er optimalisert for å samle exRNA fra MSC kultur for neste generasjons sekvensering. Den generelle ordningen med arbeidsflyten er i figur 1 til venstre og de respektive kvalitetskontroll sjekkpunktene er til høyre.

Morfologi av cellene ved samling for udifferensierte (figur 3A) og differensiert (figur 3B) cellene vises. Videre vises representant normalisert aktivitetsnivåer ALP celleområde indusert i 7 dager også (Figur 3 c). Her, er ALP aktivitet ca 2,5 ganger uninduced cellene.

Tre T175 flasker av confluent MSCs gir 2-5 x 1010 partikler/mL (figur 2). Gjennomsnittlig partikkelstørrelse er ca 160-165 nm mens de fleste av partiklene er 130-140 nm. Det var noen mindre topper mellom 200 og 500 nm, som indikerer store komplekser eller store mengder.

Siden RNA kan reduseres raskt, følge strengt vilkårene for RNA utvinning som kit eller protokollen som brukes. Bruke RNase-fri betingelser, spesielt RNase-gratis vann å resuspend RNA og holde RNA på is når mulig. Etter ekstraksjon, kan RNA kvantifiseres bruker en chip-baserte kapillært geleelektroforese maskin. Representant electropherograms av RNA etter blir analysert er vist i Figur 4. Electropherogram av exRNAs inkluderer et bredt utvalg av RNAs (figur 4A). I kontrast, mobilnettet RNA har svært forskjellige topper på rundt 70-120, 1800 og 3800 nt, som tilsvarer tRNA/5S rRNA / 5.8S rRNA og 18S rRNA 28S rRNA, henholdsvis (figur 4B). RNA integritet nummeret (RIN) representerer kvaliteten av den. En god RIN av mobilnettet er > 8 (som angir nesten ingen RNA degradering). Algoritmen som RIN baseres er forholdet mellom 28S og 18 år. Dette betyr at RIN ikke er en god indikator på RNA kvaliteten på exRNAs fordi full lengde rRNAs ikke er vanligvis i exRNAs.

Etter RNA utvinning, miRNA bibliotekene ble konstruert og cDNA bibliotekene var atskilt med gel geleelektroforese. Den adapter-samskrevet cDNA av miRNAs er vanligvis mellom 140 og 160 nt. Kvaliteten på biblioteket ble deretter visualisert på en chip-baserte kapillært geleelektroforese maskin (figur 5). Figur 5A og 5B figur er bibliotekene fra det cellular RNA i dag 0 og dag 7, henholdsvis. Figur 5C og figur 5 d er exRNA bibliotekene på dag 0 og dag 7 henholdsvis. Alle fire prøver hadde topper rundt 140 nt, som indikerer vellykket miRNA biblioteket konstruksjon. Hvor mye cDNA i bibliotekene ble kvantifisert ved qPCR med et bibliotek kvantifisering kit. Kvantifisering syklusen (Cq) av standardene ble plottet mot loggen over konsentrasjon for å få en standard kurve (figur 6). Ligningen for standardkurven var så pleide Beregn konsentrasjonen bibliotekene (tabell 1). I vårt eksempel var konsentrasjonen av bibliotekene fra exRNAs 5-8 nM, som var betydelig lavere enn biblioteker fra mobilnettet RNAs (8-30 nM). Bibliotekene ble deretter delt med samme beløp og sendt for sekvensering.

Etter bibliotekene ble sekvensert, lav kvalitet leser var trimmet bort med FASTX-Toolkit og resulterende kvaliteten på biblioteket exRNAs var høy og sammenlignes med bibliotekene fra cellene (figur 7AB). Sekvenslengden av bibliotekene fra cellene hadde en enkelt topp på rundt 22 nt (figur 7C), som korrelerer med miRNAs. Derimot bibliotekene fra exRNAs ble stadig mer uensartet og inneholdt 3 store topper: 22 nt, 30 nt og 33 nt (figur 7 d). Lik sine mobilnettet kolleger, en topp på 22 nt er miRNAs. Nærmere inspeksjon avdekket at toppene på 30 og 33 nt tRNAs halvdeler/fragmenter eller piRNAs. Merknadene i tilordnede lyder ble deretter plottet. De fleste av lest (65,1%) fra mobilnettet RNA tilordnet menneskelig miRNAs og hver av de andre små RNAs sto for en liten del av den tilordnede lest (figur 8A). Contrastingly, bare 8% av exRNAs tilordnet menneskelig miRNAs (figur 8B). De mest tallrike små RNA som lest tilordnet var tRNAs. De fleste i lyder var "enestående leser" (43%). Videre undersøkelse av den enestående lest fra exRNAs til globale databaser førte til overraskende funn som de fleste av dem svarer til bakteriell sekvenser (74% og 85% for D0 og D7 exRNA, henholdsvis; Tabell 2). Derimot bare 0,9% av mobilnettet RNA var uovertruffen, og av disse, bare 10% tilordnet bakterier. En sammenligning til storfe genomet viste mindre enn 1% med antyder at FBS ikke var en kilde til forurensing (tabell 2). Derfor viser exRNAs en atypisk profil i forhold til normal mobilnettet RNA.

Figure 1
Figur 1: arbeidsflyten av exRNA sekvensering og analyse. Hele arbeidsflyten er avbildet til venstre i grå boksene og kvalitetskontroll knyttet til hvert trinn i de røde boksene til høyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: størrelse distribusjon av partikler utskilles av cellene på dag 0 og dag 7 av differensiering. Representant NTA resultatene av partikler samlet fra 3 x T175 flasker på (A) dag 0 og (B) dag 7 av differensiering. De respektive gjennomsnitt og modus str samt konsentrasjonen av partikler er ordnet under grafene. SD: standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: celle morfologi og osteogenic differensiering før ekstracellulære RNA samling. (A) mikroskop-bilde av udifferensierte BMSCs kultivert med samling media ved samling. (B) mikroskop-bilde av BMSCs ut i 7 dager med samling media ved samling. Skalere barer = 100 µm. (C) ALP aktiviteter av cellene var normalisert til deres respektive celle viabilities. Verdiene som tegnes inn var at tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representant electropherogram RNA integritet etter RNA ekstraksjon. RNA analyser av ekstracellulære RNA (A) og mobilnettet RNA (B). X-aksen er RNA (nt) og y-aksen er fluorescensen. Den første toppen er stigen på 25 nt. Ribosomal RNAs vises som 18S (1800 nt) og 28S (3800 nt). RNA integritet tall (RIN) er en indikator på RNA kvalitet basert på 18S og 28S ribosomal RNA integritet. Høyere RIN tall lik bedre kvalitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representant electropherogram cDNA biblioteker etter biblioteket. DNA analyser av bibliotekene fra (A) celler i dag 0, (B) celler på dag 7, (C) ekstracellulære RNA fra dag 0 og (D) ekstracellulære RNA dag 7. Grønn og lilla er stiger på 35 nt og 10,380 nt, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: cDNA bibliotek kvantifisering og beregning. Biblioteker ble utvannet mellom 500 - 1000 ganger for de fra exRNA og mellom 1000 og 4000 ganger for cellen RNA. Bibliotekene ble kjørt sammen med standarder fra biblioteket kvantifisering kit. Cq gjennomsnittsverdiene av DNA var plottet mot Logg10 konsentrasjonen (pM) til å generere en standardkurve, en ligning for standardkurven og en R2 verdi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: kvalitetspoeng og lengde distribusjon av sekvenser. Lav kvalitet leser og adapter sekvenser var trimmet med FASTX-Toolkit for (A) celler og (B) exRNAs. Lengde fordelingen av ren leser for (C) celler og (D) exRNAs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: merknad av små RNAs etter sekvensering. Merknader representerer prosenter av ren for (A) celler og (B) exRNAs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Eksempel Fortynningsfaktoren Cq verdi log(pM) Konsentrasjon (pM) Konsentrasjon betyr (pM) Konsentrasjon betyr * (452/143) Multiplisere med kamuflering faktor (pM)
BMSC D0 exRNA 500 7,72 0.702 5.036 5.276 16.678 8338.993
BMSC D0 exRNA 500 7.57 0.754 5.677
BMSC D0 exRNA 500 7.7 0.709 5.117
BMSC D0 exRNA 1000 8,64 0.383 2.416 2.365 7.477 7476.846
BMSC D0 exRNA 1000 8.68 0.369 2.340
BMSC D0 exRNA 1000 8.68 0.369 2.340
BMSC D7 exRNA 500 8,52 0.425 2.659 3.221 10.182 5090.913
BMSC D7 exRNA 500 8.42 0.459 2.880
BMSC D7 exRNA 500 7.97 0.615 4,125
BMSC D7 exRNA 1000 8.87 0.303 2.011 1.933 6.110 6110.391
BMSC D7 exRNA 1000 8,92-tommer 0.286 1.932
BMSC D7 exRNA 1000 8.97 0.269 1.857
BMSC D0 celle 1000 6.86 1.000 10,005 9.810 31.007 31006.974
BMSC D0 celle 1000 6.91 0.983 9.614
BMSC D0 celle 4000 8.68 0.369 2.340 2.398 7.581 30322.041
BMSC D0 celle 4000 8.59 0.400 2.514
BMSC D0 celle 4000 8.68 0.369 2.340
BMSC D7 celle 1000 8,44 0.452 2.834 2.880 9.104 9104.439
BMSC D7 celle 1000 8,43 0.456 2.857
BMSC D7 celle 1000 8.39 0.470 2.950
BMSC D7 celle 4000 10.36 -0.213 0.612 0.702 2.218 8872.689
BMSC D7 celle 4000 10.27 -0.182 0.658
BMSC D7 celle 4000 9.97 -0.078 0.836
Beregninger:
log(pM) =-0.3467 x (eksempel Cq verdi) + 3.3786; Bruk av standardkurve og formel
konsentrasjon (pM) = 10^log(pM)
Størrelse justering beregning = størrelse av DNA standard (452 bp) delt på gjennomsnittlig fragment lengden (143 bp)

Tabell 1: miRNA biblioteket kvantifisering.

Eksempel: # leser ikke tilordne menneskelige # leser tilordning til bakterier % bakteriell leser # leser tilordning til ku % bovin leser
BMSC D0 celle 131007 9858 8% 99 0,08%
BMSC D7 celle 169730 7935 5% 188 0,11%
BMSC D0 exRNA 6122833 4551477 74% 891 0,01%
BMSC D7 exRNA 7046691 5970086 85% 771 0,01%

Tabell 2: Prosentandelen av uovertruffen leser at kartet til bakterier og storfe leser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en protokoll for neste generasjons sekvensering av exRNAs som muliggjør differensial uttrykk analyser fra lav input prøver. Følge en bestemt protokoll for EV og exRNA isolasjon er viktig fordi selv små endringer (dvs. ultracentrifugation trinnet eller en endring i rotoren type) kan påvirke transcriptome og miRNA nivå13,14. Dermed uansett hvor exRNA er isolert, er det viktig å bruke samme eksperimentelle og bioinformatic fremgangsmåte på alle prøvene i et eksperiment for å kunne sammenligne resultatene.

RNA integritet vurderes vanligvis på bioanalyzer. Siden exRNAs er blottet for full lengde rRNA, RIN verdien er svært lav, men dette nødvendigvis ikke dårlig kvalitet RNA prøver. I tillegg RNA konsentrasjonen av exRNAs varierte sterkt og er ofte unøyaktig. Derfor, i stedet for å vurdere RNA kvalitet og kvantifisere RNA på bioanalyzer, bruke samme volum medier hver gang for videre behandling. Også resuspend den utpakkede RNA i samme volum rørets bufferen og bruke samme volum for biblioteket konstruksjon.

Liten RNA biblioteket byggingen var optimalisert ved å redusere mengden av adaptere til en tidel av standard protokoll og bruke halvparten av andre reagenser. Redusere adaptere ikke bare hindrer adapter dimers, det forhindrer også intramolekylære RNA circularization15. Reduksjonen i reagenser er optimalisert for Illumina TruSeq liten RNA eksempel Prep Kit. Andre kits benyttes, anbefales også lavere adapter og reagenser Følgelig, hvis ikke settet angir at det er skreddersydd til lav input prøver. Til slutt, PCR syklus for biblioteket bygging ble økt fra 12 til 15 sykluser i denne protokollen rede for den lav konsentrasjonen av exRNAs. Vi har funnet dette å være den optimale justeringen uten å se forsterkning biases15.

Ulike kvalitetskontroll beregninger kan vurderes inkludert base kvalitetspoeng og lese lengde profil. Når du gjør bioinformatikk analyser, base kvaliteten på leser i mobilnettet RNA og exRNAs var like; men var lengden distribusjon og kommenterte opprinnelsen til sekvenser helt annerledes. De fleste av leseoperasjoner fra mobilnettet RNA tilordnet menneskelige miRNAs, men en stor andel av de exRNA var uovertruffen leser. Ved nærmere ettersyn leser den uovertruffen lest viste seg for å være bakteriell (tabell 2). Dette var overraskende fordi antibiotika ble rutinemessig brukes i vår kultur. Våre resultat justerer godt med andre rapporter som viste også stor andel av uovertruffen når sekvensering cellekultur avledet exRNA16. En av årsakene til disse forurensningene er at bakterier overlapper i størrelse med ekstracellulære komplekser eller EVs, og dermed co rense under de ultracentrifugation trinn17. Tidligere publikasjoner har identifisert utbredt smitte av visse bakterier i kultur medier som forblir usett under normal celle laboratorium prosedyrer18. Hittil dette problemet i stor grad ble ignorert men bør tas i betraktning når rensende og analysere exRNAs.

Denne protokollen detaljer en komplett guide til høsting exRNAs fra kultur medier, optimalisere liten RNA biblioteket forberedelse og rå biblioteket dataene behandles. Denne protokollen fremhever spesielt forskjellige kvalitetskontroll sjekkpunkter gjennom prosessen for å demonstrere hvor lav input prøver (som exRNAs) kan avvike fra vanlig eksempel forberedelser slik at andre som arbeider med lav input prøver vet hva du skal Forvent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til Mr. Claus buss og Ms. Rita Rosendahl på iNANO for deres kundestøtte. Spesiell takk til Dr. Daniel Otzen for at vår hyppig bruk av hans ultracentrifuge. Denne studien ble støttet av Innovation fondet Danmark (MØNSTRE prosjekt).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells ATCC PCS-500-012 Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit Lonza PT-3001 Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS Gibco A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA Gibco 25200056
T175 Flask Sarstedt 833,912
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline Sigma 806552
Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly Beckman Coulter 355618
Beckman Coulter Type 60 Ti Rotor used here
NucleoCounter Chemometec NC-3000 Cell Counter
β-glycerophosphate Calbiochem 35675 Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone Sigma D4902-25MG Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma D1530-1MG Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1514 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits Roche KK4824 Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) Illumina RS-200-0012 Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep Sage Science Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit Cold Spring Harbor Lab Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt Adaptor removal in step 6
Bowtie Mapping of clean reads in step 6
Samtools To make the expression profile in step 6
Bedtools To make the expression profile in step 6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
  2. Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
  3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
  4. Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
  5. Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
  6. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
  7. Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
  8. Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
  9. NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
  10. Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
  11. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
  12. Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  13. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
  14. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  15. Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
  16. Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
  17. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  18. Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).

Tags

Genetikk problemet 145 mesenchymal stamceller ekstracellulære RNAs exosomes ekstracellulære blemmer ribonucleproteins microRNAs små RNAs neste generasjons sekvensering liten RNA biblioteket konstruksjon
Isolere, sekvensering og analysere ekstracellulære MicroRNAs fra menneskelige stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. … More

Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. T., Mothershead, C. R., Su, J., Kjems, J. Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e58655, doi:10.3791/58655 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter