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Genetics

Isolando, sequenciamento e análise MicroRNAs extracelular das células-tronco mesenquimais humanas

Published: March 8, 2019 doi: 10.3791/58655
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Interdisciplinary Nanoscience Centre, Aarhus University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo demonstra como purificar microRNAs extracelular de meios de cultura celular para construção de biblioteca pequena do RNA e a próxima geração de sequenciamento. Vários pontos de verificação de controle de qualidade são descritos para permitir que os leitores a entender o que esperar quando se trabalha com amostras de entrada baixas como exRNAs.

Abstract

RNAs extracelulares e circulantes (exRNA) são produzidas por muitos tipos de células do corpo e existem em vários fluidos corporais como saliva, plasma, soro, leite e urina. Um subconjunto destes RNAs são os reguladores posttranscriptional – microRNAs (miRNAs). Para delinear os miRNAs produzidos por tipos de células específicas, sistemas de cultura in vitro podem ser usados para colher e perfil exRNAs derivado de um subconjunto de células. Os fatores secretados de células-tronco mesenquimais estão implicados em aliviar a inúmeras doenças e é usado como o sistema de modelo in vitro. Este artigo descreve o processo de coleta, purificação do RNA pequeno e geração de biblioteca para sequência de miRNAs extracelular. ExRNAs de meios de cultura diferem de RNA celular por serem amostras de entrada baixas de RNA, que exige procedimentos otimizados. Este protocolo fornece um guia completo para sequenciamento de pequenas exRNA de meios de cultura, mostrando pontos de verificação de controle de qualidade em cada etapa durante o sequenciamento e purificação de exRNA.

Introduction

Extracelular e circulando RNAs (exRNAs) estão presentes em vários fluidos corporais e são resistentes no sentido de RNases1,2. Sua abundância elevada, a estabilidade e a facilidade de acessibilidade são atraentes para avaliação clínica como marcadores de diagnóstico e prognóstico3. O modo de transporte para exRNAs incluir vesículas extracelulares (EVs), associação com lipoproteínas (tais como lipoproteína de alta densidade; HDL) e complexos ribonucleoprotein (tais como com complexos Argonaute2)4.

Um subconjunto de exRNAs são microRNAs (miRNAs), que são pequenos não-codificantes RNAs de cerca de 22 nt que regulam a expressão do gene posttranscriptional. Ex-miRNAs têm sido implicados na comunicação célula-célula e regulação da homeostase de células5. Por exemplo, o HDL entrega ex-miR-223 para células endoteliais para reprimir a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e inflamação6. Curiosamente, miR-223 é também visto transportadas por vesículas extracelulares de leucócitos de células de câncer de pulmão, a fazer uma mais invasivo de fenótipo7programação. Assim, a transcriptoma do ex-miRNAs de vários fluidos corporais e meio de cultura celular grandemente irá melhorar a nossa compreensão de ex-miRNA sinalização.

Pequeno RNA sequenciamento (pequeno RNA seq) é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para entender a transcriptomics de RNAs pequeno. Não só podem diferentes amostras ser comparadas entre RNAs conhecidos diferencialmente expressos, mas RNAs pequeno romance também pode ser detectado e caracterizado. Consequentemente, é também um método robusto para identificar os miRNAs diferencialmente expressos em condições diferentes. No entanto, um dos obstáculos do pequeno RNA seq é a dificuldade em gerar pequenas bibliotecas seq de RNA a partir de exRNA baixa entrada fluidos como fluidos cérebro-espinhal, saliva, urina, leite, soro e meios de cultura. O protocolo de TruSeq pequeno RNA biblioteca Prep de Illumina requer aproximadamente 1 µ g de RNA total de alta qualidade e o protocolo de NEBNext pequeno RNA biblioteca Prep conjunto de New England Biolabs requer 100 µ g de ng-1 de RNA8,9. Muitas vezes, o RNA total destas amostras estão abaixo do limite de deteção para convencionais espectrofotômetros UV-vis.

Ex-miRNAs derivados de fluidos corporais são potencialmente bons marcadores de diagnósticos e prognósticos. No entanto, a fim de estudar os efeitos funcionais ou para determinar a origem do ex-miRNAs específicos, sistemas de cultura de células são usados frequentemente em vez disso. Células-tronco mesenquimais (MSCs) têm sido estudadas extensivamente porque seus EVs têm sido implicados em aliviar muitas doenças, incluindo infarto do miocárdio, a doença de Alzheimer e doença do enxerto contra hospedeiro10. Aqui, demonstramos a purificação do ex-miRNAs de medula óssea-derivado MSCs (BMSCs) e as etapas específicas usadas para otimizar a construção de biblioteca pequena do RNA, sequenciamento e análise de dados (Figura 1).

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Protocol

Nota: O meio de crescimento de células-tronco mesenquimais (mídia MSC) é preparado antecipadamente conforme indicado na Tabela de materiais.

1. cultura de pilha

Nota: Células-tronco mesenquimais humanas podem ser obtidas da medula óssea, tecido adiposo ou outras fontes de11. Alternativamente, hMSCs podem ser comprados através de um fornecedor. Os BMSCs usados no presente protocolo foram derivadas da medula óssea de pacientes e comprei de uma empresa.

  1. Descongele 1 x 106 BMSCs para um balão de T175 contendo 20 mL de mídia MSC. Incubar a 37 ° C com 5% CO2 células e substituir os meios de comunicação a cada 2-3 dias até a confluência de 80%.
  2. Lavar as células com 5 mL de 1X PBS e descartar a PBS.
  3. Separar as células pela adição de 5 mL de 0.05% Trypsin-EDTA e incubar as células por 5 min a 37 ° C. Bata nos lados do balão para facilitar o desprendimento.
  4. Adicione 15 mL de mídia MSC para inactivar a tripsina, separar as células da superfície e pipeta de cima e para baixo para obter suspensões celulares simples.
  5. Colete as células em um tubo de 50 mL e spin-down por 5 min a 300 x g para as células de Pelotas.
  6. Ressuspender as células em 1 mL de mídia MSC e contar as células usando um hemocytometer.
    Nota: Primária humano da medula óssea MSCs na confluência de 80% em um balão de T175 é em torno de 2 x 106 células.
  7. Placa hMSCs em 2.000 células/cm2 na mídia MSC fresca em 5 frascos T175. Crescem as células a 37 ° C com 5% de CO2 e substituir os meios de comunicação a cada 2-3 dias até 5 frascos de 90% confluentes T175 frascos são obtidos.

2. EVs e coleção de biomoléculas RNA-associados

Nota: Mídia de coleção EV é preparada previamente (médio modificado águia de Dulbecco [DMEM] com 10% de soro fetal bovino [FBS] e 1% penicilina/estreptomicina [P/S]). EV coleção mídia é mídia normal do MSC, mas preparado com comercial FBS empobrecido EV (Tabela de materiais). Isso é para evitar a contaminação de exRNA bovina de FBS, que normalmente contém exRNAs associado com EVs, ribonucleoproteínas e lipoproteínas. Para preparação de biblioteca pequena do RNA, exRNAs derivados 5 frascos confluentes do MSCs são necessários para permitir a construção da biblioteca.

  1. Lavar as células 3 x com 20 mL de PBS por T175 balão. Adicionar 20 mL de mídia de coleção EV por confluentes T175 balão de MSCs e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 48 h.
  2. Recolher os meios de comunicação e centrifugar a mídia por 10 min a 300 x g e 4 ° C.
  3. Recolher o sobrenadante e centrifugar a mídia por 20 min a 2.000 x g e 4 ° C.
  4. Recolher o sobrenadante e centrifugar a mídia por 30 min a 15.500 x g e 4 ° C. Em seguida, recolha o sobrenadante.
  5. Transferir a mídia para tubos se e pelota a exRNAs para 90 min em 100.000 x g e 4 ° C. Um rotor de ângulo fixo é usado aqui e a pelota é ancorada ao lado do tubo. Marcar o lado da tampa e desenhar um círculo na lateral do tubo onde a pelota é esperada.
  6. Remover o sobrenadante, seque o interior do tubo por inversão do tubo com um papel absorvente e use pequenos pedaços de papel absorvente para remover o líquido dentro do tubo sem tocar no fundo do tubo. Resuspenda o pellet em 200 µ l de PBS vortexing por 30 s e pipetagem e descer 20 x.
  7. Avalie a EVs e biomoléculas com nanopartículas acompanhamento análise (NTA) (Figura 2).
    Nota: O EVs e biomoléculas podem ser avaliadas com nanopartículas acompanhamento análise (NTA), difusão dinâmica da luz (DLS) ou transmissão de microscopia eletrônica (TEM)12.
  8. Armazene o EVs e biomoléculas a-80 ° C até mais experimentos a jusante.
    Nota: Se EVs vão ser utilizados para estudos funcionais, glicerol 20% deve ser adicionado para protegê-los de ruptura. As células podem ser coletadas usando procedimentos padrão, se necessário.

3. EVs e coleção de biomoléculas associada a RNA de células diferenciadas

Nota: EVs e RNA associado biomoléculas também podem ser coletadas dos meios de cultura de células, enquanto as células sofrem diferenciação. O exemplo descrito no protocolo descreve diferenciação osteoblástica e a coleção de exRNA no dia 0 e 7 de diferenciação. Se nenhuma diferenciação é necessária, Então pule 3 seção e vá para a seção 4.

  1. Preparar a mídia de diferenciação osteoblástica (DMEM com 10% FBS, 1% P/S, β-glicerofosfato de 10 mM, 10 dexametasona nM, 50 μM ascorbato-2-fosfato e 10mm 1.25-vitamina-D3) fresco toda vez.
  2. Uma vez MSCs são 80% de confluencia, alterar a mídia MSC para mídia de diferenciação osteoblástica.
  3. Repor os meios de comunicação de diferenciação osteoblástica após 2-3 dias.
  4. No dia 5 de diferenciação, remova a mídia e lavar as células 3 x com 20 mL de PBS por T175 balão.
  5. Adicionar 20 mL de EV coleção mídia contendo β-glicerofosfato de 10 mM, 10 nM dexametasona, 50 μM ascorbato-2-fosfato e 10mm 1.25-vitamina-D3 por confluentes T175 balão de MSCs. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO2 por 48 h garantir a continuação diferenciação, recolhendo o EVs e biomoléculas.
  6. Coletar a mídia no dia 7 e siga para isolar o EVs e biomoléculas como descrito nos passos 2.2-2.6.
  7. Para controle de qualidade, sementes células em 96-poços ou 6-poços para avaliar a diferenciação usando um ensaio de atividade da fosfatase alcalina (FAL ou ALP) ou com reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), respectivamente.
    Nota: A Figura 3 é um exemplo que mostra diferenciação osteogênica das células.

4. RNA extração e controle de qualidade

  1. Descongele as amostras da etapa 2.8 no gelo. Extraia o RNA usando um kit de isolamento de RNA (Tabela de materiais).
  2. Eluir o RNA da coluna fornecido no kit de isolamento de RNA (Tabela de materiais) em 100 μL de água livre de RNase.
  3. Concentre-se o RNA através da precipitação do álcool etílico, adicionando 1 μL de glicogênio, 10 μL de acetato de sódio 5.5 pH 2 M e 250 μL de pre-refrigerados 99% de etanol em 100 μL de RNA purificado.
  4. Incube as amostras a-20 º C durante a noite para precipitar o RNA. Pelota do RNA por centrifugação por 20 min em 16.000 x g e 4 ° C.
    Nota: A pelota é branca devido à co-precipitação com glicogênio.
  5. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento de RNA com 1 mL de etanol a 75%. Pelota do RNA novamente por 5 min à 16.000 x g e 4 ° C.
  6. Remover o etanol e deixe a tampa do tubo do RNA aberto por 5-10 min para o ar seco a pelota do RNA. Resuspenda o pellet de RNA em 7 μL de água livre de RNase.
  7. Verifique a qualidade do RNA e concentração usando uma máquina de chip baseada em eletroforese capilar para detectar o RNA de acordo com o protocolo do fabricante antes da construção da biblioteca.
    Nota: Uma distribuição de tamanho representativo do RNA é mostrada na Figura 4.
  8. Extraia o RNA celular usando um kit de purificação comercial (Tabela de materiais), se necessário.

5. Biblioteca construção e controle de qualidade

Nota: Bibliotecas de pequeno RNA são construídas usando jogos comerciais (Tabela de materiais) com ajustes devido o baixo RNA de entrada. Construção de biblioteca é realizada sobre o bloco refrigerado.

  1. Refrigere o bloco de aquecimento para tubos PCR 0,2 mL no gelo e adicionar 5 μL do RNA da etapa 4.6 em cadeia da polimerase 0,2 mL RNase-livre em um bloco de refrigerados.
  2. Dilua 3' adaptadores (01:10) em água livre de RNase em um tubo PCR de 0,2 mL RNase-livre. Adicionar 0,5 μL de adaptador diluído e misturar com 5 μL de RNA pipetando e descer 8 x e centrífuga brevemente para recolher todo o líquido na parte inferior do tubo.
  3. Incubar a mistura de adaptador de RNA e 3' a 70 ° C por 2 min em um termociclador pré-aquecido e em seguida, colocar a amostra volta no bloco refrigerado.
  4. Adicione 1 μL de tampão, ligadura, 0,5 μL de inibidor de RNase e 0,5 µ l de RNA T4 ligase do (mutante de exclusão) na mistura de adaptador de RNA e 3'. Misture por pipetagem e descer 8 x e centrifugar brevemente.
  5. Incube o tubo a 28 ° C, durante 1 h no termociclador pré-aquecido.
  6. Adicionar 0,5 μL de solução de paragem para o tubo de amostra com o tubo ficar no termociclador, misturar pipetando subindo e descendo a 8x e continuar a incubar a 28 ° C por 15 min.
  7. Dilua 5' adaptadores (01:10) em água livre de RNase em um tubo PCR de 0,2 mL RNase-livre. Adicionar 0,5 μL de 5' adaptador em um separado RNase-livre 0,2 mL PCR tubo, calor o adaptador de 5' a 70 ° C por 2 min no termociclador pré-aquecido e em seguida, coloque a amostra no bloco refrigerado.
  8. Adicionar 0,5 μL de 10 nM ATP, 0,5 μL de ligase do RNA T4 ao tubo adaptador de 5', misturar pipetando subindo e descendo a 8x e centrifugue brevemente para recolher os líquidos na parte inferior.
    Nota: Mantenha o adaptador 5' no bloco refrigerado tanto quanto possível.
  9. Adicionar 1,5 μL da mistura de adaptador de 5' para a amostra da etapa 5.6 e misture gentilmente por pipetagem 8x lentamente. Incube a amostra a 28 ° C, durante 1 h no termociclador pré-aquecido.
  10. Dilua RT cartilha 01:10 em água livre de RNase em um tubo PCR de 0,2 mL RNase-livre. Adicionar 0,5 μL de primer de RT diluído em amostra da etapa 5.9, misture suavemente pipetando subindo e descendo 8x lentamente e centrifugar brevemente.
  11. Incubar a amostra a 70 ° C por 2 min no termociclador pré-aquecido e em seguida, coloque a amostra em um bloco de refrigerados.
  12. Adicione 1 μL de 5x buffer de primeira vertente, 0,5 μL de mistura de 12,5 mM dNTP, 0,5 μL de 100mm ditiotreitol (DTT), 0,5 μL de inibidor de RNase e 0,5 μL de transcriptase reversa. Misture suavemente pipetando lentamente subindo e descendo a 8x e centrifugar brevemente.
  13. Incube a amostra a 50 ° C, durante 1 h no termociclador pré-aquecido para obter o cDNA.
  14. Adicione 4,25 μL de água ultrapura, 12,5 μL de mistura PCR, 1 μL de primer de índice e 1 μL de primer universal para o cDNA. Misture por pipetagem e descer 8 x e centrifugar brevemente.
  15. Colocar a amostra em um termociclador e configurar o reciclador da seguinte forma: 98 ° C por 30 s; 15 ciclos de 98 ° C por 10 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 15 s; e terminar o ciclo com 72 ° C por 10 min.
    Nota: A biblioteca preparada pode ser armazenada a-20 ° C, durante uma semana.
  16. Purificar a biblioteca de RNA separando a biblioteca em um gel de DNA e cortando o gel (gel de extração) entre 140 160 e bp bp e a biblioteca do gel seguindo o protocolo fornecido pelo kit de construção de biblioteca de eluição.
    Nota: Neste estudo, a biblioteca preparada da etapa 5.15 é carregada em um gel comercial (Tabela de materiais) e a biblioteca entre 140 160 e bp bp é purificado para fora por um automatizado fracionador de DNA tamanho (Tabela de materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.
  17. Concentre-se e lavar a biblioteca da etapa 5.16 usando um kit de purificação de PCR baseado em coluna (Tabela de materiais) e eluir a biblioteca em água livre de RNase a μL 10 finalmente.
  18. Carrega 1 μL da biblioteca purificada em uma microplaqueta de DNA (Tabela de materiais) para verificar o tamanho da biblioteca, seguindo o protocolo do fabricante.
  19. Diluir 1 μL da biblioteca purificada (1: 1000) em pH 10 mM 8.0 Tris-HCl com 0,05% polissorbato 20 e quantificar a biblioteca por qPCR usando um kit de quantificação de biblioteca comercial para quantificar a concentração de biblioteca usando os padrões de DNA no kit.
  20. Piscina quantidades iguais das bibliotecas de acordo com os requisitos da máquina de sequenciamento e sequência em um sistema de sequenciamento de alto rendimento.
    Nota: A construção da biblioteca de RNA celular pode ser feita usando os mesmos kits, seguindo o protocolo padrão dos kits.

6. Bioinformática do pipeline

Nota: Este é um encanamento interno e os programas usados aqui são listados no tabela de materiais.

  1. Aparar fora leituras de baixa qualidade e retire o cru lê sequências de adaptador.
  2. Mapear o lê limpo para diferentes tipos de RNAs.
    1. Anote os tRNAs, permitindo que as dois incompatibilidades porque as sequências de tRNA fortemente modificadas com misincorporation base frequente por transcriptase reversa.
    2. Anote os miRNAs pelo mapeamento de miRNAs humanos de miRBase v21 permitindo zero incompatibilidades. Desde que os miRNAs estão sujeitas A e U nontemplated 3' final adições, sequências que não são mapeadas são 3' Aparados da nts até três A e/ou T após o qual leituras são mapeadas para miRNAs humanos e outros miRNAs de miRBase v21 permitindo zero incompatibilidades.
    3. Anote a outro RNAs pequeno relevante (snRNA snoRNA, piRNA e Y RNAs), permitindo que uma incompatibilidade.
    4. Mapear o restante lê não mapeado ao longo do RNA datasets (rRNA, outro RNA de Rfam e mRNA) para avaliar a degradação.
    5. Anote as sequências para o genoma humano.
    6. Anote as sequências de genomas bacterianas.
    7. Normalizar a miRNA expressão usando a seguinte fórmula: miRNA conta / o total de contagens de todos os miRNAs mapeados) x 106.

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Representative Results

O método descrito neste protocolo é otimizado para coletar exRNA de cultura MSC para sequenciamento de próxima geração. O esquema geral de fluxo de trabalho está na Figura 1 , à esquerda e os pontos de verificação do respectivo controle de qualidade estão à direita.

A morfologia das células no dia da coleta para indiferenciado (Figura 3A) e diferenciados (Figura 3B) células são mostradas. Além disso, o representante normalizados níveis de atividade da ALP de células induzidas por 7 dias também são mostrados (Figura 3). Aqui, atividade da ALP é aproximadamente 2,5 vezes a das células uninduced.

Três frascos de T175 do MSCs confluentes rendem 2-5 x 1010 partículas/mL (Figura 2). Tamanho de partícula médio é aproximadamente 160-165 nm, enquanto a maioria das partículas são 130-140 nm. Havia alguns picos menores entre 200 e 500 nm, o que indicaria grandes complexos ou grandes agregados.

Desde que o RNA pode ser degradado rapidamente, aderir estritamente às condições de extração de RNA como pelo kit ou o protocolo usado. Usar condições RNase-livre, em particular RNase-livre água para Ressuspender o RNA e manter o RNA no gelo quando possível. Após a extração, o RNA pode ser quantificado utilizando uma máquina de chip baseada em eletroforese capilar. Electropherograms representante do RNA após sendo analisados são mostrados na Figura 4. A electroferograma de exRNAs inclui uma ampla gama de RNAs (Figura 4A). Em contraste, o RNA celular tem picos muito distintos a em torno de 70-120, 1800 e 3800 nt, que correspondem ao tRNA/5S rRNA / 5.8S rRNA 18S rRNA e rRNA 28S, respectivamente (Figura 4B). O número de integridade do RNA (RIN) representa a qualidade do RNA. É um bom RIN de RNA celular > 8 (não indicando quase nenhuma degradação de RNA). O algoritmo em que se baseia a RIN é a proporção entre 28S e 18S. Isto significa que a RIN não é um bom indicador da qualidade do RNA de exRNAs porque rRNAs completos geralmente não são detectáveis em exRNAs.

Após a extração do RNA, as bibliotecas de miRNA foram construídas e as bibliotecas de cDNA foram separadas por eletroforese em gel. O cDNA ligado-adaptador dos miRNAs é tipicamente entre 140 e 160 nt. A qualidade da biblioteca foi então visualizada em um computador baseado no chip de eletroforese capilar (Figura 5). Figura 5A e Figura 5B são as bibliotecas do RNA celular no dia 0 e dia 7, respectivamente. Figura 5 e Figura 5 são as bibliotecas de exRNA no dia 0 e dia 7, respectivamente. Todas as quatro amostras tinham picos em cerca de 140 nt, que indicam a construção de biblioteca de miRNA bem sucedida. A quantidade de cDNA nas bibliotecas foi quantificada por qPCR usando um kit de quantificação de biblioteca. O ciclo de quantificação (Cq) dos padrões foi plotado contra o log da concentração para obter uma curva padrão (Figura 6). A equação da curva padrão foi usada para calcular a concentração das bibliotecas (tabela 1). Em nosso exemplo, a concentração das bibliotecas de exRNAs era 5-8 nM, que foi significativamente menor do que bibliotecas de RNAs celulares (8-30 nM). As bibliotecas foram então agrupadas com igual quantidade e enviadas para sequenciamento.

Depois que as bibliotecas foram sequenciadas, as leituras de baixa qualidade foram aparadas afastado com FASTX-kit de ferramentas e a qualidade resultante de exRNAs a biblioteca foi elevado e comparável das bibliotecas das células (Figura 7AB). O comprimento da sequência de bibliotecas de células tinha um único pico em cerca de 22 nt (Figura 7), que se correlaciona com os miRNAs. Em contraste, as bibliotecas de exRNAs eram mais heterogêneas e continham 3 picos principais: 22 nt, 30 nt e 33 nt (Figura 7). Semelhantes aos seus homólogos celulares, o pico às 22 nt é os miRNAs. Uma inspeção mais detalhada revelou que os picos no nt 30 e 33 são os tRNAs metades/fragmentos ou piRNAs. As anotações de leituras as mapeado em seguida foram plotadas. Maioria das leituras (65,1%) de RNA celular mapeado para os miRNAs humanos e cada um do outro RNAs pequeno representaram uma pequena porção das leituras mapeadas (Figura 8A). Por outro lado estima, apenas 8% das exRNAs mapeado para os miRNAs humanos (Figura 8B). O RNA pequeno mais abundante que o lê mapeado foram os tRNAs. A maioria das leituras foram "lê incomparável" (43%). Mais exame das incomparáveis leituras de exRNAs para bancos de dados globais levou à descoberta surpreendente que a maioria deles corresponde às sequências bacterianas (74% e 85% para exRNA D0 e D7, respectivamente; Tabela 2). Em contraste, apenas 0,9% do RNA celular era inigualável e, desses, apenas 10% mapeado para bactérias. Uma comparação com o genoma bovino mostrou inferior a 1% correspondem a sugerir que a FBS não era uma fonte de contaminação (tabela 2). Daí, exRNAs apresentam um perfil atípico em relação ao RNA celular normal.

Figure 1
Figura 1: fluxo de trabalho de sequenciamento de exRNA e análise de. O fluxo de trabalho inteiro é retratado à esquerda nas caixas cinzentas e controle de qualidade associado a cada passo é em caixas de vermelho à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: distribuição de partículas secretado pelas células no dia 0 e 7 da diferenciação de tamanho. Resultados NTA representante das partículas coletaram de 3 frascos de x T175 em (um) dia 0 e (B) dia 7 de diferenciação. Os respectivos tamanhos média e modo, bem como a concentração das partículas é tabulada abaixo dos gráficos. SD: desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: morfologia e diferenciação osteogênica antes da coleção extracelular do RNA celular. (A) Micrografia de indiferenciadas BMSCs cultivadas com mídia de coleção no dia da coleta. (B) Micrografia de BMSCs diferenciado para 7 dias com mídia de coleção no dia da coleta. Barras de escala = 100 µm. (C) ALP atividades das células foram normalizadas para suas realidades de célula respectivos. Os valores plotados foram a de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: electroferograma representante da integridade do RNA após a extração do RNA. Análises de RNA, do RNA extracelular (A) e (B) de RNA celular. O eixo x é o comprimento do RNA (nt) e o eixo y é a fluorescência. O primeiro pico é a escada em 25 nt. RNAs ribossomal são mostrados como 18S (1.800 nt) e 28S (3.800 nt). Número de integridade do RNA (RIN) é um indicador de qualidade de RNA baseado na integridade do RNA ribossomal 18S e 28S. Os números mais altos de RIN igual qualidade melhor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: electroferograma representante das bibliotecas após a construção da biblioteca de cDNA. Análises de DNA das bibliotecas do (A) células no dia 0, (B) no dia 7, (C) RNA extracelular do dia 0 e (D) RNA extracelular do dia 7. Números de verde e roxos são as escadas em 35 nt e 10.380 nt, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: cDNA biblioteca quantificação e cálculo. As bibliotecas foram diluídas entre 500 - 1.000 vezes por aqueles de exRNA e entre 1.000 e 4.000 vezes por RNA celular. As bibliotecas foram executadas juntamente com os padrões do kit para quantificação da biblioteca. Os valores médios de Cq dos padrões de DNA foram plotados contra a concentração de10 log (pM) para gerar uma curva-padrão, uma equação para a curva padrão e um valor de2 R. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: escores de qualidade e distribuição de comprimento de sequências. Baixa qualidade lê e sequências de adaptador foram aparadas com FASTX-Toolkit para células (A) e (B) exRNAs. A distribuição de comprimento de limpo lê para células (C) e (D) exRNAs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: anotação de RNAs pequeno após o sequenciamento. Anotações representam porcentagens de leituras limpas para as células (A) e (B) exRNAs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostra Factor de diluição Valor de CQ log(PM) Concentração (pM) Média de concentração (pM) Média de concentração * (452/143) Multiplique pelo fator dillution (pM)
BMSC D0 exRNA 500 7.72 0.702 5.036 5.276 16.678 8338.993
BMSC D0 exRNA 500 7,57 0.754 5.677
BMSC D0 exRNA 500 7.7 0.709 5.117
BMSC D0 exRNA 1000 8,64 0,383 2.416 2.365 7.477 7476.846
BMSC D0 exRNA 1000 8,68 0,369 2.340
BMSC D0 exRNA 1000 8,68 0,369 2.340
ExRNA BMSC D7 500 8,52 0.425 2.659 3.221 10.182 5090.913
ExRNA BMSC D7 500 8,42 0.459 2.880
ExRNA BMSC D7 500 7,97 0,615 4.125
ExRNA BMSC D7 1000 8,87 0.303 2.011 1,933 6.110 6110.391
ExRNA BMSC D7 1000 8,92 0.286 1.932
ExRNA BMSC D7 1000 8.97 0.269 1.857
Célula de D0 BMSC 1000 6,86 1,000 10.005 9.810 31.007 31006.974
Célula de D0 BMSC 1000 6,91 0.983 9.614
Célula de D0 BMSC 4000 8,68 0,369 2.340 2.398 7.581 30322.041
Célula de D0 BMSC 4000 8.59 0,400 2.514
Célula de D0 BMSC 4000 8,68 0,369 2.340
Célula D7 BMSC 1000 8.44 0.452 2.834 2.880 9.104 9104.439
Célula D7 BMSC 1000 8,43 0.456 2.857
Célula D7 BMSC 1000 8.39 0.470 2.950
Célula D7 BMSC 4000 10,36 -0.213 0.612 0.702 2.218 8872.689
Célula D7 BMSC 4000 10.27 -0.182 0.658
Célula D7 BMSC 4000 9.97 -0.078 0.836
Cálculos:
log(PM) =-0.3467 x (valor da amostra de Cq) + 3.3786; Use a curva padrão e fórmula
concentração (pM) = 10^log(pM)
Cálculo do ajustamento do tamanho = padrão de tamanho de DNA (452 bp) dividido pelo comprimento médio fragmento (143 bp)

Tabela 1: quantificação de biblioteca de miRNA.

Amostra: # lê não mapeamento humano # lê o mapeamento para bactérias % de leitura bacteriana # lê mapeamento de vaca lê % bovina
Célula de D0 BMSC 131007 9858 8% 99 0,08%
Célula de D7 BMSC 169730 7935 5% 188 0,11%
BMSC D0 exRNA 6122833 4551477 74% 891 0,01%
ExRNA BMSC D7 7046691 5970086 85% 771 0,01%

Tabela 2: A porcentagem de inigualável lê esse mapa para bactérias e leituras de bovinas.

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Discussion

Aqui, descrevemos um protocolo para o sequenciamento de geração próxima de exRNAs que permite análises de expressão diferencial de amostras de entrada baixas. Aderindo a um protocolo específico para isolamento EV e exRNA é importante porque mesmo pequenas alterações (ou seja, a etapa de ultracentrifugação ou uma mudança no tipo de rotor) podem influenciar a transcriptoma e miRNA níveis13,14. Assim, independentemente de como o exRNA é isolado, é importante aplicar o mesmo procedimento experimental e bioinformatic para todas as amostras em um experimento para poder comparar os resultados.

Integridade do RNA é geralmente avaliada em bioanalyzer. Entretanto, desde que exRNAs são desprovidos de comprimento total rRNA, seu valor RIN é muito baixa, mas isso não reflete necessariamente as amostras de RNA de baixa qualidade. Além disso, a concentração de RNA do exRNAs variou muito e muitas vezes é imprecisa. Portanto, em vez de avaliação da qualidade do RNA e quantificar o RNA sobre o bioanalyzer, use o mesmo volume de mídia cada vez para processamento adicional. Também, resuspenda o RNA extraído do mesmo volume de buffer de ressuspensão e use o mesmo volume para construção de biblioteca.

Pequena construção de biblioteca de RNA foi otimizada, reduzindo a quantidade de adaptadores para um décimo do protocolo padrão e usando metade dos outros reagentes. Não só reduzir os adaptadores de rede impede dímeros de adaptador, também previne intramolecular RNA circularização15. A redução de reagentes é otimizada para o Kit de preparação amostra Illumina TruSeq pequeno RNA. Devem ser utilizados outros kits, recomenda-se também baixar adaptador e reagentes em conformidade, a menos que o kit especifica que é adaptada a baixa entrada de amostras. Finalmente, o ciclo PCR para a construção da biblioteca foi aumentado de 12 para 15 ciclos neste protocolo para contabilizar a baixa concentração de exRNAs. Achamos que seja o ajuste ideal sem ver amplificação enviesamentos15.

Várias métricas de controle de qualidade podem ser avaliadas incluindo escores de qualidade de base e li o perfil de comprimento. Ao fazer análises de bioinformática, a qualidade de base do lê no celular do RNA e exRNAs foram semelhantes; no entanto, a distribuição de comprimento e a origem anotada de sequências foram completamente diferentes. Maioria das leituras de RNA celular mapeado para miRNAs humanos, no entanto, uma grande proporção de leituras a exRNA eram leituras incomparáveis. Após uma inspeção, o incomparável lê acabou por ser bacteriana lê (tabela 2). Isto foi surpreendente porque os antibióticos foram usados rotineiramente em nossa cultura. Nosso resultado alinha-se bem com outros relatórios que também mostraram grande proporção de leituras incomparáveis ao sequenciamento de cultura de células derivadas de exRNA16. Uma das razões para esses contaminantes é que as bactérias se sobrepõem em tamanho com complexos extracelulares ou EVs e daí co purificam durante o passo de ultracentrifugação17. Publicações anteriores identificaram a contaminação generalizada de determinadas bactérias em meios de cultura que despercebido no âmbito de procedimentos de laboratório célula normal18. Até à data, este problema tem sido ignorado, mas deve ser considerado quando purificação e análise de exRNAs.

Este protocolo detalha um guia completo para colheita exRNAs de meios de cultura, otimizando a preparação de biblioteca pequena do RNA e processar os dados brutos de biblioteca. Este protocolo especificamente destaca os vários pontos de verificação de controle de qualidade durante todo o processo para demonstrar o quão baixo amostras de entrada (como exRNAs) podem desviar-se de preparações de amostra normal para que outras pessoas que trabalham com amostras de entrada baixas podem saber o que Espere.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Nós estamos gratos ao Sr. Claus Bus e Sra. Rita Rosendahl em iNANO para sua assistência técnica. Agradecimentos especiais a Dr. Daniel Otzen para permitir que nosso uso frequente dele se. Este estudo foi suportado pelo fundo de inovação Dinamarca (revista projeto).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells ATCC PCS-500-012 Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit Lonza PT-3001 Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS Gibco A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA Gibco 25200056
T175 Flask Sarstedt 833,912
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline Sigma 806552
Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly Beckman Coulter 355618
Beckman Coulter Type 60 Ti Rotor used here
NucleoCounter Chemometec NC-3000 Cell Counter
β-glycerophosphate Calbiochem 35675 Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone Sigma D4902-25MG Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma D1530-1MG Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1514 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits Roche KK4824 Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) Illumina RS-200-0012 Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep Sage Science Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit Cold Spring Harbor Lab Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt Adaptor removal in step 6
Bowtie Mapping of clean reads in step 6
Samtools To make the expression profile in step 6
Bedtools To make the expression profile in step 6

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References

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Tags

Células tronco mesenquimal de genética edição 145 RNAs extracelulares exosomes ribonucleproteins vesículas extracelulares microRNAs pequenos RNAs sequenciamento de próxima geração pequena construção de biblioteca de RNA
Isolando, sequenciamento e análise MicroRNAs extracelular das células-tronco mesenquimais humanas
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Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. … More

Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. T., Mothershead, C. R., Su, J., Kjems, J. Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e58655, doi:10.3791/58655 (2019).

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