Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Изоляция, виртуализации и анализа внеклеточного микроРНК от мезенхимальных стволовых клеток человека

Published: March 8, 2019 doi: 10.3791/58655
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Interdisciplinary Nanoscience Centre, Aarhus University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол показано, как очистить внеклеточного микроРНК носителя культуры клеток для малых РНК библиотеки строительных и следующего поколения последовательности. Чтобы позволить читателям понять, чего ожидать при работе с низкой ввода образцы как exRNAs описаны различные контрольно-пропускные пункты контроля качества.

Abstract

Внеклеточные и циркулирующего РНК (exRNA) производятся многие типы клеток организма и существуют в многочисленных телесных жидкостей, таких как слюна, плазмы, сыворотки, молоко и мочи. Одно подмножество этих молекул РНК являются посттранскрипционного регуляторы – микроРНК (интерферирующим). Разграничить адаптивной, производимых типов конкретных клеток, в пробирке культуры системы могут использоваться для сбора и профиль exRNAs, полученных от одного подмножество ячеек. Выделяется факторы мезенхимальных стволовых клеток вовлечены в облегчении многочисленных заболеваний и используется как в пробирке модель системы здесь. Этот документ описывает процесс сбора, очистки малых РНК и библиотека поколения внеклеточного интерферирующим последовательности. ExRNAs от культуры средств массовой информации отличаются от клеточной РНК, будучи низкий входной образцов РНК, которая вызывает для оптимизации процедур. Этот протокол обеспечивает полное руководство для малых exRNA последовательности носителя культуры, показаны контрольно-пропускные пункты контроля качества на каждом этапе во время exRNA очистки и последовательности.

Introduction

Внеклеточные и циркулирующих РНК (exRNAs) в различных жидкостях и устойчивы к полиадениновый1,2. Их многочисленность, стабильность и легкость доступа являются привлекательными для клинической оценки как диагностические и прогностические маркеры3. Режим транспорта для exRNAs включают внеклеточного везикулы (EVs), ассоциации с липопротеинов (например липопротеидов высокой плотности; HDL) и рибонуклеопротеида комплексы (такие как с Argonaute2 комплексами)4.

Подмножество exRNAs являются микроРНК (интерферирующим), которые являются небольшие некодирующих РНК из около 22 nt, которые регулируют экспрессию генов посттранскрипционного. Экс адаптивной были причастны к ячейке коммуникации и регуляции гомеостаза клетки5. К примеру, HDL поставляет экс мир-223 эндотелиальных клеток для подавления Межмицеллярная молекула 1 (ICAM-1) и воспаление6. Интересно, что мир-223 рассматривается также перевозимых на внеклеточные везикулы легких раковых клеток, программирование их брать на более инвазивных фенотип7из лейкоцитов. Таким образом транскриптом экс адаптивной различных телесные жидкости и клетки культуры среднего значительно улучшит наше понимание экс miRNA сигнализации.

Некодирующие РНК последовательности (seq малых РНК) является мощным инструментом, который может использоваться для понимания transcriptomics малых РНК. Не только можно сравнить различные образцы среди дифференциально выразил известный РНК, но Роман малых РНК также могут быть обнаружены и характерны. Следовательно это также надежный метод идентификации дифференциально выраженной интерферирующим при различных условиях. Однако одна из трудностей малых РНК seq является трудность в создании малых РНК seq библиотек из низких exRNA ввода жидкостей, таких как спинномозговой жидкости, слюна, моча, молока, сыворотки и культуры средств массовой информации. TruSeq малые РНК библиотека Prep протокол от Illumina требует примерно 1 мкг высокого качества всего РНК и протокол NEBNext малых РНК библиотека Prep набор из Новой Англии Biolabs требует 100 нг-1 мкг РНК8,9. Зачастую всего РНК из этих образцов находятся ниже предела обнаружения для обычных-УФ Вид спектрофотометры.

Экс адаптивной производным от жидкостями являются потенциально хорошие диагностических и прогностических маркеров. Однако чтобы изучить функциональные последствия или определить происхождение конкретных экс адаптивной, клетки культуры системы часто используются вместо этого. Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) были изучены широко потому, что их EVs были вовлечены в облегчении многих заболеваний, включая инфаркт миокарда, болезни Альцгеймера и трансплантат против принимающей болезни10. Здесь мы демонстрируем очистки экс адаптивной из костного мозга, полученных MSCs (BMSCs) и конкретные шаги, используемые для оптимизации малых РНК библиотека строительства, последовательности и анализ данных (рис. 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Средство роста мезенхимальных стволовых клеток (MSC СМИ) готовится заранее, как указано в Таблице материалов.

1. клеточная культура

Примечание: Можно получить мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга, жировой ткани или других источников11. Кроме того использования могут быть куплены через поставщика. BMSCs, используемые в настоящем протоколе были получены из костного мозга пациентов и купил от компании.

  1. Размораживание 1 х 106 BMSCs в T175 колбу, содержащий 20 мл MSC средств массовой информации. Инкубировать клетки при 37 ° C с 5% CO2 и заменить средства массовой информации каждые 2-3 дня до 80% confluency.
  2. Вымыть клетки с 5 мл ПБС и отбросить PBS.
  3. Отсоединить клетки, добавив 5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубации клеток для 5 минут при 37 ° C. Постучите по стенкам колбы для облегчения отряда.
  4. Добавляют 15 мл MSC СМИ инактивирует трипсина, отсоединить клетки от поверхности и пипетки вверх и вниз, чтобы получить одну ячейку суспензий.
  5. Соберите клетки в 50 мл трубки и спин вниз на 5 мин на x 300 g Пелле клетки.
  6. Ресуспензируйте клеток в 1 мл MSC СМИ и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева.
    Примечание: Основная костного мозга человека MSCs на 80% confluency в T175 колбу — около 2 х 106 клеток.
  7. Использования плиты в 2000 клеток/см2 свежих MSC СМИ в 5 T175 колбы. Рост клеток при 37 ° C с 5% CO2 и заменить средства массовой информации каждые 2-3 дня до получения 5 флакон фляги вырожденная T175 90%.

2. EVs и РНК связанные биомолекул коллекции

Примечание: EV коллекции СМИ готовится заранее (средний [DMEM] Дульбекко изменение орла с плода бычьим сывороточным [FBS] 10% и 1% пенициллина/стрептомицина [P/S]). EV коллекции СМИ является нормальной MSC СМИ, но приготовленные коммерческих EV-истощены FBS (Таблица материалов). Это позволяет избежать крупного рогатого exRNA загрязнения от FBS, который обычно содержит exRNAs, связанные с EVs, ribonucleoproteins и липопротеинов. Для малых РНК библиотека подготовки exRNAs, производного от 5 вырожденная колбы MSCs необходимы для включения библиотеки строительство.

  1. Вымыть клетки 3 x с 20 мл PBS на T175 колбу. Добавить 20 мл EV коллекции средств массовой информации за вырожденная T175 флакон MSCs и инкубировать при 37 ° C с 5% CO2 в течение 48 часов.
  2. Сбор средств массовой информации и центрифуги СМИ за 10 мин на 300 x g и 4 ° C.
  3. Собирать супернатант и центрифуги СМИ за 20 минут, 2000 x g и 4 ° C.
  4. Собирать супернатант и центрифуги СМИ за 30 мин на 15500 x g и 4 ° C. Затем собирают супернатант.
  5. Средства массовой информации передавать ультрацентрифуга трубы и Пелле exRNAs 90 мин 100 000 x g и 4 ° C. Здесь используется фиксированный угол ротора и гранулы, привязанный к стороне трубки. Марк на стороне крышки и нарисуйте круг на стороне трубки, где ожидается гранулы.
  6. Удалить супернатант, сухой внутри трубки, инвертирование трубку на абсорбирующий бумаги и использовать небольшие кусочки фильтровальной бумаги для удаления жидкости внутри трубки не касаясь в нижней части трубки. Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл PBS, vortexing для 30 s и закупорить вверх и вниз 20 x.
  7. Оценить EVs и биомолекул с наночастиц, отслеживания анализа (НТА) (Рисунок 2).
    Примечание: EVs и биомолекул можно оценить с наночастиц, отслеживания, анализа (НТА), Динамическое рассеяние света (DLS) или передачи электронной микроскопии (ТЕА)12.
  8. Храните EVs и биомолекул на-80 ° C до далее вниз по течению экспериментов.
    Примечание: Если EVs будет использоваться для функциональных исследований, 20% глицерина необходимо добавить для их защиты от разрыва. Клетки могут быть собраны с помощью стандартных процедур, в случае необходимости.

3. EVs и РНК связанные биомолекул коллекции дифференцированных клеток

Примечание: EVs и РНК связанные биомолекул также может быть собраны из СМИ культуры клеток, в то время как клетки проходят дифференциацию. Пример, изображенные в протоколе описывает osteoblastic дифференциация и exRNA коллекции в день 0 и 7 дифференциации. Если различие не требуется, пропустите раздел 3 и перейдите к разделу 4.

  1. Подготовить osteoblastic дифференциация СМИ (DMEM с 10% FBS, 1% P/S, β-Глицерофосфат 10 мм, 10 Нм дексаметазон, 50 мкм аскорбат-2-фосфат и 10 мм 1,25 витамин D3) свежий каждый раз.
  2. После того как MSCs 80% притока, измените СМИ MSC osteoblastic дифференциация СМИ.
  3. Пополнение osteoblastic дифференциация СМИ после 2-3 дня.
  4. На 5 день дифференциации, удалите средства массовой информации и вымыть клетки 3 x с 20 мл PBS на T175 колбу.
  5. Добавить 20 мл EV коллекции сред, содержащих 10 мм β-метронидазол, 10 Нм дексаметазон, 50 мкм аскорбат-2-фосфат и 1,25 витамин D 10 мм3 за вырожденная T175 флакон MSCs. инкубировать клетки при 37 ° C с 5% CO2 в течение 48 часов обеспечить продолжение дифференциация во время сбора EVs и биомолекул.
  6. Сбор средств массовой информации на 7 день и перейти к изоляции EVs и биомолекул, как описано в шагах 2.2-2.6.
  7. Для контроля качества семян клетки в 96-колодцев или скважин-6 для оценки дифференцировки, используя assay активность щелочной фосфатазы (ALP) или с количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответственно.
    Примечание: На рисунке 3 является пример, показывающий Остеогенные дифференцировки клеток.

4. РНК добыча и контроль качества

  1. Оттепель образцы из шага 2.8 на льду. Извлечь РНК с помощью комплекта изоляции РНК (Таблица материалов).
  2. Элюировать РНК из столбца комплекта изоляции РНК (Таблица материалов) в 100 мкл РНКазы свободной воды.
  3. Концентрат РНК через этанола осадков, добавив 1 мкл гликогена, 10 мкл 2 М-рН 5,5 натрия ацетата и 250 мкл предварительно охлажденные 99% этанола в 100 мкл очищенный РНК.
  4. Проинкубируйте образцы при-20 ° C на ночь, чтобы осадить РНК. Пелле РНК центрифугированием на 20 мин в 16000 x g и 4 ° C.
    Примечание: Гранулы белого вследствие совместного осадков с гликогена.
  5. Удалить супернатант и помыть лепешка РНК с 1 мл 75% этанола. Пелле РНК снова за 5 мин на 16000 x g и 4 ° C.
  6. Удаление этанола и оставьте крышку трубки РНК открытой для 5-10 мин в воздух сухой Пелле РНК. Ресуспензируйте Пелле РНК в 7 мкл РНКазы свободной воды.
  7. Проверьте качество РНК и концентрации с помощью чип основе капиллярного электрофореза машины для определения РНК по данным производителя протокола до начала строительства библиотеки.
    Примечание: Представитель размер распределение РНК показано на рисунке 4.
  8. Экстракт клеточной РНК, при необходимости, с комплектом коммерческой очистки (Таблица материалов).

5. Библиотека строительство и контроль качества

Примечание: Малые РНК библиотеки построены с использованием коммерческих комплекты (Таблица материалов) с изменениями из-за низкой РНК ввода. Строительство библиотеки выполняется на блоке охлажденной.

  1. Chill Отопление блока для 0.2 мл ПЦР пробирок на льду и Пипетка 5 мкл РНК из шага 4.6 в 0,2 мл, RNase бесплатно ПЦР трубы на блоке охлажденной.
  2. Разбавьте 3' адаптеры (1:10) в РНКазы свободной воде в ПЦР-пробирку 0,2 мл, RNase бесплатно. Добавить 0,5 мкл разбавленного адаптер и смешать с 5 мкл РНК, закупорить вверх и вниз 8 x и центрифуги кратко, чтобы собрать все жидкости в нижней части трубки.
  3. Инкубировать структуре РНК и 3' адаптер при 70 ° C в течение 2 минут в разогретой тепловая велосипедист и затем поместите образец обратно на блоке охлажденной.
  4. Добавьте 1 мкл буфера перевязки, 0.5 мкл битор РНКазы и 0,5 мкл T4 РНК лигаза (удаление мутант) в РНК и 3' адаптер смесь. Смешать, закупорить вверх и вниз 8 x и центрифуги кратко.
  5. Инкубируйте трубки на 28 ° C в течение 1 ч в разогретой тепловая велосипедист.
  6. Добавить 0,5 мкл раствора стоп в пробирку образца с трубки, оставаясь в тепловая велосипедист, смешивать, закупорить вверх и вниз 8 x и продолжать Инкубируйте на 28 ° C в течение 15 мин.
  7. Разбавьте 5' адаптеры (1:10) в РНКазы свободной воде в ПЦР-пробирку 0,2 мл, RNase бесплатно. Добавить 0,5 мкл 5' адаптер в отдельный бесплатно РНКазы 0.2 мл ПЦР-пробирку, тепла 5' адаптер при 70 ° C в течение 2 минут в разогретой тепловая велосипедист и затем поместите образец на блоке охлажденной.
  8. Добавить 0,5 мкл 10 Нм АТФ, 0.5 мкл лигаза РНК T4 адаптер трубы 5', смешивать, закупорить вверх и вниз 8 x и центрифуги кратко собрать все жидкости в нижней.
    Примечание: Держите адаптер 5' на охлажденные блок как можно больше.
  9. Добавление в 1,5 мкл смеси адаптер 5' от шаге 5.6 и очень осторожно перемешать путем дозирования 8 x медленно. Проинкубируйте образцы на 28 ° C в течение 1 ч в разогретой тепловая велосипедист.
  10. Разбавьте RT грунтовка 1:10 в РНКазы свободной воде в свободной РНКазы ПЦР-пробирку 0,2 мл. Добавить 0,5 мкл разбавленного RT грунтовки в выборку из шага 5.9, смесь очень мягко, закупорить вверх и вниз 8 x медленно и центрифуги кратко.
  11. Инкубировать образца при 70 ° C в течение 2 минут в разогретой тепловая велосипедист и затем поместите образец на охлажденные блока.
  12. Добавьте 1 мкл 5 x первая прядь буфера, 0.5 мкл 12,5 мм dNTP смеси, 0.5 мкл 100 мм Дитиотреитол (DTT), 0.5 мкл битор РНКазы и 0,5 мкл обратной транскриптазы. Очень осторожно перемешать, закупорить вверх и вниз 8 x медленно и центрифуги кратко.
  13. Инкубируйте образца на 50 ° C в течение 1 ч в разогретой тепловая велосипедист получать cDNA.
  14. Добавление 4.25 мкл ультрачистая вода, 12,5 мкл, комплекса ПЦР, 1 мкл индекс грунта и 1 мкл Универсальный грунт в cDNA. Смешать, закупорить вверх и вниз 8 x и центрифуги кратко.
  15. Поместите образец в тепловая велосипедист и настройте циклователь следующим: 98 ° C за 30 сек; 15 циклов 98 ° c 10 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 15 s; и в конце цикла с 72 ° C для 10 мин.
    Примечание: Подготовленные библиотека может храниться при температуре-20 ° C на одну неделю.
  16. Очистить библиотеки РНК, отделив библиотеки на ДНК гель и резки гель (гель извлечение) между 140 bp и 160 bp и элюирующие библиотеки из геля после протокол, предоставляемые библиотека строительства комплект.
    Примечание: В этом исследовании, подготовленный библиотеки из шага 5.15 загружается на коммерческих гель (Таблица материалов) и библиотека между 140 bp и 160 bp, очищается от автоматизированных фракционатор размер ДНК (Таблица материалов) согласно Протокол от производителя.
  17. Сосредоточиться и мыть библиотеки из шага 5.16 с использованием комплекта очистки на основе столбцов ПЦР (Таблица материалов) и наконец элюировать библиотеки в 10 мкл РНКазы свободной воды.
  18. Загрузите 1 мкл очищенный библиотеки в микросхему ДНК (Таблица материалов) для проверки размера библиотеки после производителя протокол.
  19. Разбавьте 1 мкл очищенный библиотеки (1: 1000) в 10 мм pH 8.0 трис-HCl с 0,05% Полисорбат 20 и количественно библиотеки, используя набор для количественной оценки коммерческая библиотека для количественного определения концентрации Библиотека, с использованием стандартов ДНК в комплект ПЦР.
  20. Бассейн равное количество библиотек согласно требованиям машины последовательность и последовательность на систему виртуализации высокой пропускной способности.
    Примечание: Библиотека строительство клеточной РНК может быть сделано с использованием же наборы, следуя стандартным протоколом комплектов.

6. Биоинформатика конвейер

Примечание: Это внутренний конвейер и программы, используемые здесь перечислены в таблица материалов.

  1. Trim от низкого качества чтения и удалите адаптер последовательности из сырья читает.
  2. Сопоставьте чистой читает различные виды РНК.
    1. Аннотируйте tRNAs, позволяя два несоответствия, потому что сильно измененной последовательности tRNA вызывают частые базовый misincorporation, обратной транскриптазы.
    2. Аннотируйте интерферирующим путем сопоставления для человека интерферирующим от miRBase v21, позволяя нулевой несоответствия. Так как интерферирующим подлежат A и U nontemplated 3' конца дополнений, последовательности, которые не являются 3', обрезается до трех A и/или T НТС, после чего читает сопоставляются человека адаптивной и другие интерферирующим от miRBase v21, позволяя нулевой несоответствия.
    3. Аннотации для других соответствующих малых РНК (мяРНК, snoRNA, Пирна и Y РНК), позволяя одно несоответствие.
    4. Карта оставшихся несопоставленные читает длинные наборы РНК (рРНК, других РНК от Rfam и мРНК) для оценки степени деградации.
    5. Аннотируйте последовательности генома человека.
    6. Аннотируйте последовательности для бактериальных геномов.
    7. Нормализовать Мирна выражение, используя следующую формулу: Мирна подсчитывает / общая подсчитывает все сопоставленные интерферирующим) x 106.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Метод, описанный в настоящем Протоколе оптимизирован для сбора exRNA от MSC культуры для следующего поколения последовательности. Общая схема рабочего процесса на рис. 1 на левой стороне и соответствующего контроля качества контрольно-пропускные пункты на право.

Морфология клеток в день сбора для недифференцированные (Рисунок 3А) и дифференцированной (рис. 3B) показаны клетки. Кроме того представитель нормализованных уровни ALP активности клеток, индуцированной 7 дней также показаны (рис. 3 c). ALP деятельность здесь, примерно в 2,5 раза, uninduced клеток.

Три T175 колбы вырожденная MSCs выход 2-5 x 1010 частиц/мл (рис. 2). Размер Средняя частиц является приблизительно 160-165 Нм, хотя большинство частиц 130-140 Нм. Там было несколько меньше пиков между 200 и 500 Нм, который будет указывать большие комплексы или крупных агрегатов.

Так как РНК могут быть быстро деградировали, строго придерживаться условий РНК добыча комплект или используемый протокол. РНКазы свободных условий использования, в частности РНКазы свободной воды Ресуспензируйте РНК и держать РНК на льду, когда это возможно. После извлечения РНК может быть определена количественно с помощью машины на базе чипа капиллярного электрофореза. Представитель electropherograms РНК после анализируемого показаны на рисунке 4. Electropherogram exRNAs включает в себя широкий диапазон РНК (рис. 4A). В отличие от клеточной РНК имеет очень четкие пики вокруг 70-120, 1800 и 3800 nt, которые соответствуют tRNA/5S рРНК / 5.8S рРНК, 18S рРНК и 28S рРНК, соответственно (рис. 4В). Число целостности РНК (Рин) представляет качество РНК. Хороший Рин клеточной РНК-> 8 (с указанием почти не деградации РНК). Алгоритм, на котором основан Рин является соотношение между 28S и 18. Это означает, что Рин не является хорошим показателем качества РНК exRNAs, потому что полнометражный теорией обычно не обнаруживаются в exRNAs.

После извлечения РНК Мирна библиотеки были построены и кДНК библиотек были отделены электрофорезом геля. Адаптер лигируют cDNA интерферирующим обычно находится между 140 и 160 nt. Качество библиотеки был затем визуализирована на компьютере на базе чипа капиллярного электрофореза (рис. 5). Рисунок 5А и 5B рисунок являются библиотеки из клеточной РНК в день 0 и 7 дней, соответственно. Рисунок 5 c и 5 d на рисунке являются библиотеки exRNA в день 0 и 7 день соответственно. Все четыре образцы имели вершины около 140 nt, которые указывают успешный Мирна библиотека строительства. Количество cDNA в библиотеках была выполнена количественная оценка с использованием библиотеки комплекта количественной ПЦР. Количественная оценка цикла (Cq) стандартов был заговор против журнала концентрации для получения калибровочной кривой (рис. 6). Уравнение кривой стандартного затем использовалась для расчета концентрации библиотек (Таблица 1). В нашем примере концентрация библиотек из exRNAs был 5-8 Нм, который был значительно ниже, чем библиотек из клеточной РНК (8-30 Нм). Библиотеки были затем объединены с равным количеством и отправлены для виртуализации.

После того, как были последовательными библиотек низкого качества чтений были обрезаны прочь с FASTX-инструментарий и результирующее качество библиотека exRNAs была высокой и сопоставимой с эффективностью работы библиотек из клеток (рис. 7AB). Длина последовательности библиотек из клеток был один пик около 22 nt (рис. 7 c), что коррелирует с адаптивной. В отличие от библиотек от exRNAs более неоднородны и содержит 3 основные пики: 22 nt 30 nt и 33 nt (рис. 7 d). Похож на их клеточных коллегами, пик на 22 nt является адаптивной. Тщательный осмотр показал, что пики на 30 и 33 nt tRNAs половинки/фрагменты или piRNAs. Затем были нанесены аннотации сопоставленных читает. Большинство читает (65,1%) от клеточной РНК, сопоставляются человека адаптивной и каждой из других малых РНК, приходится небольшая часть сопоставленных читает (рис. 8A). Contrastingly только 8% exRNAs сопоставляется человека интерферирующим (Рисунок 8B). Наиболее распространенных малые РНК, с которым сопоставлены чтений были tRNAs. Большинство читает были «непревзойденной читает» (43%). Дальнейшее изучение непревзойденной читает от exRNAs к глобальным базам данных привело к удивительно вывод, что большинство из них соответствуют бактериального последовательности (74% и 85% для D0 и D7 exRNA, соответственно; Таблица 2). Напротив лишь 0,9% клеточной РНК была непревзойденной, и тех, только 10% сопоставляется бактерий. Сравнение с бычьим генома показал, менее чем в 1% матч, предполагая, что FBS не был источником загрязнения (Таблица 2). Следовательно exRNAs выставку нетипичным профилем, по сравнению с нормальной клеточной РНК.

Figure 1
Рисунок 1: процесс exRNA последовательности и анализа. Весь процесс изображен слева в серые коробки и контроль качества, связанные с каждым этапом в Красные флажки справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: размер распределение частиц, выделяется клетками в день 0 и 7 день дифференцировки. Представитель NTA результаты частиц собраны из 3 x T175 колбы на (A) день 0 и день 7 (B) дифференциации. Соответствующие размеры среднее и режим, а также концентрация частиц сведены под графиками. SD: стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: сотовый морфологии и остеогенном дифференциации до внеклеточного РНК коллекции. (A) Микрофотография недифференцированные BMSCs, культивируемых с коллекции средств массовой информации в день сбора. (B) Микрофотография BMSCs продифференцировано за 7 дней с коллекции средств массовой информации в день сбора. Масштаб баров = 100 µm. (C) ALP деятельности клеток были нормализованы в их соответствующих клеток коммуникации. Значения, отображенные в том, что из трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: представитель electropherogram РНК целостности после извлечение RNA. Анализ РНК внеклеточного РНК (A) и клеточной РНК (B). Ось x — это длина РНК (nt) и ось y является флуоресценции. Первый пик это лестница на 25 nt. рибосомной РНК показано как 18S (1800 nt) и 28S (3800 nt). РНК целостности номер (Рин) является показателем качества РНК, основанный на целостность 18S и 28S рибосомной РНК. Выше Рин чисел равно лучшего качества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: представитель electropherogram библиотек cDNA после библиотеки строительства. Анализ ДНК библиотек от (A) клетки в день 0, (B) на 7 день, (C) внеклеточной РНК от день 0 и (D) внеклеточной РНК от 7 дней. Зеленый и фиолетовый цифры являются лестницы на 35 nt и 10,380 nt, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: кДНК библиотеки количественной оценки и расчета. Библиотеки разводили между 500 - 1000 раз, для тех, кто из exRNA и между 1000 и 4000 раз клетки РНК. Библиотеки были запускаются вместе с стандарты из комплекта количественного определения библиотеки. Средние значения Cq ДНК стандартов были заговоре против концентрации10 журнала (ПП) для создания стандартной кривой, уравнение для стандартной кривой и значение R2 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: показатели качества и распределение длины последовательностей. Низкое качество читает и адаптер последовательности были обрезаны с FASTX-инструментарий для клетки (A) и (B) exRNAs. Распределение длины чистой читает для клетки (C) и (D) exRNAs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: Аннотация малых РНК после виртуализации. Аннотации представляют процент чистой читает для клетки (A) и (B) exRNAs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Пример Коэффициент разрежения CQ значение log(PM) Концентрация (pM) Средняя концентрация (pM) Средняя концентрация * (452/143) Умножить на фактор чистовая (pM)
ExRNA BMSC D0 500 7.72 0,702 5.036 5.276 16.678 8338.993
ExRNA BMSC D0 500 7.57 0,754 5.677
ExRNA BMSC D0 500 7.7 0,709 5.117
ExRNA BMSC D0 1000 8.64 0.383 2.416 2.365 7.477 7476.846
ExRNA BMSC D0 1000 8.68 0.369 2.340
ExRNA BMSC D0 1000 8.68 0.369 2.340
ExRNA BMSC D7 500 8.52 0.425 2.659 3.221 10.182 5090.913
ExRNA BMSC D7 500 8.42 0.459 2.880
ExRNA BMSC D7 500 7.97 0.615 4,125
ExRNA BMSC D7 1000 8.87 0.303 2,011 1.933 6.110 6110.391
ExRNA BMSC D7 1000 8.92 0.286 1.932
ExRNA BMSC D7 1000 8.97 0.269 1,857
Ячейка BMSC D0 1000 6.86 1.000 10,005 9.810 31.007 31006.974
Ячейка BMSC D0 1000 6.91 0.983 9.614
Ячейка BMSC D0 4000 8.68 0.369 2.340 2.398 7.581 30322.041
Ячейка BMSC D0 4000 8.59 0.400 2.514
Ячейка BMSC D0 4000 8.68 0.369 2.340
Ячейка BMSC D7 1000 8.44 0.452 равно 2,834 2.880 9.104 9104.439
Ячейка BMSC D7 1000 8.43 0.456 2,857
Ячейка BMSC D7 1000 8.39 0.470 2.950
Ячейка BMSC D7 4000 10.36 -0.213 0.612 0,702 2.218 8872.689
Ячейка BMSC D7 4000 10.27 -0.182 0.658
Ячейка BMSC D7 4000 9.97 -0.078 0.836
Расчеты:
log(PM) =-0.3467 x (значение образца Cq) + 3.3786; Использование стандартной кривой и формула
концентрация (вечера) = 10^log(pM)
Размер корректировки расчета = стандартный размер ДНК (452 bp) делится на среднем фрагмент длиной (143 bp)

Таблица 1: Мирна библиотека количественной оценки.

Пример: # считывает не сопоставления человека # считывает сопоставление бактерий % Бактериальный считывает # считывает сопоставление корова читает % крупного рогатого скота
BMSC D0 ячейки 131007 9858 8% 99 0,08%
BMSC ячейка D7 169730 7935 5% 188 0.11%
ExRNA BMSC D0 6122833 4551477 74% 891 0,01%
ExRNA BMSC D7 7046691 5970086 85% 771 0,01%

Таблица 2: Доля непревзойденной читает что карта бактерии и бычьего читает.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем протокол для следующего поколения последовательности exRNAs, который позволяет анализ дифференциального выражение от низкого входного образцов. Придерживаясь определенных протоколов для изоляции EV и exRNA важно, потому что даже небольшие изменения (например, шаг ultracentrifugation или изменения в тип ротора) могут влиять транскриптом и Мирна уровнях13,14. Таким образом независимо от того, как exRNA изолирован, важно применить ту же процедуру экспериментальной и bioinformatic для всех образцов в эксперименте, чтобы иметь возможность сравнить результаты.

Целостность РНК обычно оценивается на bioanalyzer. Однако поскольку exRNAs лишенный полная длина рРНК, их значение Рин является очень низким, но это не обязательно отражает низкое качество РНК образцы. Кроме того концентрация РНК exRNAs различны и часто является неточной. Следовательно вместо оценки качества РНК и количественного определения РНК на bioanalyzer, используйте такой же объем средств массовой информации каждый раз для дальнейшей обработки. Кроме того Ресуспензируйте извлеченные РНК в том же объеме ресуспендирования буфера и использовать тот же объем на строительство библиотеки.

Малые РНК библиотека строительства был оптимизирован, уменьшая количество адаптеров в одной десятой от стандартного протокола и используя половину других реагентов. Снижение сетевые адаптеры не только предотвращает адаптер димеры, она также предотвращает внутримолекулярной РНК рецензий15. Сокращение реагентов оптимизирована для комплекта Prep Illumina TruSeq малых РНК образца. Должны использоваться другие комплекты, рекомендуется также снизить адаптер и реагенты, соответственно, если комплект указывает, что с учетом низкого входного образцы. Наконец цикл PCR на строительство библиотеки было увеличено с 12 до 15 циклов в этом протоколе с учетом низкой концентрации exRNAs. Мы нашли это будет оптимальной регулировки не видя амплификации предубеждения15.

Различные метрики контроля качества могут быть оценены включая базовый показатель качества ключевого и читать длина профиля. При выполнении анализа биоинформатики, базовый качества чтения в клеточной РНК и exRNAs были похожи; Однако распределение длины и аннотированный происхождение последовательности были совершенно разные. Большинство читает из клеточной РНК, сопоставляются человека адаптивной, однако, большая часть exRNA чтений были непревзойденной читает. При более внимательном рассмотрении непревзойденной читает, оказался бактериальных читает (Таблица 2). Это было удивительно, потому что антибиотики обычно использовались в нашей культуре. Наш результат хорошо согласуется с другими докладами, которые также показали большое количество непревзойденной читает при виртуализации клеточной культуры производных exRNA16. Одна из причин для этих загрязнителей, что бактерии перекрываются в размер с внеклеточного комплексов или EVs и следовательно совместно очистить во время ultracentrifugation шаг17. Предыдущие публикации выявили широкое загрязнение некоторых бактерий в культуре средств массовой информации, которые остаются незамеченными при нормальной клетки лаборатории процедуры18. На сегодняшний день, эта проблема во многом игнорируется, но должны приниматься во внимание при очистки и анализа exRNAs.

Этот протокол подробности полное руководство для уборки exRNAs от культуры средств массовой информации, оптимизации малых РНК библиотека подготовки и обработки сырья библиотеки данных. Этот протокол конкретно освещаются различные контрольно-пропускные пункты контроля качества на протяжении всего процесса, чтобы продемонстрировать, как низко ввода образцы (как exRNAs) могут отличаться от обычной выборки препараты так, что другие работы с низкой ввода образцов может знать, что ожидаете.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарны г-н Клаус автобус и г-жа Рита Rosendahl на iNANO за их технической помощи. Особая благодарность д-р Даниэль Otzen позволяя нашим частым использованием его ультрацентрифугирования. Это исследование было поддержано в инновационный фонд Дании (MUSTER проекта).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells ATCC PCS-500-012 Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit Lonza PT-3001 Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS Gibco A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA Gibco 25200056
T175 Flask Sarstedt 833,912
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline Sigma 806552
Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly Beckman Coulter 355618
Beckman Coulter Type 60 Ti Rotor used here
NucleoCounter Chemometec NC-3000 Cell Counter
β-glycerophosphate Calbiochem 35675 Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone Sigma D4902-25MG Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma D1530-1MG Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1514 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits Roche KK4824 Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) Illumina RS-200-0012 Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep Sage Science Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit Cold Spring Harbor Lab Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt Adaptor removal in step 6
Bowtie Mapping of clean reads in step 6
Samtools To make the expression profile in step 6
Bedtools To make the expression profile in step 6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
  2. Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
  3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
  4. Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
  5. Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
  6. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
  7. Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
  8. Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
  9. NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
  10. Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
  11. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
  12. Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  13. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
  14. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  15. Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
  16. Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
  17. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  18. Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).

Tags

Генетика выпуск 145 мезенхимальных стволовых клеток внеклеточная РНК внеклеточная везикулы ribonucleproteins exosomes микроРНК малые РНК следующего поколения последовательности малая конструкция библиотеки РНК
Изоляция, виртуализации и анализа внеклеточного микроРНК от мезенхимальных стволовых клеток человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. … More

Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. T., Mothershead, C. R., Su, J., Kjems, J. Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e58655, doi:10.3791/58655 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter