Beschrijven we een methode van het gebruik van polyethyleneimine (PEI)-gecoat superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes voor transfecting macrofagen met siRNA. Deze nanodeeltjes kan efficiënt siRNA leveren aan macrofagen in vitro en in vivo en stilte doel genexpressie.
Vanwege hun cruciale rol bij het reguleren van de immuunrespons, macrofagen hebben voortdurend onderwerp geweest van intensief onderzoek en vertegenwoordigen een veelbelovend therapeutisch doel in vele aandoeningen, zoals kanker, auto-immune ziekten en atherosclerose. RNAi-gemedieerde gene zwijgen is een waardevolle benadering van keuze sonde te manipuleren macrofaag functie; echter de transfectie van macrofagen met siRNA wordt vaak beschouwd als worden technisch uitdagende en paar methodologieën gewijd aan de overdracht van siRNA aan macrofagen zijn momenteel beschikbaar. Hier presenteren we een protocol superparamagnetische ijzeroxide polyethyleneimine-gecoate nanodeeltjes (PEI-SPIONs) te gebruiken als een voertuig voor de beoogde levering van siRNA aan macrofagen. PEI-SPIONs zijn in staat van bindende en volledig condenserend siRNA wanneer de gewichtsverhouding Fe: siRNA 4 bereikt en hoger. In vitro, deze nanodeeltjes kan efficiënt leveren siRNA in primaire macrofagen, alsmede in de macrofaag-achtige RAW 264.7 cellijn, zonder afbreuk te doen aan levensvatbaarheid van de cellen in de optimale dosis voor transfectie, en, uiteindelijk, ze veroorzaken siRNA-gemedieerde doel gene zwijgen. Naast wordt gebruikt voor in vitro siRNA transfectie, vormen PEI-SPIONs ook een veelbelovende instrument voor het leveren van siRNA macrofagen in vivo. Met het oog op de gecombineerde functies van magnetische eigenschap en het gen-zwijgen vermogen, worden systemisch toegediende PEI-SPION/siRNA deeltjes verwacht niet alleen te moduleren macrofaag functie, maar ook om macrofagen image gemaakt en bijgehouden worden. Kortom, PEI-SPIONs een eenvoudige, veilige en effectieve nonviral platform voor siRNA levering aan macrofagen vertegenwoordigen zowel in vitro als in vivo.
Macrofagen zijn een soort aangeboren immuun cellen verdeeld in alle weefsels van het lichaam, zij het in verschillende hoeveelheden. Door overlegging van een verscheidenheid van cytokines en andere bemiddelaars, zij een kritische rol spelen in de verdediging van de gastheer tegen invasie microbiële ziekteverwekkers, weefselherstel na verwonding en bij het handhaven van de weefsel homeostase1. Macrofagen zijn vanwege hun belang, voortdurend het onderwerp van intensief onderzoek. Ondanks de prevalentie in genregulatie en functie studies, siRNA-gemedieerde gene zwijgen is echter minder kans om te slagen in macrofagen, omdat deze cellen — met name primaire macrofagen — zijn vaak moeilijk te transfect. Dit kan worden toegeschreven aan een relatief hoge mate van toxiciteit meest gevestigde transfectie benaderingen waarin het celmembraan chemisch is is gekoppeld (bijvoorbeeldmet polymeren en lipiden) of fysiek (bijvoorbeelddoor electroporation en Gene geweren) verstoord te laten siRNA moleculen Kruis het membraan, daardoor drastisch verminderen van2,3van de levensvatbaarheid van de macrofagen. Macrofagen zijn bovendien speciale fagocyten rijk aan afbraakroutes enzymen. Deze enzymen kunnen schade aan de integriteit van siRNA, verzwakken haar silencing efficiëntie zelfs als gen-specifieke siRNA is afgeleverd in de cel3,4. Daarom moet een effectieve macrofaag-gerichte siRNA delivery systeem ter bescherming van de integriteit en stabiliteit van siRNA tijdens levering4.
Het wordt steeds duidelijker dat disfunctionele macrofagen zijn betrokken bij het opzetten en de progressie van bepaalde gemeenschappelijke klinische stoornissen zoals auto-immune ziekten, kanker en atherosclerose. Om deze reden, modulerende macrofaag functie met, bijvoorbeeld, siRNA, is ontstaan als een aantrekkelijke methode voor de behandeling van deze stoornissen5,6,7. Hoewel veel vooruitgang is geboekt, is een grote uitdaging van siRNA gebaseerde behandeling strategie de specificiteit van de arme cel van systemisch toegediende siRNA en de onvoldoende siRNA ICT door macrofagen, die bijgevolg tot ongewenste bijwerkingen leiden. In vergelijking met gratis nucleïnezuur therapeutics die meestal geen optimale cel selectiviteit en leiden vaak tot uit-target bijwerkingen, drug-geladen nanodeeltjes (NPs), vanwege hun spontane neiging van worden gevangen door het reticuloendotheliaal systeem, kan worden ontworpen voor passieve targeting macrofagen in vivo, waardoor verbeterde therapeutische effectiviteit met minimale bijwerkingen8. Huidige NPs onderzocht voor de levering van molecules van RNA omvatten anorganische nanocarriers en verschillende liposomen polymeren9. Onder hen toont polyethyleneimine (PEI), een type van kationische polymeren staat bindend en nucleïnezuren condenserend in gestabiliseerde NPs, de hoogste RNA capaciteit9,10te leveren. PEI nucleïnezuren beschermt tegen aantasting van het enzymatische en nonenzymatic hun overdracht bemiddelt tussen de celmembranen en bevordert hun intracellulaire vrijlating. Hoewel aanvankelijk geïntroduceerd als een DNA levering reagens, PEI bleek later een aantrekkelijk platform voor in vivo siRNA levering, hetzij lokaal of systemisch9,10.
Superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes (SPIONs) hebben aangetoond grote belofte in de medische biologie, vanwege hun magnetische eigenschappen, biocompatibiliteit, vergelijkbare grootte op biologisch belangrijke objecten, hoge oppervlakte-gebied-te-volumeverhouding, en gemakkelijk aan te passen oppervlak voor bioagent bijlage11. Bijvoorbeeld, vanwege hun potentiële nut als contrast agent en snelle opname door macrofagen, zijn SPIONs ontstaan als een favoriete klinische instrument om beeld weefsel macrofagen12. Terwijl de SPIONs zijn ook uitvoerig bestudeerd als nucleïnezuur levering voertuigen11,13,14,15, om onze kennis, bevat de literatuur weinig rapporten van SPIONs als een drager voor macrofaag-gerichte siRNA levering. Voor de levering van het gen door SPIONs, is hun oppervlak meestal bekleed met een laag van hydrofiel kationische polymeren waarop negatief geladen nucleic zuren kunnen worden via een elektrostatisch proces aangetrokken en vastgebonden. Hier presenteren we een methode voor de synthese van SPIONs waarvan oppervlak wordt gewijzigd met laag-moleculair-gewicht (10 kDa), vertakte PEI (PEI-SPIONs). Deze magnetische nanoplatforms zijn dan aangewend om te condenseren siRNA, vorming van PEI-SPION/siRNA complexen waarmee siRNA vervoer in de cel. We reden dat spontane fagocytose van SPIONs door de cellen van de reticuloendotheliaal systeem16, in combinatie met het sterke vermogen van bindende en PEI-SPIONs geschikt voor het efficiënte vervoer van siRNA in condenserend nucleic zuren door PEI, maakt macrofagen. De hier gepresenteerde gegevens ondersteunen de haalbaarheid PEI-SPION/siRNA-gemedieerde gene monddood maken in macrofagen in cultuur, alsmede in vivo.
Macrofagen zijn vuurvast tot transfect door veelgebruikte nonviral benaderingen, zoals electroporation, kationische liposomen, en lipide-soorten. Hier beschreven we een betrouwbare en efficiënte methode om transfect van macrofagen met siRNA. Met behulp van het huidige protocol, kunnen meer dan 90% van macrofaag-achtige RAW 264.7 cellen (figuur 2B) en rat peritoneale macrofagen18 zijn transfected met siRNA zonder aanzienlijke waardevermindering van de levensvatbaarhei…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (81772308) en de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (nr. 2017YFA0205502).
DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |