Summary
Bu iletişim kuralı, hücre kültür ortamından küçük RNA Kütüphane inşaat ve sonraki nesil sıralama ekstraselüler mikroRNA'lar arındırmak gösterilmiştir. Çeşitli kalite kontrol denetim noktaları ne exRNAs gibi düşük giriş örnekleri ile çalışırken olacağını anlamak okuyucuların izin açıklanmıştır.
Abstract
Hücre dışı ve dolaşımdaki RNA'ların (exRNA) birçok hücre türü vücut tarafından üretilen ve tükürük, plazma, serum, süt ve idrar gibi çok sayıda vücut sıvısı bulunmaktadır. Bu RNA'ların bir alt kümesidir posttranscriptional regülatör – mikroRNA (miRNAs). Belirli hücre tipleri tarafından üretilen miRNAs betimlemek için tüp bebek kültür sistemleri hasat için kullanılabilir ve hücre bir alt grubunu profil exRNAs türetilmiş. Mezenkimal Kök hücre salgılanan faktörler çok sayıda hastalıkları ortadan kaldırılmasına karıştığı ve burada tüp bebek modeli sistemi olarak kullanılır. Bu kağıt toplama işlemi, küçük RNA arınma ve Kütüphane üretimi için sıra ekstraselüler miRNAs açıklanır. ExRNAs kültür ortamından hücresel RNA düşük RNA giriş örnekleri, için en iyi duruma getirilmiş yordamları çağıran kalarak farklı. Bu iletişim kuralı her adım kalite kontrol noktalarında exRNA arıtma ve sıralamanın sırasında gösterilen için kapsamlı bir rehber küçük exRNA sıralama kültür ortamından sağlar.
Introduction
Hücre dışı ve RNA'ların (exRNAs) dolaşan mevcut çeşitli vücut sıvıları ve dirençli doğru RNases1,2. Onların yüksek bereket, istikrar ve rahatlık-in erişilebilirlik tanılama ve prognostik işaretçileri3olarak klinik değerlendirmesi için caziptir. ExRNAs için ulaşım modu dahil hücre dışı veziküller (EVs), (örneğin, yüksek yoğunluklu lipoprotein; lipoproteinler ile dernek HDL) ve Ribonükleoprotein kompleksleri (gibi Argonaute2 kompleksleri ile)4.
ExRNAs bir alt kümesidir yaklaşık 22 kodlamayan RNA'ların, küçük mikroRNA (miRNAs), posttranscriptional gen ekspresyonu düzenleyen nt. Eski miRNAs hücre-hücre iletişim ve hücre homeostazı5Yönetmeliği karıştığı olmuştur. Örneğin, HDL endotel hücre adezyon molekül 1 (ICAM-1) bastırmak için eski-miR-223 sunar ve inflamasyon6. İlginçtir, miR-223 da ekstrasellüler lökosit akciğer kanseri hücreleri, onları bir daha invaziv fenotip7üzerinde almak programlama veziküller tarafından taşınan görülmektedir. Böylece, ex-miRNAs çeşitli vücut sıvıları ve hücre kültür orta transcriptome büyük ölçüde eski miRNA sinyal anlayışımızı geliştirir.
Küçük RNA (küçük RNA seq) sıralama küçük RNA'ların transcriptomics anlamak için kullanılan güçlü bir araçtır. Sadece farklı örnekleri arasında differentially ifade bilinen RNA'ların karşılaştırılabilir ama roman küçük RNA'ların da tespit ve karakterize. Sonuç olarak, farklı koşullar altında differentially ifade miRNAs belirlemek de sağlam bir yöntemdir. Ancak, bir küçük RNA seq engel üzerinden düşük exRNA giriş sıvı serebrospinal sıvı, tükürük, idrar, süt, serum ve kültür medya gibi küçük RNA seq kütüphaneler üreten zor olmasıdır. Illumina TruSeq küçük RNA Kütüphane hazırlık kuralından yaklaşık 1 µg kaliteli toplam RNA'ın gerektirir ve New England Biolabs NEBNext küçük RNA Kütüphane hazırlık ayarla iletişim kuralından 100 ng-1 µg RNA8,9gerektirir. Oftentimes, bu örnekler üzerinden toplam RNA vardır geleneksel UV-VIS Spektrofotometreler için algılama sınırı altında.
EX-miRNAs vücut sıvıları türetilmiş potansiyel olarak iyi prognostik ve tanılama işaretleri vardır. Ancak, fonksiyonel etkilerini incelemek için veya belirli eski miRNAs kökenini belirlemek için hücre kültür sistemleri genellikle bunun yerine kullanılır. Onların EVs miyokard infarktüsü, Alzheimer hastalığı ve Greft versus host hastalığı10dahil olmak üzere birçok hastalığın ortadan kaldırılmasına karıştığı olmuştur çünkü Mezenkimal Kök hücre (MSCs) kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Burada, biz eski miRNAs arınma kemik iliği türevi MSCs (BMSCs) ve küçük RNA Kütüphane yapılar, sıralama ve veri analizi (şekil 1) en iyi duruma getirmek için kullanılan belirli adımları göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Mezenkimal Kök hücre büyüme orta (MSC medya) Malzemeler tablobelirtildiği gibi önceden hazırlanır.
1. hücre kültürü
Not: İnsan Mezenkimal kök hücrelerin kemik iliği, yağ dokusu veya diğer kaynakları11elde edilebilir. Alternatif olarak, hMSCs bir tedarikçi ile satın alınabilir. Bu protokol için kullanılan BMSCs hastaların kemik iliği elde edilen ve bir şirketten satın aldı.
- 1 x 106 BMSCs 20 mL MSC medya içeren bir T175 şişesi içine çözülme. %5 CO2 37 ° C'de hücreler kuluçkaya ve her 2-3 gün öncesine kadar % 80 confluency ortamı değiştirin.
- 5 mL 1 x PBS de hücrelerle yıkayın ve PBS atın.
- 5 mL % 0.05 de ekleyerek hücreleri ayırma tripsin-EDTA ve 37 ° C'de 5 min için hücreleri kuluçka Dekolmanı kolaylaştırmak için balonun kenarlarında dokunun.
- Tripsin devre dışı bırakabilirsiniz, yüzey ve yukarı ve aşağı tek hücre süspansiyonlar elde etmek için pipet hücrelerden ayırmak için MSC medyasının 15 mL ekleyin.
- 50 mL tüp ve hücreleri cips için 300 x g de 5 min için aşağı spin hücrelerde toplamak.
- MSC medya 1 mL hücrelerde resuspend ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
Not: 2 x 10-6 hücre birincil insan ilik MSCs % 80'i confluency bir T175 şişesi içinde de var. - 2.000 hücreler/cm2 5 T175 şişeler taze MSC medyada'de plaka hMSCs. %5 CO2 37 ° C'de hücrelerin büyümesine ve her 2-3 gün kadar % 90 Konfluent T175 şişeler 5 şişe elde edilen ortamı değiştirin.
2. EVs ve biomolecules RNA ilişkili koleksiyonu
Not: EV toplama medya önceden hazırlanır (Dulbecco'nın modifiye kartal orta [DMEM] % 10 fetal sığır serum [FBS] ve % 1 penisilin/streptomisin [P/S] ile). EV toplama medya normal MSC ortam, ancak ticari EV tükenmiş FBS ile (Tablo reçetesi) hazır. Bu normalde EVs, ribonucleoproteins ve lipoproteinler ile ilgili exRNAs içeren FBS, kirlenme sığır exRNA kaçınmaktır. Küçük RNA Kütüphane hazırlık için MSCs 5 Konfluent şişeler türetilmiş exRNAs Kütüphane inşaat etkinleştirmek için gereklidir.
- 3 hücreleri yıkama x PBS 20 mL başına T175 şişesi ile. EV toplama medya MSCs Konfluent T175 şişe başına 20 mL ekleyin ve % 5 CO2 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- Medya toplamak ve 300 x g , 10 min ve 4 ° c için medya santrifüj kapasitesi
- Süpernatant toplamak ve medya 2.000 x g de 20 dk ve 4 ° c için santrifüj kapasitesi
- Süpernatant toplamak ve medya 15,500 x g de 30 dk ve 4 ° c için santrifüj kapasitesi Daha sonra süpernatant toplamak.
- Ultracentrifuge tüpler için medya aktarmak ve 100.000 x g ve 4 ° c, 90 dakika exRNAs cips Sabit açılı rotor burada kullanılır ve Pelet tüp tarafına demir attı. Kapak tarafında işaretlemek ve Pelet nerede beklenen tüp tarafında bir daire çizin.
- Süpernatant kaldırırken, tüp içine tüp emici kağıt üzerine ters çevirme Makinası ve küçük parçalar halinde emici kağıt tüp içinde sıvı tüp alt dokunmadan kaldırmak için. PBS 200 μL vortexing 30 tarafından Pelet resuspend s ve aşağı yukarı 20 x pipetting.
- EVs ve biomolecules izleme çözümlemesi (NTA) (Şekil 2) nanopartikül ile değerlendirmek.
Not: EVs ve biomolecules analizi (NTA), dinamik ışık saçılma (DL) veya iletim elektron mikroskobu (TEM)12izleme nanopartikül ile tespit edilebilir. - EVs ve biomolecules-80 ° C'de daha da aşağı akım deneyler kadar saklayın.
Not: EVs fonksiyonel çalışmaları için kullanılmak üzere kullanacaksanız, % 20 gliserol onları rüptür üzerinden korumak için eklenmiş olması gerekir. Hücreleri Standart prosedürler kullanarak toplanabilir.
3. EVs ve farklılaşmış hücreler topluluğu RNA ilişkili biomolecules
Not: EVs ve RNA biomolecules ilişkili hücrelere farklılaşma tabi iken aynı zamanda hücre kültür ortamından toplanan olabilir. Protokol olarak adı geçen örnek osteoblastik farklılaşma ve exRNA koleksiyonu gün 0 ve 7 farklılaşma açıklar. Hiçbir farklılaşma gerekiyorsa, atlamak Bölüm 3 ve Bölüm 4'e geçin.
- Osteoblastik farklılaşma ortam hazırlamak (DMEM % 10 ile FBS, % 1 P/S, 10 mM β-gliserofosfat, 10 nM deksametazon, 50 mikron askorbat-2-fosfat ve 10 mM 1,25-vitamin-D3) taze her zaman.
- MSCs % 80 birleşmesi olduğunda, MSC medya osteoblastik farklılaşma medyaya değiştirin.
- Osteoblastik farklılaşma medya 2-3 gün sonra doldurmak.
- Gün 5 farklılaşma, medyayı çıkarın ve hücreleri 3 yıkama x PBS 20 mL başına T175 şişesi ile.
- 10 mM β-gliserofosfat, içeren EV toplama medya 10 nM deksametazon, 50 mikron askorbat-2-fosfat ve 10 mM D vitamini 1.253 Konfluent T175 şişesi MSCs. Incubate emin olmak 48 saat için % 5 CO2 ile 37 ° C'de hücreler devam etti, başına 20 mL ekleyin farklılaşma EVs ve biomolecules toplarken.
- Günlük 7 medya toplamak ve EVs ve 2.2-2,6 adımlarda açıklandığı gibi biomolecules izole etmek için devam edin.
- Kalite kontrol için sırasıyla hücreleri 96-kuyu veya farklılaşma bir alkalen fosfataz (ALP) faaliyet tahlil kullanarak değerlendirmek için 6-kuyu veya nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), ile tohum.
Not: Resim 3 Osteojenik farklılaşma hücre gösteren bir örnektir.
4. RNA çıkarma ve kalite kontrol
- Adım 2.8 buz örneklerinden çözülme. Bir RNA izolasyon Kiti (Tablo reçetesi) kullanarak RNA ayıklayın.
- RNA izolasyon Kiti (Tablo reçetesi) sağlanan sütun RNA RNase free su 100 μL içinde elute.
- RNA etanol yağış ile arıtılmış RNA 100 μL 1 μL glikojen, 2 M pH 5.5 sodyum asetat 10 μL ve önceden soğutulmuş % 99 etanol 250 μL ekleyerek konsantre.
- -20 ° C'de RNA çökelti gecede örnekleri kuluçkaya. RNA 16.000 x g ve 4 ° c, 20 dk centrifuging tarafından cips
Not: Pelet glikojen ile ortak yağış nedeniyle beyazdır. - Süpernatant kaldırmak ve RNA Pelet 1 mL % 75 etanol ile yıkayın. RNA 16.000 x g ve 4 ° c, 5 min için tekrar cips
- Etanol kaldırmak ve RNA tüp kapağını açık hava için 5-10 dakika için Kuru RNA Pelet bırakın. RNA Pelet RNase free su 7 μL içinde resuspend.
- Kütüphane inşaat önce üreticinin protokolüne göre RNA algılamak için bir Kapiler Elektroforez çip tabanlı makine kullanarak toplama ve RNA kalitesini kontrol edin.
Not: RNA'ın bir temsilcisi boyut dağılımı şekil 4' te gösterilmiştir. - Hücresel RNA bir ticari arıtma Kiti (Tablo reçetesi) kullanarak ayıklayın.
5. Kütüphane inşaat ve kalite kontrol
Not: Küçük RNA kitaplıkları ayarlamalar nedeniyle giriş düşük RNA ile ticari kitleri (Tablo reçetesi) kullanılarak inşa edilir. Kütüphane inşaat soğutulmuş blokta gerçekleştirilir.
- Isıtma bloğu için 0.2 mL PCR tüpleri buz soğuk ve adım 4,6 0.2 mL RNase free PCR tüpleri içine soğuk bir blok üzerinde RNA'ın 5 μL pipet.
- 3' adaptörler (1:10) 0.2 mL RNase free PCR tüp RNase free suda oranında seyreltin. 0.5 μL seyreltilmiş bağdaştırıcısının ve 8 x ve santrifüj kısaca tüm sıvı tüp alt toplamak için yukarı ve aşağı pipetting tarafından RNA 5 μL ile karıştırın.
- 70 ° c ısıtılmış bir termal cycler 2 min için RNA ve 3' adaptör karışımı kuluçkaya ve örnek soğutulmuş blokta yerleştirin.
- 1 μL ligasyonu arabelleği, 0.5 μL RNase inhibitörü ve T4 RNA ligaz (silme mutant) 0.5 μL RNA ve 3' adaptör karışımı ekleyin. Yukarı ve aşağı 8 x pipetting tarafından mix ve kısaca santrifüj kapasitesi.
- Tüp 28 ° c ısıtılmış termal cycler 1 h için kuluçkaya.
- Durmak eriyik 0.5 μL örnek tüp termal cycler kalan tüp içine eklemek, yukarı ve aşağı 8 x pipetting tarafından mix ve 15 dakika 28 ° C'de kuluçkaya devam.
- 5' adaptörler (1:10) 0.2 mL RNase free PCR tüp RNase free suda oranında seyreltin. Bir ayrı RNase free 0.2 mL PCR tüp, ısı 5' adaptörü 70 ° c ısıtılmış termal cycler 2 min için içine 5' bağdaştırıcısının 0.5 μL ekleyin ve sonra örnek soğutulmuş blokta yer.
- 10 nM ATP, T4 RNA ligaz 5' adaptör Tube 0.5 μL 0.5 μL eklemek, yukarı ve aşağı 8 x pipetting tarafından mix ve kısaca tüm sıvılar altına toplamak için santrifüj kapasitesi.
Not: 5' adaptör soğutulmuş blokta mümkün olduğu kadar devam et. - 5' adaptör karışımı 1,5 μL örnek için adım 5.6 ve çok yavaşça pipetting 8 x tarafından yavaş yavaş karıştırın. Örnek için Önceden ısıtılmış termal cycler 1 h 28 ° C'de kuluçkaya.
- RT bir RNase free 0.2 mL PCR tüp RNase free suda astar 1:10 oranında seyreltin. Seyreltilmiş RT astar 0.5 μL örnek adım 5,9, çok yavaşça yukarı ve aşağı 8 x yavaş yavaş pipetting tarafından mix ekleyin ve kısa bir süre santrifüj kapasitesi.
- 70 ° c ısıtılmış termal cycler 2 min için örnek kuluçkaya ve örnek bir soğutulmuş blokta yerleştirin.
- 5 x ilk strand arabellek, 0.5 μL 12,5 mM dNTP mix, 100 mM dithiothreitol (DTT), 0,5 μL RNase inhibitörü ve transkriptaz 0.5 μL 0.5 μL 1 μL ekleyin. Çok yavaş yavaş yavaş aşağı yukarı 8 x pipetting tarafından mix ve kısaca santrifüj kapasitesi.
- Örnek 50 ° c için 1 h cDNA elde etmek için Önceden ısıtılmış termal cycler kuluçkaya.
- 4.25 μL ultrasaf su, 12,5 μL PCR karışımı, 1 μL dizin astar ve evrensel astar 1 μL cDNA ekleyin. Yukarı ve aşağı 8 x pipetting tarafından mix ve kısaca santrifüj kapasitesi.
- Örnek bir termal cycler yerleştirin ve cycler aşağıdaki gibi ayarlayın: 30 98 ° C s; 15 devredir 10 98 ° c s, 30 60 ° C s ve 72 ° C 15 s; ve son 10 dk 72 ° C ile çevriminde.
Not: Hazır Kütüphane-20 ° C'de bir hafta boyunca saklanır. - Bir DNA jel kitaplığı ayıran ve jel (jel ayıklama) 140 arasında kesme RNA Kütüphane arındırmak bp ve 160 bp ve Kütüphane inşaat kiti tarafından verilen protokol sonrası jel kitaplıktan eluting.
Not: Bu çalışmada, ticari jel (Malzemeler tablo) ve 140 arasında kütüphane üzerine adım 5,15 hazır Kütüphane yüklenir bp ve 160 bp saf dışarı tarafından bir otomatik DNA boyutu fractionator (Malzeme tablo) göre üreticinin iletişim kuralı. - Konsantre ve adım bir sütun tabanlı PCR arıtma Kiti (Tablo reçetesi) kullanarak 5,16 kitaplığından yıkama ve 10 μL RNase free su kütüphanede sonunda elute.
- Üreticinin protokol sonrası Kütüphane boyutunu kontrol etmek için bir DNA çip (Tablo reçetesi) üzerine saf Kütüphanesi 1 μL yükleyin.
- 1 μL arıtılmış Kütüphanesi (1: 1000) 10 mM pH 8.0 içinde seyreltik Tris-HCl % 0.05 polysorbate 20 ile ve kit ile DNA Standartlar kullanılarak kütüphane konsantrasyon ölçmek için bir ticari Kütüphane miktar kit kullanarak qPCR tarafından Kütüphane ölçmek.
- Havuzu eşit miktarda kitaplıkları gereksinimlerine uygun sıralama makine ve sıralı olarak yüksek üretilen iş sıralama sistemi.
Not: Hücresel RNA'ın Kütüphane inşaat yapılabilir Kit standart iletişim kuralı takip ederek aynı Kitleri kullanarak.
6. Biyoinformatik boru hattı
Not: Bu kurum içi bir boru hattı ve burada kullanılan programların listelenen tablo reçetesi.
- Dış görev düşük kaliteli okuma döşeme ve adaptör dizileri ham okuma kaldırın.
- Temiz okuma RNA'ların farklı türleri eşleştirin.
- TRNA ağırlıklı olarak tRNA dizileri sık temel misincorporation ters transkriptaz tarafından neden çünkü iki uyuşmazlıkları izin vererek açıklama.
- MiRNAs ile eşleştirerek sıfır duyarlıysa yanlış eşleşmeyi sağlayan insan miRNAs miRBase v21 dan açıklama ekleyin. Beri miRNAs A tabidir ve U nontemplated 3' son eklemeler, harita dizileri vardır 3' en çok üç A ve/veya T nts sonra okuma insan miRNAs ve diğer miRNAs miRBase v21 dan sıfır uyuşmazlıkları izin için eşleştirilir, kesilmiş.
- İlgili diğer küçük RNA'lar için (snRNA, snoRNA, piRNA ve Y RNA'ların) bir uyuşmazlığı izin vererek açıklama.
- Kalan eşlenmemiş okuma bozulması değerlendirmek için uzun RNA (rRNA, diğer RNA Rfam ve mRNA) veri kümeleri eşleştirin.
- İnsan Genomu dizileri açıklama ekleyin.
- Bakteriyel genom dizileri açıklama ekleyin.
- MiRNA ifade aşağıdaki formülü kullanarak normalize: miRNA sayar / toplam tüm eşlenen miRNAs sayar) x 106.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol için açıklanan yöntemi sonraki nesil sıralama için MSC kültüründen exRNA toplamak için optimize edilmiştir. İş akışının genel düzeni şekil 1 ' solda ve sağda ilgili kalite kontrol denetim noktaları vardır.
Koleksiyon için gün hücre morfolojisi (şekil 3A) farklılaşmamış ve (şekil 3B) farklı hücreleri gösterilir. Ayrıca, 7 gün boyunca indüklenen hücre ALP aktivitesinin temsilcisi normalleştirilmiş düzeyleri de (şekil 3 c) gösterilir. Burada, ALP yaklaşık 2,5 kat bu uninduced hücrelerinin faaliyettir.
Üç T175 şişeler Konfluent MSCs, 2-5 x 1010 parçacıklar/mL (Şekil 2) verim. Ortalama partikül büyüklüğü yaklaşık 160-165 nm ise 130-140 nm parçacıklar çoğu. Hangi büyük kompleksleri veya büyük toplamları göstermek istiyorsunuz 200 ve 500 nm arasında birkaç daha küçük tepeler vardı.
RNA hızlı bir şekilde bozulmuş beri kesinlikle RNA ekstraksiyon kiti veya kullanılan iletişim kuralı göre şartlarına uygun. Koşullar RNase free kullanın, özellikle RNase free su RNA resuspend ve RNA buz mümkün olduğunda üzerinde tutmak için. Çıkarma sonra RNA bir Kapiler Elektroforez çip tabanlı makine kullanarak sayısal. Analiz ediliyor sonra RNA'ın temsilcisi electropherograms şekil 4' te gösterilmiştir. ExRNAs electropherogram bir geniş aralığı, RNA'ların (şekil 4A) içerir. Buna karşılık, hücresel RNA çevresinde, çok farklı tepeler vardır 70-120, 1800 ve tRNA/5S için karşılık gelen 3800 nt rRNA / 5.8S rRNA, 18S rRNA ve 28S rRNA, sırasıyla (şekil 4B). RNA bütünlüğü (RIN) RNA kalitesini temsil eder. Hücresel RNA'ın iyi bir RIN olduğunu > 8 (hemen hemen hiçbir RNA bozulma olduğunu gösterir). RIN dayandığı 28S ve 18S arasındaki oran algoritmasıdır. Bu tam uzunlukta rRNA'lar genellikle exRNAs algılanabilir değildir çünkü RIN exRNAs RNA kalitesinin iyi bir göstergesi değildir anlamına gelir.
RNA ayıklama, miRNA kütüphaneler inşa edildi ve cDNA kitaplıkları tarafından Jel Elektroforez ayrı kaldık. MiRNAs adaptörü bakmaksızın cDNA genellikle 140 ve 160 nt arasında olan. Kütüphanede kalitesini sonra bir Kapiler Elektroforez çip tabanlı makinede (şekil 5) görüntülenir. Şekil 5A ve şekil 5B hücresel RNA kitaplıklardan gün 0 ve gün 7, sırasıyla vardır. Şekil 5C ve şekil 5 d exRNA gün 0 ve gün 7 sırasıyla kitaplıklarıdır. Tüm dört örnekleri zirveleri vardı yaklaşık 140 başarılı miRNA Kütüphane inşaat belirtmek nt. CDNA kütüphanelerde miktarı bir kütüphane miktar kit kullanarak qPCR tarafından sayısal. Standartların miktar döngüsü (Cq) standart eğri (şekil 6) elde etmek için konsantrasyon günlük karşı çizildi. Standart eğri denklemi sonra kitaplıkları (Tablo 1) konsantrasyonu hesaplamak için kullanıldı. Bizim örnekte exRNAs kitaplıklarından konsantrasyonu 5-8 nM, hangi önemli ölçüde hücresel (8-30 nM) RNA'ların kitaplıklardan daha düşük idi. Kütüphaneler sonra eşit miktar ile havuza alınmış ve sıralama için yolladı.
Kütüphaneler sıralı sonra düşük kaliteli okuma uzak FASTX-Toolkit ile kesilmiş ve Kütüphane exRNAs elde edilen kalitesi yüksek ve karşılaştırılabilir kütüphanelerin hücrelerden (şekil 7AB). Hücreleri kitaplıklardan sıra uzunluğu yaklaşık 22, tek bir tepe vardı miRNAs ile ilişkili olan nt (şekil 7C). Buna ek olarak, exRNAs kitaplıklardan daha heterojen ve 3 büyük tepeler yer: 22 nt, 30 nt ve 33 nt (Şekil 7 d). Hücresel karşılıkları 22 zirvesinde nt miRNAs benzer. Yakından bakıldığında ortaya doruklarına 30 ve 33 nt, tRNA yarım/parçaları bulunmaktadır ya da piRNAs. Ek açıklamaları, eşlenen okuma sonra çizildi. Çoğu okuma (%65,1) insan miRNAs ve her biri diğer küçük RNA'lar eşlenen küçük bir kısmı için muhasebeleştirilir eşlenmiş hücresel RNA (şekil 8A) okur. Contrastingly, yalnızca % 8'i exRNAs insan miRNAs (resim 8B) eşlenir. Eşlenen okuma tRNA edildi en bol küçük RNA. Çoğu okuma "eşsiz okuma" (% 43) vardı. Daha fazla muayene exRNAs eşsiz okunma küresel veritabanlarına liderliğindeki çoğu bakteriyel serileri karşılık gelen şaşırtıcı bulma (% 74 ve %85 D0 ve D7 exRNA için sırasıyla; Tablo 2). Buna ek olarak, yalnızca %0,9 hücresel RNA'ın eşsiz ve o, sadece % 10 bakteri için eşleştirilmiş. % 1'den küçük bir karşılaştırma için gösterdi sığır genom FBS kirlenme (Tablo 2) kaynağı olmadığını düşündüren aynı. Bu nedenle, exRNAs normal hücresel RNA karşılaştırıldığında bir atipik profil sergi.
Şekil 1: iş akışı exRNA sıralama ve analiz. Tüm iş akışı gri kutularındaki soldaki tasvir ve sağdaki kırmızı kutuları kalite kontrol her adım ile ilişkili olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: boyutu 0 gün ve gün 7 farklılaşma hücreler tarafından salgılanan parçacıklar dağılımı. Gün 0 ve (B) gün 7 farklılaşma (A), 3 x T175 şişeler temsilcisi NTA sonuçları parçacıkların toplanan. Konsantrasyon parçacıkların yanı sıra ilgili ortalama ve modu boyutları grafiklerin sekmeli. SD: standart sapması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: hücre morfolojisi ve Osteojenik farklılaşma hücre dışı RNA koleksiyonu önce. Farklılaşmamış BMSCs koleksiyonu medya ile toplama gününde kültürlü(a)test. (B) test BMSCs toplama günü koleksiyonu medya ile 7 gün için farklı. Ölçek çubukları 100 µm. (C) = ALP faaliyetleri hücrelerin onların anılan sıraya göre hücre viabilities için normalleştirilmiş. Çizilen değerlerinin üç bağımsız deney vardı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: RNA çıkarma sonra RNA bütünlüğünü temsilcisi electropherogram. Hücre dışı RNA(a)'ınRNA analizleri ve hücresel RNA (B). X ekseni RNA (nt) uzunluğu ve y ekseni floresan. 25 merdiven ilk tepedir nt. ribozomal RNA'ların gösterilir 18S (1800 nt) ve 28S (3.800 nt). RNA bütünlük numarası (RIN) RNA kalite 18S ve 28S ribozomal RNA bütünlüğü dayalı bir göstergesidir. RIN numaraları daha büyük daha iyi kalite eşit. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Kütüphane inşaat sonrası cDNA kütüphanelerin temsilcisi electropherogram. (A)hücreleri (B) hücreleri, gün 7, 0 günden (C) hücre dışı RNA ve (D) hücre dışı RNA gün 7 gün 0, kütüphanelerin DNA analizler. Yeşil ve mor sayılardır 35 merdivenler nt ve 10,380 nt, anılan sıraya göre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: cDNA Kütüphanesi miktar ve hesaplama. Kitaplıklar arasında 500 - 1000 kez exRNA ve 1000 arasında ve 4.000 kere hücre RNA seyreltilmiş. Kütüphaneler standartları ile birlikte Kütüphane miktar Seti'nden işletilmiştir. DNA standartların ortalama Cq değerleri standart bir eğri, standart eğri ve R2 değeri bir denklemi oluşturmak için günlük10 konsantrasyon (pM) karşı çizildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: Kalite Puanlarını ve uzunluğu dağıtım sıralarının. Düşük kaliteli okur ve adaptör dizileri hücreleri(a)ve (B) exRNAs için FASTX-Toolkit ile kesilmiş. Temiz uzunluk dağılımı (C) hücreleri ve (D) exRNAs için okur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: küçük RNA'ların ek sıralama sonra açıklama. Ek açıklamalar(a)hücreleri ve (B) exRNAs için temiz okuma yüzdesi temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Örnek | Seyreltme faktörü | CQ değeri | log(pM) | Konsantrasyonu (AM) | Konsantrasyon ortalama (AM) | Konsantrasyon ortalama * (452/143) | Dillution faktör (pM) tarafından çarpın |
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7,72 | 0.702 | 5.036 | 5.276 | 16.678 | 8338.993 |
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7.57 | 0.754 | 5.677 | |||
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7,7 | 0.709 | 5.117 | |||
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8,64 | 0.383 | 2.416 | 2.365 | 7.477 | 7476.846 |
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D7 exRNA | 500 | 8,52 | 0.425 | 2.659 | 3.221 | 10.182 | 5090.913 |
| BMSC D7 exRNA | 500 | 8,42 | 0.459 | 2.880 | |||
| BMSC D7 exRNA | 500 | 7,97 | 0.615 | 4,125 | |||
| BMSC D7 exRNA | 1000 | 8,87 | 0.303 | 2.011 | 1.933 | 6.110 | 6110.391 |
| BMSC D7 exRNA | 1000 | 8.92 | 0.286 | 1.932 | |||
| BMSC D7 exRNA | 1000 | 8.97 | 0.269 | 1,857 | |||
| BMSC D0 hücre | 1000 | 6.86 | 1.000 | 10,005 | 9.810 | 31.007 | 31006.974 |
| BMSC D0 hücre | 1000 | 6,91 | 0.983 | 9.614 | |||
| BMSC D0 hücre | 4000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | 2.398 | 7.581 | 30322.041 |
| BMSC D0 hücre | 4000 | 8.59 | 0.400 | 2.514 | |||
| BMSC D0 hücre | 4000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D7 hücresi | 1000 | 8.44 | 0.452 | 2,834 | 2.880 | 9.104 | 9104.439 |
| BMSC D7 hücresi | 1000 | 8.43 | 0.456 | 2.857 | |||
| BMSC D7 hücresi | 1000 | 8,39 | 0.470 | 2.950 | |||
| BMSC D7 hücresi | 4000 | 10,36 | -0.213 | 0.612 | 0.702 | 2.218 | 8872.689 |
| BMSC D7 hücresi | 4000 | 10.27 | -0.182 | 0.658 | |||
| BMSC D7 hücresi | 4000 | 9,97 | -0.078 | 0.836 | |||
| Hesaplamalar: | |||||||
| log(pM) =-0.3467 (örnek Cq değeri) x + 3.3786; Standart eğri ve formül kullanma | |||||||
| konsantrasyonu (pM) 10^log(pM) = | |||||||
| Boyutu ayarlama hesaplama = DNA boyutu standart (452 bp) ortalama parça uzunluğa göre bölünmüş (143 bp) | |||||||
Tablo 1: miRNA Kütüphane miktar.
| Örnek: | # insan eşleme değil okur | # bakteri için eşleme okur | Bakteriyel okuma yüzdesi | # ineğe eşleme okur | sığır okuma yüzdesi |
| BMSC D0 hücre | 131007 | 9858 | % 8 | 99 | %0,08 |
| BMSC D7 hücresi | 169730 | 7935 | % 5 | 188 | % 0,11 |
| BMSC D0 exRNA | 6122833 | 4551477 | %74 | 891 | %0.01 |
| BMSC D7 exRNA | 7046691 | 5970086 | % 85 | 771 | %0.01 |
Tablo 2: Eşsiz yüzdesi bu harita bakteri ve sığır okur okur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, biz fark ifade analizleri düşük giriş örneklerinden sağlar exRNAs, sonraki nesil sıralama için bir iletişim kuralı tanımlamak. Belirli bir iletişim kuralı için EV ve exRNA yalıtım yapıştırma miRNA13,14düzeyde ve hatta küçük değişiklikler (yani, ultrasantrifüj adım ya da bir değişiklik rotor tipi) transcriptome etkileyebilir çünkü önemlidir. Böylece, nasıl exRNA izole ne olursa olsun, bu sonuçları karşılaştırmak için bir deney tüm örnekleri aynı deneysel ve bioinformatic yordamı uygulamak önem taşıyor.
RNA bütünlüğü genellikle bioanalyzer değerlendirilir. ExRNAs yoksun olduğundan tam uzunlukta rRNA, onların RIN değeri çok düşüktür, ancak bu düşük kaliteli RNA örnekleri yansıtmayabilir. Ayrıca, exRNAs RNA konsantrasyonu büyük ölçüde değişik ve çoğu zaman yanlış. Bu nedenle, yerine RNA kalite değerlendirme ve bioanalyzer üzerinde RNA miktarının, aynı birimin medya her zaman daha fazla işlemek için kullanın. Ayrıca, ayıklanan RNA resuspension arabellek aynı birim resuspend ve aynı birim Kütüphane yapımı için kullanabilirsiniz.
Küçük RNA Kütüphane yapılar için onda standart Protokolü'nün adaptörleri miktarını azaltarak ve yarısı diğer reaktifler kullanarak optimize edildi. Adaptörler azaltarak sadece adaptör dimer önler, ayrıca intramolecular RNA daireselleşmesi15engeller. Reaktifler azalma Illumina TruSeq küçük RNA örnek hazırlık takımı için optimize edilmiştir. Belgili tanımlık teçhizat özel düşük giriş örnekleri olduğunu belirtmediği sürece diğer setleri kullanılması gerektiğini, bu da adaptör ve Kimyasalları buna göre düşük önerilir. Son olarak, Kütüphane inşaat PCR çevriminde 12'den 15 exRNAs düşük konsantrasyon için hesap için bu iletişim kurallarını döngülerle için yükseltilmiştir. Bu amplifikasyon önyargıları15görmeden en iyi ayarı olarak bulduk.
Çeşitli kalite kontrol ölçümleri de dahil olmak üzere temel Kalite Puanlarını değerlendirildi ve uzunluğu profilini okudum. Biyoinformatik analizleri yaparken hücresel RNA ve exRNAs okur temel kalite benzer vardı; Ancak, uzunluğu dağıtım ve dizileri açıklamalı kökeni tamamen farklıydı. Çoğu insan miRNAs için ancak, exRNA okuma büyük bir kısmı eşlenen hücresel RNA okunma eşsiz okuma vardı. Yakından incelenmesi üzerine, bakteriyel olduğu ortaya çıktı eşsiz okur okur (Tablo 2). Antibiyotik kültürümüzde rutin olarak kullanıldığından bu şaşırtıcı oldu. Bizim sonuç hücre kültürü sıralama exRNA16türetilmiş zaman da eşsiz okuma büyük kısmı gösterdi de diğer raporları ile hizalar. Bu kirleticiler için nedenlerinden biri bakteri hücre dışı kompleksleri veya EVs boyutunda örtüşme ve bu nedenle sırasında ultrasantrifüj adım17co arındırmak olduğunu. Önceki yayınları altında normal hücre laboratuar prosedürleri18farkedilmeden kalır bazı bakteri kültürü medya yaygın bulaşma belirledik. Bugüne kadar bu sorun büyük ölçüde göz ardı ama zaman arındırıcı ve exRNAs analiz dikkate alınmalıdır.
Bu iletişim kuralı kültür ortamından exRNAs hasat, küçük RNA Kütüphane hazırlık en iyi duruma getirme ve ham kitaplığı veri işleme için tam bir rehber ayrıntıları. Bu iletişim kuralı, özellikle sürecinde böylece diğerleri düşük giriş örnekleriyle çalışma ne için bilmiyor olabilir nasıl düşük giriş örnekleri (exRNAs gibi) normal örnek hazırlıkları sapma göstermek için çeşitli kalite kontrol denetim noktaları vurgular bekliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Onların teknik destek için iNANO Bay Claus otobüs ve Bayan Rita Rosendahl için minnettarız. Onun ultracentrifuge sık sık bizim kullanımına izin veren Dr. Daniel Otzen sayesinde özel. Bu çalışmada yenilik Fonu Danimarka (kabul Projesi) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
- NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
